KR101653899B1

KR101653899B1 - 징코라이드의 추출 분리 방법

Info

Publication number: KR101653899B1
Application number: KR1020147030215A
Authority: KR
Inventors: 이 순; 용홍 주; 정빙 통; 지에 왕
Original assignee: 청두 바이위 파머수티컬 씨오., 엘티디
Priority date: 2012-04-23
Filing date: 2012-05-17
Publication date: 2016-09-02
Also published as: EP2842957A1; EP2842957B1; CN102659808B; EP2842957A4; CA2871146C; JP2015514785A; CA2871146A1; US20150044311A1; JP5940212B2; KR20150001777A; WO2013159412A1; CN102659808A; US9084755B2

Abstract

본 발명은 징코라이드(Ginkgolides)의 추출 분리 방법에 관한 것으로서 은행잎을 추출(extraction), 액-액 추출(liquid-liquid extraction), 칼럼 통과(passing colum), 결정화(crystallization), 혼정 단계를 거쳐 징코라이드를 얻고 상기 징코라이드에는 빌로발라이드(C₁₅H₁₈O₈) 25.0%~50.0%, 징코라이드A(C₂₀H₂₄O₉) 20.0%~45.0%, 징코라이드B(C₂₀H₂₄O₁₀) 10.0%~30.0%, 징코라이드C(C₂₀H₂₄O₁₁) 5.0%~15.0%가 포함되어 있고 빌로발라이드, 징코라이드A, 징코라이드B, 징코라이드C의 총량은 95%보다 크다.

Description

징코라이드의 추출 분리 방법{METHOD FOR EXTRACTING AND SEPARATING GINKGOLIDES}

본 발명은 식물 추출 분야에 속하며 구체적으로는 징코라이드의 추출분리 방법에 관한 것이다.

20세기 60년대부터 많은 국가에서는 현대적 분리 기술을 이용하여 은행잎의 화학 성분에 대해 연구를 진행하였고 약리 실험과 임상 검증을 거쳐 은행잎의 다방면의 생물 활성이 이에 포함된 특정적인 화학 성분과 관련이 있는 것을 발견하였다. 독일의 Dr. Willar Schwabe는 처음으로 은행잎의 한가지 간단한 추출물을 등록하였고 1972년에 출원을 신청하였으며(W Schwabe DE176708와 DE2117429), EGb761로 명명하였다. 상기 추출물은 심뇌혈관 질환과 신경계 질환의 치료에 사용되고 현저한 효과를 갖고 있으며 독성 및 부작용이 없다. 징코라이드계 화합물(ginkgolids)은 강한 혈소판활성화인자(PAF) 길항 작용을 갖고 있다. 은행 제제를 치료 약물로 취급하고 있는 국가들로는 독일, 프랑스, 중국이 있고 기타 국가에서는 모두 건강 기능성 식품 또는 비처방용 약물로 사용하고 있으며 미국에서 개발해 낸 은행 건강 기능성 식품은 이미 FDA의 허가를 획득하였다.

징코라이드는 테르페노이드에 속하고 테르펜 락톤이라고 부르며 세스키테르펜 락톤과 디테르펜 락톤으로 구성된 은행잎 중 중요한 활성 성분의 하나이다. 빌로발라이드（bilobalide)는 세스키테르펜 락톤에 속하며 1967년에 R.T.Major 및 1969년에 K.Weinges에 의해 분리하여 얻었고 현재 은행잎으로부터 발견된 유일한 세스키테르펜 락톤 화합물이다. 징코라이드A, B, C, M, J(ginkgolid A, B, C, M, J)는 디테르펜 락톤 화합물이며 1932년에 처음으로 S.Furukawa에 의해 은행잎으로부터 분리해 냈고 1967년에 이르러서야 K.Nakanish, M.Mamyama과 K.Okabe등에 의해 추가로 분리 되었으며 그의 화학적 구조를 확정하였다. 구조상으로부터 보면 빌로발라이드계 분자 골격은 15개의 탄소 원자로 구성되어 있고 서로 융합되어 있는 4개의 오원자 고리를 갖고 있으며 그중에는 하나의 오원자 탄소 고리, 3개의 오원자 락톤 탄소 고리가 있으며 오원자 고리에는 천연산물 중에서 보기 드문 t-부틸기 하나가 연결되어 있다. 빌로발라이드는 매우 강한 생물 활성을 갖고 있고 신경 생장을 촉진하는 작용이 있으며 뇌세포 미토콘드리아의 산화적 스트레스에 인한 기능의 변화를 방지할 수 있고 노년 기억 기능을 개선할 수 있으며 노인성 치매의 발생을 방지할 수 있고 뇌, 척수신경이 탈수초되는 것을 방지하는 작용을 갖고 있으며 그의 신경 영양, 신경 보호 작용은 징코라이드보다 강하다. 징코라이드B는 항염증, 항쇼크, 및 심뇌혈관을 보호하고 급성 췌장염을 치료하는 등 작용이 있다. 징코라이드계 화합물의 분자 골격은 20개의 탄소 원자로 구성되어 있고 6개의 오원자 고리가 구비되어 있으며 그중에서 2개의 오원자 탄소 고리, 3개의 오원자 락톤 고리, 1개의 테트라히드로푸란 고리, 두개의 오원자 탄소 고리가 나선환의 방식으로 연결되어 있고 그 외의 고리는 융합의 방식으로 연결되어 있으며 하나의 강성 장대여뀌 형태의 특수한 입체 화학구조를 형성하고 있다. 징코라이드의 분자 중에는 모두 천연물질에서 보기 드문 t-부틸기를 갖고 있으며 징코라이드는 디테르펜 락톤과 세스키테르펜 락톤를 포함하고 디테르펜 락톤에는 주로 징코라이드A, B, C, J, M등이 있으며 세스키테르펜 락톤에는 빌로발라이드가 있다.

20세기 70년대 초기에 PAF를 발견한 후, 약리 학자들은 빌로발라이드에 대해 연구를 진행하였으며 징코 테르펜 락톤(Ginkgo Terpene Lactones)이 강한 혈소판활성화인자 길항제로서 면역계통, 중추신경계통 및 허혈성 손상에 대해 보호 작용이 있고 항쇼크, 항알레르기 및 항염증 효과가 있다는 것을 확정하였다. 징코라이드A, B, C, M, J의 구조상의 차이점은 이들이 포함하고 있는 히드록실기의 수량과 히드록실기의 연결 위치가 다른 것입니다. 징코라이드는 모두 강한 혈소판활성화인자 길항제로서 은행잎 중의 특수한 생리 활성의 관건적인 성분이다.

징코라이드는 혈소판활성화인자 PAF수용체에 대해 강한 특이성 억제 작용이 있으며 그중에서 징코라이드의 항 PAF활성이 가장 높다. PAF는 혈소판과 여러가지 염증 조직이 분비하여 발생된 내원성 인지질이고 지금까지 발견한 제일 유효적인 혈소판응집 유도제로서 이는 많은 질병의 발생 및 발전과 밀접한 관계를 갖고 있다. 징코라이드는 지금까지 임상 응용 전망이 가장 우수한 천연 PAF수용체 길항제로서 그의 길항 작용 활성은 화학 구조와 밀접한 관계가 있다. 락톤 구조에서 R3이 히드록실기이거나 히드록실기의 수량이 많아질 때 PAF에 대한 길항 활성이 약해지며 R2가 히드록실기이고 R3이 H일 때 활성은 현저하게 증강된다. 그중에서 징코라이드B가 PAF에 대한 길항 작용이 가장 강하다.

징코라이드의 추출 및 정제 방법은 비교적 많고 주요하게는 용매 추출법, 칼럼 추출법, 용매 추출-칼럼 추출법, 초임계 추출법 및 크로마토그래프 또는 칼럼 크로마토그래피 정제법 등이 있다. 이런 방법들은 모두 높은 함량의 징코라이드를 유효적으로 분리해 낼 수 없으며 징코라이드의 각 조성성분의 비례가 확정되지 못하므로 임상에서 사용할 때 약효가 서로 부동하고 이의 함량이 높지 않기에 일정한 안전 리스크도 존재하고 있으며 완전한 약리 독리 실험 및 임상 실험 데이터가 없다. 따라서 상기 방법은 모두 실험단계에 있으므로 약품의 생산 과정에 사용하지 않았다. 비록 중국에서는 징코라이드 주사액에 관한 특허가 있으나 이들의 조성은 본 발명과 모두 부동하고 ICH성원국가의 관청 웹사이트에서 검색한 결과, 지금까지 아직 기타의 징코라이드 주사제제의 시판 제품이 없는 상황이다. 지금 징코라이드류 성분의 테스트는 주로 HPLC-UV법, HPLC-MS와 HPLC-ELSD법을 비교적 많이 사용하고 있으나 이런 방법들은 징코라이드 중의 각 성분의 함량만 측정할 수 있으므로. 상기 제품 중의 불량 반응 물질에 대한 엄격한 제어가 결핍하기에 약품의 질량 특징을 진실하게 반영할 수 없으며 완전한 약품 질량 제어 체계를 형성하지 못한 것이 실정이다. 비록 많은 징코라이드의 발명 특허가 있지만 제어 방법이 너무 간단하고, 또한 징코라이드의 조성 비례가 확정되지 않아 모두 한약 주사제제로 제조될 수 없고 임상의 효과와 응용의 안전성을 보증할 수 없다.

비록 중국, 독일 등 국가에는 많은 징코라이드의 특허와 이에 대한 보도가 있으나 본 발명은 공정 과정, 질량 제어 기술 및 임상 적응 질환 등 방면에서 기타 발명 특허와 완전히 다르고 특히 서로 다른 분리 정제 공정으로부터 얻은 테르펜 락톤의 성분은 각각 다르며 지금까지 4가지 성분(징코라이드A, B, C 와 빌로발라이드)의 비례가 고정된 징코라이드 유효 부위를 추출한 조성물의 공정에 대한 보도가 아직 없고 징코라이드 중의 4가지 성분의 핑거 프린트 제어 기술 및 잔류 가능한 큰 분자, 단백질의 검사 방법에 대한 보도도 없다. 본 발명에서 제조한 징코라이드 주사액은 이미 국가 식품약품 감독 관리국의 허가 번호(approval number)를 받았으며 국약준자Z20110035이며 이는 지금까지 국제상에서의 첫번째인 은행 유효 부위 주사제제로서 제품의 구조가 분명하고 명확하다.

본 발명에서 해결한 기술적 과제는 징코라이드의 추출 분리 방법을 제공하는 것이며 상기 추출 분리 방법은 조성 성분이 고정된 징코라이드를 얻을 수 있다.

상기 방법은 하기 단계를 포함한다.

(A) 은행잎을 분쇄시키고 유기 용매를 첨가하여 추출한 후, 농축 추출액에 산화 방지 보호제를 첨가하고 pH조절제를 사용하여 pH를 4-5로 조절시킨 후, 농축, 냉장시키는 추출단계

그중에서 추출 유기 용매는 에틸 알콜, 아세톤 또는 에틸 아세테이트이고 농도는 50~80%v/v이며 사용량은 5~12배이며 바람직하게는 6~10배이며,

추출방법은 환류 추출 또는 달임 추출이다.

1) 환류 추출:

50%~80%v/v의 에틸 알콜: 추출온도는 75~85℃이며, 추출 차수는 2~3번이고 추출 시간은 1~2시간/번이며;

50%~80%v/v의 아세톤: 추출온도는 45~55℃이며, 추출 차수는 2~3번이고 추출 시간은 1~2시간/번이며;

50%~80%v/v의 에틸 아세테이트: 추출온도는 55~65℃이며, 추출 차수는 2~3번 이고 추출 시간은 1~2시간/번이며; 진공도는 -0.02~0.08MPa이다.

바람직한 추출 조건은 3번 추출하고 매번 1.5시간 동안 추출하며 바람직한 에틸 알콜의 농도는 65%v/v이고 바람직한 아세톤의 농도는 50%v/v이며 바람직한 에틸 아세테이트의 농도는 60%v/v이다.

2) 달임 추출

50%~80%v/v의 에틸 알콜: 추출온도는 80~90℃이며, 추출 차수는 2~3번이고 추출 시간은 1~2시간/번이며;

50%~80%v/v의 아세톤: 추출온도는 50~60℃이며, 추출 차수는 2~3번이고 추출 시간은 1~2시간/번이며;

50%~80%v/v의 에틸 아세테이트: 추출온도는 60~65℃이며, 추출 차수는 2~3번 이고 추출 시간은 1~2시간/번이며; 진공도는 -0.02~0.08MPa이다.

추출액을 농축 과정에서 열을 받은 후 징코라이드는 분리되기 쉽기에 보호제와 pH조절제를 첨가할 필요가 있다. 보호제를 첨가하는 것은 징코라이드가 열을 받아 분해되는 것을 방지하기 위한 것이고 사용될 수 있는 산화방지 보호제는 주요하게 중성 아미노산이 있고 세린, 메티오닌, 아스파라진 또는 트레오닌 중의 하나 이상을 포함하고 바람직한 것은 메티오닌이다.

pH조절제는 주로 유기 약산이고 구연산, 사과산, 소르빈산 중의 하나 이상을 포함하고 바람직 한 것은 구연산을 사용하는 pH를 조절하는 것이며 그의 약산성을 이용하여 안정제로 사용하는 것을 통하여 징코라이드가 염기성 조건하에서 개환(ring opening)하는 것을 방지하기 위한 것이다. 그 원인은 징코라이드가 오원자 고리로서 약산성 조건하에서 안정하고 구연산이 약산이기에 징코라이드가 염기성 조건하에서 개환되는 것을 방지할 수 있기 때문이다.

단계(A)의 냉장의 목적은 물과 기름을 분리하여 물 중의 지용성 잡질을 제거하기 위한 것이다.

(B) 농축액을 먼저 n-헥산 또는 석유에테르로 2~3번(바람직하게는 등체적의 n-헥산 또는 석유에테르를 사용하여 액-액 추출을 진행함) 추출하고 수상은 지용성 용매로 4~5번( 바람직하게는 등체적의 에틸 아세테이트로 액-액 추출을 진행함) 추출한 다음 물포화 2-부틸 알콜(n-부틸 알콜)-에틸 아세테이트 혼합 용매로 4~5번(바람직하게는 등체적의 물포화 2-부틸 알콜-에틸 아세테이트 혼합 용매로 추출함) 추출한 후, 유기상 추출액을 한데 모아 감압농축을 진행하는 액-액 추출 단계

그중에서 먼저 n-헥산 또는 석유에테르로 추출하는 것은 엽록소, 징콜릭애시드를 제거하기 위한 것이다.

그다음에 지용성 용매로 징코라이드를 추출하고 사용할 수 있는 지용성 용매는 에틸 아세테이트, 포름산 에틸, 아세톤, 부탄온 중의 하나 이상일 수 있다.

징코 테르펜 락톤은 에틸 아세테이트에 용해되기 쉽고 진게틴이 에틸 아세테이트 중에서의 용해성이 상대적으로 낮고 열수와 물함유 알콜 중에서의 용해도가 비교적 크므로 에틸 아세테이트를 사용하여 징코라이드를 추출할 수 있으며 이를 진게틴류 화합물과 분리시킨 다음, 분리하여 얻은 징코라이드 조제품은 추가로 활성탄, 실리카 겔 또는 수지 칼럼으로 흡착하여 크로마토그래피를 진행하여 잡질을 추가로 제거할 수 있고 다음에, 물함유 알콜 중에서 결정화시키면 비교적 순수한 징코라이드를 얻을 수 있다.

(C) 액-액 추출 농축액을 폴리아미드(30~60메쉬) 수지 칼럼을 통과시키고 차례대로 물 1~5BV, 20~40%v/v 에틸 알콜 3~5BV, 60~90%v/v 에틸 알콜 2~3BV를 사용하여 용출시키고 용출액의 유속을 2~3BV/h로 제어하며 용출시킨 후 용출액을 한데 모아 감압농축, 건조시키는 칼럼 통과 단계

(D) 칼럼을 통과한 후의 건조물을 비등한 물에 첨가시키고 교반 및 용해시켜 냉각을 진행한 후, 상등액을 등체적의 에틸 아세테이트, 포름산 에틸 또는 아세톤으로 4~5번 액-액 추출시킨 후 추출액을 한데 모아 감압농축시켜 건조되도록 증발시킨(drying by distillation) 후 5~8배 양의 30%~50%v/v 에틸 알콜을 첨가하여 가열 교반 용해시키고 여과, 냉장시켜 결정을 석출시킨 후 여과를 진행하고 얻은 여과액 I는 대기시키며 결정은 30%~50%v/v 에틸 알콜로 세척하고 감압농축하여 결정I를 얻으며;

여과액 I는 알콜 함량이 10%~30%v/v 될 때까지 농축하고 냉장을 진행하여 결정을 석출시키고 여과한 후 얻은 여과액 II는 대기시키며, 30%~50%v/v의 알콜로 세척하고 감압건조시켜 결정II를 얻으며;

여과액II를 농축시켜 활성탄 0.1%~0.5%(g/L)를 첨가하여 흡착을 진행하고 여과한 후 얻은 여과액을 알콜 함량이 10%~30%v/v되도록 농축시키고 냉장하여 결정을 석출시키고 여과한 후 얻은 여과액 III는 대기시키며, 결정을 30%~50%v/v의 에틸 알콜로 세척하고 감압건조시켜 결정III를 얻으며;

여과액III을 농축시켜 활성탄-실리카 겔(체적비는 1:1~1:3임) 칼럼을 통과시키고 먼저 30%~50%v/v의 에틸 알콜로 용출시킨 다음 70%~90%v/v의 에틸 알콜로 용출시키며 수집한 용출액을 알콜 함량이 10%~30%v/v가 되도록 농축시킨 후 냉장하여 결정을 석출시키고 결정을 여과한 후 얻은 여과액 IV는 대기시키며, 결정을 30%v/v의 알콜로 세척하고 감압건조시켜 결정 IV를 얻으며;

여과액IV를 농축시켜 냉장하여 결정을 석출시키고 여과한 다음 결정을 30%v/v 에틸 알콜로 세척하고 감압건조시켜 결정 V를 얻으며;

HPLC가 모액 중의 잔여 징코라이드에 대한 검측결과에 따라 여과액IV에 대한 결정화 여부를 고려하는 결정화 단계;

(E) 결정I, II, III, IV, V를 균일하게 혼합하고 분쇄시켜 흰색과 유사한 결정 조성물을 얻고 상기 결정 조성물의 유효 부위의 HPLC 함량은 95%보다 큰 혼정 단계

본 발명에 따른 추출 분리 방법을 사용하여 얻은 징코라이드의 파라미터는 다음과 같다.

a) 성질 상태: 백색과 유사하거나 약간 황색을 띤 결정성 분말이다. 에틸 아세테이트 중에서 용해되기 쉽고 메틸 알콜, 에틸 알콜 중에서 용해되며 물 중에서 거의 용해되지 않는다.

b) 수분: 5.0%보다 작다.

c) 단백질: 595nm 파장하에서의 흡광도는 0.05보다 작다.

d) 탄닌, 수지, 옥살산염, 칼륨 이온: 검측해 내지 못하였다.

e) 잔류 용매: 에틸 알콜과 에틸 아세테이트는 모두 0.5%보다 작고 n-헥산은 0.029%보다 작으며 카프로락탐은 0.0015%보다 작다.

f) 총 징콜릭애시드: HPLC법으로 측정한 총 징콜릭애시드 함량은 5ppm보다 작다.

g) 큰 분자와 중합체: 겔 크로마토그래피법으로 측정한 결과 잔류된 큰 분자와 중합체가 없다. LC-MS법으로 측정한 결과 분자량이 1000보다 큰 대분자 물질과 중합체가 없다.

h) 중금속: 10ppm보다 작다.

i) 비소 염: 2ppm보다 작다.

k) 이상한 독성: 0.2mg/ml의 용액으로 제조한 후 정맥 주사법을 사용하여 투여하는데 부합된다.

l) 핑거 프린트:HPLC법으로 측정하고 빌로발라이드 대조품, 징코라이드A 대조품, 징코라이드B 대조품, 징코라이드C 대조품을 참조물로 하며 한약 크로마토그래피 핑거 프린트 유사도 평가 시스템에 따르면 4개의 공유 피크의 유사도는 0.95보다 크다.

m) 함량: HPLC법으로 측정하고 건조품에 따라 계산하면 빌로발라이드(C₁₅H₁₈O₈) 25.0%~50.0%, 징코라이드A(C₂₀H₂₄O₉) 20.0%~45.0%, 징코라이드B(C₂₀H₂₄O₁₀) 10.0%~30.0%, 징코라이드C(C₂₀H₂₄O₁₁) 5.0%~15.0%가 포함되어 있고 빌로발라이드, 징코라이드A, 징코라이드B, 징코라이드C의 총량은 95%보다 크다.

본 발명에 따른 징코라이드의 추출 분리 방법에 따라, 조성 성분이 고정된 징코라이드를 얻을 수 있다.

도1은 용출 체적이 용출율에 대한 영향을 나타낸 도면이다.
도2는 에틸 알콜의 유속이 용출율에 대한 영향을 나타낸 도면이다.
도3은 징코라이드의 LC-MS스펙트럼을 나타낸 도면이다(분자량 400~1000).
도4는 징코라이드의 LC-MS스펙트럼을 나타낸 도면이다(분자량 400~3000).
도5는 징코라이드의 대조 핑거 프린트를 나타낸 도면으로써, 공유 피크에서 피크2는 징코라이드C이며 핑크3은 빌로발라이드이고 피크4는 징코라이드A이며 피크5는 징코라이드B인, 도면이다.

하기 내용은 본 발명에 따른 징코라이드의 제조 방법 중의 관건적 조건에 대한 선별실험에 대한 설명이다.

1. 액-액 추출 방안의 선별 실험

방법1: 농축액을 먼저 등체적의 n-헥산으로 2`3번 추출하고 수상은 8배 양의 부탄온-아세톤(4:6)으로 온열된 상태하에서 5번 추출하며 추출액을 한데 모아 감압농축시킨다.

방법2:농축액을 먼저 등체적의 n-헥산으로 2~3번 추출하고 수상을 다시 등체적의 에틸 아세테이트로 4~5번 추출하며 등량의 물포화의 2-부틸 알콜-에틸 아세테이트(7:3)으로 4~5번 추출한 후 추출액을 한데 모아 감압농축을 진행하고 건조시킨다.

상기 두가지 추출 분리 정제 방법 선별 실험에서 HPLC-ELSD법으로 가각 두가지 실험 중의 징코라이드의 총량에 대해 측정하고 그 실험 결과는 하기 표1에 나타났다.

추출방안 선별 실험결과

고찰 항목	방법1	방법2
외관 성질 상태	갈색 분말	갈색 분말
총 징코라이드 함량(%)	14.1	10.8

방법2로 얻은 총 락톤 함량은 모두 비교적 높고 에틸 아세테이트와 2-부틸 알콜은 안전성이 극히 높은 용매이므로 방법2를 액-액 추출 분리 정제 공정으로 사용한다.

2. 크로마토그래피 조건 선별 실험

추출액에 아직 대량의 진게틴류 물질 및 기타 잡질이 포함되어 있기에 순도가 극히 높은 징코라이드를 얻으려면 반드시 플라본과 징코라이드를 유효하게 분리시켜야 한다. 지금 보편적으로 사용하는 분리 방법은 폴리아미드 수지 칼럼 분리법, 산화알루미늄 칼럼 크로마토그래피법과 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피법이 있으며 발명자가 대비 연구를 진행한 과정과 결과는 다음과 같다.

방법1: 추출액을 폴리아미드 수지 칼럼을 통과시키고 먼전 2~3배 양의 30%의 에틸 알콜로 용출한 다음 70%의 에틸 알콜로 용출시키며 용출 속도는 2BV/h이고 용출액을 농축시키고 건조되도록 증발시킨다(drying by distillation).

방법2: 추출액을 산성 산화알루미늄 칼럼을 통과시키고 추출액을 등량의 산화알루미늄과 혼합하여 건조시키며 건식법으로 칼럼에 올린(upper column) 후, 4~6배 양의 에틸 아세테이트로 용출시키고 용출 속도는 2BV/h이며 용출액을 농축시키고 건조되도록 증발시킨다(drying by distillation).

방법3: 추출액을 실리카겔 칼럼을 통과시키고 추출액을 등량의 칼럼 크로마토그래피 실리카 겔과 혼합하여 건조시키며 건식법으로 칼럼에 올린(upper column) 후, 먼저 4~6배 양의 석유에테르-에틸 아세테이트(2:1)로 용출시키고 용출 속도는 2BV/h이며 용출액을 농축시키고 건조되도록 증발시킨다(drying by distillation).

HPLC-ELSD법으로 각각 세가지 실험 중의 징코라이드의 총량에 대해 측정을 진행하고 그 실험결과는 표2에 나타났다.

칼럼 크로마토그래피 실험결과

고찰 항목	방법1	방법2	방법3
외관 성질 상태	황색 분말	황색 분말	황색 분말
총 징코라이드 함량(%)	47.8	35.5	38.2

상기로부터 알 수 있다시피 폴리아미드 수지 칼럼으로 얻은 징코라이드의 함량이 가장 높고 분리 효과가 비교적 좋다.

폴리아미드 수지는 플라본에 대해 비교적 좋은 흡착 작용이 있기에 징코라이드와 진게틴을 효과적으로 분리시킬 수 있으며 칼럼 통과 용출 공정 파라미터에 대해 고찰을 진행할 수 있다.

1) 물 세척 체적의 선택: 증류수로 수지 칼럼을 세척하면 매우 우수한 잡질 제거 효과를 일으킬 수 있고 5BV의 물로 수지 칼럼을 세척하고 유속을 1~2BV/h로 제어하여 흘러나오는 색갈은 짙은 색으로부터 옅은 색으로 변하게 되며 물 세척액을 5BV 수집한 후 유출액은 맑고 투명하게 된다. 검측 결과로부터 보면 물체적이 3BV에 도달할 때 칼럼 중의 수용성 잡질은 이미 기본상 깨끗해지게 되고 징코라이드를 검측해 낼 수 없기에 3BV의 물 세척 체적을 선택한다. 용출 체적이 용출율에 대한 영향은 도1에 나타났다.

2) 에틸 알콜 용출 농도가 용출 효과에 대한 영향: 추출물을 각각 부동한 폴리아미드 칼럼에 올린 후 30min동안 흡착시키고 먼저 3BV의 물로 세척한 다음 각각 10%, 30%, 40%, 50%, 70%, 90%인 에틸 알콜로 용출시키고 유속은 1BV/h이며 에틸 알콜 용출액을 각각 수집하고 각 농도의 용출액 중의 징코라이드의 양을 측정하며 에틸 알콜 농도가 높아짐에 따라 용출량과 용출율은 모두 상승되지만 40%의 에틸 알콜인 경우에는 용출량의 상승 속도가 완만해지고 90%의 에틸 알콜인 경우에는 용출량의 차별이 크지 않다. 30%의 에틸 알콜인 경우에는 기본상 최적의 용출율에 달성되므로 30%의 에틸 알콜을 바람직한 용출 농도로 사용한다.

3) 에틸 알콜의 해석 유속이 용출 효과에 대한 영향: 추출물을 각각 부동한 폴리아미드 칼럼에 올린 후 30min동안 흡착시키고 먼저 3BV의 물로 세척한 다음 40%의 에틸 알콜로 용출시키며 유속은 1BV/h이다. 비교적 바람직한 에틸 알콜 해석 유속을 선택하기 위하여 각각 1, 2, 3, 4, 5BV/h의 유속으로 칼럼에 올린 후 용출시키고 3BV의 용출액을 얻으며 징코라이드의 양을 측정한다. 용출 유속과 해석율은 매우 큰 관련성이 있고 유속이 높아짐에 따라 해석율은 증가되지만 3BV/h에 도달한 경우에는 오히려 하강된다. 이는 속도가 빠르게 되어 에틸 알콜 용출액이 흡착된 징코라이드와 잘 교환할 수 없기 때문에 좋은 용출 효과에 달성할 수 없다. 바람직한 유속은 2~3BV/h이다. 에틸 알콜 유속이 용출율에 대한 영향은 도2에 나타났다.

3. 결정화 조건의 선별 실험:

비록 칼럼 통과, 추출후의 추출물 중의 징코라이드의 함량이 증가되었고 플라본류 물질도 효과적으로 분리되었지만 징코라이드의 함량은 아직 주사제제의 요구에 도달할 수 없기에 추가로 결정화하여 정제하여야 한다. 징코라이드가 에틸 알콜, 에틸 아세테이트 등 용매에서 잘 용해되지만 물, n-헥산 등 용매에서는 용해되지 않기에 오직 극성이 적합한 혼합 용매를 결정화 용매로 사용해야 한다.

1) 30%v/v 에틸 알콜 용매: 결정화하려는 추출물 10g을 취하여 각각 4, 6, 8, 10배 양의 30% 에틸 알콜을 첨가하고 가열하여 용해시킨다. 저온(0~6℃)에서 방치한 후 여과시켜 감압건조하여 결정의 중량을 각각 측정한다. 실험결과는 하기 표3과 같다.

30% 에틸 알콜 결정 실험결과

용매 첨가량(배)	4	6	8	10
가열 용해 상황	미완전 용해	완전 용해	완전 용해	완전 용해
결정량(g)	3.8	4.5	4.2	2.4

결정화시킬 때 5~8배 양의 30% 에틸 알콜을 첨가하는 것이 비교적 바람직하고 석출된 결정이 비교적 많다.

2) n-헥산-에틸 아세테이트(8:1) 용매: 결정화하려는 추출물 10g을 취하여 각각 4, 6, 8, 10배 양의n-헥산-에틸 아세테이트(8:1)을 첨가하고 가열하여 용해시킨다. 저온(0~6℃)에서 방치한 후 여과시켜 감압건조하여 결정의 중량을 각각 측정한다. 실험결과는 하기 표4와 같다.

n-헥산-에틸 아세테이트 혼합 용매 결정 실험결과

용매 첨가량(배)	4	6	8	10
가열 용해 상황	완전 용해	완전 용해	완전 용해	완전 용해
결정량(g)	2.3	3.5	3.8	3.2

n-헥산-에틸 아세테이트 혼합 용매의 결정 석출량은 30% 에틸 알콜 용매의 결정 석출량보다 적다.

3) 10%v/v 에틸 아세테이트 용매: 결정화하려는 추출물 10g을 취하여 각각 4, 6, 8, 10배 양의 10%v/v 에틸 아세테이트 용매를 첨가하고 가열하여 용해시킨다. 저온(0~6℃)에서 방치한 후 여과시켜 감압건조하여 결정의 중량을 각각 측정한다. 실험결과는 하기 표5와 같다.

10%v/v 에틸 아세테이트 결정 실험결과

용매 첨가량(배)	4	6	8	10
가열 용해 상황	미완전 용해	완전 용해	완전 용해	완전 용해
결정량(g)	2.3	3.5	3.3	2.2

10%의 에틸 아세테이트의 결정 석출량은 30% 에틸 알콜 용매의 결정 석출량보다 적다.

실험결과에 의하면 결정 용매는 5~8배 양의 30% 에틸 알콜을 선택하는 것이 바람직하다.

하기는 본 발명에 따른 방법으로 징코라이드를 제조하는 실례이다.

실시예1

은행잎 조제(粗制) 분말 50kg에 65%에틸 알콜을 첨가하고 가열하여 매번 1.5시간동안 3번(10, 8, 6배 양) 환류 추출을 진행한 후 추출액을 한데 모아 여과시키고 감암농축시키며 0.05%의 메티오닌을 첨가하여 교반 용해하고 구연산 용액을 사용하여 pH가 4~5가 되도록 조절한 다음 계속 농축시켜 저온에서 방치하고 여과시킨다. 먼저 등량의 n-헥산으로 추출한 다음 등량의 에틸 아세테이트로 추출하고 마지막에 물포화 2-부틸 알콜-에틸 아세테이트 혼합용매로 추출하며 폴리아미드(30~60메쉬) 수지 칼럼을 통과시킨 다음 먼저 물로 용출시키고 계속해서 30% 에틸 알콜로 용출시키며 다음으로 70% 에틸 알콜로 용출시킨 후 용출액을 한데 모아 감압농축시킨다. 2~3배 양의 비등한 물에 첨가시키고 교반 및 용해시켜 방치하여 냉각시킨 후 에틸 아세테이트로 추출하고 감압농축시켜 에틸 알콜을 첨가하여 가열하고 교반 용해시킨 다음 여과하고 냉각되도록 방치하여 결정을 석출시키고 여과하여 건조시켜 결정I를 얻는다(주로 빌로발라이드와 징코라이드B이다). 여과액을 계속 농축시키고 에틸 알콜이 30%까지 되도록 첨가시키며 방치하여 결정을 석출시키고 여과하며 건조시켜 결정II를 얻는다(주로 징코라이드A, B, C이다). 여과액에 약용 탄소를 첨가하고 교반흡착시키고 여과하며 농축하고 냉각되도록 방치하여 결정을 석출시키며 여과하여 건조시켜 결정III을 얻는다(주로 징코라이드A와B이다). 여과액을 농축시켜 약용탄-실리카 겔(1:1) 칼럼을 통과시키고 먼저 2배양의 30% 에틸 알콜로 용출시킨 다음 4배 양의 70%에틸 알콜로 용출시키며 용출액을 수집하고 농축시켜 30%가 되도록 에틸 알콜을 첨가한 후 냉각되도록 방치하여 결정을 석출시키고 여과하며 건조시켜 결정IV를 얻는다. 결정을 균일하게 혼합한 후 징코라이드 91.6g을 얻고 HPLC 함량은 97.2%이며 그중에서 빌로발라이드(C₁₅H₁₈O₈)는 42.5%이고, 징코라이드A(C₂₀H₂₄O₉) 는 25.4%이며, 징코라이드B(C₂₀H₂₄O₁₀)는 18.7%이고, 징코라이드C(C₂₀H₂₄O₁₁)는10.6%이다.

실시예2

은행잎 조제(粗制) 분말 200kg에 6배 양의 80%에틸 알콜을 첨가하고 가열하여 매번 1.5시간동안 3번 환류 추출을 진행한 후 추출액을 한데 모아 여과시키고 여과액을 알콜 냄새가 없을 때까지 감압시켜 에틸 알콜을 회수한 다음 0.05%의 메티오닌을 첨가하여 교반 용해하고 구연산 용액을 사용하여 pH가 4~5가 되도록 조절한 다음 계속 농축시켜 저온에서 방치하고 여과시킨다. 먼저 n-헥산으로 추출한 다음 에틸 아세테이트로 추출하고 마지막에 물포화 2-부틸 알콜-에틸 아세테이트 혼합용매로 추출하며 폴리아미드(30~60메쉬) 수지 칼럼을 통과시킨 다음 먼저 30% 에틸 알콜로 용출시킨 다음 70% 에틸 알콜로 용출시킨 후 용출액을 한데 모아 감압농축시킨다. 비등한 물에 첨가시키고 교반 및 용해시켜 방치하여 냉각시킨 후 에틸 아세테이트로 추출하고 감압농축시켜 에틸 알콜을 첨가하여 가열하고 교반 용해시킨 다음 여과하고 냉각되도록 방치하여 결정을 석출시키고 여과하여 건조시켜 결정I를 얻는다(주로 빌로발라이드와 징코라이드B이다). 여과액을 계속 농축시키고 에틸 알콜을 첨가시키며 방치하여 결정을 석출시키고 여과하며 건조시켜 결정II를 얻는다(주로 징코라이드A, B, C이다). 여과액에 약용 탄소를 첨가하고 교반흡착시키고 여과하며 농축하고 에틸 알콜을 첨가하며 냉각되도록 방치하여 결정을 석출시키며 여과하여 건조시켜 결정III을 얻는다(주로 징코라이드A와B이다). 여과액을 농축시켜 약용탄-실리카 겔(1:1) 칼럼을 통과시키고 먼저 2배양의 30% 에틸 알콜로 용출시킨 다음 4배 양의 70%에틸 알콜로 용출시키며 용출액을 수집하고 농축시켜 30%가 되도록 에틸 알콜을 첨가한 후 냉각되도록 방치하여 결정을 석출시키고 여과하며 건조시켜 결정IV를 얻는다. 결정을 균일하게 혼합한 후 징코라이드 362.8g을 얻고 HPLC 함량은 96.8%이며 그중에서 빌로발라이드(C₁₅H₁₈O₈)는 31.2%이고, 징코라이드A(C₂₀H₂₄O₉) 는 28.8%이며, 징코라이드B(C₂₀H₂₄O₁₀)는 28.2%이고, 징코라이드C(C₂₀H₂₄O₁₁)는 8.6%이다.

실시예3

은행잎 조제(粗制) 분말 200kg에 8배 양의 75%에틸 알콜을 첨가하고 가열하여 매번 1.5시간동안 3번 환류 추출을 진행한 후 추출액을 한데 모아 여과시키고 여과액을 알콜 냄새가 없을 때까지 감압시켜 에틸 알콜을 회수한 다음 0.05%의 메티오닌을 첨가하여 교반 용해하고 구연산 용액을 사용하여 pH가 4~5가 되도록 조절한 다음 계속 농축시켜 저온에서 방치하고 여과시킨다. 먼저 n-헥산으로 추출한 다음 에틸 아세테이트로 추출하고 마지막에 물포화 2-부틸 알콜-에틸 아세테이트 혼합용매로 추출하며 폴리아미드(30~60메쉬) 수지 칼럼을 통과시킨 다음 먼저 30% 에틸 알콜로 용출시킨 다음 75% 에틸 알콜로 용출시킨 후 용출액을 한데 모아 감압농축시킨다. 비등한 물에 첨가시키고 교반 및 용해시켜 방치하여 냉각시킨 후 에틸 아세테이트로 추출하고 감압농축시켜 에틸 알콜을 첨가하여 가열하고 교반 용해시킨 다음 여과하고 냉각되도록 방치하여 결정을 석출시키고 여과하여 건조시켜 결정I를 얻는다(주로 빌로발라이드와 징코라이드B이다). 여과액을 계속 농축시키고 에틸 알콜을 첨가시키며 방치하여 결정을 석출시키고 여과하며 건조시켜 결정II를 얻는다(주로 징코라이드A, B, C이다). 여과액에 약용 탄소를 첨가하고 교반흡착시키고 여과하며 농축하고 에틸 알콜을 첨가하며 냉각되도록 방치하여 결정을 석출시키며 여과하여 건조시켜 결정III을 얻는다(주로 징코라이드A와B이다). 여과액을 농축시켜 약용탄-실리카 겔(1:1) 칼럼을 통과시키고 60%에틸 알콜로 용출시키며 용출액을 수집하고 농축시켜 냉각되도록 방치하여 결정을 석출시키고 여과하며 건조시켜 결정IV를 얻는다. 결정을 균일하게 혼합한 후 징코라이드 375.5g을 얻고 HPLC 함량은 97.1%이며 그중에서 빌로발라이드(C₁₅H₁₈O₈)는 35.8%이고, 징코라이드A(C₂₀H₂₄O₉) 는 28.5%이며, 징코라이드B(C₂₀H₂₄O₁₀)는 26.2%이고, 징코라이드C(C₂₀H₂₄O₁₁)는 6.6%이다.

실시예4

은행잎 조제(粗制) 분말 200kg에 10배 양의 75%에틸 알콜을 첨가하고 가열하여 매번 1.5시간동안 3번 환류 추출을 진행한 후 추출액을 한데 모아 여과시키고 여과액을 알콜 냄새가 없을 때까지 감압시켜 에틸 알콜을 회수한 다음 0.05%의 메티오닌을 첨가하여 교반 용해하고 구연산 용액을 사용하여 pH가 4~5가 되도록 조절한 다음 계속 농축시켜 저온에서 방치하고 여과시킨다. 먼저 n-헥산으로 추출한 다음 에틸 아세테이트로 추출하고 마지막에 물포화 2-부틸 알콜-에틸 아세테이트 혼합용매로 추출하며 폴리아미드(30~60메쉬) 수지 칼럼을 통과시킨 다음 먼저 25% 에틸 알콜로 용출시킨 다음 65% 에틸 알콜로 용출시킨 후 용출액을 한데 모아 감압농축시킨다. 비등한 물에 첨가시키고 교반 및 용해시켜 방치하여 냉각시킨 후 에틸 아세테이트로 추출하고 감압농축시켜 50%에틸 알콜을 첨가하여 가열하고 교반 용해시킨 다음 여과하고 냉각되도록 방치하여 결정을 석출시키고 여과하여 건조시켜 결정I를 얻는다(주로 빌로발라이드와 징코라이드B이다). 여과액을 계속 농축시키고 에틸 알콜을 첨가시키며 방치하여 결정을 석출시키고 여과하며 건조시켜 결정II를 얻는다(주로 징코라이드A, B, C이다). 여과액에 약용 탄소를 첨가하고 교반흡착시키고 여과하며 농축하고 냉각되도록 방치하여 결정을 석출시키며 여과하여 건조시켜 결정III을 얻는다(주로 징코라이드A와B이다). 여과액을 농축시켜 약용탄-실리카 겔(1:1) 칼럼을 통과시키고 60% 에틸 알콜로 용출시킨 다음 용출액을 수집하고 농축시켜 냉각되도록 방치하여 결정을 석출시키고 여과하며 건조시켜 결정IV를 얻는다. 여과액을 농축시키고 냉각되도록 방치하며 결정을 석출시키고 여과하며 건조시켜 결정V를 얻는다. 결정을 균일하게 혼합한 후 징코라이드 362.2g을 얻고 HPLC 함량은 96.5%이며 그중에서 빌로발라이드(C₁₅H₁₈O₈)는 35.5%이고, 징코라이드A(C₂₀H₂₄O₉) 는 26.0%이며, 징코라이드B(C₂₀H₂₄O₁₀)는 26.2%이고, 징코라이드C(C₂₀H₂₄O₁₁)는 8.8%이다.

실시예5

은행잎 조제(粗制) 분말 200kg에 8배 양의 50%에틸 아세테이트를 첨가하고 가열하여 매번 1.5시간동안 3번 환류 추출을 진행한 후 추출액을 한데 모아 여과시키고 여과액을 감압시켜 에틸 아세테이트를 회수한 다음 0.05%의 메티오닌을 첨가하여 교반 용해하고 구연산 용액을 사용하여 pH가 4~5가 되도록 조절한 다음 계속 농축시켜 저온에서 방치하고 여과시킨다. 먼저 석유에테르로 추출한 다음 수상을 다시 에틸 아세테이트로 추출하고 마지막에 물포화 2-부틸 알콜-에틸 아세테이트 혼합용매로 추출하며 폴리아미드(30~60메쉬) 수지 칼럼을 통과시킨 다음 먼저 30% 에틸 알콜로 용출시킨 다음 75% 에틸 알콜로 용출시킨 후 용출액을 한데 모아 감압농축시킨다. 비등한 물에 첨가시키고 교반 및 용해시켜 방치하여 냉각시킨 후 아세톤으로 추출하고 건조될 때까지 감압농축시켜 50%에틸 알콜을 첨가하여 가열하고 교반 용해시킨 다음 여과하고 냉각되도록 방치하여 결정을 석출시키고 여과하여 건조시켜 결정I를 얻는다(주로 빌로발라이드와 징코라이드B이다). 여과액을 계속 농축시키고 에틸 알콜을 첨가시키며 방치하여 결정을 석출시키고 여과하며 건조시켜 결정II를 얻는다(주로 징코라이드A, B, C이다). 여과액에 약용 탄소를 첨가하고 교반흡착시키고 여과하며 농축하고 냉각되도록 방치하여 결정을 석출시키며 여과하여 건조시켜 결정III을 얻는다(주로 징코라이드A와B이다). 여과액을 농축시켜 약용탄-실리카 겔(1:1) 칼럼을 통과시키고 60% 에틸 알콜로 용출시킨 다음 용출액을 수집하고 농축시켜 냉각되도록 방치하여 결정을 석출시키고 여과하며 건조시켜 결정IV를 얻는다. 결정을 균일하게 혼합한 후 징코라이드 350.6g을 얻고 HPLC 함량은 97.4%이며 그중에서 빌로발라이드(C₁₅H₁₈O₈)는 40.0%이고, 징코라이드A(C₂₀H₂₄O₉) 는 22.5%이며, 징코라이드B(C₂₀H₂₄O₁₀)는 27.2%이고, 징코라이드 C(C₂₀H₂₄O₁₁)는 10.3%이다.

실시예6

은행잎 조제(粗制) 분말 200kg에 8배 양의 50% 아세톤을 첨가하고 가열하여 매번 1.5시간동안 3번 환류 추출을 진행한 후 추출액을 한데 모아 여과시키고 여과액을 감압시켜 아세톤을 회수한 다음 0.05%의 메티오닌을 첨가하여 교반 용해하고 구연산 용액을 사용하여 pH가 4~5가 되도록 조절한 다음 계속 농축시켜 저온에서 방치하고 여과시킨다. 먼저 석유에테르로 추출한 다음 수상을 다시 에틸 아세테이트로 추출하고 마지막에 물포화 2-부틸 알콜-에틸 아세테이트 혼합용매로 추출하며 폴리아미드(30~60메쉬) 수지 칼럼을 통과시킨 다음 먼저 30% 에틸 알콜로 용출시킨 다음 70% 에틸 알콜로 용출시킨 후 용출액을 한데 모아 감압농축시킨다. 비등한 물에 첨가시키고 교반 및 용해시켜 방치하여 냉각시킨 후 에틸 아세테이트로 추출하고 건조될 때까지 감압농축시켜 30%에틸 알콜을 첨가하여 가열하고 교반 용해시킨 다음 여과하고 냉각되도록 방치하여 결정을 석출시키고 여과하여 건조시켜 결정I를 얻는다(주로 빌로발라이드와 징코라이드B이다). 여과액을 계속 농축시키고 에틸 알콜을 첨가시키며 방치하여 결정을 석출시키고 여과하며 건조시켜 결정II를 얻는다(주로 징코라이드A, B, C이다). 여과액에 약용 탄소를 첨가하고 교반흡착시키고 여과하며 농축하고 에틸 알콜을 첨가하며 냉각되도록 방치하여 결정을 석출시키고 여과하여 건조시켜 결정III을 얻는다(주로 징코라이드A와B이다). 여과액을 농축시켜 약용탄-실리카 겔(1:1) 칼럼을 통과시키고 60% 에틸 알콜로 용출시킨 다음 용출액을 수집하고 농축시켜 냉각되도록 방치하여 결정을 석출시키고 여과하며 건조시켜 결정IV를 얻는다. 여과액을 농축시키고 냉각되도록 방치하며 결정을 석출시키고 여과하며 건조시켜 결정V를 얻는다.결정을 균일하게 혼합한 후 징코라이드 343.5g을 얻고 HPLC 함량은 96.2%이며 그중에서 빌로발라이드(C₁₅H₁₈O₈)는 38.2%이고, 징코라이드A(C₂₀H₂₄O₉) 는 28.3%이며, 징코라이드B(C₂₀H₂₄O₁₀)는 24.2%이고, 징코라이드 C(C₂₀H₂₄O₁₁)는 9.3%이다.

실시예7

은행잎 조제(粗制) 분말 200kg에 8배 양의 70% 에틸 알콜을 첨가하고 약간 비등될 때까지 가열시켜 매번 1.5시간동안 3번 달임 추출을 진행한 후 추출액을 한데 모아 여과시키고 여과액을 감압시켜 에틸 알콜을 회수한 다음 0.05%의 메티오닌을 첨가하여 교반 용해하고 구연산 용액을 사용하여 pH가 4~5가 되도록 조절한 다음 계속 농축시켜 저온에서 방치하고 여과시킨다. 먼저 석유에테르로 추출한 다음 수상을 다시 에틸 아세테이트로 추출하고 마지막에 물포화 2-부틸 알콜-에틸 아세테이트 혼합용매로 추출하며 폴리아미드(30~60메쉬) 수지 칼럼을 통과시킨 다음 먼저 30% 에틸 알콜로 용출시킨 다음 70% 에틸 알콜로 용출시킨 후 용출액을 한데 모아 감압농축시킨다. 비등한 물에 첨가시키고 교반 및 용해시켜 방치하여 냉각시킨 후 에틸 아세테이트로 추출하고 건조될 때까지 감압농축시켜 30%에틸 알콜을 첨가하여 가열하고 교반 용해시킨 다음 여과하고 냉각되도록 방치하여 결정을 석출시키고 여과하여 건조시켜 결정I를 얻는다(주로 빌로발라이드와 징코라이드B이다). 여과액을 계속 농축시키고 에틸 알콜을 첨가시키며 방치하여 결정을 석출시키고 여과하며 건조시켜 결정II를 얻는다(주로 징코라이드A, B, C이다). 여과액에 약용 탄소를 첨가하고 교반흡착시키고 여과하며 농축하고 에틸 알콜을 첨가하며 냉각되도록 방치하여 결정을 석출시키고 여과하여 건조시켜 결정III을 얻는다(주로 징코라이드A와B이다). 여과액을 농축시켜 약용탄-실리카 겔(1:1) 칼럼을 통과시키고 60% 에틸 알콜로 용출시킨 다음 용출액을 수집하고 농축시켜 냉각되도록 방치하여 결정을 석출시키고 여과하며 건조시켜 결정IV를 얻는다. 여과액을 농축시키고 냉각되도록 방치하며 결정을 석출시키고 여과하며 건조시켜 결정V를 얻는다.결정을 균일하게 혼합한 후 징코라이드 362.6g을 얻고 HPLC 함량은 97.4%이며 그중에서 빌로발라이드(C₁₅H₁₈O₈)는 36.5%이고, 징코라이드A(C₂₀H₂₄O₉) 는 25.3%이며, 징코라이드B(C₂₀H₂₄O₁₀)는 28.2%이고, 징코라이드 C(C₂₀H₂₄O₁₁)는 7.4%이다.

상기 내용을 종합하면 알 수 있다시피 본 발명에 따른 추출 분리 정제 방법을 사용하면 순도가 비교적 높고 조성 성분이 상대적으로 고정된 징코라이드를 얻을 있다. 그중에는 빌로발라이드(C₁₅H₁₈O₈) 25.0%~50.0%, 징코라이드A(C₂₀H₂₄O₉) 20.0%~45.0%, 징코라이드B(C₂₀H₂₄O₁₀) 10.0%~30.0%, 징코라이드C(C₂₀H₂₄O₁₁) 5.0%~15.0%가 포함되어 있고 빌로발라이드, 징코라이드A, 징코라이드B, 징코라이드C의 총량은 95%보다 크다.

본 발명에 따른 징코라이드의 각 항목의 검측 방법 및 검측 결과는 다음과 같다.

b) 수분: 60℃에서 감압건조시킨 후 손실된 중량은 5.0%보다 작다.

c) 단백질: 595nm 파장하에서의 흡광도는 0.05보다 작다.

본 발명의 징코라이드 24mg을 취하고 에틸 알콜 2ml을 첨가하여 용해시킨 후 50ml까지 물을 첨가하여 희석시켜 테스트 용액으로 사용한다. 쿠마시브릴리언트블루(Bradford)법에 따라 측정하고 대응된 시약을 공백(blank)로 하고 595nm의 파장하에서의 흡광도는 0.05보다 작다.

d) 탄닌, 수지, 옥살산염, 칼륨 이온

사용할 수 있는 검측 방법은 하기와 같다.

탄닌: 단백질 검사 항목 테스트 용액 1ml을 취하고 희초산 한방울을 첨가한 다음 젤라틴 염화나트륨 시약을 다섯방울 첨가하여 균일하게 흔든 후 10분간 동안 방치한 후 혼탁하거나 침전의 현상이 나타나지 않았다.

수지: 단백질 검사 항목 테스트 용액 5ml을 취하고 염산 한방울을 첨가한 다음 30분간 동안 방치한 후 수지상의 물질이 석출되지 않았다.

옥살산염: 단백질 검사 항목 테스트 용액 2ml을 취하고 pH가 1~2가 될 때까지 희염산으로 조절하고 여과한 다음 여과액을 암모니아수로 pH가 5~6이 될 때까지 조절한 후 3%의 염화칼슘 용액 세방울 첨가하여 10분간 동안 방치한 후 혼탁하거나 침전의 현상이 나타나지 않았다.

칼륨 이온: 단백질 검사 항목 테스트 용액 2ml을 취하여 10ml인 네슬러 관에 방치하고 염기성 포름알데히드 용액 0.6ml, 3%EDTA 용액 두방울, 3% 나트륨 테트라페닐 붕산염 0.5ml을 첨가하고 10ml이 될 때까지 물을 가하여 희석한 후 별도로 염화칼륨 표준 용액 0.8ml을 취하여 같은 방법으로 실험을 진행한 결과, 테스트 용액의 혼탁도는 대조 용액보다 높지 않다.

결과: 탄닌, 수지, 옥살산염, 칼륨이온을 검출해 내지 못하였다.

e) 잔류 용매

1) 에틸 알콜, 에틸 아세테이트와 n-헥산: 에틸 알콜과 에틸 아세테이트의 함량이 모두 0.5%보다 작고 n-헥산 함량이 0.029%보다 작다.

2) 수지 잔류량: 카프로락탐 함량은 0.0015%보다 작다.

f) 총 징콜릭애시드: 총 징콜릭애시드 함량은 5ppm보다 작다.

측정방법:

1) 겔 크로마토그래피법 크로마토그래피 칼럼:Phenomenex BioSep-SEC-S2000,300x7.8mm, 5um, 이동상:0.71%(0.02%의 아지드 나트륨이 포함되어 있음)의 황산나트륨 용액, 칼럼 온도: 35℃, 유속: 0.5ml/min. 결과: 잔류한 큰 분자와 중합체가 없다.

2) HPLC-MS 연합용법 이동상: 메틸 알콜-물(90:10), 크로마토그래피 칼럼: Agilent RX-C₁₈(2.1 x50mm), 칼럼 온도: 25℃, 유속: 0.3ml/min. 결과: 분자량이 1000보다 큰 큰분자와 중합체가 없다.

h) 중금속: 10ppm보다 작다.

i) 비소 염: 2ppm보다 작다.

테스트 용액의 제조: 본 발명의 징코라이드 25mg을 취하고 에틸 알콜 2ml로 용해시킨 후 염화나트륨 주사액을 첨가하여 0.2mg/ml의 용액으로 제조한다.

검사법: 체중이 17~20g인 마우스 다섯 마리를 선택하여 마우스의 꼬리 부분의 정맥에 테스트 용액 0.5ml을 주사한 후 48시간 동안에 사망이 없다.

l) 핑거 프린트: HPLC법으로 측정하고 60분간의 크로마토그램을 기록한다.한약 크로마토그래피 핑거 프린트 유사도 평가 시스템에 따르면 4개의 공유 피크의 유사도는 0.95보다 크다.

m) 함량: HPLC법으로 측정하고 건조품에 따라 계산하면 빌로발라이드(C₁₅H₁₈O₈)는 25.0%~50.0%여야 하고, 징코라이드A(C₂₀H₂₄O₉)는 20.0%~45.0%여야 하며, 징코라이드B(C₂₀H₂₄O₁₀)는 10.0%~30.0%여야 하고, 징코라이드C(C₂₀H₂₄O₁₁)는 5.0%~15.0%여야 하며 빌로발라이드, 징코라이드A, 징코라이드B, 징코라이드C의 총량은 95%보다 크다

l) 핑거 프린트와 m)함량 측정이 사용한 검측방법은 같으며 조건은 다음과 같다. 옥타데실 실란 결합 실리카 겔을 충전제로 사용하고 메틸 알콜-테트라히드로푸란-물(25:10:65)을 이동상으로 하며, ELSD를 사용하고 드리프트 관의 온도는 105℃이며 유량(flow rate)은 3.00L/min이고 칼럼 온도는 40℃이며 이론적 패널 수는 빌로발라이드의 피크에 따라 계산하면 2500이상이어야 한다. 빌로발라이드 피크와 징코라이드C 피크의 분리도는 1.5보다 커야 한다.

n) 열원의 검사: 체온의 상승은 0.6℃보다 낮아야 한다.

테스트 용액의 제조: 본 발명에 따른 징코라이드 20mg을 정밀하게 취하여 에틸 알콜 2ml을 첨가하여 용해시킨 후 0.9%의 염화나트륨 주사액100ml에 첨가한다.

검사법, 가정 양식 토끼 3마리를 선택하여 정상 체온을 측정한 후 15분간 내에 토끼 체중 1kg/5ml의 양으로 귀 정맥에 테스트 용액을 완만히 주사하고 30분간 마다 체온을 1번 측정하여 총 6번 측정한다. 체온의 상승은 모두 0.6℃보다 낮아야 하며 3마리 토끼의 체온이 상승한 총 합은 1.3℃보다 낮아야 한다.

본 발명의 기술적 효과를 증명하기 위하여 발명자는 상기 발명내용에 대해 큰 분자 및 중합체의 측정 연구와 설명을 진행하였다. 하기 실험은 본 발명을 추가로 설명하고 해석하기 위한 것이고 본 발명은 이에 한정되지 않는다.

1 실험기기 및 시약

Agilent 1200형 HPLC, 자외선 검측기, 시차 굴절 검측기.

Phenomenex BioSep-SEC-S2000 겔 PW 칼럼.

덱스트란 대조품D2000(남색 글루칸 2000), 중국식품약품검측연구원 번호 140646-2000-01.

포도당 대조품(D0), 함량: 99.5%, 번호 086K0166, SIGMA.

초순수용Millipore-Q 초순수 계통으로 제조되었다.

기타 시약은 analytically pure이다.

2 이동상의 선택

0.71%(0.02%의 아지드 나트륨이 포함되어 있음)의 황산나트륨 용액을 이동상으로 사용한다.

3 검측기의 선택

통용형 검측기 시차 굴절 검측기(differential refraction detector)를 선택하고 상기 검측기는 굴절 계수의 차이가 존재하는 물질에 대해 모두 우수한 반응이 있다.

4 확정하려는 크로마토그래피 조건

크로마토그래피 칼럼: Phenomenex BioSep-SEC-S2000, 300x7.8mm, 5㎛

이동상: 0.71% (0.02%의 아지드 나트륨이 포함되어 있음)의 황산나트륨 용액

칼럼 온도: 35℃，검측기 온도: 35℃, 유속: 0.5/ml/min

5 징코라이드 각 성분의 분자량

6) 방법학 연구

(1) 덱스트란과 포도당 대조품을 각각 이동상을 첨가하여 10mg/ml의 용액으로 만든 후 대조품 용액을 각각 20㎕ 정밀하게 취하여 크로마토그래프에 투입하고 크로마토그램을 기록한다. 결과, 덱스트란은 보류시간 9.816'에 피크가 나타났고 포도당은 보류시간 18.712'에 피크가 나타났다. 이는 겔 크로마토그래피법을 사용하면 분자량이 큰 물질이 먼저 피크가 나타나고 분자량이 작은 물질이 후에 피크가 나타나는 것을 표명한다.

(2) 본 발명에 따른 징코라이드 10mg을 취하여 에틸 알콜 2ml을 첨가하여 용해시킨 후 덱스트란 대조품 용액(10mg/ml)1ml을 첨가하여 균일하게 혼합한 후 정밀하게 10㎕를 취하여 크로마토그래프에 투입하고 크로마토그램을 기록한다. 결과, 보류시간 9.698'에 덱스트란을 검출해 냈고 징코라이드 주사액 성분의 피크는 모두 18min이후에 나타났으며 이는 분자량이 180-450인 물질의 피크가 나타나는 시간은 18min 정도이고 분자량이 5000-2000000인 물질의 피크가 나타나는 시간은 9min 정도이며 겔 크로마토그래피법으로 큰 분자 물질을 검측할 수 있다는 것을 표명한다.

본 제품에 큰 분자 및 중합체가 존재하지 않는 것을 재차 검증하기 위하여 LC-MS실험을 진행하였다.

크로마토그래피 조건: 메틸 알콜-물(90:10)을 이동상으로 사용하고 Agilent RX-C₁₈(2.1x50mm) 크로마토그래피 칼럼을 사용하며 칼럼 온도는 25℃이고 유속은 0.3ml/min이다.

테스트 용액의 제조: 본 발명에 따른 징코라이드 10mg을 정밀하게 취하여 메스 플라스크에 넣어 적당한 량의 1% 초산을 첨가하여 용해시키고 이동상을 넣어 눈금치까지 희석시키고 균일되도록 흔든 후 테스트 용액으로 사용한다.

LC-MS 연합 사용 테스트: 확정된 실험방법에 따라 테스트 용액을 각각 10㎕을 취하고 400~1000 및 400~3000의 분자량 범위내에서 각각 테스트를 진행하고 크로마토그램을 기록한다. 실험결과는 하기 표6에 나타났다.

LC-MS연합사용 분자량 측정 결과

[M+Na]⁺	M
419.1,431.5,447.4,463.3,475.7,532.2,588.8,701.8	396.1,408.5,424.4,440..3,452.7,509.2,678.8

LC-MS 연합 사용 분자량 측정 결과로부터 보면 가각 징크로이드A(분자량 408.5), 징코라이드B(분자량 424.4), 징코라이드C(분자량 440.4)를 검출해 냈고 본 발명의 징코라이드의 유효성분과 완전히 일치되고 테스트한 분자량의 범위가 400-3000사이에 있으므로 빌로발라이드에 대해서는 테스트를 진행하지 않았다. 본 발명의 징코라이드에서 분자량이 700이상인 물질을 검출해 내지 못하였고 기타 부동한 분자량의 물질은 기타 잡질일 가능성이 있다. LC-MS를 이용하여 징코라이드 중의 부동한 성분의 분자량에 대해 테스트를 진행하는 것은 본 제품에 큰 분자 또는 중합체가 포함되지 않는 것을 설명한다. 징코라이드LC-MS의 스펙트럼은 도면 3과 도면4를 참조하면 된다.

실시예8

징코라이드 질량 제어=총 징콜릭 애시드의 검사

크로마토그래피 조건과 게통 적용성 실험: 옥타데실 실란 결합 실리카 겔을 충전제로 사용하고 메틸 알콜-1% 빙초산(90:10)을 이동상으로 하며, 유속은 1.0ml/min이고 검측 파장은 310nm이다. 이론적 패널수는 징콜릭애시드 피크로 계산하면 4000이상이어야 한다.

대조품 용액의 제조: 적당한 량의 징콜릭 애시드 대조품을 취하여 정밀하게 측정한 후 메틸 알콜를 첨가하여 1ml에 5㎍을 포함한 용액으로 제조하여 대조품 용액으로 사용한다. 별도로 적당한 량의 총 징콜릭 애시드 대조품을 취하여 정밀하게 측정한 후 메틸 알콜를 첨가하여 1ml에 100㎍을 포함한 용액으로 제조하여 위치를 정하기 위한 대조 용액으로 사용한다.

테스트 용액의 제조: 본 발명에 따른 징코라이드 5g을 취하여 정밀하게 측정한 후 플라스크에 넣어 n-헥산 50ml을 첨가하여 2시간동안 가열 환류시킨 다음 꺼내어 냉각되도록 방치하고 여과한 다음 잔사는 다시 소량의 n-헥산으로 세척하고 여과액과 세척액을 한데 모아 수욕위에 방치하여 마르도록 증발을 진행한다. 잔사에 메틸 알콜을 넣어 용해시키고 2ml까지 희석하고 균일하게 흔든 후 테스트 용액으로 사용한다.

측정법: 테스트 용액, 대조품 용액 및 위치를 정하기 위한 대조 용액을 각각 20㎕ 정밀하게 취하고 액체 크로마토그래피에 주입한 후 테스트 용액 중에서 총 징콜릭 애시드 대조품과 대응된 크로마토그래피 피크의 총 피크 면적을 계산하고 징콜릭 애시드 대조품 외부표준법에 따라 총 징콜릭 애시드 함량을 측정한 결과 총 징콜릭 애시드의 함량은 5ppm보다 작다.

발명자는 본 발명의 기술효과를 증명하기 위해 상기 발명 내용에 대해 연구와 설명을 진행하였다. 하기 실험은 본 발명을 해석하고 설명하기 위한 것이고 본 발명은 이에 한정되지 않는다.

a 방법1

테스트 용액의 제조: 본 발명에 따른 징코라이드 5g을 취하여 정밀하게 측정한 후 플라스크에 넣어 석유에테르(60~90℃) 50ml을 정밀하게 첨가하여 2시간동안 환류시킨 다음 꺼내어 냉각되도록 방치하고 여과한 다음 잔사는 다시 소량의 석유에테르로 한번 세척하고 여과액과 세척액을 한데 모아 수욕위에 방치하여 마르도록 증발을 진행한다. 잔사에 메틸 알콜을 넣어 용해시키고 2ml까지 희석하고 균일하게 흔든 후 테스트 용액(1)으로 사용한다.

공백 샘풀 용액의 제조: 석유에테르(60~90℃) 50ml을 취하여 삼각 플라스크에 넣은 후 2시간 동안 환류를 진행하고 수욕위에 방치하여 마르도록 증발을 진행한다 잔사에 메틸 알콜을 첨가하여 용해시키고 2ml까지 희석하여 균일하게 흔든 후 공백 용액(1)로 사용한다.

b 방법2

테스트 용액의 제조: 본 발명에 따른 징코라이드 5g을 취하여 정밀하게 측정한 후 플라스크에 넣어 n-헥산 50ml을 정밀하게 첨가하여 2시간동안 환류시킨 다음 꺼내어 냉각되도록 방치하고 여과한 다음 잔사는 다시 소량의 n-헥산으로 한번 세척하고 여과액과 세척액을 한데 모아 수욕위에 방치하여 마르도록 증발을 진행한다. 잔사에 메틸 알콜을 넣어 용해시키고 2ml까지 희석하고 균일하게 흔든 후 테스트 용액(2)으로 사용한다.

공백 샘풀 용액의 제조: n-헥산50ml을 취하여 플라스크에 넣은 후 2시간 동안 환류를 진행하고 수욕위에 방치하여 마르도록 증발을 진행한다 잔사에 메틸 알콜을 첨가하여 용해시키고 2ml까지 희석하여 균일하게 흔든 후 공백 용액(2)로 사용한다.

측정법: 테스트 용액과 공백 용액을 각각 20㎕ 정밀하게 취하고 액체 크로마토그래피에 주입한 후 크로마토그램을 기록한다. 시험결과는 하기 표7에 나타났다.

실험결과는 하기 내용을 표명하였다. 방법1(석유에테르)를 사용하여 샘플을 제조하면 공백 용액 중에서 크로마토그래피 피크를 검출해 냈고 그의 피크 면적과 테스트 용액이 검출된 크로마토그래피 피크의 면적이 일치되고 이는 공백 실험의 간섭이 있는 것을 설명한다. 방법2(n-헥산)를 사용하여 샘플을 제조하면 공백 용액과 테스트 용액 중에서 모두 크로마토그래피 피크를 검출해 내지 못하였기에 발명자는 방법2를 사용하여 샘플 첨가 회수 실험을 진행하였고 이를 통하여 방법2의 가실시성을 검증하였다.

c 총 징콜릭 애시드의 샘플 첨가 회수 실험

테스트 용액의 제조: 본 발명에 따른 징코라이드 5g을 취하여 정밀하게 측정한 후 플라스크에 넣고 농도가 1.032mg/ml의 총 징콜릭 애시드 대조품 용액 0.2ml을 정밀하게 첨가한 다음 n-헥산 50ml을 정밀하게 첨가하고 2시간동안 환류시키고 냉각되도록 방치하며 여과한 다음 잔사는 다시 소량의 n-헥산으로 세척하고 여과액과 세척액을 한데 모아 수욕위에 방치하여 마르도록 증발을 진행한다. 잔사에 메틸 알콜을 넣어 용해시키고 2ml까지 희석하고 균일하게 흔든 후 테스트 용액으로 사용한다.

대조품 용액의 제조: 농도가 1.032mg/ml의 총 징콜릭 애시드 대조품 용액 0.2ml을 정밀하게 취하고 2ml의 메스 플라스크에 넣고 메틸 알콜을 첨가하여 눈금치까지 희석시키고 균일하게 흔든 후 대조품 용액으로 사용한다.

측정법: 테스트 용액과 대조품 용액을 각각 20㎍ 정밀하게 취하고 액체 크로마토그래피에 주입한 후 크로마토그램을 기록한다.

결과 : 테스트 용액이 총 징콜릭 애시드 대조품의 크로마토그래피와 대응된 위치에서 총 징콜릭 애시드 크로마토그래피 피크를 검출해 낼 수 있고 피크 면적으로부터 보면 테스트 용액과 대조품 용액의 피크 면적은 일치되며 이는 회수율이 비교적 좋다는 것을 설명한다. 실험결과는 표8에 나타났다.

d 재현성 실험

대조품 용액의 제조: 적당한 량의 징콜릭 애시드 대조품을 정밀하게 취한 후 메틸 알콜을 첨가하여 1ml에 5㎍을 포함하는 용액으로 제조한 후 대조품 용액으로 사용한다. 별도로 적당한 량의 총 징콜릭 애시드 대조품을 취하여 정밀하게 측정한 후 메틸 알콜을 첨가하여 1ml에 100㎍을 포함하는 용액으로 제조한 후 위치를 정하기 위한 대조 용액으로 사용한다.

테스트 용액의 제조: 본 발명에 따른 징코라이드 5g을 총 6군을 취하여 정밀하게 측정한 후 각각 플라스크에 넣어 n-헥산 50ml을 첨가하여 2시간동안 환류시킨 다음 냉각되도록 방치하고 여과한 다음 잔사는 소량의 n-헥산으로 세척하고 여과액과 세척액을 한데 모아 수욕위에 방치하여 마르도록 증발을 진행한다. 잔사에 메틸 알콜을 넣어 용해시키고 2ml까지 희석하며 균일하게 흔든 후 테스트 용액으로 사용한다.

측정법: 테스트 용액, 대조품 용액 및 위치를 정하기 위한 대조 용액을 각각 20㎕ 정밀하게 취하고 액체 크로마토그래피에 주입한 후 크로마토그램을 기록한다. 실험결과는 표9에 나타났다.

실험결과는 본 발명의 징코라이드 중에 징콜릭 애시드가 없는 것을 표명한다.

e 회수율 실험

테스트 용액의 제조: 본 발명에 따른 징코라이드 5g을 총 6군을 취하여 정밀하게 측정한 후 각각 플라스크에 넣은 후 징콜릭 애시드 대조품 용액 1.6ml, 2.0ml, 2.4ml을 각각 첨가한 다음 n-헥산 50ml을 각각 첨가하여 2시간동안 환류시킨 다음 냉각되도록 방치하고 여과한 다음 잔사는 소량의 n-헥산으로 세척하고 여과액과 세척액을 한데 모아 수욕위에 방치하여 마르도록 증발을 진행한다. 잔사에 메틸 알콜을 넣어 용해시키고 2ml까지 희석하며 균일하게 흔든 후 테스트 용액으로 사용한다.

대조품 용액의 제조: 재현성 실험에서의 대조품 용액과 같은 방법으로 제조한다.

측정법: 테스트 용액, 대조품 용액을 각각 20㎕ 정밀하게 취하고 액체 크로마토그래피에 주입한 후 크로마토그램을 기록한다. 매개 농도는 3번씩 측정하고 총 9번을 측정한다. 회수율과 RSD치를 계산한다. 실험결과는 표10에 나타났다.

실험결과는 회수율이 비교적 좋은 것을 표명한다.

실시예9

징코라이드 질량 제어- 핑거 프린트 검사: 옥타데실 실란 결합 실리카 겔을 충전제로 사용하고 메틸 알콜-테트라히드로푸란-물(25:10:65)를 이동상으로 하며, ELSD를 사용하고 드리프트 관의 온도는 105℃이며 유량(flow rate)은 3.00L/min이고 칼럼 온도는 40℃이며 이론적 패널 수는 빌로발라이드의 피크에 따라 계산하면 2500이상이어야 한다. 빌로발라이드 피크와 징코라이드C 피크의 분리도는 1.5보다 커야 한다.

참조물 용액의 제조: 적당한 량의 빌로발라이드 대조품 징코라이드A 대조품, 징코라이드B 대조품, 징코라이드C 대조품을 각각 정밀하게 취하고 메틸 알콜을 첨가하여 매 1ml에 각각 0.15mg, 0.12mg, 0.1mg, 0.1mg를 포함하는 혼합 용액으로 제조한 후 균일하게 흔들어 참조물 용액으로 사용한다.

테스트 용액의 제조: 본 발명의 징코라이드 6mg를 정밀하게 취하고 10ml의 메스 플라스크에 넣은 후 메틸 알콜 1ml을 넣어 용해시키고 이동상을 가하여 눈금치까지 희석하고 균일하게 흔들어 테스트 용액으로 사용한다.

측정법: 참조물 용액, 테스트 용액을 각각 20㎕ 정밀하게 취하고 액체 크로마토그래피에 주입한 후 60분간의 크로마토그램을 기록한다.

한약 크로마토그래피 핑거 프린트 유사도 평가 시스템에 따르면 테스트 제품 핑거 프린트와 대조 핑거 프린트의 유사도는 0.95보다 크다.

징코라이드 핑거 프린트 중에서 피크 2는 징코라이드C이고 피크3은 빌로발라이드이며 피크4는 징코라이드A이고 피크5은 징코라이드B이고 본 제품 중의 유효부위인 4개 특징 피크는 핑거 프린트에서 모두 일일이 대응될 수 있다. 징코라이드 대조 핑거 프린트는 도5와 같다.

우선 국가 약전 위원회 2004년 핑거 프린트 지정 소프트웨어-한약 크로마토그래피 핑거 프린트 유사도 평가 시스템A버전을 사용하여 10개 배치의 징코라이드에 대해 대조 핑거 프린트를 생성하고 부동한 배치의 테스트제품 핑거 프린트를 대조 핑거 프린트와 유사도 소프터웨어를 사용하여 유사도를 계산한다. 실험결과는 표11에 나타났다.

10개 배치의 징코라이드 핑거 프린트의 유사도는 모두 0.95보다 크다.

실시예10

징코라이드 질량 제어-잔류 용매의 측정

1) 에틸 알콜, 에틸 아세테이트와 n-헥산

테스트 용액의 제조: 본 발명의 징코라이드를 약 0.1g 취하고 정밀하게 측정한 후 정공병(Headspace병)에 넣은 후 N,N-디메틸포름아미드를 정밀하게 5ml을 첨가하여 용해시키고 밀봉하여 테스트 용액으로 사용한다.

대조품 용액의 제조: 적당한 량의 에틸 알콜, 에틸 아세테이트와 n-헥산을 취하여 정밀하게 측정하고 N,N-디메틸포름아미드으로 정량희석하여 매 1ml에 각각30㎍를 포함하는 용액으로 제조한 후 5ml을 정밀하게 취하여 정공병에 넣어 밀봉하여 대조품 용액으로 사용한다.

측정법: 6% 시아노프로필페닐-94% 디메틸폴리실록산(또는 극성이 접근한 것)을 고정액으로 사용하고 개시온도는 50℃이며 3분간 동안 유지시킨 후 매분간 40℃의 속도로 160℃까지 승온시키고 3분간 동안 유지한다. 주입구의 온도는 200℃이고 검측기 온도는 250℃이며 정공병의 펴형 온도는 80℃이고 평형 시간은 30분이다. 대조품 용액을headspace injection하여 각 성분의 피크사이의 분리도는 요구에 부합해야 하며 다음으로 테스트 용액과 대조품 용액을 취하여 각각 headspace injection한 후 크로마토그램을 기록하고 외부표준법에 따라 피크 면적으로 계산한다.

에틸 알콜과 에틸 아세테이트의 함량은 모두 0.5%보다 적고 n-헥산은 0.029%보다 작다.

2) 수지 잔류량

대조품 용액의 제조: 적당한 량의 N,N-디메틸아세트아미드를 취하고 정밀하게 측정한 후 물로 매 1ml에 0.1mg을 포함한 용액을 제조하여 균일하게 흔든 후 내표준 용액으로 사용한다. 적당한 량의 카프로락탐을 정밀하게 측정한 후 내표준 용액을 첨가하여 매 1ml에 약 37.5㎍의 카프로락탐을 포함하는 용액을 제조하여 대조품 용액으로 사용한다.

테스트 용액의 제조: 본 발명의 징코라이드 2.5g을 취하여 정밀하게 측정한 후 삼각 플라스크에 넣고 n-헥산 25ml을 첨가하여 2시간동안 환류한 후 꺼내어 냉각되도록 방치하고 여과한 다음 소량의 n-헥산으로 세척하고 여과액과 세척액을 한데 모아 60℃의 수욕에서 건조되도록 증발하고 잔사에 내표준 용액1ml을 첨가하여 용해시킨 후 테스트 용액으로 사용한다.

측정법: 폴리에틸렌글리콜(PEG-20M)(또는 극성이 비슷한 것)을 고정액으로 사용하고 개시온도는 100℃이며 2분간 동안 유지시킨 후 매분간 40℃의 속도로 160℃까지 승온시키고 3분간 동안 유지시킨 다음 40℃의 속도로 220℃까지 승온시키고 7분간 동안 유지시킨다. 주입구의 온도는 240℃이고 검측기 온도는 260℃이다. 대조품 용액과 테스트 용액을 각각 1㎕ 측정하여 취하고 액체 크로마토그래피에 주입한 후 크로마토그램을 기록한다. 내표준법에 따라 피크 면적으로 계산하고 테스트 용액 중의 카프로락탐 피크 면적과 내표준 피크 면적의 비례는 대조품 용액 중의 카프로락탐 피크 면적과 내표준 피크 면적의 비례보다 작다.

카프로락탐은 미검출되었다.

실시예11

징코라이드 질량 제어- 함량의 측정

크로마토그래피 조건과 게통 적용성 실험: 옥타데실 실란 결합 실리카 겔을 충전제로 사용하고 메틸 알콜-테트라히드로푸란-물(25:10:65)을 이동상으로 하며, ELSD를 사용하고 드리프트 관의 온도는 105℃이며 유량(flow rate)은 3.00L/min이고 칼럼 온도는 40℃이며 이론적 패널 수는 빌로발라이드의 피크에 따라 계산하면 2500이상이어야 한다. 빌로발라이드 피크와 징코라이드C 피크의 분리도는 1.5보다 커야 한다.

대조품 용액의 제조: 적당한 량의 빌로발라이드 대조품, 징코라이드A 대조품, 징코라이드B 대조품, 징코라이드C 대조품을 정밀하게 취하고 매 1ml에 각각 0.15mg, 0.12mg, 0.1mg, 0.1mg를 포함하는 혼합 용액으로 제조한 후 균일하게 흔들어 대조품 용액으로 사용한다.

측정법: 대조품 용액10㎕, 20㎕, 테스트 용액 10㎕~20㎕을 각각 정밀하게 취하고 HPLC에 주입한 후 크로마토그램을 기록한다. 외표준 이포인트법 로그 방정식으로 빌로발라이드, 징코라이드A, .징코라이드B와 징코라이드C의 함량을 각각 계산한다.

건조품으로 계산하면 빌로발라이드(C₁₅H₁₈O₈) 는 42.5%, 징코라이드A(C₂₀H₂₄O₉) 25.4%, 징코라이드B(C₂₀H₂₄O₁₀) 18.7%, 징코라이드C(C₂₀H₂₄O₁₁) 10.6%가 포함되어 있고 빌로발라이드, 징코라이드A, 징코라이드B, 징코라이드C의 총량은 97.2%이다.

실시예12

징코라이드 질량 제어-이상독성 검사

테스트 용액의 제조: 본 발명의 징코라이드를 취하여 염화나트륨 주사액을 첨가하여 1ml에 0.2mg이 포함되어 있는 용액을 제조한다.

검사법: 체중이 17-20g인 5마리의 마우스를 선택하고 마우스의 꼬리 부분 정맥에 테스트 용액을 각각 0.5ml 주사하여 48시간 동안에 사망이 없다.

실시예13

징코라이드 질량 제어- 열원 검사

테스트 용액의 제조: 본 발명의 징코라이드 10mg을 취하고 0.9%의 염화나트륨 주사액 50ml에 첨구하여 균일하게 흔든다.

검사법: 가정 양식 토끼 3마리를 취하여 그의 정상 체온을 측정한 후 15분간 내에 토끼 체중 1kg/5ml의 양으로 귀 정맥에 테스트 용액을 완만히 주사하고 30분간 마다 체온을 1번 측정하여 총 6번 측정한다. 체온의 상승은 모두 0.6℃보다 낮아야 하며 3마리 토끼의 체온이 상승한 총 합은 1.3℃보다 낮아야 한다.

실시예14

징코라이드 주사액 질량 제어- 물질 관련 검사

주사액 처방

징코라이드: 테르펜 락톤으로 계산하면 1-10mg/ml

글리세롤 0.2-0.5ml/ml

에틸 알콜 0.4-0.7ml/ml

주사용수 0-0.5ml/ml

제조방법은 a) 에틸 알콜과 글리세롤을 혼합하고 징코라이드를 첨구하여 용해시킨고 에틸 알콜 또는 주사용수를 전량까지 보충시킨 다음 5-10%의 구연산 용액 또는 1-10%의 염산 용액으로 pH를 2-3이 될 때까지 조절하는 조제단계; b) 여과제균 단계; c) 밀봉단계; d) 멸균단계를 포함한다.

1) 단백질: 징코라이드 주사액 2ml을 취하여 물을 첨가하여 50ml으로 제조한 후 테스트 용액으로 사용한다. 쿠마시브릴리언트블루G-250 약50mg을 취하여 25ml 에틸 알콜 중에 용해시킨 다음 85%(v/v) 의 인산 50ml을 첨가하고 물을 첨가하여 500ml까지 희석한 후 균일하게 흔들고 여과액을 5ml 정밀하게 측정한 후 시험관 중에 넣은 다음 1ml의 테스트 용액을 첨가하고 균일하게 흔든 후 3min 방치한다. 같은 방법으로 공백을 제조하여 595nm의 파장하에서 흡광도를 측정한 결과 테스트 용액의 흡광도는 0.05보다 작다.

2) 탄닌: 단백질 검사 항목 테스트 용액 1ml에 희초산 한방울을 첨가한 다음젤라틴 염화나트륨 시약을 다섯방울 첨가하여 균일하게 흔든 후 10분간 동안 방치한 후 혼탁하거나 침전의 현상이 나타나지 않았다.

3）수지: 단백질 검사 항목 테스트 용액 5ml을 취하고 염산 한방울을 첨가한 다음 30분간 동안 방치한 후 수지상의 물질이 석출되지 않았다.

4) 옥살산염: 단백질 검사 항목 테스트 용액 2ml을 취하고 pH가 1~2가 될 때까지 희염산으로 조절하고 여과한 다음 여과액을 암모니아수로 pH가 5~6이 될 때까지 조절한 후 3%의 염화칼슘 용액 세방울 첨가하여 10분간 동안 방치한 후 혼탁하거나 침전의 현상이 나타나지 않았다.

5) 칼륨 이온: 단백질 검사 항목 테스트 용액 2ml을 취하여 10ml인 네슬러 관에 방치하고 염기성 포름알데히드 용액 0.6ml, 3%EDTA 용액 두방울, 3% 나트륨 테트라페닐 붕산염 0.5ml을 첨가하고 10ml이 될 때까지 물을 가하여 희석한 후 별도로 염화칼륨 표준 용액 0.8ml을 취하여 같은 방법으로 실험을 진행한 결과, 테스트 용액의 혼탁도는 대조 용액보다 높지 않다.

실시예15

징코라이드 주사액 질량 제어-용혈과 응집 검사

테스트 용액의 제조: 징코라이드 주사액(실시예14의 방법에 따라 제조) 6ml을 0.9% 염화나트륨 주사액 100ml에 첨가하여 균일하게 흔든다.

검사법: 깨끗한 유리 시험관 5개를 준비하고 1, 2호 시험관을 테스트 제품관으로 정하고 3호 시험관을 음성 대조관으로 정하며 4호 시험관을 양성 대조관으로 정하고 5호 시험관을 테스트 제품 대조관으로 정한다. 표12에 따라 2%의 적혈구 현탁액, 0.9% 염화나트륨 용액, 증류수를 차례대로 첨가하고 균일하게 혼합한 후 즉시로 37℃±0.5℃의 인큐베이터에서 보육한다.

시험관 중의 용액이 밝은 홍색을 띄게 되면 I부분에 무세포 잔류 또는 소량의 적혈구 잔류가 있으며 이는 용혈 발생이 있는 것을 표명한다. 만약 적혈구가 전부 밑으로 침전하게 되면 상등액은 무색 투명하거나 상등액이 유색 투명하지만 1, 2호관과 5호관을 육안으로 관찰하면 뚜렷한 차이가 없게 되면 이는 용혈 발생이 없는 것을 표명한다. 3시간 후에 관찰한 결과 용혈과 응집 반응이 발생되지 않았다.

실시예16

징코라이드 주사액 질량 제어-핑거 프린트 검사

크로마토그래피 조건과 게통 적용성 실험: 옥타데실 실란 결합 실리카 겔을 충전제로 사용하고 메틸 알콜-테트라히드로푸란-물(25:10:65)를 이동상으로 하며, ELSD를 사용하고 드리프트 관의 온도는 105℃이며 유량(flow rate)은 3.00L/min이고 칼럼 온도는 40℃이며 이론적 패널 수는 빌로발라이드의 피크에 따라 계산하면 2500이상이어야 한다. 빌로발라이드 피크와 징코라이드C 피크의 분리도는 1.5보다 커야 한다.

테스트 용액의 제조: [함량 측정]항 하의 테스트 용액을 취한다.

실시예17

징코라이드 주사액 질량 제어-함량 측정

대조품 용액의 제조: 적당한 량의 빌로발라이드 대조품 징코라이드A 대조품, 징코라이드B 대조품, 징코라이드C 대조품을 각각 정밀하게 취하고 메틸 알콜을 첨가하여 매 1ml에 각각 0.15mg, 0.12mg, 0.1mg, 0.1mg를 포함하는 혼합 용액으로 제조한 후 균일하게 흔들어 대조품 용액으로 사용한다.

테스트 용액의 제조: 징코라이드 주사액(실시예14의 방법에 따라 제조) 1ml을 정밀하게 취하고 인산염완충액(pH 6.5) 14ml을 첨가하고 균일하게 흔든 후 Extrelut-20 칼럼을 올린 후 15분간 흡착시켜 에틸 아세테이트 100ml으로 용출시키고 용출액을 수집하여 수욕 위에서 건조되도록 증발시킨 후 잔사를 이동상으로 용해한 다음 10ml의 메스 플라스크로 이동하고 이동상을 첨구하여 눈금치까지 희석하고 균일하게 흔들고 0.45㎛ 미세여과지로 여과하고 테스트 용액으로 사용한다.

측정법: 대조품 용액10㎕, 20㎕, 테스트 용액 15㎕을 각각 정밀하게 취하고 HPLC에 주입한 후 크로마토그램을 기록한다. 외표준 이포인트법 로그 방정식으로 빌로발라이드, 징코라이드A, .징코라이드B와 징코라이드C의 함량을 각각 계산한다.

징코라이드 주사액 중에 매 1ml에 징코 테르펜 락톤이 5.15mg 포함되어 있다.

징코라이드 주사액 중에 빌로발라이드(C₁₅H₁₈O₈), 징코라이드A(C₂₀H₂₄O₉), 징코라이드B(C₂₀H₂₄O₁₀), 징코라이드C(C₂₀H₂₄O₁₁) 의 총량으로 계산하면 징코 테르펜 락톤을 1-10mg 포함하고 바람직하게는 4.25-5.75mg 포함한다.

Claims

(A) 은행잎을 분쇄시키고 유기 용매를 첨가하여 추출한 후, 농축 추출액에 산화 방지 보호제를 첨가하고 pH조절제를 사용하여 pH를 4-5로 조절시킨 후, 농축, 냉장시키는 추출단계,
(그중에서 (A)단계 중의 상기 추출 유기 용매는 에틸 알콜, 아세톤 또는 에틸 아세테이트이고 농도는 50~80%v/v이며 사용량은 5~12배의 양을 사용한다);
(B) 냉장된 후의 농축액을 먼저 n-헥산 또는 석유에테르로 2~3번 추출하고 수상은 지용성 용매로 4~5번 추출한 다음 물포화 2-부틸 알콜-에틸 아세테이트 혼합 용매 또는 물포화 n-부틸 알콜-에틸 아세테이트 혼합 용매로 4~5번 추출한 후, 유기상 추출액을 한데 모아 감압농축을 진행하는 액-액 추출 단계;
(C) 액-액 추출 농축액을 폴리아미드 수지 칼럼을 통과시키고 차례대로 물 1~5BV, 20~40%v/v 에틸 알콜 3~5BV, 60~90%v/v 에틸 알콜 2~3BV를 사용하여 용출시킨 후 용출액을 한데 모아 감압농축, 건조시키는 칼럼 통과 단계;
(D) 칼럼을 통과한 후의 건조물을 비등한 물에 첨가시키고 교반 및 용해시켜 냉각을 진행한 후, 상등액을 등체적의 에틸 아세테이트, 포름산 에틸 또는 아세톤으로 4~5번 액-액 추출시킨 후 추출액을 한데 모아 감압농축시켜 건조되도록 증발시킨(drying by distillation) 후 5~8배 양의 30%~50%v/v 에틸 알콜을 첨가하여 가열 교반 용해시키고 여과, 냉장시켜 결정을 석출시킨 후 여과를 진행하고 얻은 여과액 I는 대기시키며 결정은 30%~50%v/v 에틸 알콜로 세척하고 감압농축하여 결정I를 얻으며;
여과액 I는 알콜 함량이 10%~30%v/v 될 때까지 농축하고 냉장을 진행하여 결정을 석출시키고 여과한 후 얻은 여과액 II는 대기시키며, 30%~50%v/v의 알콜로 세척하고 감압건조시켜 결정II를 얻으며;
여과액II를 농축시켜 활성탄 0.1%~0.5%를 첨가하여 흡착을 진행하고 여과한 후 얻은 여과액을 알콜 함량이 10%~30%v/v되도록 농축시키고 냉장하여 결정을 석출시키고 여과한 후 얻은 여과액 III는 대기시키며, 결정을 30%~50%v/v의 에틸 알콜로 세척하고 감압건조시켜 결정III를 얻으며;
여과액III을 농축시켜 활성탄-실리카 겔 칼럼을 통과시키고 먼저 30%~50%v/v의 에틸 알콜로 용출시킨 다음 70%~90%v/v의 에틸 알콜로 용출시키며 수집한 용출액을 알콜 함량이 10%~30%v/v가 되도록 농축시킨 후 냉장하여 결정을 석출시키고 여과한 후 얻은 여과액 IV는 대기시키며, 결정을 30%v/v의 알콜로 세척하고 감압건조시켜 결정 IV를 얻으며;
여과액IV를 농축시켜 냉장하여 결정을 석출시키고 여과한 다음 결정을 30%v/v 에틸 알콜로 세척하고 감압건조시켜 결정 V를 얻는 결정화 단계;
(E) 결정I, II, III, IV, V를 균일하게 혼합하고 분쇄시켜 징코라이드를 얻는 혼정단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 징코라이드의 추출 분리 방법.
청구항1에 있어서,
상기 (A)단계의 추출 방식은 환류 추출(reflux extraction) 또는 달임 추출인 것을 특징으로 하는 징코라이드의 추출 분리 방법.
청구항2에 있어서,
상기 환류 추출은 에틸 알콜, 아세톤 또는 에틸 아세테이트를 사용하여 추출하고 그중에서 부동한 추출 용매의 농도 및 추출 조건은 에틸 알콜 농도는 50%~80%v/v이고, 추출온도는 75~85℃이며, 추출 차수는 2~3번이고 추출 시간은 1~2시간/번이며; 아세톤 농도는 50%~80%v/v이고, 추출온도는 45~55℃이며, 추출 차수는 2~3번이고 추출 시간은 1~2시간/번이며; 에틸 아세테이트 농도는 50%~80%v/v이고, 추출온도는 55~65℃이며, 추출 차수는 2~3번 이고 추출 시간은 1~2시간/번인 것을 특징으로 하는 징코라이드의 추출 분리 방법.
청구항3에 있어서,
상기 환류 추출은 에틸 알콜,아세톤 또는 에틸 아세테이트를 사용하여 추출하고 그중에서 부동한 추출 용매의 농도 및 추출 조건은, 에틸 알콜 농도는 65%v/v이고, 추출온도는 75~85℃이며, 추출 차수는 3번이고 추출 시간은 1.5시간/번이며; 아세톤 농도는 50%v/v이고, 추출온도는 45~55℃이며, 추출 차수는3번이고 추출 시간은 1.5시간/번이며; 에틸 아세테이트 농도는 60%v/v이고, 추출온도는 55~65℃이며, 추출 차수는 3번이고 추출 시간은 1.5시간/번인 것을 특징으로 하는 징코라이드의 추출 분리 방법.
청구항2에 있어서,
상기 달임 추출은 에틸 알콜, 아세톤 또는 에틸 아세테이트를 사용하여 추출하고 그중에서 부동한 추출 용매의 농도 및 추출 조건은 에틸 알콜 농도는 50%~80%v/v이고, 추출온도는 80~90℃이며, 추출 차수는 2~3번이고 추출 시간은 1~2시간/번이며; 아세톤 농도는 50%~80%v/v이고, 추출온도는 50~60℃이며, 추출 차수는 2~3번이고 추출 시간은 1~2시간/번이며; 에틸 아세테이트 농도는 50%~80%v/v이고, 추출온도는 60~65℃이며, 추출 차수는 2~3번 이고 추출 시간은 1~2시간/번인 것을 특징으로 하는 징코라이드의 추출 분리 방법.
청구항5에 있어서,
상기 달임 추출은 에틸 알콜,아세톤 또는 에틸 아세테이트를 사용하여 추출하고 그중에서 부동한 추출 용매의 농도 및 추출 조건은, 에틸 알콜 농도는 65%v/v이고, 추출온도는 80~90℃이며, 추출 차수는 3번이고 추출 시간은 1.5시간/번이며; 아세톤 농도는 50%v/v이고, 추출온도는 50~60℃이며, 추출 차수는3번이고 추출 시간은 1.5시간/번이며; 에틸 아세테이트 농도는 60%v/v이고, 추출온도는 60~65℃이며, 추출 차수는 3번이고 추출 시간은 1.5시간/번인 것을 특징으로 하는 징코라이드의 추출 분리 방법.
청구항1에 있어서,
상기 (A) 단계 중의 상기 산화방지 보호제는 중성 아미노산인 것을 특징으로 하는 징코라이드의 추출 분리 방법.
청구항1에 있어서,
상기 (A) 단계 중의 상기 산화방지 보호제는 세린, 메티오닌, 아스파라진 또는 트레오닌 중의 하나 이상인 것을 특징으로 하는 징코라이드의 추출 분리 방법.
청구항1에 있어서,
상기 (A) 단계 중의 상기 산화방지 보호제는 메티오닌인 것을 특징으로 하는 징코라이드의 추출 분리 방법.
청구항1에 있어서,
상기 (A) 단계 중의 pH 조절제는 유기 약산인 것을 특징으로 하는 징코라이드의 추출 분리 방법.
청구항1에 있어서,
상기 (A) 단계 중의 pH 조절제는 구연산, 사과산 또는 소르빈산 중의 하나 이상인 것을 특징으로 하는 징코라이드의 추출 분리 방법.
청구항1에 있어서,
상기 (A) 단계 중의 pH 조절제는 구연산인 것을 특징으로 하는 징코라이드의 추출 분리 방법.
청구항1에 있어서, 상기 (B) 단계 중의 상기 지용성 용매는 에틸 아세테이트, 포름산 에틸, 아세톤, 부탄온 중의 하나 이상인 것을 특징으로 하는 징코라이드의 추출 분리 방법.
청구항1에 있어서,
(C) 단계의 칼럼 통과의 상기 폴리아미드 수지 칼럼 중의 폴리아미드 수지의 입도는 30~60메쉬인 것을 특징으로 하는 징코라이드의 추출 분리 방법.
청구항1에 있어서,
결정화 단계인 (D) 단계 중의 상기 활성탄- 실리카 겔 칼럼 중의 활성탄과 실리카 겔의 체적 비는 1:1~1:3인 것을 특징으로 하는 징코라이드의 추출 분리 방법.