CN102659808A - 一种银杏内酯的提取分离方法 - Google Patents

一种银杏内酯的提取分离方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及植物提取领域，具体涉及一种银杏内酯的提取分离方法。本发明所解决的技术问题是提供一种银杏内酯的提取分离方法，该提取分离方法可得到组分固定的银杏内酯。该方法经提取、萃取、过柱、析晶、混晶步骤所得银杏内酯中，含白果内酯(C15H18O8)25.0％～50.0％、银杏内酯A(C20H24O9)20.0％～45.0％、银杏内酯B(C20H24O10)10.0％～30.0％、银杏内酯C(C20H24O11)5.0％～15.0％，且白果内酯、银杏内酯A、银杏内酯B、银杏内酯C总量大于95％。

Description

一种银杏内酯的提取分离方法
技术领域
本发明涉及植物提取领域，具体涉及一种银杏内酯的提取分离方法。
背景技术
自上世纪60年代开始，许多国家采用现代分离技术对银杏叶的化学成分进行研究，经药理实验和临床验证，发现银杏叶的多方面生物活性与其所含特定化学成分有关。德国Dr.WillarSchwabe首次注册了银杏叶的一种简单提取物，于1972年申请了专利(W Schwabe DE 176708和DE 2117429)，定名为EGb761，用于治疗心脑血管疾病和神经系统疾病，具有显著疗效，且无毒副作用，银杏内酯类化合物(ginkgolids)具有强血小板活化因子(PAF)拮抗作用。银杏制剂被列为治疗药物的国家有德国、法国和中国，其他国家均用为保健食品或非处方用药，美国开发出的银杏保健食品已经获得FDA批准。
银杏内酯属于萜类化合物，称为萜类内酯，由倍半萜内酯和二萜内酯组成，是银杏叶中一类重要的活性成分。白果内酯(bilobalide)属倍半萜内酯，由R.T.Major于1967年和K.Weinges于1969年分离得到，目前从银杏叶中发现的唯一的一个倍半萜内酯化合物，银杏内酯A、B、C、M、J(ginkgolidA、B、C、M、J)为二萜内酯化合物，于1932年由S.Furukawa首次从银杏叶中分离出来，1967年才由K.Nakanish、M.Maruyama和K.Okabe等人进一步分离和确定其化学结构。从结构上看，白果内酯类分子骨架由15个碳原子组成，具有互相稠合在一起的4个五元环，其中有1个五元碳环，3个五元内酯碳环，五元环上连有1个天然产物中罕见的叔丁基。白果内酯有很强的生物活性，具有促进神经生长的作用，可防止脑细胞线粒体氧化应激引起的功能改变，改善老年记忆功能，防止老年痴呆的发生，以及防止脑、脊髓神经脱髓鞘作用，其神经营养、神经保护作用比银杏内酯强。银杏内酯B有抗炎、抗休克、保护心脑血管、治疗急性胰腺炎等作用。而银杏内酯类化合物的分子骨架由20个碳原子组成，具有6个五元环，其中有2个五元碳环，3个五元内酯环，1个四氢呋喃环，两个五元碳环以螺环的形式连接在一起，其余的环以稠合的方式连接，形成一个刚性茏状的特殊立体化学结构。银杏内酯分子中均具有天然产物中罕见的叔丁基。银杏内酯包括二萜类和倍半萜类内酯，二萜类内酯主要有银杏内酯A、B、C、J、M等，半萜类内酯有白果内酯。
自20世纪70年代初发现了PAF后，药理学家对银杏内酯进行了研究，明确银杏萜内酯是强血小板活化因子拮抗剂，免疫系统、中枢神经系统、缺血损伤有保护作用，并有抗休克、抗过敏及抗炎作用。银杏内酯A、B、C、M、J结构差别在于含有的羟基数目和羟基连接的位置不同。银杏内酯均为强血小板活化因子拮抗剂，是银杏叶中特殊生理活性的关键成分。
Figure BDA0000156254270000021
银杏内酯A结构式                        银杏内酯B结构式
分子式：C20H24O9分子量：408.4    分子式：C20H24O10分子量：424.4
Figure BDA0000156254270000022
银杏内酯C结构式                        白果内酯结构式
分子式：C20H24O11分子量：440.4    分子式：C15H18O8分子量：326.3
银杏内酯对血小板活化因子PAF受体有强大的特异性抑制作用，其中银杏内酯的抗PAF活性最高。PAF是血小板和多种炎症组织分泌产生的一种内源性磷脂，是迄今发现的最有效的血小板聚集诱导剂，它与许多疾病的产生、发展密切相关。而银杏内酯目前被认为是最有临床应用前景的天然PAF受体拮抗剂，其拮抗作用活性与化学结构密切相关。当内酯结构中R3为羟基或羟基数目增多时，对PAF的拮抗活性减弱，而当R2为羟基且R3为H时，则活性显著增强，其中以银杏内酯B对PAF产生的拮抗作用最强。
银杏内酯的提取及纯化方法较多，主要有：溶剂萃取法、柱提取法、溶剂萃取-柱提取法、超临界提取法及色谱或柱层析纯化法等。这些方法都不能有效地分离出高含量的银杏内酯，且银杏内酯各组成比例不确定，因此，在临床使用上药效各不相同，由于其含量不高，也存在一定的安全风险，无完整的药理毒理及临床试验数据，因此，上述方法均处于试验阶段，未实施于药品生产过程，在中国虽有银杏内酯注射液相关专利，但其组成均与本发明不同，经ICH成员国多家官方网站检索，迄今尚无其它银杏内酯注射剂产品上市。银杏内酯类成分的测定目前多采用HPLC-UV法、HPLC-MS和HPLC-ELSD法，这些方法仅能对银杏内酯各成分的含量进行测定，由于缺乏对其产品中不良反应物质的严格控制，并不能真实的反映出药品的质量特性，不形成一个完善的药品质量控制体系，尽管银杏内酯的发明专利很多，由于控制方法过于简单，银杏内酯组成比例不定，都无法制成中药注射剂，不能保证临床疗效和应用的安全性。
尽管在中国、德国等国家有诸多关于银杏内酯的专利和报道，但本发明的工艺过程、质量控制技术和临床适应症与其它发明专利有截然不同之处，尤其是不同的分离纯化工艺得到的萜类内酯的成分各不相同，迄今为止，尚无4种组分(银杏内酯A、B、C和白果内酯)比例固定的提取银杏内酯有效部位组合物的工艺报道，也没有对银杏内酯中4种组分指纹图谱控制技术及可能残留的大分子、蛋白质检查方法的报道。本发明制备的银杏内酯注射液已获得国家食品药品监督管理局批准文号，国药准字：Z20110035，是目前国际上第一个银杏有效部位注射剂，产品结构清晰、明确。
发明内容
本发明所解决的技术问题是提供一种银杏内酯的提取分离方法，该提取分离方法可得到组分固定的银杏内酯。该方法步骤如下：
A、提取：粉碎银杏叶，加有机溶剂提取，浓缩提取液中加抗氧化保护剂，用pH调节剂调pH值至4～5，浓缩、冷藏。
其中，提取有机溶剂为乙醇、丙酮或乙酸乙酯，浓度为50～80％v/v，用量为5～12倍量，最佳用量6～10倍；
提取方法为：回流提取或煎煮提取。
1)回流提取：
50～80％v/v乙醇：提取温度75～85℃，提取次数2～3次，时间每次1～2小时；
50～80％v/v丙酮：提取温度45～55℃，提取次数2～3次，时间每次1～2小时；
50～80％v/v乙酸乙酯：提取温度55～65℃，提取次数2～3次，时间每次1～2小时；
真空度：-0.02～0.08MPa
优选提取条件为：提取3次，每次1.5小时；乙醇浓度宜选择65％v/v；丙酮浓度宜选择50％v/v；乙酸乙酯浓度宜选择60％v/v。
2)煎煮提取：
50～80％v/v乙醇：提取温度80～90℃，提取次数2～3次，时间每次1～2小时；
50～80％v/v丙酮：提取温度50～60℃，提取次数2～3次，时间每次1～2小时；
50～80％v/v乙酸乙酯：提取温度60～65℃，提取次数2～3次，时间每次1～2小时；
优选提取条件为：提取3次，每次1.5小时；乙醇浓度宜选择65％v/v；丙酮浓度宜选择50％v/v；乙酸乙酯浓度宜选择60％v/v。
提取液在浓缩过程中受热后银杏内酯易分解，需加入保护剂和pH调节剂。加入保护剂是为了防止银杏内酯受热氧化分解，可用的抗氧化保护剂主要有中性氨基酸，包括：丝氨酸、蛋氨酸、天冬酰胺、苏氨酸中至少一种，优选蛋氨酸。
pH调节剂主要是有机弱酸，包括：枸橼酸、苹果酸、山梨酸中至少一种，优选枸橼酸用于调pH值，是利用其弱酸性作为稳定剂，防止银杏内酯在碱性条件下开环。原因是银杏内酯结构为5元环，在弱酸性条件下稳定，枸橼酸为弱酸，可以防止银杏内酯在碱性条件下开环。
步骤A冷藏的目的是为了使油水分离，以除去水中脂溶性杂质。
B、萃取：将浓缩液先用正己烷或石油醚萃取2～3次(优选等体积的正己烷或石油醚萃取)，水相用脂溶性溶剂萃取4～5次(优选等体积的乙酸乙酯萃取)，再用水饱和仲丁醇(正丁醇)-乙酸乙酯混合溶剂萃取4～5次(优选等体积水饱和仲丁醇-乙酸乙酯混合溶剂萃取)，合并有机相萃取液，减压浓缩。
其中，先用正己烷或石油醚萃取是为了除去叶绿素、银杏酚酸等杂质。
再用脂溶性溶剂萃取银杏内酯，可用的脂溶性溶剂有乙酸乙酯、甲酸乙酯、丙酮、丁酮中的至少一种。
银杏萜类内酯易溶于乙酸乙酯，银杏黄酮在乙酸乙酯中溶解性相对较低，在热水中和含水醇中溶解度较大，故可用乙酸乙酯萃取银杏内酯，将其与银杏黄酮类化合物分离，分离得的银杏内酯粗品可进一步用活性炭、硅胶或树脂柱吸附层析，进一步除去杂质，然后在含水醇中结晶即可得到比较纯的银杏内酯。
C、过柱：萃取液过聚酰胺(30～60目)树脂柱，依次用1～5BV水、3～5BV 20％～40％v/v乙醇、2～3BV 60％～90％v/v乙醇洗脱，控制洗脱液流速为2～3BV/h；合并洗脱液，减压浓缩，干燥；
D、析晶：将过柱后的干燥物加入沸水中，搅拌溶解，冷却，上清液用等体积乙酸乙酯、甲酸乙酯或丙酮萃取4～5次，合并萃取液，减压浓缩，蒸干，加5～8倍量30％～50％v/v乙醇加热搅拌溶解，过滤，冷藏，析出晶体，滤过，滤液I备用，晶体用30％～50％v/v乙醇洗涤，减压干燥，得到晶体I。
滤液I浓缩至含醇量为10％～30％v/v，冷藏，析出晶体，滤过，滤液II备用；用30％～50％v/v乙醇洗涤，减压干燥，得晶体II。
浓缩滤液II，加0.1～0.5％(g/L)活性炭吸附，过滤，滤液浓缩至含醇量为10～30％v/v，冷藏，析出晶体，滤过，滤液III备用；晶体用30％～50％v/v乙醇洗涤，减压干燥，得晶体III。
滤液III浓缩，过活性炭-硅胶(体积比1∶1～1∶3)柱，先用30％～50％v/v乙醇洗脱，再用70％～90％v/v乙醇洗脱，收集洗脱液浓缩至含醇量为10％～30％v/v，冷藏析晶，滤出晶体，滤液IV备用；晶体用30％乙醇洗涤，减压干燥，得晶体IV。
浓缩滤液IV，冷藏，析出晶体，滤过，晶体用30％v/v乙醇洗涤，减压干燥，得晶体V。
根据HPLC对母液中残余银杏内酯的检测结果，考虑是否对滤液IV进行结晶。
E、混晶：将晶体I、II、III、IV、V混合均匀，粉碎，得到类白色晶体组合物，该晶体组合物有效部位(白果内酯、银杏内酯A、银杏内酯B、银杏内酯C之和)的HPLC含量大于95％。
采用本发明取分离方法得到的银杏内酯的参数如下：
a)性状：类白色或微黄色结晶性粉末。在乙酸乙酯中易溶，在甲醇、乙醇中溶解，在水中几乎不溶。
b)水分：小于5.0％。
c)蛋白质：在595nm波长处吸光度小于0.05。
d)鞣质、树脂、草酸盐、钾离子：不得检出。
e)残留溶剂：乙醇和乙酸乙酯均小于0.5％，正己烷小于0.029％，己内酰胺小于0.0015％。
f)总银杏酸：HPLC法测定总银杏酸含量小于5ppm。
g)大分子和聚合物：凝胶色谱法测定无残留大分子和聚合物。LC-MS法测定无分子量大于1000的大分子物质和聚合物。
h)重金属：小于10ppm。
i)砷盐：小于2ppm。
k)异常毒性：制成每1ml中含0.2mg的溶液，符合静脉注射法给药。
l)指纹图谱：HPLC法测定，以白果内酯对照品、银杏内酯A对照品、银杏内酯B对照品、银杏内酯C对照品为参照物，按中药色谱指纹图谱相似度评价系统，四个共有峰相似度大于0.95。
m)含量：HPLC法测定，按干燥品计算，含白果内酯(C15H18O8)25.0％～50.0％、银杏内酯A(C20H24O9)20.0％～45.0％、银杏内酯B(C20H24O10)10.0％～30.0％、银杏内酯C(C20H24O11)5.0％～15.0％，且白果内酯、银杏内酯A、银杏内酯B、银杏内酯C总量大于95％。
附图说明
图1洗脱体积对洗脱率的影响。
图2乙醇流速对洗脱率的影响。
图3银杏内酯LC-MS图谱(分子量400～1000)。
图4银杏内酯LC-MS图谱(分子量400～3000)。
图5银杏内酯对照指纹图谱；
共有峰中峰2：银杏内酯C，峰3：白果内酯，峰4：银杏内酯A，峰5：银杏内酯B。
具体实施方式
以下为本发明银杏内酯制备方法中的关键条件筛选试验。
一、萃取方案筛选试验
方法一：将浓缩液先用等体积的正己烷萃取2～3次，水相用8倍量的丁酮-丙酮(4∶6)在温热下提取5次，合并萃取液，减压浓缩。
方法二：将浓缩液先用等体积的正己烷萃取2～3次，水相再用等体积乙酸乙酯萃取4～5次，用等量水饱和的仲丁醇-乙酸乙酯(7∶3)萃取4～5次，合并萃取液，减压浓缩，干燥。
以上两种萃取分离纯化方法筛选试验，用HPLC-ELSD法分别测定两种试验中银杏内酯的总量，试验结果见表1。
表1萃取方案筛选试验结果
  考察项目   方法一   方法二
  外观性状   棕色粉末   棕色粉末
  总内酯含量(％)   14.1   10.8
方法二所得总内酯含量均较高，乙酸乙酯和仲丁醇为安全性极高的溶剂，因此，选用方法二作为萃取离纯化工艺。
二、层析条件筛选试验
由于萃取液中尚含有大量银杏黄酮类物质及其它杂质，要得到纯度极高银杏内酯，必须将黄酮与银杏内酯有效的分离，目前普遍采用的分离方法包括聚酰胺树脂柱分离法、氧化铝柱层析法和硅胶柱层析法，发明人对比研究过程及结果如下：
方法一：将萃取液过聚酰胺树脂柱，先用2～3倍量的30％乙醇洗脱，继用70％乙醇洗脱，洗脱速度为2BV/h，浓缩洗脱液，蒸干。
方法二：将萃取液过酸性氧化铝柱，将萃取液与等量氧化铝混合，烘干，干法上柱，用4～6倍量的乙酸乙酯洗脱，洗脱速度为2BV/h，浓缩洗脱液，蒸干。
方法三：将萃取液过硅胶柱，将萃取液与等量柱层析硅胶混合，烘干，干法上柱，先用用4～6倍量的石油醚-乙酸乙酯(2∶1)洗脱，洗脱速度为2BV/h，再用正己烷-乙酸乙酯(5∶1)洗脱，洗脱速度为2BV/h，浓缩洗脱液，蒸干。
用HPLC-ELSD法分别对三种试验中银杏内酯的总量进行测定，试验结果见表2。
表2柱层析试验结果
  考察项目   方法一   方法二   方法三
  外观性状   黄色粉末   黄色粉末   黄色粉末
  总内酯含量(％)   47.8   35.5   38.2
由上可见，采用聚酰胺树脂柱得到的银杏内酯含量较高，分离效果较好。
聚酰胺树脂对黄酮有较好的吸附作用，因此，可以有效地将银杏内酯和银杏黄酮进行有效地分离，对过柱洗脱工艺参数考察。
1、水洗体积的选择：蒸馏水洗涤树脂柱能起到很好的除杂作用，用5BV的水洗涤树脂柱，流速1～2BV/h，流出的颜色由深变浅，收集水洗液5BV，流出液清亮，检测结果显示，水体积达到3BV时，柱中的水溶性杂质已经基本干净，检测不出银杏内酯，所以选用3BV的水洗体积。洗脱体积对洗脱率的影响见图1。
2、乙醇洗脱浓度对洗脱效果的影响：将萃取物分别上不同聚酰胺柱，吸附30min，先用3BV水洗，再分别使用10％、30％、40％、50％、70％、90％乙醇洗脱，流速1BV/h，分别收集乙醇洗脱液，测定各浓度洗脱液中银杏内酯的量，随着乙醇浓度的升高，洗脱量和洗脱率都随之上升，但是至40％的乙醇时洗脱量提升缓慢，至90％的乙醇时洗脱量差别不大，30％的乙醇洗脱基本上达到最佳洗脱率，因此，采用30％乙醇作为最佳洗脱浓度。
3、乙醇解析流速的洗脱效果影响：将萃取物分别上不同聚酰胺柱，吸附30min，先用3BV水洗，再用40％乙醇洗脱，流速1BV/h。为选取较优的乙醇解析流速，分别以1、2、3、4、5BV/h的流速过柱，洗脱并收集3BV洗脱液，测定银杏内酯量。洗脱流速与解析率有很大的关联性，随着流速提高，解析率增加，但到3BV/h时反而下降，这是速度加快导致乙醇洗脱液不能很好的与吸附的银杏内酯交换，因而不能达到很好的洗脱效果。最佳流速2～3BV/h。乙醇流速对洗脱率的影响见图2。
三、析晶条件筛选试验：
虽然过柱、萃取后提取物中银杏内酯的含量有所增加，黄酮类物质也得到有效分离，但银杏内酯的含量尚不能达到注射剂要求，需进一步结晶纯化。银杏内酯在乙醇、乙酸乙酯等溶剂中易溶，而在水、正己烷等溶剂中不溶，因此只有选用极性合适混合溶剂作为结晶溶剂。
(1)30％v/v乙醇溶剂：取待析晶提取物10g，分别加4、6、8、10倍量30％乙醇，加热溶解，低温(0～6℃)静置，滤过，减压干燥，分别测定晶体重量，试验结果见表3。
表330％乙醇结晶试验结果
  溶剂加入量(倍)   4   6   8   10
  加热溶解情况   未溶完   溶解完全   溶解完全   溶解完全
  晶体量(g)   3.8   4.5   4.2   2.4
析晶时加5～8倍量30％乙醇比较合适，析出的晶体相对较多。
(2)正己烷-乙酸乙酯(8∶1)溶剂：取待析晶提取物10g，分别加4、6、8、10倍量正己烷-乙酸乙酯(8∶1)混合溶剂，加热溶解，低温(0～6℃)静置，滤过，减压干燥，分别测定晶体重量，试验结果见表4。
表4正己烷-乙酸乙酯混合溶剂结晶试验结果
  溶剂加入量(倍)   4   6   8   10
  加热溶解情况   溶解完全   溶解完全   溶解完全   溶解完全
  晶体量(g)   2.3   3.5   3.8   3.2
正己烷-乙酸乙酯混合溶剂析晶量少于30％乙醇溶剂析出晶体量。
(3)10％v/v乙酸乙酯溶剂：取待析晶提取物10g，分别加4、6、8、10倍量10％乙酸乙酯加热溶解，低温(0～6℃)静置，滤过，减压干燥，分别测定晶体重量，试验结果见表5。
表510％乙酸乙酯结晶试验结果
  溶剂加入量(倍)   4   6   8   10
  加热溶解情况   未溶完   溶解完全   溶解完全   溶解完全
  晶体量(g)   2.3   3.5   3]   2.2
10％乙酸乙酯溶剂析晶量少于30％乙醇溶剂析出晶体量。
根据实验结果，结晶溶剂选用5～8倍量30％乙醇比较合适。
以下为采用本发明方法制备银杏内酯的实例。
实施例1
银杏叶粗粉50kg，加65％乙醇加热回流提取3次(10、8、6倍量)，每次1.5小时，合并提取液，滤过，减压浓缩，加0.05％蛋氨酸搅拌溶解，用枸橼酸溶液调节pH值至4～5，继续浓缩，低温放置，过滤。先用等量正己烷萃取，再用等量乙酸乙酯萃取，最后用水饱和仲丁醇-乙酸乙酯混合溶剂萃取，过聚酰胺(30～60目)树脂柱，先用水洗脱，继用30％乙醇洗脱，再用70％乙醇洗脱，合并洗脱液，减压浓缩。加入2～3倍量沸水中，搅拌溶解，静置，放冷，用乙酸乙酯萃取，减压浓缩，加乙醇加热搅拌溶解，过滤，放冷，析出晶体，滤过，干燥，得晶体I(主要为白果内酯和银杏内酯B)；滤液继续浓缩，加乙醇至30％，静置，析出晶体，滤过，干燥，得晶体II(主要为银杏内酯A、B、C)；滤液加入药用炭，搅拌吸附，过滤，浓缩，放冷，析出晶体，滤过，干燥，得晶体III(主要为银杏内酯A和B)；将滤液浓缩，过药用炭-硅胶(1∶1)柱，先用2倍量30％乙醇洗脱，再用4倍量70％乙醇洗脱，收集洗脱液，浓缩，加乙醇至30％，放冷，静置，析出晶体，滤过，干燥，得晶体IV；滤液浓缩，加乙醇至30％，放冷，静置，析出晶体，滤过，干燥，得晶体V。将晶体混合均匀，得银杏内酯91.6g，HPLC含量97.2％，其中白果内酯(C15H18O8)为42.5％、银杏内酯A(C20H24O9)为25.4％、银杏内酯B(C20H24O10)为18.7％、银杏内酯C(C20H24O11)为10.6％。
实施例2
银杏叶粗粉200kg，加6倍量80％乙醇加热回流提取3次，每次1.5小时，合并提取液，滤过，滤液减压回收乙醇至无醇味，加0.05％蛋氨酸搅拌溶解，用枸橼酸溶液调节pH值至4～5，继续浓缩，低温放置，过滤。先用正己烷萃取，再用乙酸乙酯萃取，最后用水饱和仲丁醇-乙酸乙酯混合溶剂萃取，过聚酰胺(30～60目)树脂柱，先用30％乙醇洗脱，继用70％乙醇洗脱，合并洗脱液，减压浓缩。加入沸水中，搅拌溶解，静置放冷，用乙酸乙酯萃取，减压浓缩，加乙醇加热搅拌溶解，过滤，放冷，析出晶体，滤过，干燥，得晶体I(主要为白果内酯和银杏内酯B)；滤液继续浓缩，加乙醇，静置析出晶体，滤过，干燥，得晶体II(主要为银杏内酯A、B、C)；滤液加入药用炭，搅拌吸附，过滤，浓缩，加乙醇，放冷，析出晶体，滤过，干燥，得晶体III(主要为银杏内酯A和B)；将滤液浓缩，过药用炭-硅胶(1∶1)柱，先用2倍量30％乙醇洗脱，再用4倍量70％乙醇洗脱，收集洗脱液，浓缩，加乙醇至30％，放冷，静置，析出晶体，滤过，干燥，得晶体IV；滤液浓缩，加乙醇至30％，放冷，静置，析出晶体，滤过，干燥，得晶体V。将晶体混合均匀，得银杏内酯362.8g，HPLC含量96.8％，其中白果内酯(C15H18O8)为31.2％、银杏内酯A(C20H24O9)为28.8％、银杏内酯B(C20H24O10)为28.2％、银杏内酯C(C20H24O11)为8.6％。
实施例3
银杏叶粗粉200kg，加8倍量75％乙醇加热回流提取3次，每次1.5小时，合并提取液，滤过，滤液减压回收乙醇至无醇味，加0.05％蛋氨酸搅拌溶解，用枸橼酸溶液调节pH值至4～5，继续浓缩，低温放置，过滤。先用正己烷萃取，再用乙酸乙酯萃取，最后用水饱和仲丁醇-乙酸乙酯混合溶剂萃取，过聚酰胺(30～60目)树脂柱，先用30％乙醇洗脱，继用75％乙醇洗脱，合并洗脱液，减压浓缩。加入沸水中，搅拌溶解，静置放冷，用乙酸乙酯萃取，减压浓缩，加乙醇加热搅拌溶解，过滤，放冷，析出晶体，滤过，干燥，得晶体I(主要为白果内酯和银杏内酯B)；滤液继续浓缩，加乙醇，静置析出晶体，滤过，干燥，得晶体II(主要为银杏内酯A、B、C)；滤液加入药用炭，搅拌吸附，过滤，浓缩，加乙醇，放冷，析出晶体，滤过，干燥，得晶体III(主要为银杏内酯A和B)；滤液浓缩，上药用炭-硅胶(1∶1)柱，用60％乙醇洗脱，收集洗脱液，浓缩，放冷，析出晶体，滤过，干燥，得晶体IV；将晶体混合均匀，得银杏内酯375.5g，HPLC含量97.1％，其中白果内酯(C15H18O8)为35.8％、银杏内酯A(C20H24O9)为28.5％、银杏内酯B(C20H24O10)为26.2％、银杏内酯C(C20H24O11)为6.6％。
实施例4
取银杏叶粗粉200kg，加10倍量75％乙醇加热回流提取3次，每次1.5小时，合并提取液，滤过，滤液减压回收乙醇至无醇味，加0.05％蛋氨酸搅拌溶解，用枸橼酸溶液调节pH值至4～5，继续浓缩，低温放置，过滤。先用正己烷萃取，再用乙酸乙酯萃取，最后用水饱和仲丁醇-乙酸乙酯混合溶剂萃取，过聚酰胺(30～60目)树脂柱，先用25％乙醇洗脱，继用65％乙醇洗脱，合并洗脱液，减压浓缩。加入沸水中，搅拌溶解，静置放冷，用乙酸乙酯萃取，减压浓缩，加50％乙醇加热搅拌溶解，过滤，放冷，析出晶体，滤过，干燥，得晶体I(主要为白果内酯和银杏内酯B)；滤液继续浓缩，加乙醇，静置析出晶体，滤过，干燥，得晶体II(主要为银杏内酯A、B、C)；滤液加入药用炭，搅拌吸附，过滤，浓缩，放冷，析出晶体，滤过，干燥，得晶体III(主要为银杏内酯A和B)；滤液浓缩，上药用炭-硅胶(1∶1)柱，用60％乙醇洗脱，收集洗脱液，浓缩，放冷，析出晶体，滤过，干燥，得晶体IV；滤液浓缩，放冷，析出晶体，滤过，干燥，得晶体V；将晶体混合均匀，得银杏内酯362.2g，HPLC含量96.5％，其中白果内酯(C15H18O8)为35.5％、银杏内酯A(C20H24O9)为26.0％、银杏内酯B(C20H24O10)为26.2％、银杏内酯C(C20H24O11)为8.8％。
实施例5
银杏叶粗粉200kg，加8倍量60％乙酸乙酯加热回流提取3次，每次1.5小时，合并提取液，滤过，滤液减压回收乙酸乙酯，加0.05％蛋氨酸搅拌溶解，用枸橼酸溶液调节pH值至4～5，继续浓缩，低温放置，过滤。先用石油醚萃取，水相再用乙酸乙酯萃取，最后用水饱和仲丁醇-乙酸乙酯混合溶剂萃取，过聚酰胺(30～60目)树脂柱，先用30％乙醇洗脱，继用75％乙醇洗脱，合并洗脱液，减压浓缩。加入沸水中，搅拌溶解，静置放冷，用丙酮萃取，减压浓缩至干，加50％乙醇加热搅拌溶解，过滤，放冷，析出晶体，滤过，干燥，得晶体I(主要为白果内酯和银杏内酯B)；滤液继续浓缩，加乙醇，静置析出晶体，滤过，干燥，得晶体II(主要为银杏内酯A、B、C)；滤液加入药用炭，搅拌吸附，过滤，浓缩，加乙醇，放冷，析出晶体，滤过，干燥，得晶体III(主要为银杏内酯A和B)；滤液浓缩，上药用炭-硅胶(1∶1)柱，用60％乙醇洗脱，收集洗脱液，浓缩，放冷，析出晶体，滤过，干燥，得晶体IV；将晶体混合均匀，得银杏内酯350.6g，HPLC含量97.4％，其中白果内酯(C15H1808)为40.0％、银杏内酯A(C20H24O9)为22.5％、银杏内酯B(C20H24O10)为27.2％、银杏内酯C(C20H24O11)为10.3％。
实施例6
银杏叶粗粉200kg，加8倍量50％丙酮加热回流提取3次，每次1.5小时，合并提取液，滤过，滤液减压回收丙酮，加0.05％蛋氨酸搅拌溶解，用枸橼酸溶液调节pH值至4～5，继续浓缩，低温放置，过滤。先用石油醚萃取，水相再用乙酸乙酯萃取，最后用水饱和仲丁醇-乙酸乙酯混合溶剂萃取，过聚酰胺(30～60目)树脂柱，先用30％乙醇洗脱，继用70％乙醇洗脱，合并洗脱液，减压浓缩。加入沸水中，搅拌溶解，静置放冷，用乙酸乙酯萃取，减压浓缩至干，加30％乙醇加热搅拌溶解，过滤，放冷，析出晶体，滤过，干燥，得晶体I(主要为白果内酯和银杏内酯B)；滤液继续浓缩，加乙醇，静置析出晶体，滤过，干燥，得晶体II(主要为银杏内酯A、B、C)；滤液加入药用炭，搅拌吸附，过滤，浓缩，加乙醇，放冷，析出晶体，滤过，干燥，得晶体III(主要为银杏内酯A和B)；滤液浓缩，上药用炭-硅胶(1∶1)柱，用60％乙醇洗脱，收集洗脱液，浓缩，放冷，析出晶体，滤过，干燥，得晶体IV；滤液浓缩，放冷，析出晶体，滤过，干燥，得晶体V；将晶体混合均匀，得银杏内酯343.5g，HPLC含量96.2％，其中白果内酯(C15H18O8)为38.2％、银杏内酯A(C20H24O9)为28.3％、银杏内酯B(C20H24O10)为24.2％、银杏内酯C(C20H24O11)为9.3％。
实施例7
银杏叶粗粉200kg，加8倍量70％乙醇加热至微沸煎煮提取3次，每次1.5小时，合并提取液，滤过，滤液减压回收丙酮，加0.05％蛋氨酸搅拌溶解，用枸橼酸溶液调节pH值至4～5，继续浓缩，低温放置，过滤。先用石油醚萃取，水相再用乙酸乙酯萃取，最后用水饱和仲丁醇-乙酸乙酯混合溶剂萃取，过聚酰胺(30～60目)树脂柱，先用30％乙醇洗脱，继用70％乙醇洗脱，合并洗脱液，减压浓缩。加入沸水中，搅拌溶解，静置放冷，用乙酸乙酯萃取，减压浓缩至干，加30％乙醇加热搅拌溶解，过滤，放冷，析出晶体，滤过，干燥，得晶体I(主要为白果内酯和银杏内酯B)；滤液继续浓缩，加乙醇，静置析出晶体，滤过，干燥，得晶体II(主要为白果内酯和银杏内酯A、B)；滤液加入药用炭，搅拌吸附，过滤，浓缩，加乙醇，放冷，析出晶体，滤过，干燥，得晶体III(主要为银杏内酯A和C)；滤液浓缩，上药用炭-硅胶(1∶1)柱，用60％乙醇洗脱，收集洗脱液，浓缩，放冷，析出晶体，滤过，干燥，得晶体IV；滤液浓缩，放冷，析出晶体，滤过，干燥，得晶体V；将晶体混合均匀，得银杏内酯362.6g，HPLC含量97.4％，其中白果内酯(C15H18O8)为36.5％、银杏内酯A(C20H24O9)为25.3％、银杏内酯B(C20H24O10)为28.2％、银杏内酯C(C20H24O11)为7.4％。
综上，采用本发明所使用的提取分离纯化方法可得到纯度较高组分相对固定的银杏内酯，其中，含白果内酯(C15H18O8)25.0％～50.0％、银杏内酯A(C20H24O9)20.0％～45.0％、银杏内酯B(C20H24O10)10.0％～30.0％、银杏内酯C(C20H24O11)5.0％～15.0％，且白果内酯、银杏内酯A、银杏内酯B、银杏内酯C总量大于95％。
本发明银杏内酯的分项检测方法及检测结果如下：
a)性状：类白色或微黄色结晶性粉末。
在乙酸乙酯中易溶，在甲醇、乙醇中溶解，在水中几乎不溶。
b)水分：60℃减压干燥减失重量小于5.0％。
c)蛋白质：在595nm波长处吸光度小于0.05。
取本发明银杏内酯约24mg，加乙醇2ml溶解后，加水稀释至50ml，作为供试品溶液。照考马斯亮蓝法(Bradford法)测定，以相应的试剂为空白，在595nm波长处吸光度小于0.05。
d)鞣质、树脂、草酸盐、钾离子
可采用的检测方法有：
鞣质：取蛋白质检查项供试品溶液1ml，加入稀醋酸1滴，再加明胶氯化钠试液5滴，摇匀，放置10分钟，未出现浑浊或沉淀。
树脂：取蛋白质检查项供试品溶液5ml，加盐酸1滴，放置30分钟，无树脂状物质析出。
草酸盐：取蛋白质检查项供试品溶液2ml，用稀盐酸调节pH值至1～2，滤过，滤液用氨水调节pH值为5～6，加3％氯化钙溶液3滴，放置10分钟，未出现浑浊或沉淀。
钾离子：取蛋白质检查项供试品溶液2ml，置10ml纳氏比色管中，加碱性甲醛溶液0.6ml、3％EDTA溶液2滴、3％四苯硼钠溶液0.5ml，加水稀释至10ml，另取标准氯化钾溶液0.8ml，同法试验，供试品溶液的浊度不高于对照溶液。
结果：未检出鞣质、树脂、草酸盐、钾离子。
e)残留溶剂
(1)乙醇、乙酸乙酯和正己烷：含乙醇和乙酸乙酯均小于0.5％，正己烷小于0.029％。
(2)树脂残留量：含己内酰胺小于0.0015％。
f)总银杏酸：含总银杏酸小于5ppm。
g)大分子和聚合物：凝胶色谱法测定无残留大分子和聚合物。LC-MS法测定，结果无分子量大于1000的大分子和聚合物。
测定方法：
(1)凝胶色谱法色谱柱：Phenomenex BioSep-SEC-S2000，300×7.8mm，5um，流动相：0.71％(内含0.02％的叠氮化钠)硫酸钠溶液，柱温：35℃，检测器温度：35℃，流速：0.5ml/min。结果：无残留大分子和聚合物。
(2)HPLC-MS联用法流动相：甲醇-水(90∶10)、色谱柱：Agilent RX-C18(2.1×50mm)柱温：25℃，流速：0.3ml/min。结果：结果无分子量大于1000的大分子和聚合物。
h)重金属：小于10ppm。
i)砷盐：小于2ppm。
k)异常毒性：制成每1ml中含0.2mg的溶液，符合静脉注射法给药。
供试品溶液的制备：取本发明银杏内酯约25mg，用乙醇2ml溶解后加氯化钠注射液制成每1ml中含0.2mg的溶液。
检查法：取体重17～20g小鼠5只，注入小鼠尾静脉供试品溶液0.5ml，48小时无死亡。
1)指纹图谱：HPLC法测定，记录60分钟的色谱图。按中药色谱指纹图谱相似度评价系统，四个共有峰相似度大于0.95。
m)含量：HPLC法测定，按干燥品计算，含白果内酯(C15H18O8)应为25.0％～50.0％、银杏内酯A(C20H24O9)应为20.0％～45.0％、银杏内酯B(C20H24O10)应为10.0％～30.0％、银杏内酯C(C20H24O11)应为5.0％～15.0％，且白果内酯、银杏内酯A、银杏内酯B、银杏内酯C总量大于95％。
l)指纹图谱和m)含量测定采用的检测方法相同，条件如下：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-四氢呋喃-水(25∶10∶65)为流动相；用蒸发光散射检测器，漂移管温度：105℃；载气流速：3.00L/min；柱温：40℃；理论板数按白果内酯峰计算应不低于2500。白果内酯峰与银杏内酯C峰的分离度应大于1.5。
n)热原检查：体温升高低于0.6℃。
供试品溶液的制备：精密称取本发明银杏内酯20mg，加入2ml乙醇使溶解，再加入0.9％氯化钠注射液100ml中。
检查法：取家兔3只，测定其正常体温后15分钟内，按家兔体重每1kg注射5ml自耳静脉缓缓注入供试品溶液，每隔30分钟测定体温1次，共测6次，体温升高均应低于0.6℃，并且3只家兔体温升高总和低于1.3℃。
发明人对上述发明内容进行了大分子及聚合物测定研究与说明，用于证明本发明的技术效果。下述试验用于进一步说明与解释本发明，但不限制本发明。
(1)试验仪器及试剂
Agilent 1200型高效液相色谱仪，紫外检测器，示差折光检测器。
Phenomenex BioSep-SEC-S2000凝胶色谱柱。
右旋糖酐对照品D2000(蓝色葡聚糖2000)，中检所，批号140646-2000-01
葡萄糖对照品(D0)，含量：99.5％，批号086K0166，SIGMA。
超纯水用Millipore-Q超纯水系统制得。
其余试剂为分析纯。
(2)流动相的选择
选取0.71％(内含0.02％的叠氮化钠)硫酸钠溶液作为流动相。
(3)检测器的选择
选用通用型检测器示差折光检测器，该检测器对于存在折光系数差异的物质均有良好的响应。
(4)拟确定的色谱条件
色谱柱：Phenomenex BioSep-SEC-S2000，300×7.8mm，5μm
流动相：0.71％(内含0.02％的叠氮化钠)硫酸钠溶液
柱温：35℃，检测器温度：35℃，流速：0.5ml/min
(5)银杏内酯各成分的分子量
  银杏内酯   银杏内酯A   银杏内酯B   银杏内酯C   白果内酯   银杏内酯J
  分子式   C20H24O9   C20H24O10   C20H24O11   C15H18O8   C20H24O10
  分子量   408.4   424.4   440.4   326.3   424.4
(6)方法学研究
①将右旋糖酐和葡萄糖对照品分别加流动相制成10mg/ml的溶液，分别精密吸取对照品溶液各20μl，注入色谱仪，记录色谱图，结果右旋糖酐在保留时间9.816′出峰，葡萄糖在保留时间18.712′出峰，表明采用凝胶色谱法，分子量大的物质先出峰，分子量小的物质后出峰。
②取本发明银杏内酯约10mg，加乙醇2ml溶解，加入右旋糖酐对照品溶液(10mg/ml)1ml，混匀，精密吸取10μl，注入色谱仪，记录色谱图，结果在保留时间9.698′检出右旋糖酐，银杏内酯注射液成分峰均在18min以后出峰，表明分子量在180～450出峰时间在18min左右，分子量5000～2000000出峰时间在9min左右，采用凝胶色谱法来检测大分子物质是可行的。
为了再一次验证本品中不含大分子及聚合物，故又进行了LC-MS试验。
色谱条件：甲醇-水(90∶10)为流动相、Agilent RX-C18(2.1×50mm)色谱柱，柱温25℃流速0.3ml/min。
供试品溶液的制备：精密称取本发明银杏内酯10mg置10ml量瓶中，加适量1％乙酸使溶解，加流动相稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。
LC-MS联用测试：根据确定的试验方法，分别取供试品溶液各10μl，在400～1000和400-3000分子量范围内分别测试，记录色谱图。试验结果见表6。
表6LC-MS联用分子量测定结果
  [M+Na]+   M
  419.1、431.5、447.4、463.3、475.7、532.2、588.8、701.8   396.1、408.5、424.4、440.3、452.7、509.2、678.8
从LC-MS联用分子量测定结果来看，分别检出银杏内酯A(分子量408.5)、银杏内酯B(分子量424.4)、银杏内酯C(分子量440.4)，与本发明银杏内酯的有效成份完全一致，由于测试分子量范围在400-3000之间，未对白果内酯进行测试，本发明银杏内酯中未检出分子量大于700以上的物质，其它不同分子量的物质可能是其它杂质的存在，经LC-MS对银杏内酯中不同成份的分子量测试，说明本品中不含大分子或聚合物。银杏内酯LC-MS图谱见图3～4。
实施例8
银杏内酯质量控制——总银杏酸检查
色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-1％冰醋酸(90∶10)为流动相；流速1.0ml/min；检测波长为310nm。理论板数按白果新酸峰计应不低于4000。
对照品溶液的制备：取白果新酸对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含5μg的溶液作为对照品溶液；另取总银杏酸对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含100μg的溶液，作为定位用对照溶液。
供试品溶液的制备：取本发明银杏内酯5g，精密称定，置烧瓶中，加正己烷50ml，加热回流2小时，取出，放冷，滤过，残渣再用少量正己烷洗涤，合并滤液与洗涤液，置水浴上蒸干，残渣加甲醇溶解并稀释至2ml，摇匀，作为供试品溶液。
测定法：精密吸取供试品溶液、对照品溶液及定位用对照溶液各20μl，注入液相色谱仪，计算供试品溶液中与总银杏酸对照品相应色谱峰的总峰面积，以白果新酸对照品外标法计算总银杏酸含量，总银杏酸小于5ppm。
发明人对上述发明内容进行了研究与说明，用于证明本发明的技术效果。下述试验用于进一步说明与解释本发明，但不限制本发明。
a、方法一
供试品溶液的制备：取本发明银杏内酯5g，精密称定，置烧瓶中，精密加入石油醚(60～90℃)50ml，回流2小时，取出，放冷，滤过，残渣再用少量石油醚洗涤1次，合并滤液与洗涤液，置水浴上蒸干，残渣加甲醇溶解并稀释至2ml，摇匀，作为供试品溶液(1)。
空白样品溶液的制备：取石油醚(60～90℃)50ml，置锥形瓶中，回流2小时，置水浴上蒸干，残渣加甲醇溶解并稀释至2ml，摇匀，作为空白溶液(1)。
b、方法二(正己烷替换石油醚)
供试品溶液的制备：取本发明银杏内酯5g，精密称定，置烧瓶中，精密加入正己烷50ml，回流2小时，取出，放冷，滤过，残渣再用少量正己烷洗涤1次，合并滤液与洗涤液，置水浴上蒸干，残渣加甲醇溶解并稀释至2ml，摇匀，作为供试品溶液(2)。
空白样品溶液的制备：取正己烷50ml，置烧瓶中，回流2小时，置水浴上蒸干，残渣加甲醇溶解并稀释至2ml，摇匀，作为空白溶液(2)。
测定法：精密吸取供试品溶液和空白溶液各20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。试验结果见表7。
表7两种方法检测结果表
Figure BDA0000156254270000161
试验结果表明：采用方法一(石油醚)制备样品，空白溶液中检出色谱峰，其峰面积与供试品溶液检出的色谱峰面积基本一致，说明空白试验有干扰；而采用方法二(正己烷)制备样品，空白溶液与供试品溶液均未检出色谱峰，故发明人拟采用方法二来做加样回收试验，以此来验证方法二的可行性。
c、总银杏酚酸的加样回收试验
供试品溶液的制备：取本发明银杏内酯5g，精密称定，置烧瓶中，精密加入浓度为1.032mg/ml的总银杏酸对照品溶液0.2ml，再精密加入正己烷50ml，回流2小时，放冷，滤过，残渣再用少量正己烷洗涤，合并滤液与洗涤液，置水浴蒸干，残渣加甲醇溶解并稀释至2ml，摇匀，作为供试品溶液。
对照品溶液的制备：精密量取浓度为1.032mg/ml的总银杏酸对照品溶液0.2ml，置2ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。
测定法：精密吸取供试品溶液和对照品溶液各20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。
结果：供试品溶液在与总银杏酸对照品色谱相应的位置上能检出总银杏酸色谱峰，从峰面积来看，供试品溶液与对照品溶液峰面积一致，说明回收率较好。试验结果见表8。
表8加样回收率试验结果
Figure BDA0000156254270000171
d、重现性试验
对照品溶液的制备：取白果新酸对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含5μg的溶液作为对照品溶液。另取总银杏酸对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含100μg的溶液，作为定位用对照溶液。
供试品溶液制备：取本发明银杏内酯5g，精密称定，共称取6份，分别置烧瓶中，加正己烷50ml，回流2小时，放冷，滤过，残渣用少量正己烷洗涤，合并滤液与洗涤液，置水浴上蒸干，残渣加甲醇溶解并稀释至2ml，摇匀，作为供试品溶液。
测定法：精密吸取供试品溶液、对照品溶液及定位用对照溶液各20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。试验结果见表9。
表9重现性试验结果
  编号   1#   2#   3#   4#   5#   6#
  总银杏酸检查结果   未检出   未检出   未检出   未检出   未检出   未检出
试验结果表明，本发明银杏内酯中无银杏酚酸。
e、回收率试验
供试品溶液制备：取本发明银杏内酯5g，精密称定，共称取3份，分别置烧瓶中，分别加入浓度为3.04μg/ml白果新酸对照品溶液1.6ml、2.0ml、2.4ml，再分别加正己烷50ml，回流2小时，放冷，滤过，残渣用少量正己烷洗涤，合并滤液与洗涤液，置水浴上蒸干，残渣加甲醇溶解并稀释至2ml，摇匀，作为供试品溶液。
对照品溶液的制备：同重现性试验项。
测定法：精密吸取供试品溶液、对照品溶液各20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。每个浓度测定三次，共9次。计算回收率、RSD值。试验结果见表10。
表10回收率试验结果表
Figure BDA0000156254270000181
试验结果表明，回收率较好。
实施例9
银杏内酯质量控制——指纹图谱检查
色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-四氢呋喃-水(25∶10∶65)为流动相；用蒸发光散射检测器，漂移管温度：105℃；载气流速：3.00L/min；柱温：40℃；理论板数按白果内酯峰计算应不低于2500。白果内酯峰与银杏内酯C峰的分离度应大于1.5。
参照物溶液的制备：分别精密称取白果内酯对照品、银杏内酯A对照品、银杏内酯B对照品、银杏内酯C对照品适量，加甲醇制成每1ml分别含0.15mg、0.12mg、0.1mg、0.1mg的混合溶液，摇匀，作为参照物溶液。
试品溶液的制备：取本发明银杏内酯6mg，精密称定，置10ml量瓶中加甲醇1ml溶解，加流动相稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。
测定法：分别精密吸取参照物溶液和供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，记录60分钟的色谱图。
按中药色谱指纹图谱相似度评价系统，供试品指纹图谱与对照指纹图谱相似度大于0.95。
发明人对上述发明内容进行了研究与说明，用于证明本发明的技术效果。下述试验用于进一步说明与解释本发明，但不限制本发明。
在银杏内酯指纹图谱中，其中峰2为银杏内酯C、峰3为白果内酯、峰4为银杏内酯A、峰5为银杏内酯B，本品中有效部位4个特征峰在指纹图谱中均能一一对应。银杏内酯对照指纹图谱见图5。
首先采用国家药典委员会2004年指纹图谱指定软件——中药色谱指纹图谱相似度评价系统A版分别对10批银杏内酯生成对照指纹图谱，将不同批次的供试品指纹图谱与对照指纹图谱用相似度软件进行计算相似度。试验结果见表11。
表11 10批银杏内酯相似度结果
  批号   100401   100402   100403   100404   110101
  相似度   0.992   0.997   0.991   0.996   0.982
  批号   110102   110103   110601   110602   110603
  相似度   0.999   0.997   0.992   0.993   0.989
10批银杏内酯指纹图谱的相似度均大于0.95。
实施例10
银杏内酯质量控制——残留溶剂测定
(1)乙醇、乙酸乙酯和正己烷
供试品溶液的制备：取本发明银杏内酯约0.1g，精密称定，置顶空瓶中，精密加入N，N-二甲基甲酰胺5ml使溶解，密封，作为供试品溶液。
对照品溶液的制备：取乙醇、乙酸乙酯和正己烷适量，精密称定，用N，N-二甲基甲酰胺定量稀释制成每1ml中各约含30μg的溶液，精密量取5ml，置顶空瓶中，密封，作为对照品溶液。
测定法：以6％氰丙基苯基-94％二甲基聚硅氧烷(或极性相近)为固定液，起始温度为50℃，维持3分钟，以每分钟40℃的速率升温至160℃，维持3分钟；进样口温度200℃；检测器温度为250℃；顶空瓶平衡温度为80℃，平衡时间为30分钟。取对照品溶液顶空进样，各成分峰之间的分离度应符合要求；再取供试品溶液与对照品溶液分别顶空进样，记录色谱图，按外标法以峰面积计算。
含乙醇和乙酸乙酯均小于0.5％，正己烷小于0.029％。
(2)树脂残留量
对照品溶液的制备：取N，N-二甲基乙酰胺适量，精密称定，用水制成每1ml约含0.1mg的溶液，摇匀，作为内标溶液；精密称取己内酰胺适量，加内标溶液制成每1ml约含己内酰胺37.5μg的溶液，作为对照品溶液。
供试品溶液的制备：取本发明银杏内酯约2.5g，精密称定，置锥形瓶中，加正己烷25ml，回流2小时，取出，放冷，滤过，用少量正己烷洗涤，合并滤液与洗涤液，于60℃水浴蒸干，残渣加内标溶液1ml使溶解，作为供试品溶液。
测定法：以聚乙二醇(PEG-20M)(或极性相近)为固定液；起始温度为100℃，维持2分钟，以每分钟40℃的速率升温至160℃，维持3分钟，再以40℃的速率升温至220℃，维持7分钟；进样口温度为240℃；检测器温度为260℃。精密量取对照品溶液与供试品溶液各1μl，注入气相色谱仪，记录色谱图。按内标法以峰面积计算，供试品溶液中己内酰胺峰面积与内标峰面积的比值小于对照品溶液中己内酰胺峰面积与内标峰面积的比值。
己内酰胺未检出。
实施例11
银杏内酯质量控制——含量测定
色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-四氢呋喃-水(25∶10∶65)为流动相；用蒸发光散射检测器，漂移管温度：105℃；载气流速：3.00L/min；柱温：40℃；理论板数按白果内酯峰计算应不低于2500。白果内酯峰与银杏内酯C峰的分离度应大于1.5。
对照品溶液的制备：分别精密称取白果内酯对照品、银杏内酯A对照品、银杏内酯B对照品、银杏内酯C对照品适量，加甲醇制成每1ml分别含0.15mg、0.12mg、0.1mg、0.1mg的混合溶液，摇匀，作为对照品溶液。
供试品溶液的制备：取本发明银杏内酯6mg，精密称定，置10ml量瓶中加甲醇1ml溶解，加流动相稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。
测定法：分别精密量取对照品溶液10μl、20μl和供试品溶液10～20μl，注入高效液相色谱仪，记录色谱图，用外标两点法对数方程分别计算白果内酯、银杏内酯A、银杏内酯B和银杏内酯C的含量。
按干燥品计算，白果内酯(C15H18O8)为42.5％、银杏内酯A(C20H24O9)为25.4％、银杏内酯B(C20H24O10)为18.7％、银杏内酯C(C20H24O11)为10.6％，且白果内酯、银杏内酯A、银杏内酯B、银杏内酯C总量97.2％。
实施例12
银杏内酯质量控制——异常毒性检查
供试品溶液的制备：取本发明银杏内酯，加氯化钠注射液制成每1ml中含0.2mg的溶液。
检查法：取体重17～20g小鼠5只，分别注入小鼠尾静脉供试品溶液0.5ml，48小时内无死亡。
实施例13
银杏内酯质量控制——热原检查
供试品溶液的制备：取本发明银杏内酯10mg，加入到0.9％氯化钠注射液50ml中，摇匀。
检查法：取家兔3只，测定其正常体温后15分钟内，按家兔体重每1kg注射5ml自耳静脉缓缓注入供试品溶液，每隔30分钟测定体温1次，共测6次，体温升高均低于0.6℃，并且3只家兔体温升高总和低于1.3℃。
实施例14
银杏内酯注射液质量控制——有关物质检查
注射液处方：
制备方法为：
a)配制：混合乙醇和甘油，加入银杏内酯、溶解，补加乙醇或注射用水至全量，用5～10％枸橼酸溶液或1～10％盐酸溶液调节pH值至3.2～3.8；
b)过滤除菌；
c)灌封；
d)灭菌。
(1)蛋白质：取银杏内酯注射液2ml，加水制成50ml，作为供试品溶液。称取考马斯亮蓝G-250约50mg，溶于25ml乙醇中，再加入85％(w/v)的磷酸50ml，加水稀释至500ml，摇匀，过滤，精密量取滤液5ml置试管中，再加入1ml供试品溶液，摇匀，放置3min。同法做空白，于595nm波长下，测定吸光度，供试品溶液吸光度小于0.05。
(2)鞣质：取蛋白质检查项供试品溶液1ml加入稀醋酸1滴，再加明胶氯化钠试液5滴，摇匀，放置10分钟，未出现浑浊或沉淀。
(3)树脂：取蛋白质检查项供试品溶液5ml，加盐酸1滴，放置30分钟，无树脂状物质析出。
(4)草酸盐：取蛋白质检查项供试品溶液2ml，用稀盐酸调节pH值至1～2，滤过，滤液用氨水调节pH值为5～6，加3％氯化钙溶液3滴，放置10分钟，未出现浑浊或沉淀。
(5)钾离子：取蛋白质检查项供试品溶液2ml，置10ml纳氏比色管中，加碱性甲醛溶液0.6ml、3％EDTA溶液2滴、3％四苯硼钠溶液0.5ml，加水稀释至10ml，另取标准氯化钾溶液0.8ml，同法试验，浊度低于对照溶液。
实施例15
银杏内酯注射液质量控制——溶血与凝聚检查
供试品溶液的制备：取银杏内酯注射液(按实施例14制备)6ml，加入到0.9％氯化钠注射液100ml中摇匀。
检查法：取洁净玻璃试管5只，编号，1、2号管为供试品管，3号管为阴性对照管，4号管为阳性对照管，5号管供试品对照管。按表12所示依次加入2％红细胞悬液、0.9％氯化钠溶液、蒸馏水，混匀后立即置37℃±0.5℃的恒温箱中进行温育。
表12溶血和凝聚试验加入量
  试管编号   1   2   3   4   5
  2％红细胞悬液/ml   2.5   2.5   2.5   2.5
  0.9％氯化钠溶液/ml   2.2   2.2   2.5   4.7
  蒸馏水/ml   2.5
  供试品溶液/ml   0.3   0.3   0.3
如试管中的溶液呈澄明红色，底部无细胞残留或有少量红细胞残留，表明有溶血发生；如红细胞全部下沉，上清液无色澄明，或上清液虽有色澄明，但1，2号管和5号管肉眼观察无明显差异，则表明无溶血发生。3小时后观察未产生溶血和凝聚反应。
实施例16
银杏内酯注射液质量控制——指纹图谱检查
色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-四氢呋喃-水(25∶10∶65)为流动相；用蒸发光散射检测器，漂移管温度：105℃；载气流速：3.00L/min；柱温：40℃；理论板数按白果内酯峰计算应不低于2500。白果内酯峰与银杏内酯C峰的分离度应大于1.5。
参照物溶液的制备：分别精密称取白果内酯对照品、银杏内酯A对照品、银杏内酯B对照品、银杏内酯C对照品适量，加甲醇制成每1ml分别含0.15mg、0.12mg、0.1mg、0.1mg的混合溶液，摇匀，作为参照物溶液。
供试品溶液的制备：取[含量测定]项下的供试品溶液。
测定法：分别精密吸取参照物溶液和供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，记录60分钟的色谱图。
按中药色谱指纹图谱相似度评价系统，供试品指纹图谱与对照指纹图谱经相似度大于0.95。
实施例17
银杏内酯注射液质量控制——含量测定
色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-四氢呋喃-水(25∶10∶65)为流动相；用蒸发光散射检测器，漂移管温度：105℃；载气流速：3.00L/min；柱温：40℃；理论板数按白果内酯峰计算应不低于2500。白果内酯峰与银杏内酯C峰的分离度应大于1.5。
对照品溶液的制备：分别精密称取白果内酯对照品、银杏内酯A对照品、银杏内酯B对照品、银杏内酯C对照品适量，加甲醇制成每1ml分别含0.15mg、0.12mg、0.1mg、0.1mg的混合溶液，摇匀，作为对照品溶液。
供试品溶液的制备：精密量取银杏内酯注射液(按实施例14制备)1ml，加磷酸盐缓冲溶液(pH6.5)14ml，摇匀，上Extrelut-20柱，吸附15分钟，用乙酸乙酯100ml洗脱，收集洗脱液，于水浴上蒸干，残渣用流动相溶解并转移至10ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，用0.45μm微孔滤膜滤过，作为供试品溶液。
测定法：分别精密吸取对照品溶液10μl、20μl，供试品溶液15μl，注入高效液相色谱仪，记录色谱图，用外标两点法对数方程分别计算白果内酯、银杏内酯A、银杏内酯B和银杏内酯C的含量。
银杏内酯注射液中每1ml含银杏萜类内酯5.15mg。
银杏内酯注射液中每1ml含银杏萜类内酯以白果内酯(C15H18O8)、银杏内酯A(C20H24O9)、银杏内酯B(C20H24O10)和银杏内酯C(C20H24O11)的总量计为1-10mg，优选4.25～5.75mg。

Claims (9)

1.银杏内酯的提取分离方法，其特征在于：步骤如下：
A、提取：粉碎银杏叶，加有机溶剂提取，浓缩提取液中加抗氧化保护剂，用pH调节剂调pH值至4～5，浓缩、冷藏；
其中，步骤A所述提取有机溶剂为乙醇、丙酮或乙酸乙酯，浓度为50～80％v/v，用量为5～12倍量；
B、萃取：将冷藏后的浓缩液先用正己烷或石油醚萃取2～3次；水相用脂溶性溶剂萃取4～5次，再用水饱和仲丁醇-乙酸乙酯混合溶剂或水饱和正丁醇-乙酸乙酯混合溶剂萃取4～5次，合并有机相萃取液，减压浓缩；
C、过柱：将萃取浓缩液过聚酰胺树脂柱，依次用1～5BV水、3～5BV 20％～40％v/v乙醇、2～3BV 60％～90％v/v乙醇洗脱，控制洗脱液流速为2～3BV/h；合并洗脱液；减压浓缩，干燥；
D、析晶：将过柱后的干燥物加入沸水中，搅拌溶解，冷却，上清液用等体积乙酸乙酯、甲酸乙酯或丙酮萃取4～5次，合并萃取液，减压浓缩，蒸干，加5～8倍量30％～50％v/v乙醇加热搅拌溶解，过滤，冷藏，析出晶体，滤过，滤液I备用，晶体用30％～50％v/v乙醇洗涤，减压干燥，得到晶体I；
滤液I浓缩至含醇量为10％～30％v/v，冷藏，析出晶体，滤过，滤液II备用；用30％～50％v/v乙醇洗涤，减压干燥，得晶体II；
浓缩滤液II，加0.1％～0.5％活性炭吸附，过滤，滤液浓缩至含醇量为10％～30％v/v，冷藏，析出晶体，滤过，滤液III备用；晶体用30％～50％v/v乙醇洗涤，减压干燥，得晶体III；
滤液III浓缩，过活性炭-硅胶柱，先用30％～50％v/v乙醇洗脱，再用70％～90％v/v乙醇洗脱，收集洗脱液浓缩至含醇量为10％～30％v/v，冷藏，析出晶体，滤过，滤液IV备用；晶体用30％v/v乙醇洗涤，减压干燥，得晶体IV；
滤液IV浓缩，冷藏，析出晶体，滤过，晶体用30％v/v乙醇洗涤，减压干燥，得晶体V；
E、混晶：将晶体I、II、III、IV、V混合均匀，粉碎，即得银杏内酯。
2.根据权利要求1所述的银杏内酯的提取分离方法，其特征在于：步骤A所述提取的方式为回流提取或煎煮提取。
3.根据权利要求2所述的银杏内酯的提取分离方法，其特征在于：所述回流提取采用乙醇、丙酮或乙酸乙酯提取，其中，不同提取溶剂的浓度及提取条件如下：
乙醇：浓度为50％～80％v/v，提取温度75～85℃，提取次数2～3次，时间每次1～2小时；
丙酮：浓度为50％～80％v/v，提取温度45～55℃，提取次数2～3次，时间每次1～2小时；
乙酸乙酯：浓度为50％～80％v/v，提取温度55～65℃，提取次数2～3次，时间每次1～2小时；
进一步，优选提取条件为：提取3次，每次1.5小时；乙醇浓度65％v/v；丙酮浓度50％v/v；乙酸乙酯浓度60％v/v。
4.根据权利要求2所述的银杏内酯的提取分离方法，其特征在于：所述煎煮提取采用乙醇、丙酮或乙酸乙酯提取，其中，不同提取溶剂的浓度及提取条件如下：
乙醇：浓度为50％～80％v/v，提取温度80～90℃，提取次数2～3次，时间每次1～2小时；
丙酮：浓度为50％～80％v/v，提取温度50～60℃，提取次数2～3次，时间每次1～2小时；
乙酸乙酯：浓度为50％～80％v/v，提取温度60～65℃，提取次数2～3次，时间每次1～2小时；
进一步，优选提取条件为：提取3次，每次1.5小时；乙醇浓度65％v/v；丙酮浓度50％v/v；乙酸乙酯浓度60％v/v。
5.根据权利要求1所述的银杏内酯的提取分离方法，其特征在于：步骤A所述抗氧化保护剂为中性氨基酸；
进一步，抗氧化保护剂优选丝氨酸、蛋氨酸、天冬酰胺或苏氨酸中的至少一种；
进一步，抗氧化保护剂最优选蛋氨酸。
6.根据权利要求1所述的银杏内酯的提取分离方法，其特征在于：步骤A所述pH调节剂为有机弱酸；
进一步，pH调节剂优选枸橼酸、苹果酸或山梨酸中的至少一种；
进一步，pH调节剂最优选枸橼酸。
7.根据权利要求1所述的银杏内酯的提取分离方法，其特征在于：步骤B所述脂溶性溶剂为乙酸乙酯、甲酸乙酯、丙酮、丁酮中的至少一种。
8.根据权利要求1所述的银杏内酯的提取分离方法，其特征在于：步骤C过柱所述聚酰胺树脂柱中聚酰胺树脂的粒度为30～60目。
9.根据权利要求1所述的银杏内酯的提取分离方法，其特征在于：步骤D析晶中所述活性炭-硅胶柱中活性炭与硅胶的体积为体积比1∶1～1∶3。
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