CN102911184A

CN102911184A - 白果内酯的分离纯化制备方法

Info

Publication number: CN102911184A
Application number: CN2012104571188A
Authority: CN
Inventors: 朱永红; 孙毅
Original assignee: CHENGDU BAIYU TECHNOLOGY PHARMACEUTICAL CO LTD
Current assignee: Chengdu Baiyu Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2012-11-14
Filing date: 2012-11-14
Publication date: 2013-02-06
Anticipated expiration: 2032-11-14
Also published as: CN102911184B; WO2014075461A1

Abstract

白果内酯的分离纯化方法，其特征在于：它包括如下步骤：（1）取银杏叶提取物，以甲醇或甲醇水溶液溶解，滤过，滤液备用；（2）取步骤（1）的滤液，浓缩至干，甲醇溶解后，上反相硅胶柱，用10%v/v甲醇溶液除杂后，再以体积比为甲醇-异丙醇-水=(23-27)：(8-12)：(63-67)洗脱，白果内酯作对照TLC点板跟踪，合并白果内酯段洗脱液，浓缩至干，得白果内酯粗品；（3）取白果内酯粗品，重结晶，干燥，即得白果内酯。本发明在不使用超临界CO₂精制纯化的基础上，通过对柱层析、重结晶步骤的筛选，制备得到了纯度97%以上的白果内酯，且转移率高；与现有技术相比，本发明不仅分离得到了高纯度的白果内酯，还减少了工艺步骤，有效降低了设备成本和生产能耗，更适于工业化生产。

Description

白果内酯的分离纯化制备方法

背景技术

白果内酯（bilobalide），是银杏叶中重要的活性成分之一，它属倍半萜内酯，由R.T.Major于1967年和K.Weinges于1969年分离得到，目前从银杏叶中发现的唯一的一个倍半萜内酯化合物，其结构式如下：

白果内酯结构式

分子式：C₁₅H₁₈O₈分子量：326.3

白果内酯有很强的生物活性，具有促进神经生长的作用，可防止脑细胞线粒体氧化应激引起的功能改变，改善老年记忆功能，防止老年痴呆的发生，以及防止脑、脊髓神经脱髓鞘作用，用于治疗神经病、脑病和脊髓病，症状包括：感觉异常、软瘫或麻痹性痴呆、非正常神经反射、肌肉萎缩、肌肉痉挛、震颤、表面性或深度敏感性失调、头痛和四肢痛、语言失调、视力和听力失调、玄晕、神经失调和缺乏集中性、记忆力减退及定向力消失等。白果内酯对脑水肿和脑缺血的疗效明显，具有神经保护作用。白果内酯的急毒试验表明，各剂量组的动物行为活动正常，高中低剂量组大鼠所检测的各项指标与对照组比较未见明显由于药物所致的异常变化，动物未表现出明显的毒性反应。长期毒性实验表明，各剂量组的动物生理状况未见异常，血液学、血液生化、主要脏器系数、组织病理学等多项指标检查均未见异常改变。

白果内酯良好的药效活性和较低的不良反应，使其成为目前对银杏叶内酯成分研究的热点之一。白果内酯与银杏叶提取物中的黄酮类物质、胶体物质的溶解性差别很小，分离纯化非常困难，对白果内酯单体的分离、纯化，几年国内多直接以银杏叶提取物为原料，采用高效液相制备色谱、配位色谱法分离纯化、硅胶柱分离重结晶法、超临界流体萃取法或者使用大孔吸附树脂进行分离，但是，一般用普通硅胶柱分离和制备色谱柱分离，存在很多局限性，普通硅胶柱分离度差，周期长，得到产品纯度低，硅胶无法再生循环利用，环境污染大，高速逆流制备色谱和配位色谱法虽然能得到高纯度产品，但成本较高，产量极小，无法进行大规模工业化生产。随着柱层析技术的发展，目前也有人采用反相硅胶柱层析来分离白果内酯，如专利号：200410065104.7，采用反相硅胶柱色谱，以乙醇-水（95：5~5：95）梯度洗脱，收取白果内酯流分，浓缩至干，用甲醇溶液重结晶后，干燥，得到含量大于97%的白果内酯，收率在90%以上。该方法分离速度较快，且白果内酯纯度和收率较高，反相硅胶可以反复使用，大大的节约生产成本，但是，它需要使用超临界萃取技术，其生产成本和设备要求较高，不利于该分离方法的普及。

发明内容

本发明的目的在于提供一种无需特殊设备就能迅速分离纯化得到高纯度白果内酯的方法。

本发明提供了白果内酯的分离纯化方法，它包括如下步骤：

（1）取银杏叶提取物，以甲醇或甲醇水溶液溶解，滤过，滤液备用；

（2）取步骤（1）的滤液，浓缩至干，甲醇溶解后，上反相硅胶柱，用10%v/v甲醇溶液除杂后，再以体积比为甲醇-异丙醇-水=(23-27)：(8-12)：(63-67)洗脱，白果内酯作对照TLC点板跟踪，合并白果内酯段洗脱液，浓缩至干，得白果内酯粗品；

（3）取白果内酯粗品，重结晶，干燥，即得白果内酯。

其中，步骤（1）中，所述甲醇水溶液浓度为20%v/v。

其中，步骤（2）中，10%v/v甲醇溶液的洗脱用量为2倍柱体积。

进一步地，步骤（2）中，甲醇-异丙醇-水的比例为25：10：65。

其中，步骤（2）中，甲醇-异丙醇-水的洗脱速度在2L/h以下。

进一步地，甲醇-异丙醇-水的洗脱速度为0.5~2L/h。

进一步优选地，甲醇-异丙醇-水的洗脱速度为2L/h。

其中，步骤（2）中，所述述反相硅胶柱的径高比为（8~12）：（50~60）。

进一步地，，步骤（2）中，所述反相硅胶柱的填料为RP-C18。

进一步地，所述反相硅胶柱的填料粒径为10-20μm；反相硅胶柱的径高比为1：4-8。

进一步优选地，所述反相硅胶柱的填料粒径为10μm；反相硅胶柱的径高比为1：5。

其中，步骤（3）中，重结晶所用溶媒为20-30%v/v甲醇，溶媒用量为干浸膏的5-10倍。

进一步地，步骤（3）中，重结晶所用溶媒为30%v/v甲醇，溶媒用量为干浸膏的6-8倍。

其中，所述银杏叶提取物中，含总黄酮醇苷不少于24.0%，含萜类内酯以白果内酯、白果内酯A、白果内酯B、白果内酯C的总量计不少于6.0%；在以甲醇或甲醇水溶液溶解之前还需要预处理，预处理的方法为：银杏叶提取物在水中加热搅拌，过滤，收集滤渣，即可。

其中，所述银杏叶提取物为银杏总内酯，其中，白果内酯含量在25%w/w以上。

进一步地，所述银杏叶提取物为银杏总内酯，其中，所述白果内酯含量为25%~50%w/w。

更进一步地，所述银杏叶提取物为银杏总内酯，其中，总内酯含量在90%w/w以上。

本发明在不使用超临界CO₂精制纯化的基础上，通过对反相柱层析、重结晶步骤的筛选，制备得到了纯度97%以上的白果内酯，且转移率高；与现有技术相比，本发明不仅分离得到了高纯度的白果内酯，还减少了工艺步骤，有效降低了设备成本和生产能耗，更适于工业化生产。

附图说明

图1银杏总内酯含量测定HPLC图

图2洗脱速度白果内酯转移率的影响

图3白果内酯含量测定HPLC图

具体实施方式

实施例1白果内酯的分离纯化

取银杏叶提取物200g，加1000ml热水搅拌溶解，过滤，滤渣用20%甲醇200ml加热搅拌溶解，滤过，滤液低温放置，滤过，滤液浓缩至干，加甲醇200ml加热溶解，上反相硅胶柱（RP-C18，粒径10μm，直径80mm，硅胶高度500mm），先用10%甲醇溶液3L洗涤，流速2L/h，弃去；再用7.5L甲醇-异丙醇-水（25：10：65）分段洗脱，流速2L/h，每段0.5L，白果内酯作对照TLC点板跟踪，收集含白果内酯段洗脱液，减压浓缩至干，得白果内酯粗品，再加6~8倍量30%甲醇加热溶解，低温放置（0—8℃），析出晶体，60℃减压干燥，得白果内酯5.9g，经HPLC测定（参见图3），纯度为98.2%，白果内酯转移率88.8%。

实施例2白果内酯的分离纯化

取银杏叶提取物2kg，加8~10L热水搅拌溶解，过滤，滤渣用2~3L20%甲醇加热搅拌溶解，滤过，滤液低温放置，滤过，滤液浓缩至干，加甲醇200ml加热溶解，上反相硅胶柱（RP-C18，粒径10μm，直径120mm，硅胶高度600mm），先用10%甲醇溶液7L洗涤，流速2L/h，弃去；再用20L甲醇-异丙醇-水（25：10：65）分段洗脱，流速2L/h，每段1.5L，白果内酯作对照TLC点板跟踪，收集含白果内酯段洗脱液，减压浓缩至干，得白果内酯粗品，再加6~8倍量30%甲醇加热溶解，低温放置（0—8℃），析出晶体，60℃减压干燥，得白果内酯57.8g，含量97.6%，白果内酯转移率86.4%。

实施例1、2所用银杏叶提取物，符合《中国药典》2010年版一部要求，即含总黄酮醇苷不少于24.0%，含萜类内酯以白果内酯、银杏内酯A、银杏内酯B、银杏内酯C的总量计不少于6.0%。

经测定，所用银杏叶提取物所含银杏总内酯为6.8%，该原料可通过购买市售商品得到，也可以通过药典方法制备。

实施例3白果内酯的分离纯化

取银杏总内酯50g，加甲醇50ml加热溶解，冷却至室温，上反相硅胶柱（RP-C18，粒径10μm，直径80mm，硅胶高度500mm），先用10%甲醇溶液3L洗涤，流速2L/h，再用10L甲醇-异丙醇-水（25：10：65）分段洗脱，每段约1L，白果内酯作对照TLC点板跟踪，收集含白果内酯段洗脱液，减压浓缩至干，得白果内酯粗品，再加6~8倍量30%甲醇加热溶解，低温放置（0—8℃），析出晶体，60℃减压干燥，得白果内酯19.3g，含量97.6%，白果内酯转移率90.1%。

实施例4白果内酯的分离纯化

取银杏总内酯300g，加甲醇200ml加热溶解，冷却至室温，上反相硅胶柱（RP-C18，粒径10μm，直径120mm，硅胶高度600mm），先用10%甲醇溶液8L洗涤，流速2L/h，再用20L甲醇-异丙醇-水（25：10：65）分段洗脱，每段约1.5L，白果内酯作对照TLC点板跟踪，收集含白果内酯段洗脱液（约8~10段），减压浓缩至干，得白果内酯粗品，再加6~8倍量30%甲醇加热溶解，低温放置（0—8℃），析出晶体，60℃减压干燥，得白果内酯115.0g，含量98.1%，白果内酯转移率90.0%。

实施例3、4所用银杏总内酯，是按照专利申请号：201210121252.0中公开的方法制备，经测定，总内酯含量为95.2%以上，其中白果内酯含量为42.5％（参见图1）。本发明中，所述银杏总内酯，也可以通过购买市售商品得到，或通过其他现有方法制备，如专利申请号：201110267979.5。

实施例5本发明分离纯化方法的筛选

a、洗脱剂种类对白果内酯分离效果的影响

分别选取20%甲醇、30%甲醇、40%甲醇和甲醇-异丙醇-水（25：10：65）为洗脱剂，称取银杏总内酯50g（内酯含量95%以上），先用2BV 10%甲醇溶液洗涤，速度为2L/h，再用上述洗脱剂洗脱，收集含白果内酯洗脱液，减压浓缩至干，研究洗脱剂对白果内酯分离效果的影响。

不同洗脱剂洗脱试验结果见表1。

表1不同洗脱剂对白果内酯分离效果试验

洗脱剂	白果内酯纯度（%）	白果内酯转移率（%）
			20%甲醇	52.6	45.1
30%甲醇	64.3	50.2
			40%甲醇	62.7	56.5
甲醇-异丙醇-水（25：10：65）	96.1	89.5

实验小结：

在洗脱过程中，白果内酯C首先被洗脱，然后依次是白果内酯和白果内酯A被洗脱。适当浓度甲醇虽然能将白果内酯洗脱，白果内酯的分离度不好，转移率较低，不能满足大生产需要。从白果内酯纯度和转移率来看，以甲醇-异丙醇-水（25：10：65）为洗脱剂效果较好。

b、洗脱速度对白果内酯分离效果的影响

对洗脱速度为0.5L/h、1L/h、2L/h、3L/h、4L/h进行考察：称取银杏总内酯100g（内酯含量95%以上），按实施例3制备，洗脱剂为甲醇-异丙醇-水（25：10：65）时，研究不同洗脱速度对白果内酯分离效果的影响。

洗脱速度白果内酯转移率及纯度影响试验结果见图2和表2。

表2洗脱速度白果内酯纯度影响

洗脱速度（L/h）	白果内酯的纯度（%）	白果内酯转移率（%）
			0.5	75.6	95.6
1	88.7	92.7
			2	96.2	90.2
3	87.5	82.6
			4	52.8	75.6

实验小结：

洗脱速度越慢白果内酯的洗脱效果越好，但流速过慢耗时较长，相反，洗脱速度为3L/h以上时，虽然白果内酯被洗脱下来的速度较快，但白果内酯与银杏内酯A的分离效果较差，白果内酯的转移率及纯度都较低。

从白果内酯纯度和转移率来看，洗脱速度在2L/h效果较好。

c、重结晶溶媒的选择

为了得到高纯度白果内酯单体，柱层析分离后的干燥物需要进一步的纯化，采用结晶的方法进行纯化。

影响结晶的主要因素有溶媒浓度、体积及温度，由于白果内酯在高温下不稳定，选取60℃溶解样品的温度，对溶剂与固液比进行研究。

选择20%、30%、40%和50%v/v的甲醇水溶液为溶剂，称取白果内酯粗品20g，按实施例3制备，在60℃溶解样品，溶剂用量以完全溶解为准，低温放置，研究不同浓度甲醇溶液对收率的影响。溶媒浓度对转移率试验结果见表3。

表3甲醇浓度对收率的影响

样品量(g)	甲醇浓度（%）	溶剂用量(ml)	转移率（%）
				20	20	190	84.5
20	30	140	86.8
				20	40	100	72.1
20	50	80	60.4

实验小结：

粗品中白果内酯与其它杂质都溶于甲醇，因此，甲醇浓度不宜过高；浓度较高时杂质的干扰作用会使转移率降低，也无法得到高纯度的白果内酯晶体。由实验可知，甲醇浓度在20~30%时，白果内酯的转移率最高，为了保证最佳专业率，将结晶溶媒选为30%甲醇。

d、溶媒体积对结晶的影响

称取白果内酯粗品20g（按实施例2制备），以30%的甲醇溶液为溶剂，温度为60℃，溶剂用量为粗品重量的4倍、6倍、8倍和10倍，样品溶解完全后低温放置，研究不同体积对收率的影响。

溶媒体积对结晶的影响试验结果见表4。

表4溶媒体积对结晶的影响

样品量(g)	甲醇浓度（%）	溶剂用量(ml)	转移率（%）
				20	30	200	72.5
20	30	160	86.8
				20	30	120	88.1
20	30	80	70.4

实验小结：

溶媒体积对结晶影响较大，溶剂用量太少时很难进行热过滤，并会导致样品损耗；溶剂用量过多，晶体不能完全析出，影响收率。经实验可知，甲醇用量为6~8倍时，晶体析出最多，转移率最大。

因此，综合上述实验，本发明重结晶选用6~8倍量30%甲醇。

综上所述，本发明在不使用超临界萃取精制纯化的基础上，通过对柱层析、重结晶步骤的筛选，制备得到了纯度97%以上的白果内酯，且转移率高；与现有技术相比，本发明不仅分离得到了高纯度的白果内酯，还减少了工艺步骤，有效降低了设备成本和生产能耗，更适于工业化生产。

Claims

1.白果内酯的分离纯化方法，其特征在于：它包括如下步骤：

（3）取白果内酯粗品，重结晶，干燥，即得白果内酯。

2.根据权利要求1所述的分离纯化方法，其特征在于：步骤（1）中，所述甲醇水溶液浓度为20%v/v。

3.根据权利要求1所述的分离纯化方法，其特征在于：步骤（2）中，10%v/v甲醇溶液的洗脱用量为1~2倍柱体积。

4.根据权利要求1所述的分离纯化方法，其特征在于：步骤（2）中，甲醇-异丙醇-水的比例为25：10：65；优选地，甲醇-异丙醇-水的洗脱速度在2L/h以下，洗脱用量为2~5倍柱体积。

5.根据权利要求4所述的分离纯化方法，其特征在于：甲醇-异丙醇-水的洗脱速度为0.5~2L/h；优选地，甲醇-异丙醇-水的洗脱速度为2L/h。

6.根据权利要求1所述的分离纯化方法，其特征在于：步骤（2）中，所述述反相硅胶柱的径高比为（8~12）：（50~60）。

7.根据权利要求1或6所述的分离纯化方法，其特征在于：所述反相硅胶柱的填料为RP-C18。

8.根据权利要求1所述的分离纯化方法，其特征在于：步骤（3）中，重结晶所用溶媒为20-30%v/v甲醇，溶媒用量为白果内酯粗品的5-10倍；优选地，重结晶所用溶媒为30%v/v甲醇，溶媒用量为白果内酯粗品的6-8倍。

9.根据权利要求1所述的分离纯化方法，其特征在于：所述银杏叶提取物中，含总黄酮醇苷不少于24.0%，含萜类内酯以白果内酯、白果内酯A、白果内酯B、白果内酯C的总量计不少于6.0%；在以甲醇或甲醇水溶液溶解之前还需要预处理，预处理的方法为：银杏叶提取物在水中加热搅拌，过滤，收集滤渣，即可。

10.根据权利要求1所述的分离纯化方法，其特征在于：所述银杏叶提取物为银杏总内酯，其中，白果内酯含量在25%w/w以上。

11.根据权利要求10所述的分离纯化方法，其特征在于：所述银杏叶提取物为银杏总内酯，其中，所述白果内酯含量为25%~50%w/w；优选地，银杏叶提取物中总内酯含量在90%w/w以上。