JP5940212B2 - ギンコライドの抽出分離方法 - Google Patents
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Description
50%〜80%v/vエタノール:抽出温度が75〜85℃で、抽出回数が2〜3回で、時間が1〜2時間/回であり、
50%〜80%v/vアセトン:抽出温度が45〜55℃で、抽出回数が2〜3回で、時間が1〜2時間/回であり、
50%〜80%v/v酢酸エチル:抽出温度が55〜65℃で、抽出回数が2〜3回で、時間が1〜2時間/回であり、
真空度:−0.02〜0.08MPa
好ましい抽出条件が:3回抽出して、毎回1.5時間で、エタノールの適当な濃度が65%v/vで、アセトンの適当な濃度が50%v/vで、酢酸エチルの適当な濃度が60%v/vである。
50%〜80%v/vエタノール:抽出温度が80〜90℃で、抽出回数が2〜3回で、時間が1〜2時間/回であり、
50%〜80%v/vアセトン:抽出温度が50〜60℃で、抽出回数が2〜3回で、時間が1〜2時間/回であり、
50%〜80%v/v酢酸エチル:抽出温度が60〜65℃で、抽出回数が2〜3回で、時間が1〜2時間/回であり、
好ましい抽出条件が:3回抽出して、毎回1.5時間で、エタノールの適当な濃度が65%v/vで、アセトンの適当な濃度が50%v/vで、酢酸エチルの適当な濃度が60%v/vである。
a)性状:類白色または微黄色結晶粉末である。酢酸エチルに溶けやすく、メタノール、エタノールに溶け、水にはほとんど溶けない。
b)水分:5.0%より低い。
c)蛋白質:595nmの吸光度が0.05より小さい。
d)タンニン、樹脂、シュウ酸塩、カリウムイオン:検出されていない。
e)残留溶媒:エタノール及び酢酸エチルとも0.5%より低く、ノルマルヘキサンが0.029%より低く、カプロラクタムが0.0015%より低い。
f)総ギンコール酸:HPLC法で測定した総ギンコール酸の含有量が5ppmより低い。
g)大分子及び重合体:ゲルクロマトグラフィーで測定した結果、残留大分子及び重合体は検出されていない。LC−MS法で測定した結果、分子量が1000より大きい大分子物質及び重合体は検出されていない。
h)重金属:10ppmより低い。
i)ヒ素塩:2ppmより低い。
k)異常毒性:調製された0.2mg/ml溶液が静脈注射法投与に適する。
l)フィンガープリント:HPLC法によって測定し、ビロバリド標準物、ギンコライドA標準物、ギンコライドB標準物、ギンコライドC標準物を参照物質とし、漢方薬クロマトフィンガープリントの類似度評価システムに基づき、4つの共通ピークの類似度は0.95より大きい。
m)含有量:HPLC法によって測定し、乾燥品に基づいて計算し、ビロバリド(C15H18O8)25.0〜50.0%、ギンコライドA(C20H24O9)20.0〜45.0%、ギンコライドB(C20H24O10)10.0〜30.0%、ギンコライドC(C20H24O11)5.0〜15.0%を含有し、且つビロバリド、ギンコライドA、ギンコライドB、ギンコライドCの総含有量は95%より大きい。
酢酸エチルに溶けやすく、メタノール、エタノールに溶け、水にほとんど溶けない。
b)水分:60℃で減圧し乾燥減量が5.0%より小さい。
c)蛋白質:595nmでの吸光度が0.05より小さい。
本発明のギンコライド約24mgを取り、エタノール2mlを加えて溶解した後、水を加えて50mlまで希釈し、試料溶液とする。ブラッドフォード法(Bradford法)に基づいて測定し、対応する試薬をブランクとし、595nmでの吸光度が0.05より小さい。
採用可能な測定方法は、
タンニン:蛋白質測定項目用の試料溶液1mlを取り、希酢酸1滴を加え、さらにゼラチン塩化ナトリウム試液5滴を加え、振り混ぜて、10分間放置し、混濁または沈殿物は認められない。
(1)エタノール、酢酸エチル及びノルマルヘキサン:エタノール及び酢酸エチルの含有量が共に0.5%より低く、ノルマルヘキサンの含有量が0.029%より低い。
(2)樹脂残留量:カプロラクタムの含有量が0.0015%より低い。
測定方法:
(1)ゲルクロマトグラフィーカラム:Phenomenex BioSep−SEC−S2000、300×7.8mm、5μm、移動相:0.71%(うち、0.02%のアジ化ナトリウムを含有する)硫酸ナトリウム溶液、カラム温度:35℃、検出器温度:35℃、流速:0.5ml/min。結果:残留大分子及び重合体が検出されていない。
i)ヒ素塩:2ppmより低い。
試料溶液の調製:本発明のギンコライド約25mgを取り、エタノール2mlで溶解した後塩化ナトリウム注射液を加えて0.2mg/ml溶液を調製する。
検査法:体重17〜20gのマウス5匹を取り、マウスの尾静脈に試料溶液0.5mlを注入し、48時間以内に死亡が認められない。
試料溶液の調製:本発明のギンコライド20mgを精密に量り、2mlエタノールを加えて溶解させ、さらに100mlの0.9%塩化ナトリウム注射液に加える。
検査方法:家兎3匹を取り、その正常体温を測定した後15分以内に、家兎体重に基づいて1kg当たりに5ml、試料溶液を耳静脈から注射し、30分毎に体温を1回測定し、合計6回測定し、体温の上昇は全て0.6℃より低く、且つ3匹の家兎の体温の上昇が合計1.3℃より低いはずである。
Agilent 1200型高速液体クロマトグラフ、紫外検出器、示差屈折率検出器。
Phenomenex BioSep−SEC−S2000ゲルクロマトグラフカラム。
デキストラン標準物質D2000(ブルーデキストラン2000)、中検所、ロット番号140646−2000−01
グルコース標準物質(D0)、含有量:99.5%、ロット番号086K0166、SIGMA。
超純水はMillipore−Q超純水システムによって製造される。
その他の試薬は分析級試薬である。
0.71%(うち、0.02%のアジ化ナトリウムを含有する)硫酸ナトリウム溶液を移動相とする。
汎用型検出器の示差屈折率検出器を選び、当該検出器は屈折係数の差異が存在する物質に対して全て良好な応答を有する。
クロマトグラフカラム:Phenomenex BioSep−SEC−S2000、300×7.8mm、5μm
移動相:0.71%(うち、0.02%のアジ化ナトリウムを含有する)硫酸ナトリウム溶液
カラム温度:35℃、検出器温度:35℃、流速:0.5ml/min
1.デキストラン及びグルコースの標準物質にそれぞれ移動相を加えて10mg/mlの溶液を調整し、それぞれ標準物質の溶液20μlを精密に取り、クロマトグラフに注入し、クロマトグラムを記録し、結果、デキストランは保持時間9.816’にてピークが現れ、グルコースは保持時間18.712’にてピークが現れることから、ゲルクロマトグラフィー法を採用すると、分子量の大きい物質が先にピークが現れ、分子量の小さい物質が後にピークが現れることを示す。
クロマトグラフィー条件及びシステム適用性試験:オクタデシルシリル基結合シリカゲルを充填剤とし、メタノール−1%氷酢酸(90:10)を移動相とし、流速が1.0ml/minで、検出波長が310nmである。理論段数がギンコール酸に基づいて計算すると4000より低くないはずである。
試料溶液の調製:本発明のギンコライド5gを取り、精密に量り、フラスコに入れ、石油エーテル(60〜90℃)50mlを精密に加え、2時間還流し、取り出し、放冷し、ろ過を行い、残渣を少量の石油エーテルでさらに1回洗浄し、ろ液と洗浄液を併せ、水浴上に置いて蒸発乾燥し、残渣はメタノールを加えて溶解し且つ2mlまで希釈し、振り混ぜて、試料溶液(1)とする。
試料溶液の調製:本発明のギンコライド5gを取り、精密に量り、フラスコに入れ、ノルマルヘキサン50mlを精密に加え、2時間還流し、取り出し、放冷し、ろ過を行い、残渣を少量のノルマルヘキサンでさらに1回洗浄し、ろ液と洗浄液を併せ、水浴上に置いて蒸発乾燥し、残渣はメタノールを加えて溶解し且つ2mlまで希釈し、振り混ぜて、試料溶液(2)とする。
試料溶液の調製:本発明のギンコライド5gを取り、精密に量り、フラスコに入れ、濃度が1.032mg/mlである総ギンコール酸標準物質溶液0.2mlを精密に加え、さらにノルマルヘキサン50mlを精密に加え、2時間還流し、放冷し、ろ過を行い、残渣を少量のノルマルヘキサンでさらに洗浄し、ろ液と洗浄液を併せ、水浴に置いて蒸発乾燥し、残渣はメタノールを加えて溶解し且つ2mlまで希釈し、振り混ぜて、試料溶液とする。
標準物質溶液の調製:ギンコール酸標準物質適量を取り、精密に量り、メタノールを加えて1ml当たりに5μgを含有する溶液を調整して標準物質溶液とする。また、総ギンコール酸標準物質適量を別に取り、精密に量り、メタノールを加えて1ml当たりに100μgを含有する溶液を調整して位置決め用標準溶液とする。
試料溶液の調製:本発明のギンコライド5gを取り、精密に量り、合計3回分を量り、それぞれフラスコに入れ、濃度が3.04μg/mlであるギンコール酸標準物質溶液1.6ml、2.0ml、2.4mlをそれぞれ加え、さらにノルマルヘキサン50mlをそれぞれ加え、2時間還流させ、放冷し、ろ過を行い、残渣を少量のノルマルヘキサンで洗浄し、ろ液と洗浄液を併せて、水浴上に置いて蒸発乾燥させ、残渣はメタノール溶液を加えて溶解し且つ2mlまで希釈し、振り混ぜて、試料溶液とする。
測定方法:試料溶液、標準物質溶液それぞれ20μlを精密に取り、液体クロマトグラフに注入し、クロマトグラムを記録する。各濃度は3回測定し、合計9回である。回収率、RSD値を計算する。試験結果は表10に示す。
クロマトグラフィー条件及びシステム適用性試験:オクタデシルシリル基結合シリカゲルを充填剤とし、メタノール−テトラヒドロフラン−水(25:10:65)を移動相とし、蒸発型光散乱検出器を使用し、ドリフトチューブ温度が105℃、キャリアガス流速が3.00L/minで、カラム温度が40℃で、理論段数はビロバリドピークに基づいて計算すると2500より低くないはずである。ビロバリドピークとギンコライドCピークとの分離度は1.5より大きいはずである。
(1)エタノール、酢酸エチル及びノルマルヘキサン
試料溶液の調製:本発明のギンコライド約0.1gを取り、精密に量り、ヘッドスペースボトルに入れ、N,N−ジメチルホルムアミド5mlを精密に加えて溶解させ、密封し、試料溶液とする。
標準物質溶液の調製:適量のN,N−ジメチルホルムアミドを取り、精密に量り、水で1ml当たりに約0.1mgを含有する溶液を調整し、振り混ぜて、内部標準液とし、カプロラクタムを適量に量り、内部標準液を加えて1ml当たりに約37.5μgのカプロラクタムを含有する溶液を調整し、標準物質溶液とする。
カプロラクタムは検出されていない。
クロマトグラフィー条件及びシステム適用性試験:オクタデシルシリル基結合シリカゲルを充填剤とし、メタノール−テトラヒドロフラン−水(25:10:65)を移動相とし、蒸発型光散乱検出器を使用し、ドリフトチューブ温度が105℃で、キャリアガス流速が3.00L/minで、カラム温度が40℃で、理論段数はビロバリドピークに基づいて計算すると2500より低くないはずである。ビロバリドピークとギンコライドCピークとの分離度は1.5より大きいはずである。
試料溶液の調製:本発明のギンコライドを取り、塩化ナトリウム注射液を加えて1ml当たりに0.2mgを含有する溶液を調整する。
試料溶液の調製:本発明のギンコライド10mgを取り、0.9%塩化ナトリウム注射液50mlに加え、振り混ぜる。
注射液処方:
ギンコライド:テルペンラクトンに基づいて計算すると 1〜10mg/ml
グリセリン 0.2〜0.5ml/ml
エタノール 0.4〜0.7ml/ml
注射用水 0〜0.5ml/ml。
a)調製:エタノールとグリセリンを混合し、ギンコライドを加えて、溶解させ、エタノールまたは注射用水を全量まで補充追加し、5〜10%のクエン酸溶液または1〜10%の塩酸溶液でpH値を3.2〜3.8まで調節する。
b)ろ過除菌する。
c)充填密封する。
(1)蛋白質:ギンコライド注射液2mlを取り、水を加えて50mlを調整し、試料溶液とする。クマシーブリリアントブルーG−250約50mgを量り、25mlエタノールに溶解させ、さらに85%(w/v)リン酸50mlを加え、水を加えて500mlに希釈し、振り混ぜて、ろ過し、ろ液5mlを精密に量ってテストチューブに入れ、さらに1ml試料溶液を加え、振り混ぜて、3分間放置する。同様な方法でブランクを調製し、波長595nmの吸光度を測定し、試料溶液の吸光度が0.05より小さい。
試料溶液の調製:ギンコライド注射液(実施例14に基づいて調製する)6mlを取り、0.9%塩化ナトリウム注射液100mlに加えて振り混ぜる。
クロマトグラフィー条件及びシステム適用性試験:オクタデシルシリル基結合シリカゲルを充填剤とし、メタノール−テトラヒドロフラン−水(25:10:65)を移動相とし、蒸発型光散乱検出器を使用し、ドリフトチューブ温度が105℃で、キャリアガス流速が3.00L/minで、カラム温度が40℃で、理論段数はビロバリドピークに基づいて計算すると2500より低くないはずである。ビロバリドピークとギンコライドCピークとの分離度は1.5より大きいはずである。
クロマトグラフィー条件及びシステム適用性試験:オクタデシルシリル基結合シリカゲルを充填剤とし、メタノール−テトラヒドロフラン−水(25:10:65)を移動相とし、蒸発型光散乱検出器を使用し、ドリフトチューブ温度が105℃で、キャリアガス流速が3.00L/minで、カラム温度が40℃で、理論段数はビロバリドピークに基づいて計算すると2500より低くないはずである。ビロバリドピークとギンコライドCピークとの分離度は1.5より大きいはずである。
Claims (15)
- ギンコライドの抽出分離方法であって、
イチョウ葉を粉砕し、有機溶媒を加えて抽出を行い、濃縮された抽出液に抗酸化剤を加え、pH調節剤を用いてpH値を4〜5に調節し、濃縮し、冷蔵し、
前記抽出に使う有機溶媒がエタノール、アセトンまたは酢酸エチルであり、濃度が50〜80%v/vで、用量が5〜12倍である、抽出ステップA、
冷蔵された後の濃縮液をまずノルマルヘキサンまたは石油エーテルで2〜3回抽出し、水相を脂溶性溶媒で4〜5回抽出し、さらに水飽和2−ブタノール−酢酸エチル混合溶媒または水飽和n−ブタノール−酢酸エチル混合溶媒で4〜5回抽出し、有機相抽出液を併せて、減圧濃縮する、抽出ステップB、
抽出濃縮液をポリアミド樹脂カラムに通過させ、順に1〜5BVの水、3〜5BVの20%〜40%v/vのエタノール、2〜3BVの60%〜90%v/vのエタノールで溶出し、溶出液の流速を2〜3BV/hに制御しながら、溶出を行い、溶出液を併せて、減圧濃縮し、乾燥する、カラムクロマトグラフィーステップC、
カラムクロマトグラフィーされた後の乾燥物を沸騰水に加え、撹拌して溶解させ、冷却し、上澄み液を等体積の酢酸エチル、蟻酸エステルまたはアセトンで4〜5回抽出し、抽出液を併せて、減圧濃縮し、蒸発乾燥させ、5〜8倍量の30%〜50%v/vエタノールを加えて加熱撹拌して溶解させ、ろ過を行い、冷蔵し、結晶を析出させ、ろ過して、ろ液Iとして用意しておき、結晶を30%〜50%v/vのエタノールで洗浄し、減圧乾燥して、結晶Iを得、
ろ液Iをアルコール含有量が10%〜30%v/vになるまで濃縮し、冷蔵して、結晶を析出させ、ろ過を行い、ろ液IIとして用意しておき、30%〜50%v/vのエタノールで洗浄し、減圧乾燥して、結晶IIを得、
ろ液IIを濃縮し、0.1%〜0.5%の活性炭を加えて吸着させ、ろ過を行い、ろ液をアルコール含有量が10%〜30%v/vになるまで濃縮し、冷蔵し、結晶を析出させ、ろ過して、ろ液IIIとして用意しておき、結晶を30%〜50%v/vのエタノールで洗浄し、減圧乾燥して、結晶IIIを得、
ろ液IIIを濃縮し、活性炭−シリカゲルカラムクロマトグラフィーし、まず30%〜50%v/vのエタノールで溶出し、さらに70%〜90%v/vのエタノールで溶出し、溶出液を収集してアルコール含有量が10%〜30%v/vになるまで濃縮し、冷蔵し、結晶を析出させ、ろ過を行い、ろ液IVとして用意しておき、結晶を30%v/vエタノールで洗浄し、減圧乾燥して、結晶IVを得、
ろ液IVを濃縮し、冷蔵して、結晶を析出させ、ろ過を行い、結晶を30%v/vのエタノールで洗浄し、減圧乾燥して、結晶Vを得る、結晶析出ステップD、
結晶I、II、III、IV、Vを混合して均一化させ、粉砕を行って、ギンコライドを得る、結晶混合ステップE、を含むことを特徴とするギンコライドの抽出分離方法。 - ステップAの前記抽出方法が還流抽出または煎じ抽出であることを特徴とする請求項1に記載のギンコライドの抽出分離方法。
- 前記還流抽出はエタノール、アセトンまたは酢酸エチルを使用して抽出を行い、そのうち、異なる抽出溶媒の濃度及び抽出条件が以下の通りであり、
エタノール:濃度が50%〜80%v/v、抽出温度が75〜85℃、抽出回数が2〜3回、時間が1〜2時間/回であり、
アセトン:濃度が50%〜80%v/v、抽出温度が45〜55℃、抽出回数が2〜3回、時間が1〜2時間/回であり、
酢酸エチル:濃度が50%〜80%v/v、抽出温度が55〜65℃、抽出回数が2〜3回、時間が1〜2時間/回であることを特徴とする請求項2に記載のギンコライドの抽出分離方法。 - 前記還流抽出はエタノール、アセトンまたは酢酸エチルを使用して抽出を行い、そのうち、異なる抽出溶媒の濃度及び抽出条件が以下の通りであり、
エタノール:濃度が65%v/v、抽出温度が75〜85℃、抽出回数が3回、時間が1.5時間/回であり、
アセトン:濃度が50%v/v、抽出温度が45〜55℃、抽出回数が3回、時間が1.5時間/回であり、
酢酸エチル:濃度が60%v/v、抽出温度が55〜65℃、抽出回数が3回、時間が1.5時間/回であることを特徴とする請求項3に記載のギンコライドの抽出分離方法。 - 前記煎じ抽出はエタノール、アセトンまたは酢酸エチルを使用して抽出を行い、そのうち、異なる抽出溶媒の濃度及び抽出条件が以下の通りであり、
エタノール:濃度が50%〜80%v/v、抽出温度が80〜90℃、抽出回数が2〜3回、時間が1〜2時間/回であり、
アセトン:濃度が50%〜80%v/v、抽出温度が50〜60℃、抽出回数が2〜3回、時間が1〜2時間/回であり、
酢酸エチル:濃度が50%〜80%v/v、抽出温度が60〜65℃、抽出回数が2〜3回、時間が1〜2時間/回であることを特徴とする請求項2に記載のギンコライドの抽出分離方法。 - 前記煎じ抽出はエタノール、アセトンまたは酢酸エチルを使用して抽出を行い、そのうち、異なる抽出溶媒の濃度及び抽出条件が以下の通りであり、
エタノール:濃度が65%v/v、抽出温度が80〜90℃、抽出回数が3回、時間が1.5時間/回であり、
アセトン:濃度が50%v/v、抽出温度が50〜60℃、抽出回数が3回、時間が1.5時間/回であり、
酢酸エチル:濃度が60%v/v、抽出温度が60〜65℃、抽出回数が3回、時間が1.5時間/回である、ことを特徴とする請求項5に記載のギンコライドの抽出分離方法。 - ステップAの前記抗酸化剤が中性のアミノ酸であることを特徴とする請求項1に記載のギンコライドの抽出分離方法。
- ステップAの前記抗酸化剤がセリン、メチオニン、アスパラギンまたはトレオニンのうちの少なくとも1種であることを特徴とする請求項1に記載のギンコライドの抽出分離方法。
- ステップAの前記抗酸化剤がメチオニンであることを特徴とする請求項1に記載のギンコライドの抽出分離方法。
- ステップAの前記pH調節剤が有機弱酸であることを特徴とする請求項1に記載のギンコライドの抽出分離方法。
- ステップAの前記pH調節剤がクエン酸、リンゴ酸またはソルビン酸のうちの少なくとも1種であることを特徴とする請求項1に記載のギンコライドの抽出分離方法。
- ステップAの前記pH調節剤がクエン酸であることを特徴とする請求項1に記載のギンコライドの抽出分離方法。
- ステップBの前記脂溶性溶媒が酢酸エチル、蟻酸エステル、アセトン、ブタノンのうちの少なくとも1種であることを特徴とする請求項1に記載のギンコライドの抽出分離方法。
- カラムクロマトグラフィーステップCの前記ポリアミド樹脂カラムにおけるポリアミド樹脂の粒度が30〜60メッシュである、ことを特徴とする請求項1に記載のギンコライドの抽出分離方法。
- 結晶析出ステップDの前記活性炭−シリカゲルカラムにおける活性炭とシリカゲルとの体積比が1:1〜1:3であることを特徴とする請求項1に記載のギンコライドの抽出分離方法。
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