CN103006754B - 骆驼刺提取物及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及骆驼刺技术领域，是一种骆驼刺提取物及其制备方法。该骆驼刺提取物按下述步骤得到：第一步，树脂的处理；第二步，树脂柱的填充；第三步，取干燥骆驼刺药材粉碎后得到骆驼刺粉末；第四步，在骆驼刺粉末中加入骆驼刺粉末重量的10倍至15倍的乙醇进行一次回流提取。本发明通过乙醇回流提取的方法将干燥骆驼刺药材粉碎后和乙醇回流提取，提取液经减压浓缩、在填充后的大孔树脂柱中经蒸馏水洗脱和乙醇洗脱方法进行纯化，收集乙醇洗脱后的乙醇洗脱液减压干燥、粉碎后得骆驼刺提取物，本发明具有工艺稳定、可操作性强、重复性好和环保的特点，提高了提取效率，降低了生产成本和安全隐患。
Description
技术领域
本发明涉及骆驼刺技术领域，是一种骆驼刺提取物及其制备方法。
背景技术
骆驼刺Alhagi pseudalhagi (M.B.)Desv为豆科骆驼刺属植物，是新疆干旱沙漠地区特有的一种落叶灌木，具有很强的再生性和生态适应性，广泛分布于新疆南疆和东疆，它不但是固沙植物、优质牧草，也是改良盐碱土壤的先锋植物，同时还是维吾尔医用传统药材。骆驼刺全草具有清热解毒的功效，在临床以单方或复方组成用于治疗感冒发烧，胃腹湿热和肠炎痢疾等；民间还用于治疗风湿和癌症。国内外学者对于骆驼刺的化学成分进行了研究，文献报道骆驼刺的全草多含黄酮类、生物碱类、脂肪族类、甾醇类、氨基酸类、多糖类等成分。现代临床药理学试验表明骆驼刺提取物对豚鼠离体肠管收缩运动有显著的抑制作用。黄酮类化合物(flavonoids)为骆驼刺中主要的一类活性物质，广泛存在植物中，是骆驼刺代谢过程中产生的一类重要的次生成分，也是天然产物中研究得比较早和较多的一类化合物。黄酮类化合物是药用植物中主要活性成分之一，其结构类型的多样性决定了其生物活性的多样化。研究已经表明，黄酮类化合物具有抗氧化、抗病毒、抗过敏、抗菌、抗突变、抗肿瘤、保肝、免疫调节、抗炎、镇痛、泻下、保护心脑血管系统以及杀虫等多种生物活性，且毒副作用较低。
公开号为CN101862366A、名称为《从骆驼刺植物中提取治疗过敏性结肠炎药物的方法及其药物和用途》的专利文献公开了如下方法：“取干燥的骆驼刺地上部分通过回流提取、浓缩、有机溶剂萃取、浓缩等步骤制取”，该方法采用的有机溶剂萃取法所用的试剂操作中对人体伤害大，且萃取率低，实际工业化生产无法复制。
发明内容
本发明提供了一种骆驼刺提取物及其制备方法，克服了上述现有技术之不足，其能有效解决骆驼刺采用有机溶剂萃取对人体伤害大和萃取率低的问题。
本发明的技术方案之一是通过以下措施来实现的：一种骆驼刺提取物按下述步骤得到：第一步，树脂的处理：在待处理树脂中加入5倍待处理树脂重量的温水浸泡，温水温度控制在50℃至60℃下浸泡1小时至2小时，温水浸泡后排出树脂中的温水，在温水浸泡后的树脂中重新加入5倍待处理树脂重量的温水浸泡，温水温度控制在50℃至60℃下浸泡1小时至2小时，温水浸泡后排出树脂中的温水，如此温水浸泡3次至5次后在温水浸泡后的树脂中加入1倍至2倍待处理树脂体积的盐酸浸泡10小时至12小时，盐酸的浓度为1mol/L，浸泡后排出树脂中的盐酸浸泡液；在盐酸浸泡后的树脂中加入自来水冲洗树脂，直至从树脂中排出的自来水的PH为3至4时排出树脂中的自来水；在自来水冲洗后的树脂中加入蒸馏水冲洗树脂，直至从树脂中排出的蒸馏水为中性时排出树脂中的蒸馏水；在蒸馏水冲洗后的树脂中加入1倍至2倍待处理树脂体积的氢氧化钠溶液浸泡10小时至12小时，氢氧化钠溶液的浓度为1mol/L，浸泡后排出树脂中的氢氧化钠浸泡液；在氢氧化钠浸泡后的树脂中加入自来水冲洗树脂，直至从树脂中排出的自来水的PH为8至10时排出树脂中的自来水；在自来水冲洗后的树脂中加入蒸馏水冲洗树脂，直至从树脂中排出的蒸馏水为中性时排出树脂中的蒸馏水，得到处理后的树脂；
第二步，树脂柱的填充：在树脂柱的底部铺上一层脱脂棉，用蒸馏水将处理后的树脂悬浮起来一起加入树脂柱中，当蒸馏水和处理后的树脂加到树脂柱体积的一半时，打开树脂柱底部的出液口开关使蒸馏水流出，在树脂柱中继续加入蒸馏水和处理后的树脂，使处理后的树脂面下沉至距树脂柱上部口5cm至10cm为止，用2倍至3倍树脂柱中树脂体积的体积百分比为95%的乙醇对树脂柱中的树脂进行洗脱，乙醇洗脱后排出树脂柱中的乙醇洗脱液，得到填充后的树脂柱；
第三步，取干燥骆驼刺药材粉碎后得到骆驼刺粉末；第四步，在骆驼刺粉末中加入骆驼刺粉末重量的10倍至15倍的乙醇进行一次回流提取，一次回流提取的乙醇为体积百分比为35%至45%的乙醇，一次回流提取温度为80℃至90℃，一次回流提取时间为2小时至3小时，一次回流提取后过滤得到一次提取液和一次滤渣；第五步，在一次滤渣中加入骆驼刺粉末重量的10倍至15倍的乙醇进行二次回流提取，二次回流提取的乙醇为体积百分比为35%至45%的乙醇，二次回流提取温度为80℃至90℃，二次回流提取时间为2小时至3小时，二次回流提取后过滤得到二次提取液和二次滤渣；第六步，将一次提取液和二次提取液混合后在压力为-0.07MPa、温度为60℃下进行减压浓缩，减压浓缩至溶液中含生药为0.1克每毫升至0.5克每毫升的浓缩液；第七步，用4倍至6倍树脂柱中树脂体积的浓缩液对树脂柱中的树脂进行纯化,浓缩液的上样流速为每小时2倍至3倍的树脂柱中树脂体积，上样完成后在树脂柱中预留1倍树脂柱中树脂体积的浓缩液静置20min至30min后排出；第八步，然后用5倍至7倍树脂柱中树脂体积的蒸馏水对树脂柱中树脂进行蒸馏水洗脱, 蒸馏水的上样流速为每小时2倍至3倍的树脂柱中树脂体积，第九步，蒸馏水洗脱后用6倍至8倍树脂柱中树脂体积的乙醇对树脂柱中树脂进行乙醇洗脱, 乙醇洗脱的乙醇为体积百分比为35%至45%的乙醇，乙醇的上样流速为每小时2倍至3倍的树脂柱中树脂体积，乙醇洗脱至树脂柱底部的出液口中流出的乙醇洗脱液呈黄褐色时收集乙醇洗脱液，将收集的乙醇洗脱液在压力为-0.08MPa、温度为60℃下减压干燥4 h 至6h，粉碎后得骆驼刺提取物。
下面是对上述发明技术方案之一的进一步优化或/和改进：
上述干燥骆驼刺药材中水份的质量百分含量小于10%。
上述骆驼刺粉末的粒径为20目。
上述骆驼刺提取物的粒径为80目。
上述树脂为HPD100大孔吸附树脂；或/和，树脂柱中树脂的体积为100L至130L；或/和，树脂柱的内径和高的比为1:6至1:10。
本发明的技术方案之二是通过以下措施来实现的：一种骆驼刺提取物的制备方法按下述步骤进行：第一步，树脂的处理：在待处理树脂中加入5倍待处理树脂重量的温水浸泡，温水温度控制在50℃至60℃下浸泡1小时至2小时，温水浸泡后排出树脂中的温水，在温水浸泡后的树脂中重新加入5倍待处理树脂重量的温水浸泡，温水温度控制在50℃至60℃下浸泡1小时至2小时，温水浸泡后排出树脂中的温水，如此温水浸泡3次至5次后在温水浸泡后的树脂中加入1倍至2倍待处理树脂体积的盐酸浸泡10小时至12小时，盐酸的浓度为1mol/L，浸泡后排出树脂中的盐酸浸泡液；在盐酸浸泡后的树脂中加入自来水冲洗树脂，直至从树脂中排出的自来水的PH为3至4时排出树脂中的自来水；在自来水冲洗后的树脂中加入蒸馏水冲洗树脂，直至从树脂中排出的蒸馏水为中性时排出树脂中的蒸馏水；在蒸馏水冲洗后的树脂中加入1倍至2倍待处理树脂体积的氢氧化钠溶液浸泡10小时至12小时，氢氧化钠溶液的浓度为1mol/L，浸泡后排出树脂中的氢氧化钠浸泡液；在氢氧化钠浸泡后的树脂中加入自来水冲洗树脂，直至从树脂中排出的自来水的PH为8至10时排出树脂中的自来水；在自来水冲洗后的树脂中加入蒸馏水冲洗树脂，直至从树脂中排出的蒸馏水为中性时排出树脂中的蒸馏水，得到处理后的树脂；
第二步，树脂柱的填充：在树脂柱的底部铺上一层脱脂棉，用蒸馏水将处理后的树脂悬浮起来一起加入树脂柱中，当蒸馏水和处理后的树脂加到树脂柱体积的一半时，打开树脂柱底部的出液口开关使蒸馏水流出，在树脂柱中继续加入蒸馏水和处理后的树脂，使处理后的树脂面下沉至距树脂柱上部口5cm至10cm为止，用2倍至3倍树脂柱中树脂体积的体积百分比为95%的乙醇对树脂柱中的树脂进行洗脱，乙醇洗脱后排出树脂柱中的乙醇洗脱液，得到填充后的树脂柱；
第三步，取干燥骆驼刺药材粉碎后得到骆驼刺粉末；第四步，在骆驼刺粉末中加入骆驼刺粉末重量的10倍至15倍的乙醇进行一次回流提取，一次回流提取的乙醇为体积百分比为35%至45%的乙醇，一次回流提取温度为80℃至90℃，一次回流提取时间为2小时至3小时，一次回流提取后过滤得到一次提取液和一次滤渣；第五步，在一次滤渣中加入骆驼刺粉末重量的10倍至15倍的乙醇进行二次回流提取，二次回流提取的乙醇为体积百分比为35%至45%的乙醇，二次回流提取温度为80℃至90℃，二次回流提取时间为2小时至3小时，二次回流提取后过滤得到二次提取液和二次滤渣；第六步，将一次提取液和二次提取液混合后在压力为-0.07MPa、温度为60℃下进行减压浓缩，减压浓缩至溶液中含生药为0.1克每毫升至0.5克每毫升的浓缩液；第七步，用4倍至6倍树脂柱中树脂体积的浓缩液对树脂柱中的树脂进行纯化,浓缩液的上样流速为每小时2倍至3倍的树脂柱中树脂体积，上样完成后在树脂柱中预留1倍树脂柱中树脂体积的浓缩液静置20min至30min后排出；第八步，然后用5倍至7倍树脂柱中树脂体积的蒸馏水对树脂柱中树脂进行蒸馏水洗脱, 蒸馏水的上样流速为每小时2倍至3倍的树脂柱中树脂体积，第九步，蒸馏水洗脱后用6倍至8倍树脂柱中树脂体积的乙醇对树脂柱中树脂进行乙醇洗脱, 乙醇洗脱的乙醇为体积百分比为35%至45%的乙醇，乙醇的上样流速为每小时2倍至3倍的树脂柱中树脂体积，乙醇洗脱至树脂柱底部的出液口中流出的乙醇洗脱液呈黄褐色时收集乙醇洗脱液，将收集的乙醇洗脱液在压力为-0.08MPa、温度为60℃下减压干燥4 h 至6h，粉碎后得骆驼刺提取物。
下面是对上述发明技术方案之二的进一步优化或/和改进：
上述干燥骆驼刺药材中水份的质量百分含量小于10%。
上述骆驼刺粉末的粒径为20目。
上述骆驼刺提取物的粒径为80目。
上述树脂为HPD100大孔吸附树脂；或/和，树脂柱中树脂的体积为100L至130L；或/和，树脂柱的内径和高的比为1:6至1:10。
本发明通过乙醇回流提取的方法将干燥骆驼刺药材粉碎后和乙醇回流提取，提取液经减压浓缩、在填充后的大孔树脂柱中经蒸馏水洗脱和乙醇洗脱方法进行纯化，收集乙醇洗脱后的乙醇洗脱液减压干燥、粉碎后得骆驼刺提取物，本发明具有工艺稳定、可操作性强、重复性好和环保的特点，提高了提取效率，降低了生产成本和安全隐患。
附图说明
附图1为不同浓度下的芦丁标准液吸光度图。
具体实施方式
本发明不受下述实施例的限制，可根据本发明的技术方案与实际情况来确定具体的实施方式。
实施例1，该骆驼刺提取物按下述步骤得到：第一步，树脂的处理：在待处理树脂中加入5倍待处理树脂重量的温水浸泡，温水温度控制在50℃至60℃下浸泡1小时至2小时，温水浸泡后排出树脂中的温水，在温水浸泡后的树脂中重新加入5倍待处理树脂重量的温水浸泡，温水温度控制在50℃至60℃下浸泡1小时至2小时，温水浸泡后排出树脂中的温水，如此温水浸泡3次至5次后在温水浸泡后的树脂中加入1倍至2倍待处理树脂体积的盐酸浸泡10小时至12小时，盐酸的浓度为1mol/L，浸泡后排出树脂中的盐酸浸泡液；在盐酸浸泡后的树脂中加入自来水冲洗树脂，直至从树脂中排出的自来水的PH为3至4时排出树脂中的自来水；在自来水冲洗后的树脂中加入蒸馏水冲洗树脂，直至从树脂中排出的蒸馏水为中性时排出树脂中的蒸馏水；在蒸馏水冲洗后的树脂中加入1倍至2倍待处理树脂体积的氢氧化钠溶液浸泡10小时至12小时，氢氧化钠溶液的浓度为1mol/L，浸泡后排出树脂中的氢氧化钠浸泡液；在氢氧化钠浸泡后的树脂中加入自来水冲洗树脂，直至从树脂中排出的自来水的PH为8至10时排出树脂中的自来水；在自来水冲洗后的树脂中加入蒸馏水冲洗树脂，直至从树脂中排出的蒸馏水为中性时排出树脂中的蒸馏水，得到处理后的树脂；
第二步，树脂柱的填充：在树脂柱的底部铺上一层脱脂棉，用蒸馏水将处理后的树脂悬浮起来一起加入树脂柱中，当蒸馏水和处理后的树脂加到树脂柱体积的一半时，打开树脂柱底部的出液口开关使蒸馏水流出，在树脂柱中继续加入蒸馏水和处理后的树脂，使处理后的树脂面下沉至距树脂柱上部口5cm至10cm为止，用2倍至3倍树脂柱中树脂体积的体积百分比为95%的乙醇对树脂柱中的树脂进行洗脱，乙醇洗脱后排出树脂柱中的乙醇洗脱液，得到填充后的树脂柱；
第三步，取干燥骆驼刺药材粉碎后得到骆驼刺粉末；第四步，在骆驼刺粉末中加入骆驼刺粉末重量的10倍至15倍的乙醇进行一次回流提取，一次回流提取的乙醇为体积百分比为35%至45%的乙醇，一次回流提取温度为80℃至90℃，一次回流提取时间为2小时至3小时，一次回流提取后过滤得到一次提取液和一次滤渣；第五步，在一次滤渣中加入骆驼刺粉末重量的10倍至15倍的乙醇进行二次回流提取，二次回流提取的乙醇为体积百分比为35%至45%的乙醇，二次回流提取温度为80℃至90℃，二次回流提取时间为2小时至3小时，二次回流提取后过滤得到二次提取液和二次滤渣；第六步，将一次提取液和二次提取液混合后在压力为-0.07MPa、温度为60℃下进行减压浓缩，减压浓缩至溶液中含生药为0.1克每毫升至0.5克每毫升的浓缩液；第七步，用4倍至6倍树脂柱中树脂体积的浓缩液对树脂柱中的树脂进行纯化,浓缩液的上样流速为每小时2倍至3倍的树脂柱中树脂体积，上样完成后在树脂柱中预留1倍树脂柱中树脂体积的浓缩液静置20min至30min后排出；第八步，然后用5倍至7倍树脂柱中树脂体积的蒸馏水对树脂柱中树脂进行蒸馏水洗脱, 蒸馏水的上样流速为每小时2倍至3倍的树脂柱中树脂体积，第九步，蒸馏水洗脱后用6倍至8倍树脂柱中树脂体积的乙醇对树脂柱中树脂进行乙醇洗脱, 乙醇洗脱的乙醇为体积百分比为35%至45%的乙醇，乙醇的上样流速为每小时2倍至3倍的树脂柱中树脂体积，乙醇洗脱至树脂柱底部的出液口中流出的乙醇洗脱液呈黄褐色时收集乙醇洗脱液，将收集的乙醇洗脱液在压力为-0.08MPa、温度为60℃下减压干燥4 h 至6h，粉碎后得骆驼刺提取物。
实施例2，该骆驼刺提取物按下述步骤得到：第一步，树脂的处理：在待处理树脂中加入5倍待处理树脂重量的温水浸泡，温水温度控制在50℃或60℃下浸泡1小时或2小时，温水浸泡后排出树脂中的温水，在温水浸泡后的树脂中重新加入5倍待处理树脂重量的温水浸泡，温水温度控制在50℃或60℃下浸泡1小时或2小时，温水浸泡后排出树脂中的温水，如此温水浸泡3次或5次后在温水浸泡后的树脂中加入1倍或2倍待处理树脂体积的盐酸浸泡10小时或12小时，盐酸的浓度为1mol/L，浸泡后排出树脂中的盐酸浸泡液；在盐酸浸泡后的树脂中加入自来水冲洗树脂，直至从树脂中排出的自来水的PH为3或4时排出树脂中的自来水；在自来水冲洗后的树脂中加入蒸馏水冲洗树脂，直至从树脂中排出的蒸馏水为中性时排出树脂中的蒸馏水；在蒸馏水冲洗后的树脂中加入1倍或2倍待处理树脂体积的氢氧化钠溶液浸泡10小时或12小时，氢氧化钠溶液的浓度为1mol/L，浸泡后排出树脂中的氢氧化钠浸泡液；在氢氧化钠浸泡后的树脂中加入自来水冲洗树脂，直至从树脂中排出的自来水的PH为8或10时排出树脂中的自来水；在自来水冲洗后的树脂中加入蒸馏水冲洗树脂，直至从树脂中排出的蒸馏水为中性时排出树脂中的蒸馏水，得到处理后的树脂；
第二步，树脂柱的填充：在树脂柱的底部铺上一层脱脂棉，用蒸馏水将处理后的树脂悬浮起来一起加入树脂柱中，当蒸馏水和处理后的树脂加到树脂柱体积的一半时，打开树脂柱底部的出液口开关使蒸馏水流出，在树脂柱中继续加入蒸馏水和处理后的树脂，使处理后的树脂面下沉至距树脂柱上部口5cm或10cm为止，用2倍或3倍树脂柱中树脂体积的体积百分比为95%的乙醇对树脂柱中的树脂进行洗脱，乙醇洗脱后排出树脂柱中的乙醇洗脱液，得到填充后的树脂柱；
第三步，取干燥骆驼刺药材粉碎后得到骆驼刺粉末；第四步，在骆驼刺粉末中加入骆驼刺粉末重量的10倍或15倍的乙醇进行一次回流提取，一次回流提取的乙醇为体积百分比为35%或45%的乙醇，一次回流提取温度为80℃或90℃，一次回流提取时间为2小时或3小时，一次回流提取后过滤得到一次提取液和一次滤渣；第五步，在一次滤渣中加入骆驼刺粉末重量的10倍或15倍的乙醇进行二次回流提取，二次回流提取的乙醇为体积百分比为35%或45%的乙醇，二次回流提取温度为80℃或90℃，二次回流提取时间为2小时或3小时，二次回流提取后过滤得到二次提取液和二次滤渣；第六步，将一次提取液和二次提取液混合后在压力为-0.07MPa、温度为60℃下进行减压浓缩，减压浓缩至溶液中含生药为0.1克每毫升或0.5克每毫升的浓缩液；第七步，用4倍或6倍树脂柱中树脂体积的浓缩液对树脂柱中的树脂进行纯化,浓缩液的上样流速为每小时2倍或3倍的树脂柱中树脂体积，上样完成后在树脂柱中预留1倍树脂柱中树脂体积的浓缩液静置20min或30min后排出；第八步，然后用5倍或7倍树脂柱中树脂体积的蒸馏水对树脂柱中树脂进行蒸馏水洗脱, 蒸馏水的上样流速为每小时2倍或3倍的树脂柱中树脂体积，第九步，蒸馏水洗脱后用6倍或8倍树脂柱中树脂体积的乙醇对树脂柱中树脂进行乙醇洗脱, 乙醇洗脱的乙醇为体积百分比为35%或45%的乙醇，乙醇的上样流速为每小时2倍或3倍的树脂柱中树脂体积，乙醇洗脱至树脂柱底部的出液口中流出的乙醇洗脱液呈黄褐色时收集乙醇洗脱液，将收集的乙醇洗脱液在压力为-0.08MPa、温度为60℃下减压干燥4 h 或6h，粉碎后得骆驼刺提取物。
实施例3，作为上述实施例的优化，实施例3的干燥骆驼刺药材中水份的质量百分含量小于10%。
实施例4，作为上述实施例的优化，实施例4的骆驼刺粉末的粒径为20目。
实施例5，作为上述实施例的优化，实施例5的骆驼刺提取物的粒径为80目。
实施例6，作为上述实施例的优化，实施例6的树脂为HPD100大孔吸附树脂；树脂柱中树脂的体积为100L至130L；树脂柱的内径和高的比为1:6至1:10。HPD100大孔吸附树脂作为色谱填料具有选择性好、机械强度高、再生处理方便、吸附速度快、可大规模使用等优点被广泛用于中草药中皂苷和黄酮类成分的分离。
上述实施例中工艺参数的优选及优选方法按下述进行：
1.试验仪器与材料
1.1 仪器
紫外可见分光光度计，型旋转蒸发仪 (上海预康科技有限公司 ) ，精密电子天平 (常熟双杰测试仪器厂 )，中药粉碎机。
材料
骆驼刺采自乌鲁木齐县安宁区，经王国平鉴定为豆科骆驼刺属Alhagi植物骆驼刺Alhagi pseudalhagi (M.B.)Desv.。将骆驼刺阴干粉碎，在真空干燥器中以 60℃干燥至恒重 ,备用。芦丁标准品 (中国药品生物制品检定所 ) ，无水乙醇、石油醚、氢氧化钠、亚硝酸钠和硝酸铝均为分析纯。
方法
2.1 总黄酮的测定
2.1.1 标准液的配制
精密称取 120℃干燥恒重的芦丁标准品 7.23 mg，置 50 mL容量瓶中，用体积百分比为 60%的乙醇溶解并定容得到浓度为 0.1338mg/mL的芦丁标准溶液。选取芦丁作为骆驼刺提取物总黄酮含量测定的对照物质，该方法稳定可行，可操作性强、重复性好。
标准曲线的绘制
精密量取芦丁标准溶液各 0、0.5、1.0、2.0、3.0、 4.0、5.0、6.0、7.0、8.0mL置于 25 mL容量瓶中，分别加入体积百分比为 60%的乙醇溶液至 10 mL，再依次加入 1mL质量百分比为 5%的亚硝酸钠溶液，摇匀，放置 6 min后，再依次加入1 mL质量百分比为10%的硝酸铝溶液，摇匀，放置 6 min后，再依次加入质量百分比为4%的氢氧化钠溶液4 mL，再依次加入体积百分比为 60%的乙醇并定容至25 mL，摇匀，放置15min后在510 nm处测定吸光度值。以吸光度值为纵坐标，芦丁浓度 (mg/mL )为横坐标，制作标准曲线，得到回归方程 Y = 12.374X - 0.0036，其线性范围为0.27 mg/L至42.81mg/L，R
2
=0.9997，如附图1所示。
样品溶液的制备和黄酮含量的测定
准确称取阴干粉碎的骆驼刺药材10 g，用100mL石油醚脱脂去杂质，药渣再用100ml不同浓度的乙醇提取，提取液再用100ml体积百分比为60%的乙醇润洗并定容至250ml容量瓶中，依照“2.1.2标准曲线的绘制”项下方法测定吸光度 ,代入回归方程中计算总黄酮的含量，并计算总黄酮的得率：
总黄酮含量（%）=CVD/W×100%
式中：C 为总黄酮显色稀释后的浓度（mg/ml）
V 为稀释后的体积，D为样品的稀释倍数
W 为样品的质量
总黄酮的得率 (%) = (提取液中总黄酮浓度×提取液体积) /对应的原料重量×100%。
在此过程中分别考察不同乙醇浓度、不同料液比、不同提取时间和温度对总黄酮提取的影响。然后结合正交试验确定最佳提取工艺。
单因素实验
2.2.1 提取温度对总黄酮得率的影响
分别取骆驼刺粉末4份，每份10克，加入体积百分比为60％的乙醇100ml，加热回流提取l h，提取温度依次为60℃、70℃、80℃、90℃，提取1次，测定。不同回流温度下提取液中总黄酮的平均含量见表1。
表1
| 温度 | 60℃ | 70℃ | 80℃ | 90℃ |
| 总黄酮含量mg/g | 0.671 | 0.755 | 0.756 | 0.784 |
从表1可以看出随着回流温度的升高，提取液中总黄酮含量逐渐增加。
乙醇浓度对总黄酮得率的影响
分别取骆驼刺粉末8份，每份10克，分别加入体积百分比为20%、30%、40%、50% 、60％、70％、80％、90％的乙醇 100 ml，90℃加热回流提取1 h，提取1次、测定。不同乙醇浓度下提取液中总黄酮的平均含量见表2。
表2
| 乙醇浓度(%) | 20% | 30% | 40% | 50% | 60% | 70% | 80% | 95% |
| 总黄酮含量mg/g | 0.825 | 0.851 | 0.988 | 0.961 | 0.854 | 0.752 | 0.778 | 0.882 |
从表2可以看出随着乙醇浓度的增加，提取液中总黄酮含量先增加后降低。
提取时间对总黄酮得率的影响
分别取骆驼刺粉末4份，每份10克，加入体积百分比为 60％的乙醇 100 ml，90℃加热回流提取 l h、2h、3h、4h，提取1次，测定。不同提取时间提取液中总黄酮的平均含量见表3。
表3
| 时间（h） | 1h | 2h | 3h | 4h |
| 总黄酮含量mg/g | 0.756 | 0.884 | 0.930 | 0.841 |
从表3可以看出随着提取时间的延长，提取液中总黄酮含量先增加后降低。
料液比对总黄酮得率的影响
分别取骆驼刺粉末6份，每份10克，90℃分别加入50ml、100 ml、150 ml、200 ml、250 ml、300ml体积百分比为60％的乙醇，90℃加热回流提取1 h，提取1次，测定。不同料液比提取液中总黄酮的平均含量见表4。
表4
| 料液比 | 1:5 | 1:10 | 1:15 | 1:20 | 1:25 | 1:30 |
| 总黄酮含量mg/g | 0.547 | 0.766 | 0.798 | 1.101 | 1.283 | 1.323 |
从表4可以看出随着料液比的增加，提取液中总黄酮含量逐渐增加。
提取次数
分别取骆驼刺粉末3份，每份10克，加入体积百分比为60％的乙醇 100 ml，90℃加热回流提取 l h，分别提取1次、2次、3次、4次，测定。不同提取次数提取液中总黄酮的平均含量见表5。
表5
| 提取次数(次) | 1 | 2 | 3 |
| 总黄酮含量mg/g | 0.761 | 0.214 | 0.094 |
从表5可以看出随着提取次数的增加，提取液中总黄酮含量逐渐增加。
正交试验
根据预试验结果, 选取影响提取率的4个因素:温度( A) 、料液比（B）、乙醇浓度( C)、提取次数 ( D) , 每一个因素各选3个水平, 制定因素水平表，并按正交设计表L
9
( 3
4
) 进行试验。因素平均水平见表6，正交试验平均结果见表7，方差分析平均结果见表8。
表6
| 水平 | 温度℃ A | 料液比（倍） B | 乙醇浓度（%） C | 提取次数（次） D |
| 1 | 70 | 1：10 | 30 | 1 |
| 2 | 80 | 1：15 | 40 | 2 |
| 3 | 90 | 1：20 | 50 | 3 |
表 7
| 试验号 | 因素A | 因素B | 因素C | 因素D | 总黄酮提取率（%） |
| 1 | 70 | 1:10 | 30 | 1 | 0.7930 |
| 2 | 70 | 1:15 | 40 | 2 | 1.1274 |
| 3 | 70 | 1:20 | 50 | 3 | 1.1723 |
| 4 | 80 | 1:10 | 40 | 3 | 1.2731 |
| 5 | 80 | 1:15 | 50 | 1 | 1.1195 |
| 6 | 80 | 1:20 | 30 | 2 | 1.2681 |
| 7 | 90 | 1:10 | 50 | 2 | 1.2314 |
| 8 | 90 | 1:15 | 30 | 3 | 1.3342 |
| 9 | 90 | 1:20 | 40 | 1 | 1.1716 |
| 均值1 | 1.031 | 1.099 | 1.132 | 1.028 | |
| 均值2 | 1.220 | 1.194 | 1.191 | 1.209 | |
| 均值3 | 1.246 | 1.204 | 1.174 | 1.260 | |
| 极差 | 0.215 | 0.105 | 0.059 | 0.232 |
表8
| 变异来源 | 平方和 | 自由度 | 均方 | F值 | p-值 |
| x(1) | 0.248 | 2 | 0.124 | 138.6746 | 0.0001 |
| x(2) | 0.0601 | 2 | 0.03 | 33.5997 | 0.0001 |
| x(3) | 0.0167 | 2 | 0.0083 | 9.3242 | 0.0021 |
| x(4) | 0.2673 | 2 | 0.1336 | 149.4597 | 0.0001 |
| 误差 | 0.0143 | 16 | 0.0009 | ||
| 总和 | 0.6064 |
由表7可知, 对骆驼刺总黄酮提取率影响因素的主次顺序为D>A> B>C , 即提取次数>温度>料液比>乙醇浓度；同时还说明, 在所选因素水平范围内, 最佳提取参数组合为A
3
B
3
C
2
D
3
, 即温度为90℃，料液比为1:20，体积百分比为40%的乙醇提取3次, 骆驼刺总黄酮取率最高。方差分析结果见表8。由表8方差分析可知, 所选定的四个提取因素温度、料液比、乙醇浓度、提取次数，对试验结果有显著影响，结合生产实际，对提取条件作适当调整, 确定乙醇提取工艺条件为A
3
B
2
C
2
D
2
。
回流提取液、树脂柱中的树脂洗脱液中总黄酮含量的测定:
准确称取回流提取物2g、树脂柱中树脂进行蒸馏水洗脱后的洗脱物5g、树脂柱中树脂进行乙醇洗脱后的洗脱物0.5g，分别用体积百分比为60%的乙醇溶解，再分别用100 ml 体积百分比为60%乙醇润洗并定容到250ml的容量瓶中，依照“2.1.2标准曲线的绘制”项下方法测定吸光度 ,代入回归方程中计算总黄酮的含量，并计算总黄酮的得率。
总黄酮的得率 (%) = (溶液中总黄酮浓度×溶液体积) /对应的提取物重量×100%
不同提取物中总黄酮的得率见表9。
表9
| 提取物 | 得率mg/g |
| 树脂柱中树脂乙醇洗脱物 | 150 |
| 树脂柱中树脂蒸馏水洗脱物 | 37 |
| 回流提取物（实验室提取） | 65 |
| 回流提取物（药厂提取） | 46 |
从表9可以看出，回流提取液中总黄酮的得率为46mg/g，而树脂柱中树脂乙醇洗脱液中总黄酮得率为150mg/g，说明树脂柱中的树脂有效富集了黄酮类成分。
不同乙醇浓度洗脱效果的比较
用4倍树脂柱中树脂体积的浓缩液对树脂柱中的树脂进行纯化后,再依次用4倍树脂柱中树脂体积的水、4倍树脂柱中树脂体积的体积百分比为30%、50%、70%和95%的乙醇冲洗，不同乙醇浓度的洗脱液中总黄酮的含量见表10。
表10
| 提取物 | 提取物重量/g | 提取物总黄酮含量mg/g | 总黄酮重量/g |
| 30%乙醇洗脱液 | 2 | 55 | 0.11 |
| 50%乙醇洗脱液 | 1.1 | 60 | 0.066 |
| 70%乙醇洗脱液 | 1.2 | 70 | 0.084 |
| 95%乙醇洗脱液 | 0.9 | 85 | 0.0765 |
| 小计 | 5.2 | 0.3365 |
从表10可以看出依次用水，体积百分比为30%、50%、70%和95%的乙醇冲洗后，得到不同的洗脱液；提取物重量依次为，18g、2g、1.1g、1.2g、0.9g，依照“2.1.2标准曲线的绘制”项下方法测定吸光度，代入回归方程中计算体积百分比分别为30%、50%、70%和95%的乙醇洗脱液中总黄酮的含量依次为55mg/g、60mg/g、70mg/g、85mg/g；体积百分比为30%的乙醇洗脱物重量2克，其总黄酮含量55mg/g；体积百分比为50%的乙醇洗脱物重量1.1克，其总黄酮含量60mg/g；体积百分比为70%的乙醇洗脱物重量1.2克，其总黄酮含量70mg/g；体积百分比为95%的乙醇洗脱物重量0.9克，其总黄酮含量85mg/g；其中体积百分比为95%的乙醇洗脱物总黄酮含量最高，但是得率低，其次是体积百分比为70%的乙醇洗脱物；对比直接用体积百分比为95%的乙醇洗脱，其梯度洗脱总黄酮含量有变化，但是变化不明显，而且总黄酮含量越高，其洗脱物量越少，所以采用体积百分比为95%的乙醇洗脱。
综上所述用回流法对骆驼刺中总黄酮提取工艺进行优化，考察了温度、料液比、乙醇浓度、提取次数4个重要影响因素进行研究。根据分析结果，骆驼刺中总黄酮提的最佳提取工艺为：温度为90℃、料液比为1:20、体积百分比为40%的乙醇提取3次、乙醇对树脂柱中树脂的洗脱浓度为体积百分比为95%的乙醇；但结合生产实际，从降低生产成本出发，骆驼刺最合理的提取工艺为：即温度为90℃、料液比1:15、体积百分比为40%的乙醇提取2次、乙醇对树脂柱中树脂的洗脱浓度为体积百分比为95%的乙醇。
以上技术特征构成了本发明的实施例，其具有较强的适应性和实施效果，可根据实际需要增减非必要的技术特征，来满足不同情况的需求。
Claims (10)
1.一种骆驼刺提取物，其特征在于按下述步骤得到：第一步，树脂的处理：在待处理树脂中加入5倍待处理树脂重量的温水浸泡，温水温度控制在50℃至60℃下浸泡1小时至2小时，温水浸泡后排出树脂中的温水，在温水浸泡后的树脂中重新加入5倍待处理树脂重量的温水浸泡，温水温度控制在50℃至60℃下浸泡1小时至2小时，温水浸泡后排出树脂中的温水，如此温水浸泡3次至5次后在温水浸泡后的树脂中加入1倍至2倍待处理树脂体积的盐酸浸泡10小时至12小时，盐酸的浓度为1mol/L，浸泡后排出树脂中的盐酸浸泡液；在盐酸浸泡后的树脂中加入自来水冲洗树脂，直至从树脂中排出的自来水的PH为3至4时排出树脂中的自来水；在自来水冲洗后的树脂中加入蒸馏水冲洗树脂，直至从树脂中排出的蒸馏水为中性时排出树脂中的蒸馏水；在蒸馏水冲洗后的树脂中加入1倍至2倍待处理树脂体积的氢氧化钠溶液浸泡10小时至12小时，氢氧化钠溶液的浓度为1mol/L，浸泡后排出树脂中的氢氧化钠浸泡液；在氢氧化钠浸泡后的树脂中加入自来水冲洗树脂，直至从树脂中排出的自来水的PH为8至10时排出树脂中的自来水；在自来水冲洗后的树脂中加入蒸馏水冲洗树脂，直至从树脂中排出的蒸馏水为中性时排出树脂中的蒸馏水，得到处理后的树脂；
第二步，树脂柱的填充：在树脂柱的底部铺上一层脱脂棉，用蒸馏水将处理后的树脂悬浮起来一起加入树脂柱中，当蒸馏水和处理后的树脂加到树脂柱体积的一半时，打开树脂柱底部出液口开关使蒸馏水流出，在树脂柱中继续加入蒸馏水和处理后的树脂，使处理后的树脂面下沉至距树脂柱上部口5cm至10cm为止，用2倍至3倍树脂柱中树脂体积的体积百分比为95%的乙醇对树脂柱中的树脂进行洗脱，乙醇洗脱后排出树脂柱中的乙醇洗脱液，得到填充后的树脂柱；
第三步，取干燥骆驼刺药材粉碎后得到骆驼刺粉末；第四步，在骆驼刺粉末中加入骆驼刺粉末重量的10倍至15倍的乙醇进行一次回流提取，一次回流提取的乙醇为体积百分比为35%至45%的乙醇，一次回流提取温度为80℃至90℃，一次回流提取时间为2小时至3小时，一次回流提取后过滤得到一次提取液和一次滤渣；第五步，在一次滤渣中加入骆驼刺粉末重量的10倍至15倍的乙醇进行二次回流提取，二次回流提取的乙醇为体积百分比为35%至45%的乙醇，二次回流提取温度为80℃至90℃，二次回流提取时间为2小时至3小时，二次回流提取后过滤得到二次提取液和二次滤渣；第六步，将一次提取液和二次提取液混合后在压力为-0.07MPa、温度为60℃下进行减压浓缩，减压浓缩至溶液中含生药为0.1克每毫升至0.5克每毫升的浓缩液；第七步，用4倍至6倍树脂柱中树脂体积的浓缩液对树脂柱中的树脂进行纯化,浓缩液的上样流速为每小时2倍至3倍的树脂柱中树脂体积，上样完成后在树脂柱中预留1倍树脂柱中树脂体积的浓缩液静置20min至30min后排出；第八步，然后用5倍至7倍树脂柱中树脂体积的蒸馏水对树脂柱中树脂进行蒸馏水洗脱, 蒸馏水的上样流速为每小时2倍至3倍的树脂柱中树脂体积，第九步，蒸馏水洗脱后用6倍至8倍树脂柱中树脂体积的乙醇对树脂柱中树脂进行乙醇洗脱, 乙醇洗脱的乙醇为体积百分比为35%至45%的乙醇，乙醇的上样流速为每小时2倍至3倍的树脂柱中树脂体积，乙醇洗脱至树脂柱底部的出液口中流出的乙醇洗脱液呈黄褐色时收集乙醇洗脱液，将收集的乙醇洗脱液在压力为-0.08MPa、温度为60℃下减压干燥4 h 至6h，粉碎后得骆驼刺提取物；
其中：树脂为HPD100大孔吸附树脂；树脂柱中树脂的体积为100L至130L；树脂柱的内径和高的比为1:6至1:10。
2.根据权利要求1所述的骆驼刺提取物，其特征在于干燥骆驼刺药材中水份的质量百分含量小于10%。
3.根据权利要求1或2所述的骆驼刺提取物，其特征在于骆驼刺粉末的粒径为20目。
4.根据权利要求1或2所述的骆驼刺提取物，其特征在于骆驼刺提取物的粒径为80目。
5.根据权利要求3所述的骆驼刺提取物，其特征在于骆驼刺提取物的粒径为80目。
6.一种根据权利要求1或2或3或4或5所述的骆驼刺提取物的制备方法，其特征在于按下述步骤进行：第一步，树脂的处理：在待处理树脂中加入5倍待处理树脂重量的温水浸泡，温水温度控制在50℃至60℃下浸泡1小时至2小时，温水浸泡后排出树脂中的温水，在温水浸泡后的树脂中重新加入5倍待处理树脂重量的温水浸泡，温水温度控制在50℃至60℃下浸泡1小时至2小时，温水浸泡后排出树脂中的温水，如此温水浸泡3次至5次后在温水浸泡后的树脂中加入1倍至2倍待处理树脂体积的盐酸浸泡10小时至12小时，盐酸的浓度为1mol/L，浸泡后排出树脂中的盐酸浸泡液；在盐酸浸泡后的树脂中加入自来水冲洗树脂，直至从树脂中排出的自来水的PH为3至4时排出树脂中的自来水；在自来水冲洗后的树脂中加入蒸馏水冲洗树脂，直至从树脂中排出的蒸馏水为中性时排出树脂中的蒸馏水；在蒸馏水冲洗后的树脂中加入1倍至2倍待处理树脂体积的氢氧化钠溶液浸泡10小时至12小时，氢氧化钠溶液的浓度为1mol/L，浸泡后排出树脂中的氢氧化钠浸泡液；在氢氧化钠浸泡后的树脂中加入自来水冲洗树脂，直至从树脂中排出的自来水的PH为8至10时排出树脂中的自来水；在自来水冲洗后的树脂中加入蒸馏水冲洗树脂，直至从树脂中排出的蒸馏水为中性时排出树脂中的蒸馏水，得到处理后的树脂；
第二步，树脂柱的填充：在树脂柱的底部铺上一层脱脂棉，用蒸馏水将处理后的树脂悬浮起来一起加入树脂柱中，当蒸馏水和处理后的树脂加到树脂柱体积的一半时，打开树脂柱底部的出液口开关使蒸馏水流出，在树脂柱中继续加入蒸馏水和处理后的树脂，使处理后的树脂面下沉至距树脂柱上部口5cm至10cm为止，用2倍至3倍树脂柱中树脂体积的体积百分比为95%的乙醇对树脂柱中的树脂进行洗脱，乙醇洗脱后排出树脂柱中的乙醇洗脱液，得到填充后的树脂柱；
第三步，取干燥骆驼刺药材粉碎后得到骆驼刺粉末；第四步，在骆驼刺粉末中加入骆驼刺粉末重量的10倍至15倍的乙醇进行一次回流提取，一次回流提取的乙醇为体积百分比为35%至45%的乙醇，一次回流提取温度为80℃至90℃，一次回流提取时间为2小时至3小时，一次回流提取后过滤得到一次提取液和一次滤渣；第五步，在一次滤渣中加入骆驼刺粉末重量的10倍至15倍的乙醇进行二次回流提取，二次回流提取的乙醇为体积百分比为35%至45%的乙醇，二次回流提取温度为80℃至90℃，二次回流提取时间为2小时至3小时，二次回流提取后过滤得到二次提取液和二次滤渣；第六步，将一次提取液和二次提取液混合后在压力为-0.07MPa、温度为60℃下进行减压浓缩，减压浓缩至溶液中含生药为0.1克每毫升至0.5克每毫升的浓缩液；第七步，用4倍至6倍树脂柱中树脂体积的浓缩液对树脂柱中的树脂进行纯化,浓缩液的上样流速为每小时2倍至3倍的树脂柱中树脂体积，上样完成后在树脂柱中预留1倍树脂柱中树脂体积的浓缩液静置20min至30min后排出；第八步，然后用5倍至7倍树脂柱中树脂体积的蒸馏水对树脂柱中树脂进行蒸馏水洗脱, 蒸馏水的上样流速为每小时2倍至3倍的树脂柱中树脂体积，第九步，蒸馏水洗脱后用6倍至8倍树脂柱中树脂体积的乙醇对树脂柱中树脂进行乙醇洗脱, 乙醇洗脱的乙醇为体积百分比为35%至45%的乙醇，乙醇的上样流速为每小时2倍至3倍的树脂柱中树脂体积，乙醇洗脱至树脂柱底部的出液口中流出的乙醇洗脱液呈黄褐色时收集乙醇洗脱液，将收集的乙醇洗脱液在压力为-0.08MPa、温度为60℃下减压干燥4 h 至6h，粉碎后得骆驼刺提取物；
其中：树脂为HPD100大孔吸附树脂；树脂柱中树脂的体积为100L至130L；树脂柱的内径和高的比为1:6至1:10。
7.根据权利要求6所述的骆驼刺提取物的制备方法，其特征在于干燥骆驼刺药材中水份的质量百分含量小于10%。
8.根据权利要求6或7所述的骆驼刺提取物的制备方法，其特征在于骆驼刺粉末的粒径为20目。
9.根据权利要求6或7所述的骆驼刺提取物的制备方法，其特征在于骆驼刺提取物的粒径为80目。
10.根据权利要求8所述的骆驼刺提取物的制备方法，其特征在于骆驼刺提取物的粒径为80目。
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