CN107525862B - 拟草果总黄酮提取物的质量检测方法 - Google Patents
拟草果总黄酮提取物的质量检测方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN107525862B CN107525862B CN201710656974.9A CN201710656974A CN107525862B CN 107525862 B CN107525862 B CN 107525862B CN 201710656974 A CN201710656974 A CN 201710656974A CN 107525862 B CN107525862 B CN 107525862B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- total
- solution
- extract
- methanol
- rhamnocitrin
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N30/26—Conditioning of the fluid carrier; Flow patterns
- G01N30/38—Flow patterns
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N30/26—Conditioning of the fluid carrier; Flow patterns
- G01N30/38—Flow patterns
- G01N2030/388—Elution in two different directions on one stationary phase
Landscapes
- Physics & Mathematics (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Medicines Containing Plant Substances (AREA)
- Cosmetics (AREA)
Abstract
本发明涉及一种中药提取物的制备和质量检测方法，具体涉及一种拟草果总黄酮提取物的制备和质量检测方法，它是将拟草果的干燥果实经粉碎、醇提，甲醇或乙醇回流提取，浓缩，加水混悬，大孔吸附树脂柱层析洗脱（乙醇‑水系统），浓缩，真空干燥后，制得拟草果总黄酮提取物，该拟草果总黄酮提取物的制备方法合理、稳定、生产周期短，适合工业化生产，本发明采用紫外‑可见分光光度法、高效液相色谱一测多评法以及面积归一化法测定拟草果总黄酮提取物中拟草果总黄酮的含量，方法准确、稳定、操作简单，本发明制备得到的拟草果总黄酮提取物具有抗炎、抗菌等药理作用。
Description
技术领域
本发明涉及一种中药提取物的制备和质量检测方法，具体涉及一种拟草果总黄酮提取物的制备和质量检测方法。
背景技术
拟草果又称白草果、广西草果，为姜科豆蔻属植物拟草果（Amomum paratsao-ko S.Q.Tong et Y.M.Xia）的干燥成熟果实，在广西等地区有大面积的栽培。拟草果在广西壮族民间作为草果的代用品用作提香或者药用，临床用于治疗脘腹胀满冷痛、反胃呕吐、积食、痰饮、疟疾等症。然而迄今为止除了挥发油成分（【题名】拟草果挥发油的GC-MS分析【作者】覃兰芳，黄云峰，胡琦敏，等，广西中医药研究院【刊名】中医药导报，2014(11): 23-25，【题名】广西红草果与白草果挥发油的GC-MS分析【作者】黄云峰，覃兰芳，胡琦敏，等，广西中医药研究院【刊名】现代中药研究与实践，2014(02): 22–24）外，拟草果的非挥发性化学成分、药理活性、安全性等一系列问题并未见相关研究报道。
拟草果在广西有着广泛的栽培种植和长期的民间使用基础，而目前关于其药学方面的研究较少，对拟草果的开发利用相对滞后。随着药学科技的发展，精制的天然植物提取物低毒高效的特性受到人们越来越多的青睐，现代药理研究亦发现拟草果提取物具有抗炎、抗菌等药理作用，因此研发一种拟草果总黄酮提取物的制备方法和质量检测方法是有必要的，利于开发拟草果新的药用途径，并为药材资源的充分利用及提高其应用价值提供科学的依据。
发明内容
本发明的目的在于提供一种具有抗炎、抗菌等药理作用的拟草果总黄酮提取物的制备方法，以及拟草果总黄酮提取物的质量检测方法。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种拟草果总黄酮提取物的制备方法，该方法包括以下步骤：
（1）甲醇或乙醇加热回流提取：
①拟草果干燥果实，粉碎，按重量加5－15倍量体积浓度为70－100％的甲醇或乙醇；
②在温度为60-90℃下加热回流提取3－5次，每次0.5－2.0 h，滤过，合并滤液；
③滤液回收甲醇或乙醇，并浓缩至无醇味，加水稀释至浓度为0.04－0.067g生药量/ml的拟草果提取液，待上柱用；
（2）大孔吸附树脂分离纯化：
①选择弱极性的HP-20或AB-8大孔吸附树脂；
②吸附：上柱拟草果提取液浓度为0.04-0.06 g生药量/ml，上柱拟草果提取液体积为填充大孔吸附树脂体积的10-25倍，上柱流速为1-4 BV/h；【注：BV/h表示柱内单位时间（h）流经单位体积树脂平均液量】；
③洗脱：洗脱剂为体积浓度30-90%的乙醇，洗脱剂用量为填充大孔吸附树脂体积的10-20倍，洗脱流速为1-3BV/h，收集洗脱液，减压回收乙醇，浓缩至干，50-60 ℃真空干燥，即得拟草果总黄酮提取物。
本发明拟草果总黄酮提取物的质量检测方法包括如下含量测定方法中的一种或多种。
1、拟草果总黄酮的含量测定（紫外-可见分光光度法）
（1）对照品溶液的制备：精密称取鼠李柠檬素对照品适量，加甲醇制成每1ml 含0.15 mg 的溶液，即得；
（2）标准曲线的制备：精密量吸取鼠李柠檬素对照品溶液0.1 ml、0.2 ml、0.4 ml、0.6 ml、0.8 ml、1 ml，分别置10 ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，以甲醇作为空白，照紫外-可见分光光度法在365±1 nm 测定吸光度，以浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线；回归方程为 Y =0.07174X–0.05067，r=0.9993；
（3）测定法：取拟草果总黄酮提取物12mg，精密称定，置25ml 量瓶中，加甲醇适量使溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取1ml，置10ml 量瓶中，加甲醇适量使溶解并稀释至刻度，摇匀，以甲醇作为空白，在365±1 nm 测定吸光度，含总黄酮以鼠李柠檬素计算，即得；本拟草果总黄酮含量以鼠李柠檬素计算不得少于50.0%。
2、拟草果总黄酮的含量测定（高效液相色谱一测多评测定法）
（1）色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；检测波长为360 nm；以乙腈-0.2%磷酸水溶液（30:70～90:10）为流动相，梯度洗脱程序见表1；流速为0.5-1.5ml/min，检测波长为360 nm；理论板数以鼠李柠檬素计不低于10000。
（2）供试品溶液的制备：取拟草果提取物约10 mg，精密称定置10 ml的容量瓶中，加甲醇超声处理使溶解（功率320 W，频率80 KHz）30 min，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
（3）对照品溶液的制备：精密称定鼠李柠檬素对照品适量，加甲醇制成每1 ml含15μg的溶液，即得；
（4）测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10 μl，注入液相色谱仪，测定，以鼠李柠檬素对照品的峰面积为对照，分别计算鼠李柠檬素、槲皮素、鼠李素、3,5-二羟基-7,4′-二甲氧基黄酮和3,4′,7-三甲氧基山奈酚的含量，即得；拟草果总黄酮含量以鼠李柠檬素计，含鼠李柠檬素、槲皮素、鼠李素、3,5-二羟基-7,4′-二甲氧基黄酮和3,4′,7-三甲氧基山奈酚的总量不得少于40.0%。
结果：采用本发明的拟草果总黄酮提取物的制备和质量检测方法，经验证试验，制备得到的拟草果总黄酮提取物中拟草果总黄酮含量以鼠李柠檬素计，含鼠李柠檬素、槲皮素、鼠李素、3,5-二羟基-7,4′-二甲氧基黄酮和3,4′,7-三甲氧基山奈酚的总量可达40%以上。
3、拟草果总黄酮相对百分含量的测定（面积归一化法）
（1）色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；检测波长为360 nm；以乙腈-0.2%磷酸水溶液（30:70～90:10）为流动相，梯度洗脱程序见表1；流速为0.5-1.5ml/min，检测波长为360 nm；理论板数以鼠李柠檬素计不低于10000。
（2）供试品溶液的制备：取拟草果提取物约10 mg，精密称定置10 ml的容量瓶中，加甲醇超声处理使溶解（功率320 W，频率80 KHz）30 min，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
（3）对照品溶液的制备：精密称定鼠李柠檬素对照品适量，加甲醇制成每1 ml含15μg的溶液，即得；
（4）供试品溶液液相色谱图中各色谱峰的确定：分别精密吸取鼠李柠檬素、槲皮素、鼠李素、3,5-二羟基-7,4′-二甲氧基黄酮和3,4′,7-三甲氧基山奈酚对照品溶液与供试品溶液各10 μl，注入液相色谱仪，测定色谱与其3D光谱图，通过相对保留时间和3D光谱图的比对，确定供试品溶液中1、2、4、5、6色谱峰分别为鼠李柠檬素、槲皮素、鼠李素、3,5-二羟基-7,4′-二甲氧基黄酮和3,4′,7-三甲氧基山奈酚；通过3D光谱图比对，供试品溶液中3号色谱峰光谱特征及最大吸收值与1、2、4、5、6色谱峰基本一致，均为黄酮类化合物；3号色谱峰与鼠李柠檬素紫外吸收光谱图也基本一致，确定3号色谱峰也为黄酮类物质；
（5）测定法：精密吸取供试品溶液10 μl，注入液相色谱仪，记录色谱图；按色谱面积归一化法，测量1-6号峰的面积和色谱图上除溶剂峰以外的总色谱峰面积，计算1-6号峰峰面积之和占总峰面积的百分率；拟草果总黄酮相对百分含量以1-6号色谱峰峰面积之和计，占总峰面积百分比不少于50.0%。
本发明制备得到的拟草果总黄酮提取物可用于制备具有抗炎和抗菌作用的药物。
与现有技术相比，本发明突出的实质性特点和显著的进步是：
1、本发明首次从拟草果中制备出拟草果总黄酮含量50%以上的拟草果总黄酮提取物，并明确确定其中五个黄酮的化学成分与结构，主要黄酮的含量稳定，工艺条件合理稳定可行。
2、本发明拟草果总黄酮提取物的制备方法工艺简单，耗能低，在工艺过程中主要采用甲醇或乙醇提取，经过一次大孔吸附树脂柱分离纯化即可得到总黄酮含量较高的拟草果总黄酮提取物，使原料中有害溶剂的残留量少，符合国家对食品及药品的要求。
3、本发明采用紫外-可见分光光度法直接测定拟草果总黄酮的含量，方法准确、简单，能适应工业生产的需要，可有效的控制拟草果总黄酮提取物的质量。
4、本发明采用高效液相色谱一测多评法，以鼠李柠檬素为对照品，对拟草果总黄酮提取物中5种黄酮类成分进行同时检测，可不需要槲皮素、鼠李素、3,5-二羟基-7,4′-二甲氧基黄酮和3,4′,7-三甲氧基山奈酚含量测定的对照品，只需鉴别和定位所用的对照品即可，降低了分析成本。以色谱面积归一化法计算拟草果总黄酮的相对百分含量，可降低分析测试成本，简化分析过程提高分析速度；本发明采用的高效液相色谱一测多评法和色谱面积归一化法简单、准确，快速，做到了多组分、多指标的含量测定，可解决实际应用中对照品缺乏和多指标质量控制成本高、过程多的困难，更有效的运用于中药多成分、多指标的质量控制。
5、本发明通过对拟草果总黄酮进行研究，建立了一种拟草果总黄酮提取物的制备和质量检测方法，有利于拟草果相关产品的进一步开发利用，而且对于开发广西特色药材，开发具有高技术、高附加值的产品，提高市场竞争能力，将会产生潜在而不可估量的社会效益与经济效益。
附图说明
图1是本发明拟草果总黄酮提取物的制备工艺流程图，从图1可见，本发明所述的拟草果总黄酮提取物的制备方法包括以下步骤：拟草果干燥果实-粉碎-甲醇或乙醇加热回流提取-浓缩-回收甲醇或乙醇-粗浸膏加水混悬-大孔吸附树脂柱层析-（乙醇-水）洗脱-浓缩-真空干燥，得拟草果总黄酮提取物；
图2是本发明拟草果总黄酮提取物和鼠李柠檬素对照品的紫外吸收光谱图，从图2可见对照品鼠李柠檬素和拟草果总黄酮提取物均在365±1 nm有最大吸收，二者吸收光谱基本一致；
图3是混合对照品溶液的高效液相色谱图，图中各色谱峰成分分别为：1、槲皮素，2、鼠李素，3、未知黄酮，4、鼠李柠檬素，5、3,5-二羟基-7,4′-二甲氧基黄酮，6、3,4′,7-三甲氧基山奈酚；
图4是本发明拟草果总黄酮提取物的高效液相色谱图，图中各色谱峰成分分别为：1、槲皮素，2、鼠李素，3、未知黄酮，4、鼠李柠檬素，5、3,5-二羟基-7,4′-二甲氧基黄酮，6、3,4′,7-三甲氧基山奈酚；
图5是本发明拟草果总黄酮提取物的3D光谱图，从图5可以看出1-6号色谱峰光谱特征一致，为同一母核的同类黄酮化合物；
图6是本发明拟草果总黄酮提取物的高效液相色谱图中3号色谱峰未知黄酮和4号色谱峰鼠李柠檬素的紫外吸收光谱图，从图6可以看出3号色谱峰未知黄酮和4号色谱峰鼠李柠檬素的紫外吸收光谱图基本一致，为同一母核的同类黄酮化合物。
具体实施方式
实施例1
取拟草果干燥果实粉碎成粗粉200 g，按重量加10倍量体积浓度为70%的甲醇进行提取，于90℃水浴加热回流提取3次，每次1.5小时，滤过，合并滤液，滤液回收甲醇或乙醇并减压浓缩无醇味，加水定容至5000ml（浓度0.04g生药量/ml），四层纱布过滤至澄清液，滤过，过HP-20大孔吸附树脂柱（上样液体积为填充大孔吸附树脂体积的10倍），上柱流速为2BV/h；用10倍水洗涤，水洗液弃去，以填充大孔吸附树脂体积15倍、体积浓度为30%的乙醇洗脱，洗脱流速为1BV/h；收集洗脱液，洗脱液减压浓缩至浸膏，50℃真空干燥，即得到拟草果总黄酮的提取物，采用本发明的质量检测方法将制得的拟草果总黄酮提取物进行质量检测，测定结果为，拟草果总黄酮含量为50.60%，五种主要黄酮的含量为42.15%，总黄酮相对百分含量为53.25%。
实施例2
取拟草果干燥果实粉碎成粗粉500g，按重量加15倍量体积浓度为80%的甲醇进行提取，于80℃水浴加热回流提取4次，每次1小时，滤过，合并滤液，滤液回收甲醇或乙醇并减压浓缩无醇味，加水定容至9000 ml（0.056g药材/ml）,四层纱布过滤至澄清液，滤过，过HP-20大孔吸附树脂柱（上样液体积为20倍树脂体积），上柱流速为2BV/h；用10倍水洗涤，水洗液弃去，以以填充大孔吸附树脂体积10倍、体积浓度为90%的乙醇洗脱，收集洗脱液，洗脱流速为3 BV/h；洗脱液回收乙醇，浓缩至干，55℃真空干燥，即得到拟草果总黄酮的提取物，采用本发明的质量检测方法将制得的拟草果总黄酮提取物进行质量检测，测定结果为，拟草果总黄酮含量为51.15%，五种主要黄酮的含量为43.89%，总黄酮相对百分含量为55.47%。
实施例3
取拟草果干燥果实粉碎成粗粉500 g，按重量加5倍量100％的甲醇进行提取，于80℃水浴加热回流提取3次，每次0.5小时，滤过，合并滤液，滤液回收甲醇或乙醇并减压浓缩无醇味，加水定容至7500 ml（0.067 g药材/ml），四层纱布过滤至澄清液，滤过，过AB-8大孔吸附树脂柱（上样液体积为10倍树脂体积），上柱流速为4 BV/h；用10倍水洗涤，水洗液弃去，以填充大孔吸附树脂体积15倍、体积浓度为70%的乙醇洗脱，洗脱流速为3BV/h；收集洗脱液，洗脱液减压浓缩至浸膏，60℃真空干燥，即得到拟草果总黄酮的提取物，采用本发明的质量检测方法将制得的拟草果总黄酮提取物进行质量检测，测定结果为，拟草果总黄酮含量为52.20%，五种主要黄酮的含量为46.23%，总黄酮相对百分含量为65.92%。
实施例4
取拟草果干燥果实粉碎成粗粉200 g，按重量加10倍量体积浓度为90%的乙醇进行提取，于70 ℃水浴加热提取5次，每次1.5小时，滤过，合并滤液，滤液回收甲醇或乙醇并减压浓缩无醇味，加水定容至5000 ml（0.04 g药材/ml），四层纱布过滤至澄清液，滤过，过HP-20大孔吸附树脂柱（上样液体积为10倍树脂体积），上柱流速为1 BV/h；用10倍水洗涤，水洗液弃去，以填充大孔吸附树脂体积20倍、体积浓度为30%的乙醇洗脱，洗脱流速为1 BV/h；收集洗脱液，洗脱液减压回收乙醇，浓缩至干，60 ℃真空干燥，即得到拟草果总黄酮的提取物，采用本发明的质量检测方法将制得的拟草果总黄酮提取物进行质量检测，测定结果为，拟草果总黄酮含量为50.65%，五种主要黄酮的含量为43.89%，总黄酮相对百分含量为56.83%。
实施例5：
取拟草果干燥果实粉碎成粗粉500g，按重量加15倍量体积浓度为95%的乙醇进行提取，于60℃水浴加热提取5次，每次2小时，滤过，合并滤液，滤液回收甲醇或乙醇并减压浓缩无醇味，加水定容至9000 ml（0.056 g药材/ml）,四层纱布过滤至澄清液，滤过，过HP-20大孔吸附树脂柱（上样液体积为25倍树脂体积），上柱流速为2 BV/h；用10倍水洗涤，水洗液弃去，以填充大孔吸附树脂体积10倍、体积浓度为50%的乙醇洗脱，收集洗脱液，洗脱流速为2 BV/h；洗脱液减压浓缩至浸膏，60℃真空干燥，即得到拟草果总黄酮的提取物，采用本发明的质量检测方法将制得的拟草果总黄酮提取物进行质量检测，测定结果为，拟草果总黄酮含量为50.15%，五种主要黄酮的含量为45.20%，总黄酮相对百分含量为61.65%。
实施例6（拟草果总黄酮提取物的质量检测方法）
一、拟草果总黄酮的含量测定（紫外-可见分光光度法）
（1）对照品溶液的制备：精密称取鼠李柠檬素对照品适量，加甲醇制成每1ml 含0.15 mg 的溶液，即得；
（2）标准曲线的制备：精密量吸取鼠李柠檬素对照品溶液0.1 ml、0.2 ml、0.4 ml、0.6 ml、0.8 ml、1 ml，分别置10 ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，以甲醇作为空白，照紫外-可见分光光度法（《中国药典》2015版四部通则0401）在365±1 nm 测定吸光度，以浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线；回归方程为 Y =0.07174X–0.05067，r=0.9993；
（3）测定法：取拟草果总黄酮提取物约12mg，精密称定，置25ml 量瓶中，加甲醇适量使溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取1ml，置10ml 量瓶中，加甲醇适量使溶解并稀释至刻度，摇匀，以甲醇作为空白，在365±1 nm 测定吸光度，含总黄酮以鼠李柠檬素计算，即得；本拟草果总黄酮含量以鼠李柠檬素计算不得少于50.0%。
含量测定方法学试验如下：
1、标准曲线的制备：精密量取鼠李柠檬素对照品溶液0.1 ml、0.2 ml、0.4 ml、0.6ml、0.8 ml、1 ml，分别置10ml 量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，以甲醇作为空白，照紫外-可见分光光度法（《中国药典》2015 版四部通则 0401）在365 nm测定吸光度，以浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线。得回归方程 Y =0.07174X–0.05067，r=0.9993，表明在1.5－15 μg/mL 范围内时，鼠李柠檬素线性关系良好。
2、精密度试验：取同一供试品溶液，连续测定6 次，结果RSD 为0.39%。
3、稳定性试验：取同一供试品溶液，分别在0，30，45、60、90，120 min 测定，结果RSD 为0.11 %，表明供试品溶液在120 分钟内稳定。
4、重复性试验：取同一批样品制备供试品溶液6 份，按拟定方法测定，结果RSD 为1.07 %。
5、回收率试验：取已知含量的拟草果提取液，分别精密加入鼠李柠檬素对照品适量，按拟定方法测定含量，并计算回收率，回收率平均值为99.1%，RSD 为1.26%。
方法学试验结果表明该方法准确、稳定、操作简单，可确保产品的质量。
二、拟草果总黄酮的含量测定（高效液相色谱一测多评测定法）
（1）色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；检测波长为360 nm；以乙腈-0.2%磷酸水溶液（30:70～90:10）为流动相，梯度洗脱程序见表1；流速为0.5-1.5ml/min，检测波长为360 nm；理论板数以鼠李柠檬素计不低于10000。
（2）供试品溶液的制备：取拟草果提取物约10 mg，精密称定置10 ml的容量瓶中，加甲醇超声处理使溶解（功率320 W，频率80 KHz）30 min，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
（3）对照品溶液的制备：精密称定鼠李柠檬素对照品适量，加甲醇制成每1 ml含15μg的溶液，即得；
（4）测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10 μl，注入液相色谱仪，测定，以鼠李柠檬素对照品的峰面积为对照，分别计算鼠李柠檬素、槲皮素、鼠李素、3,5-二羟基-7,4′-二甲氧基黄酮和3,4′,7-三甲氧基山奈酚的含量，即得；拟草果总黄酮含量以鼠李柠檬素计，含鼠李柠檬素、槲皮素、鼠李素、3,5-二羟基-7,4′-二甲氧基黄酮和3,4′,7-三甲氧基山奈酚的总量不得少于40.0%。
结果：采用本发明的拟草果总黄酮提取物的制备和质量检测方法，经验证试验，制备得到的拟草果总黄酮提取物中拟草果总黄酮含量以鼠李柠檬素计，含鼠李柠檬素、槲皮素、鼠李素、3,5-二羟基-7,4′-二甲氧基黄酮和3,4′,7-三甲氧基山奈酚的总量可达40%以上。
含量测定方法学试验如下：
1、一测多评基本原理：在一定的范围内(线性范围内)成分的量(质量或浓度) 与检测器响应成正比，即：W = f A。(W表示浓度，A表示响应值)。在多指标质量评价时，以药材中某一典型成分(有对照品供应者) 为内参物，建立该成分与其他成分间的相对校正因子，然后通过校正因子计算其他组分的含量(s为内参物，k为其他组分) 。
鼠李柠檬素、槲皮素、鼠李素、3,5-二羟基-7,4′-二甲氧基黄酮和3,4′,7-三甲氧基山奈酚同为黄酮醇类化合物；五者母核相同、化学结构相似，适宜一测多评法进行含量测定。
2、线性范围制备：系列质量浓度Ⅰ-Ⅴ的混合对照品溶液，精密吸取10 μl进样，以进样量(μg)对峰面积积分值进行回归处理，得槲皮素、鼠李素、鼠李柠檬素、3,5-二羟基-7,4′-二甲氧基黄酮、3,4′,7-三甲氧基山奈酚回归方程分别为：Y=2779.580699X-2.549432719 (r＝0.9999)；Y= 2779.580699X-2.549432719(r＝0.9999)；Y=2808.116489X-16.2918029 (r＝0.9999)；Y=4417.016374X-15.30646371(r＝0.9999)；Y=3060.341959X-1.503283495 (r＝0.9999)。五者分别在0.02916~0.11648μg、0.06032~0.24128 μg、0.27176~1.08704 μg、0.03312~0.13248 μg、0.0176~0.0704 μg范围内线性关系良好。
3、校正因子计算：以鼠李柠檬素为内参物，按照一测多评基本原理项下公式(1)，分别计算鼠李柠檬素对槲皮素、鼠李素、3,5-二羟基-7,4′-二甲氧基黄酮、3,4′,7-三甲氧基山奈酚的校正因子，结果见表2。
4、精密度试验：精密吸取同一供试品溶液，在上述色谱条件下连续进样6次，槲皮素、
鼠李素、鼠李柠檬素、3,5-二羟基-7,4′-二甲氧基黄酮、3,4′,7-三甲氧基山奈酚的RSD%分别为0.85%、0.77%﹑0.76%、1.57%、0.87%。
5、稳定性试验：取同一供试品溶液，48 h内每间隔一定时间进样，测定。槲皮素、鼠李素、鼠李柠檬素、3,5-二羟基-7,4′-二甲氧基黄酮、3,4′,7-三甲氧基山奈酚的RSD%分别为0.5%﹑0.5%﹑0.52%、1.24%、0.56%。表明供试品溶液在48小时内稳定。
6、重复性试验：取同一批样品制备供试品溶液6份，按拟定方法测定，结果槲皮素、鼠李素、鼠李柠檬素、3,5-二羟基-7,4′-二甲氧基黄酮、3,4′,7-三甲氧基山奈酚的平均含量分别为3.245 mg/g、7.171 mg/g 、30.194 mg/g、3.650 mg/g、2.145 mg/g，RSD分别为0.78%、0.8%、2.07%、0.71%、0.93%。
7、回收率试验：取已知含量的拟草果提取物，精密加入一定量对照品混和溶液，按供试品溶液处理方法制备样品，测定，计算加样回收率，槲皮素、鼠李素、鼠李柠檬素、3,5-二羟基-7,4′-二甲氧基黄酮、3,4′,7-三甲氧基山奈酚平均回收率分别为98.99%、99.94%、100.89%、101.76%、99.48%，RSD分别为1.90%、1.73%、2.23%、1.13%、1.97%。
三、拟草果总黄酮相对百分含量的测定（面积归一化法）
1、色谱条件与系统适用性试验、供试品溶液的制备以及对照品溶液的制备方法与上述高效液相色谱一测多评测定法中的一致；
2、供试品溶液液相色谱图中各色谱峰的确定：分别精密吸取鼠李柠檬素、槲皮素、鼠李素、3,5-二羟基-7,4′-二甲氧基黄酮和3,4′,7-三甲氧基山奈酚对照品溶液与供试品溶液各10 μl，注入液相色谱仪，测定色谱及其3D光谱图，通过相对保留时间和3D光谱图的比对，确定供试品溶液中1、2、4、5、6色谱峰分别为鼠李柠檬素、槲皮素、鼠李素、3,5-二羟基-7,4′-二甲氧基黄酮和3,4′,7-三甲氧基山奈酚。通过3D光谱图比对，确定供试品溶液中3号色谱峰光谱特征及最大吸收值与1、2、4、5、6色谱峰基本一致，均为同一母核的同类黄酮类化合物；3号色谱峰与4号色谱峰鼠李柠檬素紫外吸收光谱图也基本一致，确定3号色谱峰也为同一母核的同类黄酮类化合物。
3、测定法：精密吸取供试品溶液10 μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。按色谱面积归一化法，测量1-6号峰的面积和色谱图上除溶剂峰以外的总色谱峰面积，计算1-6号峰峰面积之和占总峰面积的百分率。拟草果总黄酮相对百分含量以1-6号色谱峰峰面积之和计，占总峰面积百分比不少于50.0%。
方法学试验结果表明该法简单、准确，快速，可确保本品的质量。
用本发明方法提取的拟草果总黄酮提取物同时具有抗炎、抗菌等药理作用，经药效学试验，结果如下：
1、抗菌试验
指示菌株：指示菌株: 3株人体致病菌：白色葡萄球菌(Staphylococcus albus)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、蜡状芽孢杆菌(Bacilluscereus)。
(1)准备工作：制备肉汤培养基，将所需的仪器进行灭菌处理。
(2)接种：将活化好的致病菌分别接种于以灭菌处理过的LB培养基中，再将其放置于恒温振荡器中37摄氏度，震荡培养12 h。
(3)化合物初筛：将培养好的致病菌用培养液进行稀释，稀释度为 1:500-1:1000；将稀释后的含菌培养液分别定量加至96孔板的各个孔中；将样品配制成1mg/ml（拟草果总黄酮提取物10mg/ml），分别取定量加至各个孔中。加完后置于恒温培养箱中37摄氏度，恒温培养，而后用酶标仪在630nm下测各孔吸光度。
(4)测最小抑制浓度：采用微量肉汤稀释法，将培养好的致病菌用培养液进行稀释，稀释度为1:500-1:1000；将稀释后的含菌培养液分别定量加至96孔板的各孔中，然后将各等倍稀释的样品分别加入至各列孔中。加完后置于恒温培养箱中37摄氏度，恒温培养，而后用酶标仪在630nm下测各孔吸光度。记录结果。
拟草果提取物对3种致病菌表现出较好的抑制活性。结果见表3。
2、抗炎试验
细胞类型：鼠源神经小胶质BV2细胞（采用含10% FBS，1%青、链霉素的DMEM高糖培养基，于 37 ℃，含 5% CO2，饱和湿度条件下的细胞培养箱中培养。细胞为贴壁生长，根据细胞生长情况换液，以0. 25%胰酶消化传代），实验前将细胞接种于12孔板，接种细胞数为106-107/ml，孵育6-9h后换液加入LPS或DMSO，2h后加入10μM浓度的化合物孵育24h，收集细胞上清进行CBA检测。
试剂来源： DMEM高糖培养基、胎牛血清、胰酶购于美国GBICO公司；BD™Cytometric Bead Array (CBA) Human Inflammation Kit以及BD™ Cytometric BeadArray (CBA) Mouse Inflammation Kit试剂盒均购自BD公司。
2. 1 基于BV2细胞构建LPS诱导的炎症细胞模型对拟草果提取物的抗炎活性筛选（1）取对数生长期细胞制备细胞悬液，细胞计数；
（2）接种到12孔板中：THP-1细胞以1.0X106个/mL接种，每孔1ml细胞悬液，同样的样本做3个重复；
（3）37℃培养箱中培养；
（4）用160nmol/L的PMA刺激细胞36h，离心用无血清1640培养基孵育12h，加入10μM浓度的拟草果提取物2h后，再加入1μg/ml浓度的LPS；对照组为DMSO处理，阳性对照组为LPS单独处理）；
（5）37℃培养箱中继续培养24h；
2. 2 CBA技术检测拟草果提取物对免疫因子的调节作用
（1）梯度稀释标准品（1:1-1:256，上机顺序从低浓度到高浓度）；
（2）1个样品，9个标准稀释液，1个阴性对照，一个阳性对照；
（3）混合微球，每管加入10μl相应炎症因子微球，加入到15ml离心管中，labeled“mixed captured beads”；
（4）涡旋加入的6种混悬液，每管加50μl混合微球悬液，再加入50μl PE-detection，最后加入50μl标准品稀释液或样品到流式管中；
（5）室温，避光孵育2h，加入800μl wash buffer，280g，离心5min；
（6）弃上清，再加入300μl稀释液，流式细胞分析仪检测。
2. 3 实验结果
拟草果提取物能显著下调炎症因子IL-6的表达。结果见表4。
综上所述，本发明拟草果总黄酮提取物的制备方法合理、稳定、生产周期短，适合工业化生产。本发明采用紫外-可见分光光度法和高效液相色谱一测多评法以及面积归一化法测定拟草果总黄酮含量，方法准确、稳定、操作简单，分析测试成本低，能适应工业生产的需要，可有效的控制拟草果总黄酮提取物的质量。拟草果总黄酮提取物具有抗炎、抗菌等药理作用，具有良好的开发前景。
Claims (4)
1.一种拟草果总黄酮提取物的质量检测方法，其特征在于：拟草果总黄酮的含量测定采用以下步骤进行检测：
（1）对照品溶液的制备：精密称取鼠李柠檬素对照品适量，加甲醇制成每1ml 含0.15mg 的溶液，即得；
（2）标准曲线的制备：精密量吸取鼠李柠檬素对照品溶液0.1 ml、0.2 ml、0.4 ml、0.6ml、0.8 ml、1 ml，分别置10ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，以甲醇作为空白，照紫外-可见分光光度法在365±1nm 测定吸光度，以浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线，回归方程为 Y =0.07174X–0.05067，r=0.9993；
（3）测定法：取拟草果总黄酮提取物12mg，精密称定，置25ml 量瓶中，加甲醇适量使溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取1ml，置10ml 量瓶中，加甲醇适量使溶解并稀释至刻度，摇匀，以甲醇作为空白，在365±1nm 测定吸光度，含总黄酮以鼠李柠檬素计算，即得，拟草果总黄酮含量以鼠李柠檬素计算不得少于50.0%。
2.一种拟草果总黄酮提取物的质量检测方法，其特征在于：拟草果总黄酮的含量测定包括以下步骤：
（1）色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以30:70～90:10的乙腈-0.2 %磷酸水溶液为流动相，流速为0.5-1.5ml/min，检测波长为360 nm；理论板数以鼠李柠檬素计不低于10000；流动相梯度洗脱程序为：0～10min，乙腈比例为30%；10～20min，乙腈比例从30%变化为40%，20～30 min，乙腈比例为40%，30～45 min，乙腈比例从40%变化为50%，45～65 min，乙腈比例从50%变化为90%，65～75min，乙腈比例为90%；
（2）供试品溶液的制备：取拟草果总黄酮提取物10 mg，精密称定，置10 ml的容量瓶中，加甲醇适量超声处理30 min使溶解，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
（3）对照品溶液的制备：精密称定鼠李柠檬素对照品适量，加甲醇制成每1ml含15 μg的溶液，即得；
（4）测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10 μl，注入液相色谱仪，测定，以鼠李柠檬素对照品的峰面积为对照，分别计算鼠李柠檬素、槲皮素、鼠李素、3,5-二羟基-7,4′-二甲氧基黄酮和3,4′,7-三甲氧基山奈酚的含量，即得；拟草果总黄酮含量以鼠李柠檬素计，含鼠李柠檬素、槲皮素、鼠李素、3,5-二羟基-7,4′-二甲氧基黄酮和3,4′,7-三甲氧基山奈酚的总量不得少于40.0%。
3.一种拟草果总黄酮提取物的质量检测方法，其特征在于：拟草果总黄酮相对百分含量的测定包括以下步骤：
（1）色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以30:70～90:10的乙腈-0.2 %磷酸水溶液为流动相，流速为0.5-1.5ml/min，检测波长为360 nm；理论板数以鼠李柠檬素计不低于10000；流动相梯度洗脱程序为：0～10min，乙腈比例为30%；10～20min，乙腈比例从30%变化为40%，20～30 min，乙腈比例为40%，30～45 min，乙腈比例从40%变化为50%，45～65 min，乙腈比例从50%变化为90%，65～75min，乙腈比例为90%；
（2）供试品溶液的制备：取拟草果总黄酮提取物10 mg，精密称定，置10 ml的容量瓶中，加甲醇适量超声处理30 min使溶解，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
（3）对照品溶液的制备：精密称定鼠李柠檬素对照品适量，加甲醇制成每1ml含15 μg的溶液，即得；
（4）供试品溶液液相色谱图中各色谱峰的确定：分别精密吸取鼠李柠檬素、槲皮素、鼠李素、3,5-二羟基-7,4′-二甲氧基黄酮和3,4′,7-三甲氧基山奈酚对照品溶液与供试品溶液各10 μl，注入液相色谱仪，测定色谱与其3D光谱图，通过相对保留时间和3D光谱图的比对，确定供试品溶液中1、2、4、5、6色谱峰分别为鼠李柠檬素、槲皮素、鼠李素、3,5-二羟基-7,4′-二甲氧基黄酮和3,4′,7-三甲氧基山奈酚；通过3D光谱图比对，供试品溶液中3号色谱峰光谱特征及最大吸收值与1、2、4、5、6色谱峰基本一致，均为黄酮类化合物；3号色谱峰与鼠李柠檬素紫外吸收光谱图也基本一致，确定3号色谱峰也为黄酮类物质；
（5）测定法：精密吸取供试品溶液10 μl，注入液相色谱仪，记录色谱图；按色谱面积归一化法，测量1-6号峰的面积和色谱图上除溶剂峰以外的总色谱峰面积，计算1-6号峰峰面积之和占总峰面积的百分率；拟草果总黄酮相对百分含量以1-6号色谱峰峰面积之和计，占总峰面积百分比不少于50.0%。
4.根据权利要求1-3中任意一项所述的拟草果总黄酮提取物的质量检测方法，其特征在于：
所述的拟草果总黄酮提取物，其制备方法包括以下步骤：
（1）甲醇或乙醇加热回流提取：
①拟草果干燥果实，粉碎，按重量加5－15倍量体积浓度为70－100％的甲醇或乙醇；
②在温度为60-90℃下加热回流提取3－5次，每次0.5－2.0 h，滤过，合并滤液；
③滤液回收甲醇或乙醇，并浓缩至无醇味，加水稀释至浓度为0.04－0.067g生药量/ml的拟草果提取液，待上柱用；
（2）大孔吸附树脂分离纯化：
①选择弱极性的大孔吸附树脂；
②吸附：上柱拟草果提取液浓度为0.04-0.06 g生药量/ml，上柱拟草果提取液体积为填充大孔吸附树脂体积的10-25倍，上柱流速为1-4 BV/h；
③洗脱：洗脱剂为体积浓度30-90%的乙醇，洗脱剂用量为填充大孔吸附树脂体积的10-20倍，洗脱流速为1-3BV/h，收集洗脱液，减压回收乙醇，浓缩至干，50-60 ℃真空干燥，即得拟草果总黄酮提取物；
所述的大孔吸附树脂为弱极性的HP-20或AB-8大孔吸附树脂。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201710656974.9A CN107525862B (zh) | 2017-08-03 | 2017-08-03 | 拟草果总黄酮提取物的质量检测方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201710656974.9A CN107525862B (zh) | 2017-08-03 | 2017-08-03 | 拟草果总黄酮提取物的质量检测方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN107525862A CN107525862A (zh) | 2017-12-29 |
| CN107525862B true CN107525862B (zh) | 2020-03-17 |
Family
ID=60680479
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201710656974.9A Active CN107525862B (zh) | 2017-08-03 | 2017-08-03 | 拟草果总黄酮提取物的质量检测方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN107525862B (zh) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111233807B (zh) * | 2020-03-31 | 2023-08-11 | 广西壮族自治区中医药研究院 | 一种高纯度山柰酚-7,4′-二甲醚的制备方法及其质量控制方法 |
| CN111481645A (zh) * | 2020-03-31 | 2020-08-04 | 右江民族医学院 | 一种提取草果总黄酮的方法 |
| CN111346195A (zh) * | 2020-04-23 | 2020-06-30 | 成都医学院 | 一种草果总黄酮的制备方法 |
| CN111595972A (zh) * | 2020-05-29 | 2020-08-28 | 广西壮族自治区中医药研究院 | 一种多穗柯总黄酮提取物的制备方法及质量检测方法 |
| CN113138253A (zh) * | 2021-06-04 | 2021-07-20 | 西南民族大学 | 一种刷格痛风散的检测方法 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101062165A (zh) * | 2007-06-18 | 2007-10-31 | 石任兵 | 枳实总黄酮提取物及其制备方法 |
| CN102716407A (zh) * | 2012-06-27 | 2012-10-10 | 成都中医药大学 | 草果油在制备具有抑制或者杀灭白色念珠菌作用的药物中的用途 |
| CN102716408A (zh) * | 2012-06-27 | 2012-10-10 | 成都中医药大学 | 草果油在制备治疗阴道炎的药物中的用途 |
| CN104840525A (zh) * | 2015-05-19 | 2015-08-19 | 广西壮族自治区中医药研究院 | 互叶白千层总黄酮的制备及其检测方法 |
-
2017
- 2017-08-03 CN CN201710656974.9A patent/CN107525862B/zh active Active
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101062165A (zh) * | 2007-06-18 | 2007-10-31 | 石任兵 | 枳实总黄酮提取物及其制备方法 |
| CN102716407A (zh) * | 2012-06-27 | 2012-10-10 | 成都中医药大学 | 草果油在制备具有抑制或者杀灭白色念珠菌作用的药物中的用途 |
| CN102716408A (zh) * | 2012-06-27 | 2012-10-10 | 成都中医药大学 | 草果油在制备治疗阴道炎的药物中的用途 |
| CN104840525A (zh) * | 2015-05-19 | 2015-08-19 | 广西壮族自治区中医药研究院 | 互叶白千层总黄酮的制备及其检测方法 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| Antioxidant and Hepatoprotective Effect of Amomum Xanthoides;Jing-Hua Wang et al.;《The Journal of Korean Oriental Medicine》;20101231;第31卷;98-106页 * |
| 李艳杰 等.草果配方颗粒中总黄酮含量测定.《吉林中医药》.2017,第27卷(第5期),第518页首段，第2节，第519页第3节. * |
| 草果果实中的酚性成分;杨崇仁 等;《云南植物研究》;20091231;第31卷;284-288页 * |
| 草果配方颗粒中总黄酮含量测定;李艳杰 等;《吉林中医药》;20170531;第27卷(第5期);第518页首段，第2节，第519页第3节 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN107525862A (zh) | 2017-12-29 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN107525862B (zh) | 拟草果总黄酮提取物的质量检测方法 | |
| CN103435580B (zh) | 灵芝酚a及其在制药和食品中的应用 | |
| CN102145066B (zh) | 一种从密茱萸中提取总黄酮的制备方法 | |
| CN104535677B (zh) | 一种基于活性筛选的牡丹皮药材及制剂检测方法 | |
| CN104306745A (zh) | 一种天麻醒脑胶囊的质量控制方法 | |
| CN105998109A (zh) | 一种芒果核多酚提取物及其制备方法 | |
| CN103197027A (zh) | 芪蛭通络胶囊的质量控制方法 | |
| CN102928526A (zh) | 高效液相色谱法分析蛹虫草中腺苷和虫草素含量的方法 | |
| CN109917031A (zh) | 一种测定大麻二酚粗产品中大麻酚类含量的方法 | |
| CN108802255A (zh) | 测定复方制剂中灵芝酸a和灵芝三萜类成分含量的方法 | |
| CN102058641A (zh) | 一种白芷提取物及质量检测方法 | |
| CN103251658B (zh) | 牛樟芝萃取浓缩物及其制造方法 | |
| CN103006754B (zh) | 骆驼刺提取物及其制备方法 | |
| CN103454229B (zh) | 一种宣木瓜适宜采收期的判别方法 | |
| CN101104010A (zh) | 山楂黄酮类成分的提取纯化工艺 | |
| CN102807545B (zh) | 一种蔓越莓中原花青素提取物的制备方法 | |
| CN103183616A (zh) | 一种从红腺忍冬叶制备绿原酸的方法 | |
| CN102872177A (zh) | 一种红参的加工方法 | |
| CN104491048B (zh) | 一种枇杷叶总倍半萜苷提取物及其制备方法与应用 | |
| CN103463145B (zh) | 以银杏落叶为原料的银杏叶精制提取物及其制备方法与应用 | |
| CN109045087A (zh) | 一种盐肤木有效部位的富集纯化工艺 | |
| CN103323551A (zh) | 一种检测枸杞酸含量的方法 | |
| CN103142663A (zh) | 从明日叶中提取香豆素类提取物的方法及产品和应用 | |
| CN104288189B (zh) | 一种从蒙药蓝盆花中制备总黄酮的方法 | |
| CN110827995B (zh) | 一种裸花紫珠道地药材的次生代谢产物色谱与质谱指纹谱的表征方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| EE01 | Entry into force of recordation of patent licensing contract | ||
| EE01 | Entry into force of recordation of patent licensing contract |
Application publication date: 20171229 Assignee: Guangxi Houde Pharmaceutical Co.,Ltd. Assignor: GUANGXI INSTITUTE OF CHINESE MEDICINE & PHARMACEUTICAL SCIENCE Contract record no.: X2022450000405 Denomination of invention: Quality Detection Method of Total Flavonoids Extracts from Paeonia tenuifolia Granted publication date: 20200317 License type: Common License Record date: 20221227 |