CN104535677B - 一种基于活性筛选的牡丹皮药材及制剂检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种用于牡丹皮药材、中间体和制剂产品多成分质量控制方法。该方法在细胞膜固相色谱技术和糖基化孵育体系筛选出供选择成分群；结合聚类分析和主成分分析确定氧化芍药苷、芍药苷、三没食子酰葡萄糖、五没食子酰葡萄糖、苯甲酰芍药苷和丹皮酚6个主成分基础上，采用同一液相色谱条件建立牡丹皮药材、丹皮提取物中间体、牡丹皮制剂产品中氧化芍药苷、芍药苷、三没食子酰葡萄糖、五没食子酰葡萄糖、苯甲酰芍药苷和丹皮酚的含量同步测定方法；能准确测定这6个成分含量，并确定成分组成结构比范围为：(1.3~1.5):(10.4~13.9):0.5:(2.7~3.5):(1.0~1.2):(14.9~16.1)。

Description

一种基于活性筛选的牡丹皮药材及制剂检测方法

技术领域

本发明涉及一种基于活性筛选的牡丹皮药材及制剂检测方法，属于中医药研究方法学领域。

背景技术

目前国内外中药药材、中间体、制剂质量控制的方法是在化学成分研究的基础上,建立中药中的某一或两个有效成分(主成分)的定性、定量分析方法，进而控制中药的质量。但这种质量控制方法未能体现中药整体特点，也未能给出这些质控指标与药效相关的证据，更值得关注的是这些成分的质量控制不是越高越好，而是不同的成分应该控制在一定范围比例内，即“组分结构”。很多研究案例结果显示中药(复方)的最佳药效是多种药材或组分之间组成结构的生物学反映。

牡丹皮为双子叶植物，是毛茛科植物牡丹PaeoniasuffruticosaAndr.的干燥的根皮。产于安徽、四川、河南、山东等地。牡丹皮始载于《神农本草经》，列为中品，具有清热凉血、活血化淤、退虚热等功效。现代学者对牡丹皮的化学成分进行了许多药理效应研究，认为其具有心血管系统作用、保肝、降血糖、降血脂、降血压等作用，还具有中枢神经系统作用。对牡丹皮及其产品的质量控制，2010年《中国药典》质量控制标准规定药材含丹皮酚不得少于1.2％，该质控标准不能客观准确反应牡丹皮的药材质量。在《中国药典》中收录的近40种成方制剂，对于牡丹皮药材来说，质控指标仅一个或不涉及。

本技术基于活性成分的筛选，结合主成分分析、聚类分析等手段，揭示了牡丹皮药材、中间体、制剂的组成结构特征，确定多成分指标的质控范围，为牡丹皮药材及制剂提供一种多组分质量控制方法。

附图说明

图1肾系膜细胞固相化牡丹皮提取物产物色谱图(A)及化学结构图(B)，其中(a)牡丹皮孵育液；(b)最后一次PBS洗涤液；(c)空白解离液；(d)固相化产物解离液

图2牡丹皮提取物抑制AGEs生成色谱图(A)及化学结构图(B)，其中(a)牡丹皮孵育液；(b)丙酮醛孵育液；(c)牡丹皮与丙酮醛孵育液

图3牡丹皮提取物抑制血小板聚集生成色谱图(A)及化学结构图(B)，其中(a)牡丹皮孵育液；(b)最后一次PBS洗涤液；(c)空白解离液；(d)固相化产物解离液

图4HPLC法测定的不同产地牡丹皮(A)及成分聚类分析结果(B)，注：从前向后依次为湖南、安徽、甘肃、重庆、四川、贵州、河南、河北、浙江、山东产地的牡丹皮吸收峰。

图5效应物质对AGEs诱导的SOD活性(A)及MDA含量(B)的影响

图6效应物质系膜细胞FN蛋白表达的影响

图7效应物质血管内皮细胞凋亡的影响，其中：a,200μg/mL牛血清白蛋白；b,200μg/mLAGEs；c,氨基胍(10μM)+200μg/mLAGEs；d,丹皮酚pae(10-4M)+200μg/mLAGEs；e,三没食子酰葡萄糖(10-4M)+200μg/mLAGEs；f,五没食子酰葡萄糖(10-4M)+200μg/mLAGEs；g,芍药苷(10-4M)+200μg/mLAGEs；h,氧化芍药苷(10-4M)+200μg/mLAGEs；i,苯甲酰芍药苷(10-4M)+200μg/mLAGEs.AGEs组和BSA组相比,###P<0.001；样品组与AGEs组相比,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。

图8牡丹皮药材、中间体、配方颗粒6个有效成分HPLC色谱图

图9不同产地牡丹皮对肾系膜细胞ICAM-1、TGF-β1和FN表达的影响及药效聚类分析

发明内容

解决的技术问题：

本发明针对牡丹皮药材、中间体及制剂产品的质量检测现状，提供一种基于高效液相色谱法的牡丹皮药材、中间体及制剂产品质量检测方法，通过主成分分析和聚类分析统计方法，获得主要的质控指标，并经药理活性评估证明其有效，确定指标成分的控制范围，为一种基于活性筛选的牡丹皮药材及制剂检测方法。

技术方案：

基于中医药整体性特点，采用现代活性成分筛选技术筛选牡丹皮药材中多个活性成分，结合数理统计聚类分析和主成分分析，确定与药效相关的6个主要成分，经抗AGEs诱导的肾系膜细胞和血管内皮细胞的活性评估，并确定这些成分的组成结构特征及检测范围，对其药材、中间体、制剂产品进行质量检测。

本发明提供的一种基于活性筛选的牡丹皮药材及制剂检测方法，其主要包括以下步骤:

(1)采用细胞膜固相色谱技术和糖基化产物共孵育体系筛选与血小板、肾系膜细胞、抑制糖基化产物生成的成分，并对这些成分进行辨识和解析，确定13个成分。

(2)根据步骤(1)采取聚类分析根据成分进行聚类分析，并采用主成分分析确定6个与药效活性相关的主成分。

(3)根据步骤(2)中确定的6个活性成分，评价其对抗糖基化产物AGEs对肾系膜细胞和血管内皮细胞损伤的保护活性。

(4)根据步骤(2)和(3)中确定的6个活性成分，建立检测牡丹皮药材、中间体及制剂的HPLC条件：

a.液相色谱条件：色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相：乙腈(A)-0.1％甲酸水溶液(B)，梯度洗脱条件：0-20min，5％-10％A；20-30min，10％-10％A；30-80min，10％-18％A；80-120min，18％-50％A；检测波长254nm，流速0.8mL/min，柱温25℃。

b.对照品溶液的制备：分别精密称取恒重的对照品氧化芍药苷、芍药苷、三没食子酰葡萄糖、五没食子酰葡萄糖、苯甲酰芍药苷和丹皮酚适量，加60％甲醇溶液分别制成每1mL含芍药苷72.15μg、氧化芍药苷59.56μg、三没食子酰葡萄糖89.35μg、五没食子酰葡萄糖109.76μg、苯甲酰芍药苷137.67μg和丹皮酚86.23μg，用甲醇定容至刻度，摇匀；另各取1mL配成混合对照品溶液。

c.供试品溶液的制备

牡丹皮药材供试品溶液的制备：精密称定牡丹皮药材粉末约0.5g，置50mL容量瓶中，加75％乙醇(v/v)20mL，超声或回流处理30min(两次)，取出，放冷，合并滤液，加75％乙醇定容至50mL刻度，摇匀，经0.45μm的微孔滤膜滤过，即得；

牡丹皮提取物供试品溶液的制备：精密称定牡丹皮提取物0.1g，置50mL容量瓶中，加75％乙醇(v/v)20mL，超声或回流处理30min(两次)，取出，放冷，合并滤液，加75％乙醇定容至50mL刻度，摇匀，经0.45μm的微孔滤膜滤过，即得；

牡丹皮制剂供试品溶液的制备：精密称定牡丹皮制剂粉末约0.25g，置50mL容量瓶中，加75％乙醇(v/v)20mL，超声或回流处理30min(两次)，取出，放冷，合并滤液，加75％乙醇定容至50mL刻度，摇匀，经0.45μm的微孔滤膜滤过，即得；

d.测定法：高效液相色谱仪分析对照品和供试品溶液，进样体积10μL。

(5)根据步骤(4)中建立的HPLC检测方法，结合药效分析和聚类分析，确定质量检测范围。

有益效果：针对牡丹皮药材、中间体及制剂产品的质量检测缺点，本发明基于活性筛选，结合数理统计方法，确定主成分，利用高效液相色谱同步检测技术，建立氧化芍药苷、芍药苷、三没食子酰葡萄糖、五没食子酰葡萄糖、苯甲酰芍药苷和丹皮酚含量同步测定方法，并确定最佳控制范围，进一步保证牡丹皮药材药材、中间体、制剂产品的质量，此方法相对于传统以丹皮酚为单一检测指标的方法，更为科学、准确。

具体实施方式

下面结合实例对本发明进行详细说明：

实施例1

本技术建立肾系膜细胞膜固相筛选系统，并通过LC/ESI/MS/MS技术寻找、辨别和归属效应物质标志峰，最终发现发现丹皮中有8个物质为与肾系膜细胞结合成分，具体的试验方法及结果如下：

1.细胞膜固相丹皮产物检测

(1)仪器与试药：Agilent1200高效液相色谱仪(DAD检测器)；XW-80A微型漩涡混合仪(上海沪西分析仪器厂有限公司)；氮吹仪(美国Organomation公司)。质谱仪(美国)。甲醇、乙腈、甲酸(色谱纯，美国，TEDIA)，双蒸水，其它试剂均为国产分析纯。

(2)肾系膜细胞膜固相化牡丹皮中的效应成分：取人系膜HBZY-1细胞，使其贴壁正常生长，除去培养基，加入道地丹皮提取物(终浓度为2×10^-4g/mL、1×10^-4g/mL、5×10^-5g/mL)，于37℃，5％CO₂、95％O₂条件下孵育90min，取出孵育液，待测。未结合成分的洗脱：用PBS洗涤细胞，弃去上清，反复洗涤，直到洗涤液中无丹皮提取物保留峰，取最后一次PBS洗涤液，待测。取上述所得孵育液、PBS洗涤液、解离液，另取空白PBS、空白解离液作为对照，在氮吹仪下放置12h，至所有样品吹干。各样品中加入0.8mL色谱甲醇，漩涡仪2min，使其充分溶解，氮吹12h。取下样品复溶，加入0.2mL甲醇，涡旋2min。11000转离心10min。取上清分析。

(3)色谱条件色谱柱：AgilentTC-C₁₈柱(4.6×250mm，5μm)，流动相A为乙腈，流动相B为0.1％的甲酸水，流动相条件：0-20min，5％-10％A；20-30min，10％-10％A；30-80min，10％-18％A；80-120min，18％-50％A；检测波长254nm，流速0.8mL/min，柱温25℃，进样量10μL。

(4)质谱检测条件：ESI源，负离子模式检测，源电压：-4kV；雾化气(N₂):0.45L/min；帘气(N₂):0.2L/min；去簇电势(DP)：-20V，聚焦电势(FP)：-80V；质量扫描范围：m/z80～1000。

(5)结果：本实验在上述基础研究的作用下，采用2×10^-4g/mL丹皮与系膜细胞共孵育90min，结果如图1。结果表明，d1–d8为细胞膜固相活性产物，这8个物质为(d1)牡丹苷B；(d2)芍药苷亚硫酸酯；(d3)芍药苷；(d4)四没食子酰葡萄糖；(d5)四没食子酰葡萄糖；(d6)六没食子酰葡萄糖；(d7)牡丹皮苷A；(d8)丹皮酚。结合丹皮已发现化学成分，综合分析各化合物的色谱保留时间、相对分子质量、碎片离子信息以及相关文献数据推测确定了8个化合物，见表1。

表1LC/ESI/MS/MS检测系膜细胞共孵育后特征碎片

实施例2

本技术建立体外晚期糖基化终末产物(AGEs)生成的非酶糖基化系统，并通过LC/ESI/MS/MS技术寻找、辨别和归属效应物质标志峰。发现丹皮提取物与丙酮醛反应后，有色谱峰消失或减少，也有色谱峰增加，这些物质分别是三没食子酰葡萄糖、四没食子酰葡萄糖、没食子酰芍药苷、六没食子酰葡萄糖和苯甲酰芍药苷。具体的试验方法及结果如下：

捕捉羰基化合物活性物质辨识和检测

(1)仪器与试剂：Agilent1200高效液相色谱仪(DAD检测器)；XW-80A微型漩涡混合仪(上海沪西分析仪器厂有限公司)；氮吹仪(美国Organomation公司)。甲醇、乙腈、甲酸(色谱纯，美国，TEDIA)，双蒸水，其它试剂均为国产分析纯。

(2)牡丹皮提取物与AGEs前体化合物丙酮醛共反应体系

空白对照：取AGEs的反应前体丙酮醛与BSA混合，溶于PBS溶液中，于37℃中共反应。药材对照：取丹皮提取物溶于PBS溶液中，于37℃无菌条件下共反应24h。丙酮醛与牡丹皮提取物共孵育：将丙酮醛0.1mL与丹皮提取物0.2mL溶于PBS溶液体系中，于37℃无菌条件下共反应24h。以上反应体系均保证最终浓度一致。取上述所得孵育液在氮吹仪下放置12h，至所有样品吹干。各样品中加入0.8mL色谱甲醇，漩涡仪2min，使其充分溶解，氮吹12h。取下样品复溶，加入0.2mL甲醇，涡旋2min。11000转离心10min。取上清分析。

(3)色谱及质谱条件色谱与质谱条件如实施例1项下所述。

(4)结果：采用丹皮与丙酮醛共孵育，结果如图2。经HPLC分析后，发现丹皮提取物与丙酮醛反应后，有色谱峰消失或减少，也有色谱峰增加。结合丹皮已发现化学成分，综合分析各化合物的色谱保留时间、相对分子质量、碎片离子信息以及相关文献数据推测确定了5个化合物：(c1)三没食子酰葡萄糖；(c2)四没食子酰葡萄糖；(c3)没食子酰芍药苷；(c4)六没食子酰葡萄糖；(c5)苯甲酰芍药苷，见表2。

表2LC/ESI/MS/MS检测丙酮醛共孵育后特征碎片

实施例3

本技术建立血小板固相色谱系统，通过LC/ESI/MS/MS技术寻找、辨别和归属效应物质标志峰。发现丹皮提取物与血小板反应后，有4个成分存在于解离液中，发挥效应。筛选出的活性物质分别为氧化芍药苷、四没食子酰葡萄糖、五没食子酰葡萄糖和苯甲酰芍药苷。具体的试验方法及结果如下：

抑制血小板聚集的活性物质检测

(1)仪器与试药：Agilent1200高效液相色谱仪(DAD检测器)；XW-80A微型漩涡混合仪(上海沪西分析仪器厂有限公司)；氮吹仪(美国Organomation公司)。

甲醇、乙腈、甲酸(色谱纯，美国，TEDIA)，双蒸水，其它试剂均为国产分析纯。

(2)血小板固相色谱法的建立

血小板血液的制备：SD大鼠，腹股动脉取血于含有枸橼酸钠抗凝剂的试管中(血液：抗凝剂＝9:1)，900转离心10min。吸取上层富含血小板的血浆(PRP)，再将PRP3000转离心10min，使血小板沉淀。将血小板用pH6.5的EDTA的Tyrode液洗涤3次，用pH7.4的PBS调成血小板混悬液。

血小板固相化丹皮提取物中的活性物质：取血小板悬液3mL，加入丹皮提取物，按照血小板与丹皮9:1混合，同时设置空白组：丹皮与PBS共反应，37℃水浴振荡结合30min，取孵育液，待测。以5倍量pH7.4的PBS洗涤液反复吹打，3000转离心10min，收集最后一次洗涤液，待测。沉淀中加5倍量解离液，吹散，37℃水浴振荡结合30min，3000转离心10min，取上清，待用。

检测样品的制备：取上述所得孵育液、第6次洗涤液、解离液，经过甲醇超纯水活化的SPE固相萃取柱，用0.5mL超纯水冲洗，以1mL甲醇保留，保留液过0.45μm滤膜，HPLC待测。

(3)色谱及质谱条件色谱与质谱条件如实施例1项下所述。

(4)结果：采用丹皮与血小板共孵育，结果如图3。经HPLC分析后，发现4个成分存在于解离液中，综合分析各化合物的色谱保留时间、相对分子质量、碎片离子信息以及相关文献数据推测确定了4个化合物：(d1)氧化芍药苷；(d2)四没食子酰葡萄糖；(d3)五没食子酰葡萄糖；(d4)苯甲酰芍药苷，见表3。

表3LC/ESI/MS/MS检测血小板固相后特征碎片

实施例4

不同产地丹皮药材HPLC分析比较及主成分分析

(1)仪器与试药：Agilent1200高效液相色谱仪(DAD检测器)。甲醇、乙腈、甲酸(色谱纯，美国，TEDIA)，双蒸水，其它试剂均为国产分析纯。

(2)样品的制备：取0.2mL不同产地牡丹皮的浓缩提取液，摇匀，加入甲醇定容至1mL，11000转离心10min，过0.45μm微孔有机滤膜，备用。

(3)色谱条件色谱柱：AgilentTC-C₁₈柱(4.6×250mm，5μm)，流动相A为乙腈，流动相B为0.1％的甲酸水，流动相条件：0-20min，5％-10％A；20-30min，10％-10％A；30-80min，10％-18％A；80-120min，18％-50％A；检测波长254nm，流速0.8mL/min，柱温25℃，进样量10μL。

(4)药效成分峰面积聚类分析及主成分分析：以不同产地牡丹皮药材中13个化学成分峰面积为数量性状，用SPSS16.0进行聚类分析，结果如图4。依据13个成分，用SPSS16.0进行主成分分析。

(5)结果:不同产地丹皮色谱图比较：采用HPLC分析观察不同产地丹皮254nm下的吸收峰，HPLC实验结果见图4。对不同产地牡丹皮提取物中包括13个有效成分以及其他主要成分之间存在着较大的差别的峰进行峰面积统计与比较，其中，河北丹皮丹皮酚含量最高，峰面积见表5。

表5不同产地丹皮提取物20成分峰面积比较

不同产地丹皮成分聚类分析：由图4可以看出，通过对13个成分进行峰面积组成特征研究，浙江、河南丹皮与安徽道地丹皮构成较一致，归为为一类。河北产地丹皮药材为一类，成分构成与安徽道地丹皮药效组分构成差异明显。

不同产地牡丹皮13个成分的组成比例比较：牡丹苷B、芍药苷亚硫酸酯、氧化芍药苷、芍药苷、三没食子酰葡萄糖、四没食子酰葡萄糖、四没食子酰葡萄糖、五没食子酰葡萄糖、六没食子酰葡萄糖、没食子酰芍药苷、苯甲酰芍药苷、牡丹皮苷A和丹皮酚分别为峰2、7、13、14、16、17、18、19、20、21、22、23、24(对应表5)。对不同产地丹皮成分组成比例结果显示如表6，发现每个产地均有自己独特的组成特征。组分总苷/酚和鞣质13种有效成分组成结构范围为1:(0.1～0.8):(1.1～16.4):(16.4～29.5):(0.3～1.4):(0.4～1.5):(0.1～3.7):(0.9～3.8):(0.4～2.6):(0.7～2.3):(0.1～1.3):(0.4～2.1):(14.7～30.2)。

表6不同产地丹皮药效成分组成特征

主成分分析法优选丹皮属药材组成结构成分：主成分分析可以将多个指标组合成少数几个指标，并反映总体信息。为优选13个成分中具有代表性的含量较高的成分，将10个产地丹皮的13个成分的峰面积进行分析，以13个成分分别设置为x1～x13作为变量，建立10个产地的数据文件，结果如表7。

表7特征值和方差贡献率

结果显示，第一主成分至第六主成分的累积贡献率可达96.952％，表明可选用这6个代表性成分来作为后期组成结构优化实验方案的主要成分，这六个主成分为氧化芍药苷(Oxypae,Oxypaeoniflorin)、芍药苷(paeoniflorin)、苯甲酰芍药苷(Ben,benzoylpaeoniflorin)、丹皮酚(paeonol)、三没食子酰葡萄糖(Tri,trigalloylglucose)、五没食子酰葡萄糖(Pen,pentagalloylglucose)。

实施例5

6个主成分的活性评价

(1)仪器及试剂：全自动酶标仪(Thermo，美国)；CO₂细胞培养箱(HERACELL500，ThermoForma公司产品，美国)；电泳仪(型号164-5051，Bio-Rad，美国)。超氧化物歧化酶(SOD)WST-1法测定试剂盒(批号20121101)；丙二醛(MDA)测试盒(批号：20121026)购自南京建成生物工程研究所；二甲亚砜(DMSO)；四噻唑蓝(MTT)、十二烷基硫酸钠(SDS)、Tris、丙烯酰胺、过硫酸铵(APS)、四甲基乙二胺(TEMED)、苯甲基磺酰氟(PMSF)、甘氨酸(美国sigma公司)；RIPA细胞裂解液(南通碧云天生物技术研究所)；兔抗鼠FN单克隆抗体(武汉博士德生物工程有限公司)。

(2)SOD和MDA测定：依据SOD和MDA试剂盒说明操作，于450nm(SOD)和523nm(MDA)处测定吸光度根据公式计算活性。

(3)FN的westernblot测定

总蛋白提取：除去细胞上清液，于冷PBS中洗涤2遍，胰酶消化，4℃，3000rpm离心10min。样品加入蛋白裂解液200μL，蛋白酶抑制剂PMSF10μL/mL，4℃裂解40min。转移至1.5mL离心管，15000rpm，4℃，离心5min。取上清，即为所需蛋白提取液，-20℃保存备用。

聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE电泳)：取蛋白样本70μg加入5×loadingbuffer，95℃变性10min，37℃作用10min。冰上上样，浓缩胶恒压80V约30min，待蛋白样品泳动到积层胶和分离胶交界时调电压至100V，电泳约90min。

转膜及杂交：电泳结束后，取出凝胶，将PVDF膜、滤纸及海绵预先浸泡在转膜缓冲液中10min。电压200V，转膜120min。转膜结束，用PBST缓冲液漂洗PVDF膜10min。然后置于5％BSA中，室温封闭2h。封闭缓冲液中取出PVDF膜，PBST洗，10min/次(3次)。将NC膜放入洁净小盒中，根据实验目的分别加入FN(1:400)抗体，4℃孵育过夜。第二天，PBST洗三次，每次10min，分别加入二抗(1：2000)，水平摇床室温震荡1h。加入新鲜配制的DAB显色液10μL显色，待出现明显的显色带后，加入蒸馏水终止显色，置于凝胶成像系统拍照，封存。

(4)统计学分析

计量资料以均数±标准差表示，数据结果采用GraphPadPrismTM5.0统计软件包，方差分析。组间比较用t检验方法，统计学的差异用P<0.05表示。

(5)结果

活性成分对AGEs诱导的SOD活力和MDA含量的影响：结果显示，与空白组相比较，当AGEs增多诱导氧化应激后，体内外SOD活性显著减弱(P<0.05)，MDA含量升高(P<0.05)。活性成分单体作用后能改变这种效应，使SOD活性增高，MDA含量减少，改善AGEs诱导的氧化应激(图5)。

活性成分对AGEs诱导的基底膜增生的影响：分组为：FN(1):a,200μg/mLBSA；b,200μg/mLAGEs；c,氨基胍(10μM)+200μg/mLAGEs；d-f,丹皮酚pae(10^-4、10^-5、10^-6M)+200μg/mLAGEs；g-i,三没食子酰葡萄糖(10^-4、10^-5、10^-6M)+200μg/mLAGEs；j-l,五没食子酰葡萄糖(10^-4、10^-5、10^-6M)+200μg/mLAGEs.FN(2):a,200μg/mLBSA；b,200μg/mLAGEs；c,氨基胍(10μM)+200μg/mLAGEs；d-f,芍药苷(10^-4、10^-5、10^-6M)+200μg/mLAGEs；g-i,氧化芍药苷(10^-4、10^-5、10^-6M)+200μg/mLAGEs；j-l,苯甲酰芍药苷(10^-4、10^-5、10^-6M)+200μg/mLAGEs.

在采用westernblot法对细胞中FN蛋白表达量的检测时，发现优选的效应成分可使其FN蛋白表达量降低(与模型组比较)，且具有剂量依赖性，对其结果进行灰度扫描和统计学分析，见图6。实验结果说明牡丹皮中6个效应成分能明显抑制系膜细胞分泌FN(AGEs组和BSA组相比,###P<0.001；样品组与AGEs组相比,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001)。

实施例6

6个活性成分对AGEs诱导的血管内皮细胞的损伤作用

(1)仪器与试剂：OlympusIX71奥林巴斯倒置显微镜(Olympus，日本)；CP-ST100ACO2培养箱(长沙市长锦科技有限公司，湖南)；LDZ4-1.2低速离心机(北京精力离心机有限公司)；SartoriusBS224S/CB-25A电子分析天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司)；吖啶橙(AO)、溴化乙锭(EB)、D-葡萄糖购买自Sigma(Sigma-Aldrich,Inc.,USA)；低糖DMEM培养基(Gibco公司，美国)；牛血清白蛋白BSA购自Sigma，(Aldrich,Inc.,USA)；胎牛血清购自杭州四季青生物工程有限公司。

(2)细胞：人脐静脉内皮细胞(HUVECs)购自美国ATCC。HUVECs培养在含10％胎牛血清低糖DMEM培养基中(80U/ml青霉素和100U/ml链霉素)，于37℃，5％CO₂条件下孵育。

(3)AGEs的准备：精密称取5g牛血清白蛋白(BSA)和9gD-葡萄糖，加入100ml无菌的玻璃容器中，以100ml0.2mol/L磷酸盐缓冲液(PBS，pH＝7.2)溶解。溶解液过0.22μm滤膜过滤。密封状态于37℃下孵育3个月。取出棕色反应液，在PBS溶液中透析除去小分子化合物，获得糖基化终产物(AGEs)。

(4)吖啶橙和溴化乙锭荧光检测：吖啶橙-溴化乙锭(AO-EB)荧光检测法用以评估6个化合物对AGEs引起的HUVECs凋亡的影响。将10⁵/mlHUVEC细胞悬液接种至24孔板中多聚赖氨酸盖玻片上，于37℃，5％CO₂的条件下孵育24h。细胞给予无血清培养基饥饿12h后，以培养基(blank)，200μg/mlBSA，200μg/mlAGEs或/及10^-4M化合物共孵育48h(30min间隔)。AG(10μM)用作阳性对照。PBS洗涤后，装载AO-EB，萤光显微镜下观察。Image-ProPlus图像分析软体处理，依据不同颜色计算细胞凋亡率(绿色被视为是正常细胞，紫玛瑙为凋亡细胞)。根据下列公式计算凋亡率：细胞凋亡百分率(％)＝紫玛瑙面积/(玛瑙面积+绿色面积)×100％。

(5)统计分析：实验数据用SPSS16.0软件，采用one-wayANOVA法进行统计分析，结果以means±SD表示，P<0.05被认为有显着差异。

(6)结果：6个化合物对AGEs诱导HUVECs凋亡的影响

实验以AO-EB荧光检测来评估6个化合物对AGEs诱导HUVECs凋亡的影响。细胞经200μg/mlAGEs处理后，与正常组和BSA组比较，具有显着性差异。从图7可以看到，AGEs组细胞红色面积增加，但是在先给予10^-4M化合物干预后，细胞凋亡程度恢复到正常组水平。统计学结果显示化合物干预组与AGEs组相比，具有显着性差异(P＜0.01)。这些结果表明，6个化合物具有干预AGEs诱导HUVECs凋亡的活性(a,200μg/mL牛血清白蛋白；b,200μg/mLAGEs；c,氨基胍(10μM)+200μg/mLAGEs；d,丹皮酚pae(10^-4M)+200μg/mLAGEs；e,三没食子酰葡萄糖(10^-4M)+200μg/mLAGEs；f,五没食子酰葡萄糖(10^-4M)+200μg/mLAGEs；g,芍药苷(10^-4M)+200μg/mLAGEs；h,氧化芍药苷(10^-4M)+200μg/mLAGEs；i,苯甲酰芍药苷(10^-4M)+200μg/mLAGEs.AGEs组和BSA组相比,###P<0.001；样品组与AGEs组相比,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。)。

实施例7

不同产地丹皮对AGEs诱导的肾系膜细胞ICAM-1、TGF-β1和FN表达的比较

(1)仪器及试剂

电泳仪(型号164-5051，Bio-Rad，美国)；二甲亚砜(DMSO)；四噻唑蓝(MTT)、十二烷基硫酸钠(SDS)、Tris、丙烯酰胺、过硫酸铵(APS)、四甲基乙二胺(TEMED)、苯甲基磺酰氟(PMSF)、甘氨酸(美国sigma公司)；RIPA细胞裂解液(碧云天生物技术研究所)；兔抗鼠TGF-β1单克隆抗体(武汉博士德生物工程有限公司)；兔抗鼠ICAM-1单克隆抗体(武汉博士德生物工程有限公司)；兔抗鼠FN单克隆抗体(武汉博士德生物工程有限公司)。

(2)细胞培养：HBZY-1细胞加入含100μg/mL链霉素、100U/mL青霉素、10％胎牛血清的不完全DMEM(低糖)培养基，于37℃、5％CO₂、95％O₂培养箱中孵育。每隔24h换一次培养基。

(3)AGEs制备：如实施例6项下所述。

(4)模型的建立：将细胞消化后，接种于6孔板中，每孔2mL细胞悬液，孵育24h，弃去培养基，加入一定浓度的药物孵育30min，后加入AGEs共孵育，使AGEs终浓度为200μg/mL，建立病理模型。

(5)蛋白提取及Westernblot检测FN蛋白表达：细胞用冰PBS洗后，加入细胞裂解液，冰上裂解30min，4℃下15000转离心3min，收集上清，测蛋白浓度。取等量总蛋白进行SDS–PAGE的蛋白电泳，将蛋白从SDS-PAGE的凝胶上转移至PVDF膜上，BSA封闭，加入ICAM-1、TGF-β1、FN(1:400)抗体，孵育并过夜，之后加入二抗，再孵育，化学发光法显色。

(6)统计学分析：计量资料以均数±标准差表示，数据结果采用GraphPadPrismTM5.0统计软件包，方差分析。组间比较用t检验方法，统计学的差异用P<0.05表示。

(7)结果

采用WB法研究不同产地丹皮对抗糖尿病肾病诱导的ICAM-1、TGF-β1和FN的表达。实验结果发现，与空白对照组相比，当AGEs诱导DN后，模型组细胞的蛋白表达均显著增加，不同产地丹皮作用后，蛋白表达减弱，实验结果见图9A-D，丹皮对ICAM-1蛋白表达的作用不同，其药效差异为安徽>贵州>浙江>河南>山东>湖南>河北>四川>甘肃>重庆；丹皮对TGF-β1蛋白表达作用显示其药效差异为安徽>四川>山东>甘肃>重庆>湖南>河南>浙江>贵州>河北；丹皮对FN蛋白表达作用显示其药效差异为山东>安徽>四川>贵州>浙江>甘肃>湖南>河北(a.正常组；b.模型组；c.阳性组；d.安徽组；e.贵州组；f.浙江组；g.河南组；h.湖南组；i.河北组；j.四川组；k.重庆组；l.山东组；m.甘肃组。与正常组比较，###P<0.001；与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001)。

聚类分析方法可以有效的区分不同产地丹皮的药效。其中贵州、浙江、河南、安徽药效相似性较高归为一大类；湖南、河北、重庆、甘肃、四川、山东归为一类。表明安徽、贵州、浙江、河南药材在药效上不存在较明显的差异，而与其他产地丹皮具有药效显著性差异，也表明不同产地丹皮药材在质量上存在本质差异。聚类分析结果见图9E。

实施例8

牡丹皮药材的6个指标成分检测

(1)液相色谱条件：色谱条件如实施例1项下所述。色谱图见图8A。

(2)对照品溶液的制备：分别精密称取恒重的对照品氧化芍药苷(1)、芍药苷(2)、三没食子酰葡萄糖(3)、五没食子酰葡萄糖(4)、苯甲酰芍药苷(5)和丹皮酚(6)适量，加60％甲醇溶液分别制成每1mL含芍药苷72.15μg、氧化芍药苷59.56μg、三没食子酰葡萄糖89.35μg、五没食子酰葡萄糖109.76μg、苯甲酰芍药苷137.67μg和丹皮酚86.23μg，用甲醇定容至刻度，摇匀；另各取1mL配成混合对照品溶液。

(3)供试品溶液的制备：牡丹皮药材供试品溶液的制备：精密称定牡丹皮药材粉末约0.5g，置50mL容量瓶中，加75％乙醇(v/v)20mL，超声或回流处理30min(两次)，取出，放冷，合并滤液，加75％乙醇定容至50mL刻度，摇匀，经0.45μm的微孔滤膜滤过，即得；

(4)线性关系考察：取氧化芍药苷、芍药苷、三没食子酰葡萄糖、五没食子酰葡萄糖、苯甲酰芍药苷和丹皮酚对照品储备液于10mL的棕色容量瓶中，稀释0、2、10、20、40和50倍，得到不同浓度的对照品溶液，按上述色谱条件，进样5μL。用峰面积积分(Y)与浓度(X)进行线性回归，得到回归方程：Y＝191X-0.95，R²＝0.9999；Y＝189X+0.05，R²＝0.9998；Y＝171X-11.51，R²＝0.9995；Y＝884X+0.63，R²＝0.9999；Y＝180X-5.59，R²＝0.9998Y＝187X+0.08，R²＝0.9998。结果表明，氧化芍药苷、芍药苷、三没食子酰葡萄糖、五没食子酰葡萄糖、苯甲酰芍药苷和丹皮酚对照品在浓度为5.73～91.17μg/mL，2.41～106.8μg/mL，2.78～85.0μg/mL，3.05～238.0μg/mL，1.0～30.6μg/mL，14.67～292.76μg/mL内与其峰面积的线性关系良好。

(5)精密度：取丹皮样品溶液进行精密度考察。按色谱条件连续进样5次；计算氧化芍药苷、芍药苷、三没食子酰葡萄糖、五没食子酰葡萄糖、苯甲酰芍药苷和丹皮酚对照品峰面积的RSD，为0.38％，1.03％，0.52％，1.20％，1.33％，0.53％。表明仪器有良好的精密度。

(6)日间精密度：取丹皮溶液进行日间精密度考察。于第一个工作日取样品3份，按照色谱条件进样分析；连续3天同法测定，计算氧化芍药苷、芍药苷、三没食子酰葡萄糖、五没食子酰葡萄糖、苯甲酰芍药苷和丹皮酚对照品峰面积的RSD，为1.22％，1.31％，0.61％，0.42％，0.98％，1.07％，显示方法有良好的日间精密度。

(7)重复性：精密称定丹皮样品溶液，平行制备6份供试品，按上述的色谱条件进样5μL，测定峰面积，计算芍药苷RSD为1.76％，表明此方法重复性良好。

(8)稳定性：取相同的供试品，分别在0、2、4、8、12、24h时液相色谱与之前相同的条件下进样分析，测定峰面积，计算氧化芍药苷、芍药苷、三没食子酰葡萄糖、五没食子酰葡萄糖、苯甲酰芍药苷和丹皮酚对照品含量的RSD为0.46％，0.86％，1.23％，1.45％，1.11％，0.83％，说明供试品在24h内各成分稳定性较好。

(9)加样回收率：取该已知含量的丹皮样品6份，吸取1.0mL，置10mL容量瓶中，精密加入氧化芍药苷、芍药苷、三没食子酰葡萄糖、五没食子酰葡萄糖、苯甲酰芍药苷和丹皮酚对照品，蒸馏水定容到刻度，按进样10μL检测，计算其平均加样回收率为99.00％，98.50％，97.80％，101.20％，96.46％，96.78％。

(10)不同产地牡丹皮药材

按上述分析条件，测定不同产地药材6个成分的含量。根据药效聚类分析认为安徽、贵州、浙江、河南药材在药效上相近，归为一类。结合成分聚类分析结果，浙江、河南丹皮与安徽道地丹皮成分构成较一致。通过分析比较不同产地药材6个主成分的含量差异，确定不同产地牡丹皮的6各成分组成结构差异较大。药效和成分聚类分析的结果显示浙江、河南丹皮与安徽道地丹皮构成较一致，归为一类，因此我们确定在牡丹皮药材质量控制的时候不仅要考虑现有标准检测指标的含量，还需要多指标质控，更重要的是，还要强调这6个主要药效成分之间的成分结构比，即氧化芍药苷、芍药苷、三没食子酰葡萄糖、五没食子酰葡萄糖、苯甲酰芍药苷和丹皮酚6个成分的组成结构比范围为：(1.3～1.5):(10.4～13.9):0.5:(2.7～3.5):(1.0～1.2):(14.9～16.1)；6个成分的质量检测范围分别为4.36～12.98μg/mL；33.84～97.47μg/mL；1.79～5.06μg/mL；2.45～5.45μg/mL；3.27～9.99μg/mL；49.85～139.28μg/mL。

表8不同产地牡丹皮6种成分含量及结构比(μg/mL)

实施例9

不同批次牡丹皮提取物中间体的6个指标成分检测

(1)液相色谱条件：色谱条件如实施例1项下所述。色谱图见图8B。

(2)对照品溶液的制备：分别精密称取恒重的对照品氧化芍药苷(1)、芍药苷(2)、三没食子酰葡萄糖(3)、五没食子酰葡萄糖(4)、苯甲酰芍药苷(5)和丹皮酚(6)适量，加60％甲醇溶液分别制成每1mL含芍药苷72.15μg、氧化芍药苷59.56μg、三没食子酰葡萄糖89.35μg、五没食子酰葡萄糖109.76μg、苯甲酰芍药苷137.67μg和丹皮酚86.23μg，用甲醇定容至刻度，摇匀；另各取1mL配成混合对照品溶液。

(3)供试品溶液的制备：牡丹皮提取物中间体供试品溶液的制备：精密称定牡丹皮提取物0.1g，置50mL容量瓶中，加75％乙醇(v/v)20mL，超声或回流处理30min(两次)，取出，放冷，合并滤液，加75％乙醇定容至50mL刻度，摇匀，经0.45μm的微孔滤膜滤过，即得。

(4)线性关系考察：取氧化芍药苷、芍药苷、三没食子酰葡萄糖、五没食子酰葡萄糖、苯甲酰芍药苷和丹皮酚对照品储备液于10mL的棕色容量瓶中，稀释0、2、10、20、40和50倍，得到不同浓度的对照品溶液，按上述色谱条件，进样10μL。用峰面积积分(Y)与浓度(X)进行线性回归，得到回归方程：Y＝191X-0.95，R²＝0.9999；Y＝189X+0.05，R²＝0.9998；Y＝171X-11.51，R²＝0.9995；Y＝884X+0.63，R²＝0.9999；Y＝180X-5.59，R²＝0.9998Y＝187X+0.08，R²＝0.9998。结果表明，氧化芍药苷、芍药苷、三没食子酰葡萄糖、五没食子酰葡萄糖、苯甲酰芍药苷和丹皮酚对照品在浓度为5.73～91.17μg/mL，2.41～106.8μg/mL，2.78～85.0μg/mL，3.05～238.0μg/mL，1.0～30.6μg/mL，14.67～292.76μg/mL内与其峰面积的线性关系良好。

(5)精密度：取丹皮中间体样品溶液进行精密度考察。按色谱条件连续进样5次；计算氧化芍药苷、芍药苷、三没食子酰葡萄糖、五没食子酰葡萄糖、苯甲酰芍药苷和丹皮酚对照品峰面积的RSD，为0.42％，1.53％，0.89％，1.01％，0.72％，0.88％。表明仪器有良好的精密度。

(6)日间精密度：取丹皮中间体样品溶液进行日间精密度考察。于第一个工作日取样品3份，按照色谱条件进样分析；连续3天同法测定，计算氧化芍药苷、芍药苷、三没食子酰葡萄糖、五没食子酰葡萄糖、苯甲酰芍药苷和丹皮酚对照品峰面积的RSD，为1.39％，1.52％，0.58％，0.48％，0.43％，1.17％，显示方法有良好的日间精密度。

(7)重复性：精密称定丹皮中间体样品溶液，平行制备6份供试品，按上述的色谱条件进样10μL，测定峰面积，计算芍药苷RSD为1.416％，表明此方法重复性良好。

(8)稳定性：取相同的供试品，分别在0、2、4、8、12、24h时液相色谱与之前相同的条件下进样分析，测定峰面积，计算氧化芍药苷、芍药苷、三没食子酰葡萄糖、五没食子酰葡萄糖、苯甲酰芍药苷和丹皮酚对照品含量的RSD为0.62％，0.36％，1.62％，1.41％，1.16％，1.24％，说明供试品在24h内各成分稳定性较好。

(9)加样回收率：取该已知含量的丹皮中间体样品6份，吸取1.0mL，置10mL容量瓶中，精密加入氧化芍药苷、芍药苷、三没食子酰葡萄糖、五没食子酰葡萄糖、苯甲酰芍药苷和丹皮酚对照品，蒸馏水定容到刻度，按进样10μL检测，计算其平均加样回收率为102.63％，101.47％，100.52％，96.47％，99.59％，102.53％。

(10)不同批次牡丹皮提取物中间体6个成分含量测定

按上述分析条件，不同批次牡丹皮提取物中间体6个成分含量测定。结果见表9。

表9不同批次牡丹皮提取物中间体6个成分含量测定(μg/mL)

实施例10

不同批次牡丹皮配方颗粒的6个指标成分检测

(1)液相色谱条件：色谱条件如实施例1项下所述。色谱图见图8C。

(2)对照品溶液的制备：分别精密称取恒重的对照品氧化芍药苷(1)、芍药苷(2)、三没食子酰葡萄糖(3)、五没食子酰葡萄糖(4)、苯甲酰芍药苷(5)和丹皮酚(6)适量，加60％甲醇溶液分别制成每1mL含芍药苷72.15μg、氧化芍药苷59.56μg、三没食子酰葡萄糖89.35μg、五没食子酰葡萄糖109.76μg、苯甲酰芍药苷137.67μg和丹皮酚86.23μg，用甲醇定容至刻度，摇匀；另各取1mL配成混合对照品溶液。

(3)供试品溶液的制：牡丹皮配方颗粒供试品溶液的制备：精密称定牡丹皮配方颗粒粉末约0.25g，置50mL容量瓶中，加75％乙醇(v/v)20mL，超声或回流处理30min(两次)，取出，放冷，合并滤液，加75％乙醇定容至50mL刻度，摇匀，经0.45μm的微孔滤膜滤过，即得。

(4)线性关系考察：取氧化芍药苷、芍药苷、三没食子酰葡萄糖、五没食子酰葡萄糖、苯甲酰芍药苷和丹皮酚对照品储备液于10mL的棕色容量瓶中，稀释0、2、10、20、40和50倍，得到不同浓度的对照品溶液，按上述色谱条件，进样10μL。用峰面积积分(Y)与浓度(X)进行线性回归，得到回归方程：Y＝191X-0.95，R²＝0.9999；Y＝189X+0.05，R²＝0.9998；Y＝171X-11.51，R²＝0.9995；Y＝884X+0.63，R²＝0.9999；Y＝180X-5.59，R²＝0.9998Y＝187X+0.08，R²＝0.9998。结果表明，氧化芍药苷、芍药苷、三没食子酰葡萄糖、五没食子酰葡萄糖、苯甲酰芍药苷和丹皮酚对照品在浓度为5.73～91.17μg/mL，2.41～106.8μg/mL，2.78～85.0μg/mL，3.05～238.0μg/mL，1.0～30.6μg/mL，14.67～292.76μg/mL内与其峰面积的线性关系良好。

(5)精密度：取配方颗粒样品溶液进行精密度考察。按色谱条件连续进样5次；计算氧化芍药苷、芍药苷、三没食子酰葡萄糖、五没食子酰葡萄糖、苯甲酰芍药苷和丹皮酚对照品峰面积的RSD，为0.36％，1.83％，1.42％，1.15％，1.36％，0.93％。表明仪器有良好的精密度。

(6)日间精密度：取配方颗粒样品溶液进行日间精密度考察。于第一个工作日取样品3份，按照色谱条件进样分析；连续3天同法测定，计算氧化芍药苷、芍药苷、三没食子酰葡萄糖、五没食子酰葡萄糖、苯甲酰芍药苷和丹皮酚对照品峰面积的RSD，为1.82％，1.42％，1.67％，1.48％，1.52％，1.31％，显示方法有良好的日间精密度。

(7)重复性：精密称定配方颗粒样品溶液溶液，平行制备6份供试品，按上述的色谱条件进样10μL，测定峰面积，计算芍药苷RSD为1.93％，表明此方法重复性良好。

(8)稳定性：取相同的供试品，分别在0、2、4、8、12、24h时液相色谱与之前相同的条件下进样分析，测定峰面积，计算氧化芍药苷、芍药苷、三没食子酰葡萄糖、五没食子酰葡萄糖、苯甲酰芍药苷和丹皮酚对照品含量的RSD为1.72％，1.53％，1.64％，1.83％，1.37％，1.48％，说明供试品在24h内各成分稳定性较好。

(9)加样回收率：取该已知含量的丹皮配方颗粒样品6份，吸取1.0mL，置10mL容量瓶中，精密加入氧化芍药苷、芍药苷、三没食子酰葡萄糖、五没食子酰葡萄糖、苯甲酰芍药苷和丹皮酚对照品，蒸馏水定容到刻度，按进样10μL检测，计算其平均加样回收率为99.07％，99.37％，102.73％，104.73％，103.28％，97.33％。

(10)不同批次牡丹皮配方颗粒6个成分含量测定

按上述分析条件，测定不同产地药材6个成分的含量。结果见表10。

表10不同批次牡丹皮配方颗粒6个成分含量测定(μg/mL)

Claims (6)

1.一种基于活性筛选的牡丹皮药材及制剂检测方法，其特征在于检测指标成分是通过肾系膜细胞、血小板细胞膜固相色谱技术和糖基化产物反应体系筛选，结合聚类分析和主成分分析确定的，采用HPLC法，确定氧化芍药苷、芍药苷、三没食子酰葡萄糖、五没食子酰葡萄糖、苯甲酰芍药苷和丹皮酚为检测指标，所述检测指标的含量HPLC法同步测定方法如下：

①液相色谱条件：色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相：乙腈-0.1％甲酸水溶液，梯度洗脱条件：0-20min，5%-10%乙腈；20-30min，10%-10%乙腈；30-80min，10%-18%乙腈；80-120min，18%-50%乙腈；检测波长254nm，流速0.8mL/min，柱温25^oC。

②对照品溶液的制备：分别精密称取恒重的对照品氧化芍药苷、芍药苷、三没食子酰葡萄糖、五没食子酰葡萄糖、苯甲酰芍药苷和丹皮酚适量，加60%甲醇溶液分别制成每1mL含芍药苷72.15μg、氧化芍药苷59.56μg、三没食子酰葡萄糖89.35μg、五没食子酰葡萄糖109.76μg、苯甲酰芍药苷137.67μg和丹皮酚86.23μg，用甲醇定容至刻度，摇匀；另各取1mL配成混合对照品溶液。

③供试品溶液的制备

牡丹皮药材供试品溶液的制备：精密称定牡丹皮药材粉末约0.5g，置50mL容量瓶中，加75%乙醇(v/v)20mL，超声或回流处理30min两次，取出，放冷，合并滤液，加75%乙醇定容至50mL刻度，摇匀，经0.45um的微孔滤膜滤过，即得；

牡丹皮提取物供试品溶液的制备：精密称定牡丹皮提取物0.1g，置50mL容量瓶中，加75%乙醇(v/v)20mL，超声或回流处理30min两次，取出，放冷，合并滤液，加75%乙醇定容至50mL刻度，摇匀，经0.45um的微孔滤膜滤过，即得；

牡丹皮制剂供试品溶液的制备：精密称定牡丹皮制剂粉末约0.25g，置50mL容量瓶中，加75%乙醇(v/v)20mL，超声或回流处理30min两次，取出，放冷，合并滤液，加75%乙醇定容至50mL刻度，摇匀，经0.45um的微孔滤膜滤过，即得；

④测定法：高效液相色谱仪分析对照品和供试品溶液，进样体积10μl。

2.根据权利要求1中所述的一种基于活性筛选的牡丹皮药材及制剂检测方法，其特征在于这6个成分具有对抗晚期糖基化产物(AGEs)诱导肾系膜细胞和血管内皮细胞的损伤作用，即提高肾系膜细胞和血管内皮细胞的SOD活性、降低MDA含量，以及降低系膜细胞FN蛋白表达和内皮细胞凋亡的影响。

3.根据权利要求1中所述的一种基于活性筛选的牡丹皮药材及制剂检测方法，其特征在于检测指标成分氧化芍药苷、芍药苷、三没食子酰葡萄糖、五没食子酰葡萄糖、苯甲酰芍药苷、丹皮酚检测范围分别为4.36~12.98μg/mL；33.84~97.47μg/mL；1.79~5.06μg/mL；2.45~5.45μg/mL；3.27~9.99μg/mL；49.85~139.28μg/mL。

4.根据权利要求1所述的一种基于活性筛选的牡丹皮药材及制剂检测方法，其特征在于：所述的含量HPLC法同步测定方法中，牡丹皮药材、制剂中氧化芍药苷、芍药苷、三没食子酰葡萄糖、五没食子酰葡萄糖、苯甲酰芍药苷和丹皮酚与领近小峰的分离度应大于1.5。

5.根据权利要求1所述的一种基于活性筛选的牡丹皮药材及制剂检测方法，其特征在于用于牡丹皮药材、提取物、制剂的质量检测。

6.根据权利要求1所述的一种基于活性筛选的牡丹皮药材及制剂检测方法，其特征在于用于含牡丹皮的制剂包括颗粒剂、胶囊剂、酊剂、口服液、丸剂、膏剂、糖浆、片剂、外用剂型的制剂质量检测。