CN110346494A - 一种同时测定灯盏花中4种有效成分含量的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种同时测定灯盏花中4种有效成分含量的方法，所述4种有效成分为灯盏乙素、灯盏甲素、野黄芩素和芹菜素，所述的方法采用如下色谱条件：色谱柱：C18液相色谱柱；流速：0.8～1.2ml/min；柱温：25℃～35℃；检测波长：335nm；进样量：2μl；流动相A：水；流动相B：乙腈；流动相C：0.3％磷酸水溶液；采用梯度洗脱。本发明的优点是：测定方法准确可靠，科学合理。

Description

一种同时测定灯盏花中4种有效成分含量的方法
技术领域
本发明属于中药成分分析技术领域，特别涉及一种同时测定灯盏花中4种有效成分含量的方法。
背景技术
灯盏花，是菊科植物短葶飞蓬[Erigeron breviscapus(Vant.)Hand-Mazz.]的全草，又名灯盏细辛、东菊，主要分布于我国西南的云南、贵州、四川和广西等地，尤以云南最多，占98％左右，灯盏花最先记载于《滇南本草》，《中国药典》一部中也予以收录。灯盏花中含有黄酮、吡喃酮、倍半萜等五十多种化学成分，具有活血舒经、止痛消积等功效。灯盏花中的主要药用活性成分为黄酮类化合物，黄酮类化合物主要是由2个苯环与3个碳原子桥连锁形成的C6-C3-C6化合物(如图1)。灯盏花制剂在临床上对心脑血管疾病具有特殊疗效，如用于治疗由高血压、脑淤血、脑栓塞等脑血管意外所致瘫痪症以及冠心病、心绞痛等。据报道，以灯盏花黄酮类成分制成的片剂和注射液用于治疗脑血栓所致瘫痪的总有效率为95.8％。
药企以灯盏花总黄酮为基础的灯盏花浸膏，生产的益脉康片、益脉康胶囊、灯盏生脉胶囊和华佗再造丸等成药产品，药材原料的需求量约150万千克；以灯盏花素为基础，生产的灯盏花素片、灯盏花素注射液等成药药品，药材原料的需求量约120万千克；以灯盏乙素和总咖啡酸酯等酚酸类化合物为基础，生产的灯盏细辛注射液，药材原料的需求量约40万千克，共计需求约310万千克。但近年来的灯盏花种质资源调查表明，由于人们对灯盏花的过度采挖，导致灯盏花野生资源急剧减少，目前云南省内每年能够提供的野生灯盏花药材不超过50万千克。由于野生资源难以供应市场需求，自2004年起，云南省开始对灯盏花进行大规模规范化栽培，2012年云南省灯盏花种植面积达730hm2，药材总产量约274万千克，药材产量占全国的97％以上。随着灯盏花药用价值的不断开发利用，现存的野生种质资源以及现有的品种将无法满足市场对灯盏花的需求，这就需要选育出具有针对某种或某几种活性成分含量较高的品种，以满足市场的需求。
灯盏花作为原料提取类药材，其黄酮化合物以及总黄酮成分含量高低是评价其药材品质的关键指标。文献研究发现不同地区灯盏花的黄酮化合物以及总黄酮含量存在显著差异，这对灯盏花质量控制和药企选育专用型品种造成很大挑战，目前也没有文献报道不同地区灯盏花的黄酮化合物和总黄酮含量之间的关系。现有中国药典中对灯盏花的成分控制，主要是通过测定浸出物和通过高效液相测定野黄芩苷含量，不能有效证明灯盏花的品质，还需要进一步进行研究。
发明内容
为了克服现有技术的缺陷，本发明的目的是提供一种同时测定灯盏花中4种有效成分含量的方法，该方法能有效对灯盏花进行质量控制。
为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：
一种同时测定灯盏花中4种有效成分含量的方法，所述4种有效成分为灯盏乙素、灯盏甲素、野黄芩素和芹菜素，所述的方法采用如下色谱条件：
色谱柱：C18液相色谱柱；
流速：0.8～1.2ml/min；
柱温：25℃～35℃；
检测波长：335nm；
进样量：2μl；
流动相A：水；流动相B：乙腈；流动相C：0.3％磷酸水溶液；
采用如下梯度洗脱程序：
t/min 水A/％ 乙腈B/％ 0.3磷酸水C/％
0 92.0 8.0 0.0
3 0.0 24.0 76.0
14 0.0 25.5 74.5
20 0.0 26.5 73.5
26 0.0 31.0 69.0
34 0.0 90.0 10.0
35 80.0 20.0 0.0
。
作为优选，所述色谱柱选自Sun Fire C18液相色谱柱4.6mm×250mm，5μm。
作为优选，所述柱温为30℃；所述流速为1.0ml/min。
作为优选，所述方法还包括标准品溶液的制备；所述标准品溶液的制备包括以下步骤：精确称取灯盏乙素、灯盏甲素、野黄芩素、芹菜素4个标准品适量，置于10ml容量瓶中用甲醇溶解并定容，摇匀，制得标准品溶液，浓度分别为660μg/ml、673μg/ml、633μg/ml、700μg/ml，4℃保存，备用。
作为优选，所述方法还包括供试品溶液的制备；所述供试品溶液的制备包括以下步骤：取灯盏花，用乙醇提取，过滤，得提取液，再用微孔滤膜过滤，取滤液，备用。
作为优选，所述乙醇提取时采用体积浓度为65％的乙醇溶液来进行；所述提取采用浸泡后超声波振荡的方式来进行；所述浸泡的时间为1～3小时；所述超声波振荡的次数为1～5次，每次所述超声波振荡的时间为10～20分钟。
本发明提供了一种同时测定灯盏花中4种有效成分含量的方法，所述方法用于检测灯盏花中灯盏乙素、灯盏甲素、野黄芩素和芹菜素的方法。
通过本发明的技术方案，可以达到以下有益效果：
(1)该方法专属性能好，能很好地对灯盏花进行质量监测，更好地评估灯盏花的品质；
(2)在分析灯盏花中的灯盏乙素、灯盏甲素、野黄芩素和芹菜素的分离度好，测定方法科学合理，为灯盏花质量控制和药企选育专用型品种提供了必要的理论依据。
附图说明
图1为黄酮类化合物的基本结构；
图2为混合标准品溶液(A)及供试溶液(B)的HPLC图谱；
图3为灯盏乙素与总黄酮相关性关系图；
图4为黄酮总和与总黄酮相关性关系图。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
实施例
一种同时测定灯盏花中4种有效成分含量的方法
(1)准品溶液的制备；所述标准品溶液的制备包括以下步骤：精确称取灯盏乙素、灯盏甲素、野黄芩素、芹菜素4个标准品适量，置于10ml容量瓶中用甲醇溶解并定容，摇匀，制得标准品溶液，浓度分别为660μg/ml、673μg/ml、633μg/ml、700μg/ml，4℃保存，备用。
(2)供试品溶液的制备；所述供试品溶液的制备包括以下步骤：取灯盏花样本，用乙醇提取，过滤，得提取液，再用0.22μm的微孔滤膜过滤，取滤液，备用。其中，乙醇提取时采用体积浓度为65％的乙醇溶液来进行；所述提取采用浸泡后超声波振荡的方式来进行；所述浸泡的时间为1～3小时；所述超声波振荡的次数为1～5次，每次所述超声波振荡的时间为10～20分钟。作为具体的实施方式，浸泡时间可以为2小时，超声波振荡的次数为2次，每次超声波振荡的时间为15分钟。
(3)色谱条件：
色谱柱：C18液相色谱柱；
流速：0.8～1.2ml/min；作为具体的实施方式，流速可为1.0ml/min；
柱温：25℃～35℃；作为具体的实施方式，柱温可为30℃；
检测波长：335nm；进样量：2μl；
流动相A：水；流动相B：乙腈；流动相C：0.3％磷酸水溶液；
采用如下梯度洗脱程序：
t/min 水A/％ 乙腈B/％ 0.3磷酸水C/％
0 92.0 8.0 0.0
3 0.0 24.0 76.0
14 0.0 25.5 74.5
20 0.0 26.5 73.5
26 0.0 31.0 69.0
34 0.0 90.0 10.0
35 80.0 20.0 0.0
。
(4)色谱条件进样分析，分别计算4种黄酮单体化合物含量。混合标准品溶液(A)及供试溶液(B)的HPLC图谱，见图2。
(5)线性关系实验
以各标准品色谱峰峰面积为纵坐标(Y)，以进样体积为横坐标(X)绘制标准曲线，得标准曲线回归方程(见表1)。
表1 4种对照品标准曲线及其线性范围
化合物 回归方程 相关系数 线性范围
灯盏乙素 Y＝2207.9052X+17.2939 0.9999 0.0066～1.9800
灯盏甲素 Y＝2667.4260X+6.0192 0.9999 0.0067～2.0100
野黄芩素 Y＝3365.8653X+4.3711 1.0000 0.0095～2.8500
芹菜素 Y＝3417.8832X+4.6808 0.9999 0.0070～2.1000
(6)结果与分析，见表2。
表2不同地区灯盏花4个黄酮单体化合物与总黄酮含量分布(％，n＝3)
注：黄酮总和为灯盏乙素、灯盏甲素、木犀草素与芹菜素这四者之和；*表示灯盏乙素含量最高的五个地区；**表示总黄酮含量最高的五个地区。
上述实施例在云南农业大学西南中药材种质创新与利用国家地方联合工程研究中心实验室进行。
上述实施例的样本采集为：
通过随机取样方法从云南及贵州六盘水共计采集灯盏花样品46份(见表3)。其中云南省44份，主要采集于红河(8份)、大理(7份)、曲靖(7份)、昆明(6份)、丽江(4份)、玉溪(3份)、昭通(3份)、文山(2份)、保山(2份)、怒江(1份)、楚雄(1份)；贵州省六盘水市(2份)。
表3灯盏花样品采集地信息
灯盏乙素与总黄酮相关性分析
把不同地区46份样品所测灯盏乙素含量与总黄酮含量建立一个简单数学模型，结果如图3。图3显示，灯盏乙素与总黄酮之间的相关系数r＝0.8362，故这两者之间成正相关关系，回归方程表示为Y＝0.9253+1.0220X。
黄酮总和与总黄酮比较分析
把不同地区46份样品所测黄酮总和含量与总黄酮含量建立一个简单数学模型，结果如图4。图4表明，黄酮总和与总黄酮之间的相关系数r＝0.9032，故这两者之间也成正相关关系，回归方程表示为Y＝0.7063+0.9570X。
本发明对不同地区46份灯盏花种质资源进行了4种黄酮单体化合物和总黄酮的含量测定。结果表明：不同地区灯盏花种质资源4种黄酮单体化合物成分含量差异较大，地理上相距较远的种质资源间有效成分含量差异明显，地理上相近的种质资源间存在较大差异。
本发明做了灯盏乙素含量与总黄酮含量的相关性分析，结果表明这两者之间成正相关关系；本实验还用黄酮总和与总黄酮量做了相关性分析，结果同样表明这两者之间也成正相关关系，且相关系数r更大。
以上对本发明的实施方式作了详细说明，但本发明不限于所描述的实施方式。对于本领域的技术人员而言，在不脱离本发明原理和精神的情况下，对这些实施方式进行多种变化、修改、替换和变型，仍落入本发明的保护范围内。

Claims (7)

1.一种同时测定灯盏花中4种有效成分含量的方法，其特征在于：所述4种有效成分为灯盏乙素、灯盏甲素、野黄芩素和芹菜素，所述的方法采用如下色谱条件：
色谱柱：C18液相色谱柱；
流速：0.8～1.2ml/min；
柱温：25℃～35℃；
检测波长：335nm；
进样量：2μl；
流动相A：水；流动相B：乙腈；流动相C：0.3％磷酸水溶液；
采用如下梯度洗脱程序：
t/min 水A/％ 乙腈B/％ 0.3磷酸水C/％ 0 92.0 8.0 0.0 3 0.0 24.0 76.0 14 0.0 25.5 74.5 20 0.0 26.5 73.5 26 0.0 31.0 69.0 34 0.0 90.0 10.0 35 80.0 20.0 0.0
。
2.根据权利要求1所述的一种同时测定灯盏花中4种有效成分含量的方法，其特征在于：所述色谱柱选自Sun Fire C18液相色谱柱4.6mm×250mm，5μm。
3.根据权利要求1所述的一种同时测定灯盏花中4种有效成分含量的方法，其特征在于：所述柱温为30℃；所述流速为1.0ml/min。
4.根据权利要求1所述的一种同时测定灯盏花中4种有效成分含量的方法，其特征在于：所述方法还包括标准品溶液的制备；所述标准品溶液的制备包括以下步骤：精确称取灯盏乙素、灯盏甲素、野黄芩素、芹菜素4个标准品适量，置于10ml容量瓶中用甲醇溶解并定容，摇匀，制得标准品溶液，浓度分别为660μg/ml、673μg/ml、633μg/ml、700μg/ml，4℃保存，备用。
5.根据权利要求1所述的一种同时测定灯盏花中4种有效成分含量的方法，其特征在于：所述方法还包括供试品溶液的制备；所述供试品溶液的制备包括以下步骤：取灯盏花，用乙醇提取，过滤，得提取液，再用微孔滤膜过滤，取滤液，备用。
6.根据权利要求5所述的一种同时测定灯盏花中4种有效成分含量的方法，其特征在于：所述乙醇提取时采用体积浓度为65％的乙醇溶液来进行；所述提取采用浸泡后超声波振荡的方式来进行；所述浸泡的时间为1～3小时；所述超声波振荡的次数为1～5次，每次所述超声波振荡的时间为10～20分钟。
7.根据权利要求1-6任一项所述的同时测定灯盏花中4种有效成分含量的方法，其特征在于：所述方法用于检测灯盏花中灯盏乙素、灯盏甲素、野黄芩素和芹菜素的方法。
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