CN106248830A - 一种甘草中甘草酸含量的检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种甘草中甘草酸含量的检测方法，包括：取甘草药材，加入提取液提取后过滤，制得样品溶液；其中所述的提取液含有甲醇、醋酸铵水溶液和冰醋酸；对所述的样品溶液进行高效液相色谱检测，计算分析获得甘草药材中甘草酸的含量。甘草酸检测浓度在0.0392‑0.3528mg·mL‑1范围内与峰面积积分值呈良好线性关系；平均回收率为100.6％，RSD＝1.20％。本发明方法简便，灵敏度高，重现性好，样品分离度、对称性及峰形均较好，且保留时间适中，更加适合于常规检测。

Description

一种甘草中甘草酸含量的检测方法
技术领域
本发明属于医药化工领域，涉及一种甘草中甘草酸含量的检测方法。
背景技术
甘草为豆科植物甘草的干燥根及根茎，具有补脾益气、清热解毒、润肺止咳、调和诸药之功效，素有“十药九草”、“无草不药”之称。甘草中主要含有甘草酸、甘草次酸、黄酮、生物碱、氨基酸等化学成分，具有广泛的生理活性。甘草酸是甘草中最为重要的化学成分，具有消毒、消炎、抗过敏、治疗溃疡、镇咳、抗肿瘤和防治病毒肝炎、高血脂症和抗癌症等疾病的作用，引起药理学家和化学家的极大重视。
由于甘草的销量一直呈上升趋势，特别是近20多年增幅更大，国内外的需求量增大，市场走俏，诱发了对野生甘草的大量采挖，使野生资源受到严重破坏，甘草短缺已经成了世界性的问题。随着人工种植甘草面积的日益增大，甘草成品生产带来的边角料也积聚增多，为了简便、准确的确定不同产地的甘草的质量，充分利用甘草资源，同时得到纯度高、色泽好的甘草产品，提供一种检测方法对不同产地的野生与栽培甘草中甘草酸的含量变化，为甘草的药用资源和深入开发利用，提供基础依据，具有重要的意义。
发明内容
发明目的：本发明的目的在于提供一种甘草中甘草酸含量的方法，本方法操作简单，具有良好的精密度、重现性和可靠性，通用于测定各种不同来源的甘草药材中的甘草酸含量，可用于甘草药材的质量控制。
技术方案：本发明所述的甘草中甘草酸含量的检测方法，包括：
取甘草药材，加入提取液提取后过滤，制得样品溶液；其中所述的提取液含有甲醇、醋酸铵水溶液和冰醋酸；
对所述的样品溶液进行高效液相色谱检测，计算分析获得甘草药材中甘草酸的含量；高效液相色谱检测时，流动相由乙腈和磷酸水溶液按体积比35～45∶55～65配制而成。
所述醋酸铵水溶液的浓度为0.1～0.3mol·L-1；所述甲醇、醋酸铵水溶液和冰醋酸的体积比为60～70：30～40：1。
优选的，所述醋酸铵水溶液的浓度为0.2mol·L-1；所述甲醇、醋酸铵水溶液和冰醋酸的体积比为67∶33∶1。
甘草药材在提取前可先粉碎至粉末状，细度一般为200～400目，以提高活性成分浸出速率。
所述甘草药材与提取液的质量体积比(mg/ml)为1:0.5～4。
所述提取为超声提取；超声提取的时间为20～30min，功率为80～90w。
提取结束后可选择的用提取液稀释后进行过滤。过滤采用0.4～0.5μm微孔滤膜进行。
高效液相色谱检测时，色谱检测条件为：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相由乙腈和0.010～0.050mol·L-1磷酸水溶液按体积比35～45∶55～55配制而成；流速为0.8～1.2mL·min-1；检测波长为252±0.5nm；柱温为25～35℃。理论板数按甘草酸单铵盐峰计算为不低于2000(该理论板数是一个基础值，低于这个值理论上该方法可信度较低)。
优选的，高效液相色谱检测时，流动相由乙腈和0.01mol·L-1磷酸水溶液按体积比38∶62配制而成，流速为1.0mL·min-1，检测波长为252nm，柱温为30℃。
具体的，色谱柱可以采用Agilent(安捷伦)TC-C18。
另外，检测过程中，对照品为流动相稀释的甘草酸单铵盐溶液。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本方法通过高效液相色谱，实现了对不同来源甘草药材的质量检测，发现其相互间差异较大，且野生甘草中甘草酸的含量相对要高于人工种植甘草。经过试验表明，该方法简便，灵敏度高，重现性好，线性关系(甘草酸检测浓度在0.0392-0.3528mg·mL-1范围内与峰面积积分值呈良好线性关系)、精密度(RSD＝1.20％)、稳定性、回收率(100.6％)、样品分离度、对称性及峰形均较好，且保留时间适中(一般30min以内)，更加适合于常规检测。本方法准确、简便、快捷，能够更有效、更全面的控制甘草药材的质量。
本方法采用甲醇-0.1～0.3mol·L-1醋酸铵溶液-冰醋酸作提取溶剂，较之于稀乙醇、甲醇、流动相等其他溶剂，提取效率更高更完全。
本方法采用以乙腈-0.01～0.05mol·L-1磷酸溶液为流动相，灵敏度高，重现性好，样品分离度、对称性及峰形均较好，且保留时间适中，更加适合于常规检测。
附图说明
图1为实施例1高效液相色谱图；其中A-对照品；B-甘草药材(新疆阿拉山口甘草)；
图2为实施例4土库曼斯坦甘草样品的高效液相色谱图；
图3为实施例5新疆喀什甘草的高效液相色谱图；
图4为实施例7中哈萨克斯坦甘草的高效液相色谱图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐明本发明，应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定的范围。
仪器：高效液相色谱仪，岛津LC-15C。
实施例1线性关系考察
称取甘草酸单铵盐对照品约20mg，精密称定，置于10mL容量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，制成浓度为2.000mg·mL-1的甘草酸单铵盐溶液，折合甘草酸为1.960mg·mL-1，作为对照品贮备液。再精密量取对照品贮备液0.2、0.6、1.0、1.4、1.8mL，置于10mL容量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，得到含甘草酸分别为0.0392、0.1176、0.1960、0.2744、0.3528mg·mL-1的对照品溶液。分别精密吸取上述各对照品溶液5μL，进行高效液相色谱检测，色谱条件如下：
色谱柱：Agilent-C18(具体型号是TC-C18)(4.6mm×250mm，5μm)；流动相：乙腈-0.01mol·L-1磷酸水溶液(体积比为38∶62)；溶剂：甲醇-0.2mol·L-1醋酸铵水溶液-冰醋酸(体积比为67∶33∶1)；流速：1.0mL·min-1；检测波长：252nm；柱温：30℃；进样量：5μL。理论板数按甘草酸单铵盐峰计算应不低于2000。
以峰面积积分值(A)对对照品浓度(C)进行线性回归，得回归方程为A＝1.23×107C+34051.1(r＝0.9999)。结果表明，甘草酸检测浓度在0.0392-0.3528mg·mL-1范围内与峰面积积分值呈良好的线性关系。部分图谱见图1。
实施例2精密度试验
精密吸取浓度为0.1960mg·mL-1的对照品溶液5μL，按实施例1色谱条件连续进样6次，测定峰面积积分值分别为：2459390、2455275、2432390、2470314、2463095、2458402。结果，RSD＝0.52％，表明仪器精密度良好。
实施例3稳定性试验
供试品溶液的制备：取甘草药材粉末(细度为300目)约60mg，精密称定，置于100mL容量瓶中，加入溶剂(甲醇-0.2mol·L-1醋酸铵水溶液-冰醋酸，体积比为67∶33∶1)适量(30～40ml)，超声(超声功率80-90w)提取30min，静置，用溶剂稀释至刻度，摇匀，用0.45μm微孔滤膜滤过，即得。
精密量取同一供试品溶液5μL，分别在0、1、2、3、4、5、24h进行高效液相色谱检测，色谱条件同实施例1，测得峰面积积分值分别为：4640021、4705275、4622390、4610314、4643095、4718402，均值为4656582.8；结果，RSD＝0.96％，表明供试品溶液在24h内稳定。
实施例4重复性试验
称取同一甘草样品(土库曼斯坦甘草)粉末约60mg，平行6份，精密称定，按实施例3方法制备供试品溶液。精密吸取5μL，按实施例1色谱条件测定，测得峰面积积分值分别为：2362390、2407013、2399805、2357874、2341022、2360655，均值为2371459.8；结果，RSD＝1.10％，表明方法重复性较好。色谱图见图2。
实施例5加样回收率试验
取已知含量的甘草样品(新疆喀什甘草)9份，每份约60mg，精密称定，加入相应量的对照品，按上述方法(实施例3)制备供试品溶液，按上述色谱条件(实施例1)测定，计算加样回收率，结果见表1，色谱图见图3。
表1加样回收率试验结果(n＝9)
实施例6最低检测限测定
将对照品溶液稀释测定，色谱条件同实施例1，测得信噪比为3∶1时，甘草酸的最低检测浓度为0.0784μg·mL-1。
实施例7样品含量测定
取5个不同产地的甘草药材各60mg，精密称定，分别按上述方法制成供试品溶液，按上述方法测定甘草酸含量，结果见表2，部分图谱见下图4。
表2不同来源甘草药材的含量测定结果
序号 产地 平均含量/％
1 土库曼斯坦 2.3
2 新疆喀什 2.4
3 新疆阿拉山口 4.5
4 乌兹别克斯坦 5.2
5 哈萨克斯坦 5.6
实施例8
以哈萨克斯坦甘草药材为样品，采用不同溶剂进行提取后用高效液相色谱检测甘草酸含量，提取方法参照实施例3，色谱条件参考实施例1。结果参见表3。
表3

Claims (8)

1.一种甘草中甘草酸含量的检测方法，其特征在于，包括：
取甘草药材，加入提取液提取后过滤，制得样品溶液；其中所述的提取液含有甲醇、醋酸铵水溶液和冰醋酸；
对所述的样品溶液进行高效液相色谱检测，计算分析获得甘草药材中甘草酸的含量；高效液相色谱检测时，流动相由乙腈和磷酸水溶液按体积比35～45∶55～65配制而成。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述醋酸铵水溶液的浓度为0.1～0.3mol·L-1；所述甲醇、醋酸铵水溶液和冰醋酸的体积比为60～70：30～40：1。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述甘草药材与提取液的质量体积比为1：0.5～4。
4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述提取为超声提取；超声提取的时间为20～30min，功率为80～90w。
5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，高效液相色谱检测时，磷酸水溶液的浓度为0.010～0.050mol·L-1。
6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，高效液相色谱检测时，色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流速为0.8～1.2mL·min-1；检测波长为252±0.5nm；柱温为25～35℃。
7.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，高效液相色谱检测时，色谱柱采用安捷伦公司的TC-C18型号。
8.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，甘草药材在提取前粉碎至粉末状，细度为200～400目。
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