CN102641407B - 瓜蒌薤白颗粒的制备方法及检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了瓜蒌薤白颗粒的制备方法及检测方法，所述的制备方法包括a、提取物制备步骤、b、颗粒制备步骤，所述的检测方法为指纹图谱法，本发明与现有技术相比，所制的颗粒活性成分稳定性高，检测方法采用指纹图谱技术控制中药的质量，更适合中医药整体观的思想，具有更全面地评价瓜蒌薤白颗粒质量的特点。

Description

瓜蒌薤白颗粒的制备方法及检测方法

技术领域

本发明属于中药方剂的制备及检测方法，特别属于瓜蒌薤白颗粒的制备方法及检测方法。

背景技术

中药在预防和治疗心血管疾病中的作用日益突出。瓜蒌薤白白酒汤，由瓜蒌、薤白和白酒3味中药组成，其原始组方为：栝蒌实一枚(捣)薤白半斤白酒七升，出自汉代名医张仲景所著的《金匮要略》，是我国中医用于治疗胸痹症的代表方剂，也是近年来用于治疗心血管疾病的基本方剂之一，疗效确切，是一个很有价值的古方，但由于汤剂剂型原因，致使瓜蒌薤白的生物利用度较低，活性成分的稳定性不易控制；瓜蒌薤白汤室温放置7天，其总生物碱和总皂苷的含量均明显降低；

对于瓜蒌薤白白酒汤未见有关检测方法报道，仅在原著中有如下叙述：右三味，同煮，取二升，分温再服。在中国实验方剂学杂志，2010，16(15)：61-62，65.报道了瓜蒌薤白颗粒的质量标准研究一文，其为控制瓜蒌薤白颗粒制剂质量，选用薤白皂苷中的代表成分-薤白皂苷B作为含量测定的指标成分，已期为蒌薤白颗粒中薤白皂苷B的含量测定建立一种稳定性好、分离效率高的分析方法。由于中药复方是一个复杂的用药体系，特别是根据中医药整体观的思想，中药的药效是通过多种成分作用于机体的多个靶点而实现的，即使同时以几个成分作为质量控制的指标成分，仍不足以全面客观地评价中药的质量，更何况采用单一成分，因此采用薤白皂苷B无法准确全面评价瓜蒌薤白颗粒的质量。而中药指纹图谱作为天然药物的质量控制方法目前在国内外已被广泛接受。美国药典、英国药典、印度药典及WHO草药评价指南均收载了指纹图谱。ChP2010对一些品种采用了HPLC色谱指纹图谱技术，以控制产品质量，因此有必要采用指纹图谱技术对瓜蒌薤白颗粒进行质量控制。

发明内容

本发明所要解决的第1个技术问题是提供一种生物利用度高，活性成分稳定性的瓜蒌薤白颗粒的制备方法；

本发明所要解决的第2个技术问题上述瓜蒌薤白颗粒的检测方法；

本发明解决技术问题的技术方案为：瓜蒌薤白颗粒的制备方法，包括以下步骤：

a、提取物制备步骤

取瓜蒌、薤白药材，加6～12倍水或体积浓度50％-80％的乙醇于98-100℃煎煮或回流提取1～3小时，共提取2～3次，滤过，滤液浓缩成密度为1.05-1.25的稠膏，得到瓜蒌薤白提取物；

b、颗粒制备步骤

取瓜蒌薤白提取物1份，加药学上可接受的辅料1～4份进行混合，直接制成软材，再制成颗粒，干燥，整粒，包装，得瓜蒌薤白颗粒。

所述的a、提取物制备步骤也可以为以下步骤：

取瓜蒌、薤白药材适量，以体积浓度为75％-80％的乙醇溶液浸泡1h，超声处理45min，过滤，滤液浓缩至稠膏，备用；

残渣以65％-75％的乙醇溶液浸泡1h，超声处理45min，过滤，滤液浓缩至稠膏，备用；

残渣再55％-65％的乙醇溶液浸泡1h，超声处理45min，过滤，滤液浓缩至稠膏，合并三次稠膏液，备用。

所述药学上可接受的辅料为可溶性淀粉、淀粉、乳糖、蔗糖和糊精一种或两种以上组合。

所述的瓜蒌薤白颗粒规格范围为：每1～5克配方颗粒相当于瓜蒌薤白药材10～45克，可根据临床医生处方量的需求，用加入不同辅料来控制调节瓜蒌薤白配方颗粒的不同规格，优选范围为每5克相当于瓜蒌薤白生药材25克。

本发明的检测方法为指纹图谱法。

对照品溶液的制备

精密称取经五氧化二磷减压干燥12h的腺苷、槲皮素对照品适量，分别加15％甲醇制得含腺苷、槲皮素约100mg·L-1的对照品溶液。

供试品溶液的制备

取瓜蒌薤白颗粒2g及其组方药味瓜蒌、薤白各1g，用200mL的60％乙醇浸泡30min后，回流提取1h，过滤，滤渣加150mL的60％乙醇回流45min，合并二次回流提取液。用旋转蒸发仪减压回收溶剂得浸膏。浸膏用少量水溶解后，备用。

将水溶解后的溶液装入分液漏斗中，加入等量的乙酸乙酸萃取三次，取乙酸乙酯层，回收乙酸乙酯，残渣用20mL乙腈溶解，得乙酸乙酯提取层供试品溶液，0.45μm微孔滤膜过滤，备用。

取水层，再用等量的水饱和正丁醇溶液萃取三次，取正丁醇层，0.45μm微孔滤膜过滤，备用。

色谱条件

乙酸乙酯部位的色谱条件：色谱柱为Lichrospher C18(4.6mm×250mm，5μm)，以乙腈-1％H3PO4溶液为流动相，梯度洗脱(0～5min，乙腈20％→25％；5～10min，乙腈25％→27％；10～13min，乙腈27％→28％；13～15min，乙腈28％→28％；15～20min，乙腈28％→30％；20～25min，乙腈30％→31％；25～30min，乙腈31％→33％；30～35min，乙腈33％→40％；35～40min，乙腈40％→45％；40～50min，乙腈45％→45％；)，流速：1.0mL·min-1；柱温30℃；DAD检测器，检测波长为360nm。

正丁醇部位的色谱条件：色谱柱为Lichrospher C18(4.6mm×250mm，5μm)，以乙腈-水溶液为流动相，梯度洗脱(0～5min，乙腈0％→1％；5～10min，乙腈1％→1％；10～20min，乙腈1％→2％；20～25min，乙腈2％→2％；25～35min，乙腈2％→6％；35～40min，乙腈6％→6％；40～45min，乙腈6％→10％；45～50min，乙腈10％→10％)，流速：1.0mL·min-1；柱温30℃；DAD检测器，检测波长为260nm。

本发明与现有技术相比：所制的颗粒活性成分稳定性高，检测方法采用指纹图谱技术控制中药的质量，更适合中医药整体观的思想，具有更全面地评价瓜蒌薤白颗粒质量的特点。

附图说明

图1为瓜蒌薤白汤放置不同时间总生物碱的紫外-可见光谱图(酸性染料比色法)；1为0时间的总生物碱光谱图；2为放置7天后的总生物碱光谱图

图2为实施例1所制的颗粒放置不同时间总生物碱的紫外-可见光谱图(酸性染料比色法)；3为0时间的总生物碱光谱图；4为放置18个月后的总生物碱光谱图。

图3为瓜蒌薤白汤放置不同时间总皂苷的紫外-可见光谱变化(香草醛-浓硫酸显色法)5为0时间的总皂苷光谱图；6为放置7天后的总皂苷光谱图；

图4为实施例1所制的颗粒放置不同时间总皂苷的紫外-可见光谱变化(香草醛-浓硫酸显色法)7为0时间的总皂苷光谱图；8为放置18个月后的总皂苷光谱图

图5为瓜蒌薤白汤乙酸乙酯部位指纹图谱，A为0时间的指纹图谱、B为放置7天后的指纹图谱。

图6为实施例2所制的颗粒乙酸乙酯部位指纹图谱，C为0时间的指纹图谱、D为放置24个月天后的指纹图谱。

图7为实施例1所制的颗粒的正丁醇部位的指纹图谱(S-腺苷)。

图8为实施例1所制的颗粒的乙酸乙酯部位的指纹图谱(S-槲皮素)。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作详细的说明。

实施例1：

取90g瓜蒌、90g薤白药材，粉碎，加水1000ml，煎煮2小时，提取3次，合并提取药液，滤过，滤液在常压条件下浓缩至相对密度为1.05～1.15的清膏，减压干燥，研成干粉，得瓜蒌薤白提取物约18g，加乳糖3克，用体积浓度80％乙醇10ml制成软材，制成颗粒，经60℃下常压干燥，整粒，得瓜蒌薤白颗粒，分装成袋，规格为每1克相当于瓜蒌、薤白药材5克。

实施例2：

取瓜蒌、薤白药材各90g，以体积浓度75％-80％的乙醇溶液1000ml浸泡1h，超声(KH-4-DB型数控超声波清洗器，昆山禾创超声仪器公司)处理45min，过滤，滤液浓缩至稠膏，备用。残渣以65％-75％的乙醇溶液800ml浸泡1h，超声处理45min，过滤，滤液浓缩至稠膏，备用。残渣再55％-65％的乙醇溶液600ml浸泡1h，超声处理45min，过滤，滤液浓缩至稠膏，合并三次稠膏液(相对密度为1.10～1.25)，得瓜蒌薤白提取物约30g。加可溶性淀粉适量，制成软材，再制成颗粒，在60℃下常压干燥，整粒，得瓜蒌薤白颗粒，分装成袋，规格为每1克相当于瓜蒌、薤白药材6克。由图6可知，通过超声处理的提取物，其保质期明显加长。

实施例3：

取90g瓜蒌、90g薤白药材，粉碎，加60％乙醇1000g，煎煮3小时，提取3次，合并提取药液，滤过，滤液在常压条件下浓缩至相对密度为1.05～1.15的清膏，减压干燥，研成干粉，得瓜蒌薤白提取物约25g，加β-环糊精5克，用80％乙醇8ml制成软材，制成颗粒，经60℃下常压干燥，整粒，得瓜蒌薤白颗粒，分装成袋，规格为每1克相当于瓜蒌、薤白药材10克。

实例4：

取90g瓜蒌、90g薤白药材，粉碎，加70％乙醇1000ml，煎煮4小时，提取3次，合并提取药液，滤过，滤液在常压条件下浓缩至相对密度为1.10～1.25的稠膏，减压干燥，研成干粉，得瓜蒌薤白提取物约25g，加入可溶性淀粉、糖粉、糊精(1∶1∶1.5)的混合物7g，制成软材，再制成颗粒，在60℃下常压干燥，整粒，得瓜蒌薤白颗粒，分装成袋，规格为每1克相当于瓜蒌、薤白药材8克。

实施例5：检测方法。

(1)多糖的含量测定

标准品溶液的制备

取经五氧化二磷减压干燥至恒温重的槲皮素标准品，精密称定，置100mL量瓶中，加无水乙醇适量使溶解，并稀释至刻度，摇匀，即得0.054mg·mL-1的标准品溶液；

供试品溶液的制备

取瓜蒌薤白颗粒0.2g，精密称定，置100mL具塞锥形瓶中，加乙酸乙酯50mL，超声30min，过滤，取滤液，回收乙酸乙酯，残渣用无水乙醇溶解并用100ml容量瓶定容至刻度，备用；

三氯化铝溶液的制备

取三氯化铝适量，精密称定，用无水乙醇定容至100ml，制成浓度为0.1mol·L-1溶液，备用；

醋酸钠-醋酸缓冲液(pH 6.0)的制备

取醋酸钠54.6g，加1mol·L-1醋酸溶液20mL溶解后，加水稀释至500mL，即得；

检测波长的确定

取一定量的槲皮素对照品溶液和已处理好的供试品溶液，分别加三氯化铝溶液(V∶V＝1∶2)和醋酸钠-醋酸缓冲液(V∶V＝1∶1)，30℃显色30min后在200～800nm波长范围内扫描。结果表明，槲皮素对照品和供试品的最大吸收峰位一致，均位于424nm波长处，故本试验选用424nm作为检测波长；

标准曲线的制备

精密吸取槲皮素标准品溶液0.5、1、1.5、2、2.5mL，分别加三氯化铝溶液(V∶V＝1∶2)和醋酸钠-醋酸缓冲液(V∶V＝1∶1)，加无水乙醇定容至10ml。30℃显色30min后照分光光度法，于波长424nm处测定吸收度，以1ml蒸馏水按同样显色操作为空白，以测得的吸收度与其对应的浓度；

测定法

精密吸取供试品1.0mL，照标准曲线制备项下自“分别加三氯化铝溶液(V∶V＝1∶2)起”依法操作，由回归方程计算样品溶液中总黄酮含量。

(2)总黄酮的含量测定

标准品溶液的制备

取经五氧化二磷减压干燥至恒温重的槲皮素标准品，精密称定，置100mL量瓶中，加无水乙醇适量使溶解，并稀释至刻度，摇匀，即得0.054mg·mL-1的标准品溶液；

供试品溶液的制备

取瓜蒌薤白颗粒0.2g，精密称定，置100mL具塞锥形瓶中，加乙酸乙酯50mL，超声30min，过滤，取滤液，回收乙酸乙酯，残渣用无水乙醇溶解并用100ml容量瓶定容至刻度，备用；

三氯化铝溶液的制备

取三氯化铝适量，精密称定，用无水乙醇定容至100ml，制成浓度为0.1mol·L-1溶液，备用；

醋酸钠-醋酸缓冲液(pH 6.0)的制备

取醋酸钠54.6g，加1mol·L-1醋酸溶液20mL溶解后，加水稀释至500mL，即得；

检测波长的确定

取一定量的槲皮素对照品溶液和已处理好的供试品溶液，分别加三氯化铝溶液(V∶V＝1∶2)和醋酸钠-醋酸缓冲液(V∶V＝1∶1)，30℃显色30min后在200～800nm波长范围内扫描。结果表明，槲皮素对照品和供试品的最大吸收峰位一致，均位于424nm波长处，故本试验选用424nm作为检测波长；

标准曲线的制备

精密吸取槲皮素标准品溶液0.5、1、1.5、2、2.5mL，分别加三氯化铝溶液(V∶V＝1∶2)和醋酸钠-醋酸缓冲液(V∶V＝1∶1)，加无水乙醇定容至10ml。30℃显色30min后照分光光度法，于波长424nm处测定吸收度，以1ml蒸馏水按同样显色操作为空白，以测得的吸收度与其对应的浓度；

测定法

精密吸取供试品1.0mL，照标准曲线制备项下自“分别加三氯化铝溶液(V∶V＝1∶2)起”依法操作，由回归方程计算样品溶液中总黄酮含量。

实施例1-4的总黄酮量初始分别为3.75％，4.72％，4.88％，4.03％，18个月后，分别为3.65％，4.71％，4.80％，4.00％。

Claims (1)

1.瓜蒌薤白颗粒的检测方法，所述的检测方法为指纹图谱法，其特征在于：包括以下步骤

对照品溶液的制备

精密称取经五氧化二磷减压干燥12h的腺苷、槲皮素对照品适量，分别加15%甲醇制得含腺苷、槲皮素约100mg·L^-1的对照品溶液；

供试品溶液的制备

取瓜蒌薤白颗粒2g及其组方药味瓜蒌、薤白各1g，用200mL的60%乙醇浸泡30min后，回流提取1h，过滤，滤渣加150mL的60%乙醇回流45min，合并二次回流提取液，用旋转蒸发仪减压回收溶剂得浸膏，浸膏用少量水溶解后，备用；

将水溶解后的溶液装入分液漏斗中，加入等量的乙酸乙酯萃取三次，取乙酸乙酯层，回收乙酸乙酯，残渣用20mL乙腈溶解，得乙酸乙酯提取层供试品溶液，0.45μm微孔滤膜过滤，备用；

取水层，再用等量的水饱和正丁醇溶液萃取三次，取正丁醇层，0.45μm微孔滤膜过滤，备用；

色谱条件

乙酸乙酯部位的色谱条件：色谱柱为Lichrospher C₁₈4.6mm×250mm，5μm，以乙腈-1%H3PO4溶液为流动相，梯度洗脱0～5min，乙腈20%→25%；5～10min，乙腈25%→27%；10～13min，乙腈27%→28%；13～15min，乙腈28%→28%；15～20min，乙腈28%→30%；20～25min，乙腈30%→31%；25～30min，乙腈31%→33%；30～35min，乙腈33%→40%；35～40min，乙腈40%→45%；40～50min，乙腈45%→45%，流速：1.0mL·min^-1；柱温30℃；DAD检测器，检测波长为360nm；

正丁醇部位的色谱条件：色谱柱为Lichrospher C₁₈4.6mm×250mm，5μm，以乙腈-水溶液为流动相，梯度洗脱0～5min，乙腈0%→1%；5～10min，乙腈1%→1%；10～20min，乙腈1%→2%；20～25min，乙腈2%→2%；25～35min，乙腈2%→6%；35～40min，乙腈6%→6%；40～45min，乙腈6%→10%；45～50min，乙腈10%→10%，流速：1.0mL·min^-1；柱温30℃；DAD检测器，检测波长为260nm；

所述的瓜蒌薤白颗粒通过以下方法制备：

a、提取物制备步骤

取瓜蒌、薤白药材，加6～12倍水或体积浓度50%-80%的乙醇于98-100℃煎煮或回流提取1～3小时，共提取2～3次，滤过，滤液浓缩成密度为1.05～1.25的稠膏，得到瓜蒌薤白提取物；

b、颗粒制备步骤

取瓜蒌薤白提取物1份，加药学上可接受的辅料1～4份进行混合，直接制成软材，再制成颗粒，干燥，整粒，包装，得瓜蒌薤白颗粒。

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