CN107202853B - 血滞通胶囊的指纹图谱及高效液相色谱鉴别方法 - Google Patents

血滞通胶囊的指纹图谱及高效液相色谱鉴别方法 Download PDF

Info

Publication number
CN107202853B
CN107202853B CN201710519636.0A CN201710519636A CN107202853B CN 107202853 B CN107202853 B CN 107202853B CN 201710519636 A CN201710519636 A CN 201710519636A CN 107202853 B CN107202853 B CN 107202853B
Authority
CN
China
Prior art keywords
peak
stasis
open capsule
chromatographic
methanol
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201710519636.0A
Other languages
English (en)
Other versions
CN107202853A (zh
Inventor
李文革
杨德辉
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
DONGFANG PHARMACEUTICAL Co Ltd JILIN PROV
Original Assignee
DONGFANG PHARMACEUTICAL Co Ltd JILIN PROV
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by DONGFANG PHARMACEUTICAL Co Ltd JILIN PROV filed Critical DONGFANG PHARMACEUTICAL Co Ltd JILIN PROV
Priority to CN201710519636.0A priority Critical patent/CN107202853B/zh
Publication of CN107202853A publication Critical patent/CN107202853A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN107202853B publication Critical patent/CN107202853B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/88—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/88—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86
    • G01N2030/8809—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample

Landscapes

  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Sampling And Sample Adjustment (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

本发明公开了一种血滞通胶囊的指纹图谱及高效液相色谱鉴别方法。本发明首先公开了一种血滞通胶囊指纹图谱的建立方法，包括：(1)将血滞通胶囊内容物加入提取溶剂进行提取，得到提取液，纯化，得到供试品溶液；(2)将供试品溶液进行高效液相色谱分析，获得高效液相色谱图；(3)从高效液相色谱图的色谱峰中选择共有峰，得到血滞通胶囊指纹图谱。本发明进一步公开了所述方法建立的血滞通胶囊指纹图谱。本发明还公开了一种血滞通胶囊的高效液相色谱鉴别方法，该方法能够准确鉴别血滞通胶囊中的腺苷和紫丁香苷，精密度、稳定性及重复性良好。本发明所建立的血滞通胶囊的指纹图谱及高效液相色谱鉴别方法，在血滞通胶囊的质量控制中具有应用前景。

Description

血滞通胶囊的指纹图谱及高效液相色谱鉴别方法
技术领域
本发明涉及一种血滞通胶囊指纹图谱的建立方法，还涉及所述方法建立的血滞通胶囊指纹图谱，本发明进一步涉及一种血滞通胶囊的高效液相色谱鉴别方法，属于血滞通胶囊的鉴别领域。
背景技术
血滞通胶囊为薤白经加工制成的胶囊，内容物为淡棕黄色颗粒及粉末，有蒜臭、味微辣；功能与主治：通阳散结，行气导滞；用于高血脂症血瘀痰阻所致的胸闷、乏力、腹胀等。
目前，血滞通胶囊标准有薄层鉴别一项，含量测定一项；含量测定项为结合硫含量测定项，然而由于含硫化合物不稳定，因此该方法具有很大的误差性。高效液相色谱法是测定药物和天然产物中活性成分最常用的方法之一，具有快速、高效、灵敏等优点。指纹图谱是基于对中药物质群整体作用的认识，借助于波谱和色谱等技术获得中药化学成分的光谱或色谱图，是实现鉴别中药真实性、评价质量一致性和产品稳定性的可行模式。因此，建立血滞通胶囊的指纹图谱以及建立一种血滞通胶囊的高效液相色谱鉴别方法，对于血滞通胶囊的质量控制，提高血滞通胶囊的质量标准以及保障人民用药安全等将具有重要意义。
发明内容
本发明所要解决的第一个技术问题是提供一种血滞通胶囊指纹图谱的建立方法，该方法具有精密度、稳定性和重复性良好等优点；
本发明所要解决的第二个技术问题是提供所述方法建立的血滞通胶囊指纹图谱，能够应用于血滞通胶囊的质量控制或质量评价；
本发明所要解决的第三个技术问题是提供一种血滞通胶囊的高效液相色谱鉴别方法，该方法采用高效液相色谱法定性检测血滞通胶囊中的有效成份腺苷、紫丁香苷，实现对待检测血滞通胶囊的质量鉴别。
为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：
本发明首先公开了一种血滞通胶囊指纹图谱的建立方法，包括以下步骤：(1)将血滞通胶囊内容物加入提取溶剂进行提取，得到提取液，纯化，得到供试品溶液；(2)将供试品溶液进行高效液相色谱分析，获得高效液相色谱图；(3)从高效液相色谱图的色谱峰中选择共有峰，得到血滞通胶囊指纹图谱。
其中，步骤(2)所述高效液相色谱分析的色谱条件包括：色谱柱为Grace ApolloC18色谱柱，规格为4.6mm×250mm，5μm；十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相A为水，B为甲醇，进行梯度洗脱；流速为0.8ml/min；柱温为25-45℃；进样量为5-20μl；检测波长为220-320nm；优选的，柱温为40℃；进样量为10μl；检测波长为220nm。理论板数按紫丁香苷峰计算应不低于3000。所述梯度洗脱的程序包括：按体积百分比计，0-15min，A：95→85％，B：5→15％；15-20min，A：85→80％，B：15→20％；20-30min，A：80→60％，B：20→40％；30-45min，A：60→55％，B：40→45％；45-50min，A：55→95％，B：45→5％。
步骤(1)按照体积百分比计，所述提取溶剂选自30％甲醇、50％甲醇、甲醇、50％乙醇或乙醇中的任意一种；优选为50％甲醇；进一步优选的，按照g/ml计，血滞通胶囊内容物：50％甲醇＝2：50；所述提取的方式为超声提取30分钟；其中，所述超声的功率为250W，频率为40KHZ。
步骤(1)所述纯化采用中性氧化铝柱层析；优选的，所述纯化包括：将提取液滤过，取续滤液，蒸干；将蒸干后得到的残渣加50％甲醇(体积百分比，下同)溶解，分多次加在中性氧化铝柱上，用50％甲醇洗脱，收集流出液及洗脱液，蒸干；将蒸干后得到的残渣用50％甲醇溶解，即得；优选为，取续滤液10ml，蒸干后的残渣加50％甲醇约5ml溶解，分多次加在中性氧化铝柱上，用50％甲醇90ml洗脱。其中，所述中性氧化铝柱的内径为1cm；所述中性氧化铝的粒度为100-200目，用量为4g。
步骤(3)所述共有峰的选择包括：从多批供试品溶液高效液相色谱图中(其中，所述多批≥15批)，在12min-45min时间区间内选择峰面积较大的主要色谱峰-四个色谱峰作为共有峰，分别标记为峰1、峰2、峰3及峰4；以紫丁香苷峰即峰3为标准峰，各共有峰的相对保留时间为：峰1的相对保留时间为0.515-0.593、峰2的相对保留时间为0.735-0.845、峰3的相对保留时间为1.000、峰4的相对保留时间为1.168-1.344。各共有峰相对保留时间应在规定值的范围内。
本发明通过将供试品溶液色谱图中色谱峰的保留时间与紫丁香苷、腺苷对照品对照，确定峰1为腺苷的色谱峰，峰3为紫丁香苷的色谱峰。
本发明进一步公开了所述方法建立的血滞通胶囊指纹图谱；优选的，所述血滞通胶囊指纹图谱如图15所示。
本发明所建立的血滞通胶囊指纹图谱专属性强、重现性好，在血滞通胶囊的质量控制或质量评价中具有重要应用前景。
建立指纹图谱的色谱条件对于获取足以代表品种特征以及信息量足够的指纹图谱是关键性的。本发明对血滞通胶囊的液相色谱条件，包括色谱柱、流动相、检测波长、柱温、进样量以及供试品溶液制备条件等分别进行了优化筛选。色谱柱优化结果表明，在其它色谱条件相同的情况下，与Agilent C18或Shiseido C18色谱柱相比，在Grace Apollo C18(4.6mm×250mm 5μm)色谱柱中，各峰分离完全、分布较均匀，保留时间适中，整体指纹性好。检测波长优化结果表明，在220nm-320nm多波长范围内，在220nm处采集的色谱图，各峰比例适中，整体指纹性好。流动相优化结果表明，采用A：水，B：甲醇为流动相系统，洗脱程序为：0-15min，A:95→85％；15-20min，A:85→80％；20-30min，A:80→60％；30-45min，A:60→55％；45-50min，A:55→95％，色谱图上各主要色谱峰分离度好，保留时间适中，且能保证所有成分色谱峰在50分钟内全部出完。柱温优化结果表明，25-45℃范围内，以在40℃条件下各峰分离效果最好，且柱压低。进样量对指纹图谱的结果影响不大，加大进样量，可以减弱梯度洗脱时基线漂移的程度；但是进样量过大，色谱柱超载，可导致色谱峰宽增加或色谱峰尖钝化，并影响柱的寿命；实验确定，血滞通胶囊供试品溶液的进样量在5-20μl之间即可。指纹图谱时间段选择结果表明，12min以前由于溶剂峰影响指纹性不强，另外由于流动相梯度的影响供试品色谱峰在45min以前，指纹性较强的特征峰均已流出，由于流动相梯度的影响，45min后基线不稳定，所以截取12-45min时间段作为供试品的指纹区间。在供试品溶液的制备中，本发明选择50％甲醇为提取溶剂的色谱峰峰面积最大，提取效率最好，整体图貌最佳；提取方式采取一次超声提取30分钟即可提取完全，而且操作较加热回流提取更方便；对供试品溶液的纯化采用中性氧化铝柱层析，即可使基线平稳，又能去除极性较小的杂质，指纹性最佳。
精密度试验结果表明，同一份血滞通胶囊样品连续进样6次，以3号紫丁香苷为参比峰，各共有峰的相对保留时间、相对峰面积的RSD均小于3％。用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》软件评价及计算，精密度试验相似度为0.9以上。
稳定性试验结果表明，血滞通胶囊样品供试品溶液在12小时内通过HPLC分析结果稳定，各共有峰的相对保留时间的RSD均小于1％，相对峰面积比值的RSD小于3％。用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》软件计算，稳定性试验相似度为0.7以上。结果表明，室温保存下12小时内血滞通样品供试品溶液的稳定性良好。
重复性试验结果表明，6份血滞通胶囊供试品进样的相对保留时间RSD均小于1％，相对峰面积比值的RSD均小于3％，表明本发明方法的重现性良好。用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》软件计算，重复性试验相似度结果均大于0.9。
本发明还公开了一种血滞通胶囊的高效液相色谱鉴别方法，包括以下步骤：(1)将待检测血滞通胶囊内容物加入提取溶剂进行提取，得到提取液，纯化，得到供试品溶液；(2)取腺苷和紫丁香苷对照品，分别制备对照品溶液；(3)将供试品溶液与对照品溶液分别进行高效液相色谱分析，如果供试品溶液的高效液相色谱图中同时出现与腺苷、紫丁香苷对照品保留时间一致的色谱峰，则判定待检测血滞通胶囊的质量合格。
其中，步骤(3)所述高效液相色谱分析的色谱条件包括：色谱柱为Grace ApolloC18色谱柱，规格为4.6mm×250mm，5μm；十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相A为水，B为甲醇，进行梯度洗脱；流速为0.8ml/min；柱温为40℃；进样量为10μl；检测波长为220nm；理论板数按紫丁香苷峰计算应不低于3000。所述梯度洗脱的程序包括：按体积百分比计，0-15min，A：95→85％，B：5→15％；15-20min，A：85→80％，B：15→20％；20-30min，A：80→60％，B：20→40％；30-45min，A：60→55％，B：40→45％；45-50min，A：55→95％，B：45→5％；
按照体积百分比计，步骤(1)所述提取溶剂选自30％甲醇、50％甲醇、甲醇、50％乙醇或乙醇中的任意一种；优选为50％甲醇；进一步优选的，按照g/ml计，血滞通胶囊内容物：50％甲醇＝2：50；所述提取的方式为超声提取30分钟；其中，所述超声的功率为250W，频率为40KHZ。所述纯化采用中性氧化铝柱层析；优选的，所述纯化包括：将提取液滤过，取续滤液，蒸干；将蒸干后得到的残渣加50％甲醇(体积百分比，下同)溶解，分多次加在中性氧化铝柱上，用50％甲醇洗脱，收集流出液及洗脱液，蒸干；将蒸干后得到的残渣用50％甲醇溶解，即得；优选为，取续滤液10ml，蒸干后的残渣加50％甲醇约5ml溶解，分多次加在中性氧化铝柱上，用50％甲醇90ml洗脱。其中，所述中性氧化铝柱的内径1cm，中性氧化铝的粒度为100-200目，用量为4g。
步骤(2)所述对照品溶液的制备包括：将腺苷和紫丁香苷对照品分别用50％甲醇溶解，使每1ml对照品溶液中含腺苷或紫丁香苷20μg。步骤(3)根据供试品溶液的高效液相色谱图中出现与腺苷对照品保留时间一致(RSD＜3％，优选为RSD＜1％)的色谱峰，并且同时出现与紫丁香苷对照品保留时间一致(RSD＜3％，优选为RSD＜1％)的色谱峰，判定待检测血滞通胶囊的质量合格；反之，则判定待检测血滞通胶囊的质量不合格。
本发明所述的高效液相色谱鉴别方法的精密度、稳定性、重复性及耐用性良好，辅料均没有干扰峰。供试品高效液相色谱图中均出现与腺苷、紫丁香苷对照品相应保留时间的色谱峰，重现性好、专属性强。由高效液相的纯度分析可知，在供试品溶液与对照品溶液的高效液相色谱图中，与腺苷及紫丁香苷对照品相对应色谱峰的紫外吸收图一致，并且在相应保留时间处的色谱峰纯度均达100％，说明本发明液相条件分离度良好。因此，本发明血滞通胶囊的高效液相色谱鉴别方法，能够用于血滞通胶囊的质量控制。
本发明技术方案与现有技术相比，具有以下有益效果：
本发明采用高效液相色谱法建立了血滞通胶囊的指纹图谱，该方法的精密度、稳定性及重复性良好。本发明所建立的血滞通胶囊指纹图谱，相似度高、稳定性好。本发明进一步建立了一种血滞通胶囊的高效液相色谱鉴别方法，该方法能够准确鉴别血滞通胶囊产品中腺苷、紫丁香苷二种有效成份。本发明所建立的血滞通胶囊指纹图谱及高效液相色谱鉴别方法，在血滞通胶囊的质量控制等方面将具有重要应用前景。
附图说明
图1为采用Agilent C18(5μm,250×4.6mm)色谱柱的高效液相色谱图；
图2为采用Grace Apollo C18(5μm,250×4.6mm)色谱柱的高效液相色谱图；
图3为采用Shiseido C18(5μm,250×4.6mm)色谱柱的高效液相色谱图；
图4为血滞通胶囊供试品3D指纹图谱；
图5为波长220nm血滞通胶囊供试品高效液相色谱图；
图6为波长230nm血滞通胶囊供试品高效液相色谱图；
图7为波长254nm血滞通胶囊供试品高效液相色谱图；
图8为波长265nm血滞通胶囊供试品高效液相色谱图；
图9为波长290nm血滞通胶囊供试品高效液相色谱图；
图10为波长320nm血滞通样品高效液相色谱图；
图11为流动相条件①分离结果；
图12为流动相条件②分离结果；
图13为流动相条件③分离结果；
图14为流动相条件④分离结果；
图15为血滞通胶囊指纹图谱；其中，1、2、3、4为共有峰；
图16为腺苷对照品色谱峰；
图17为紫丁香苷对照品色谱峰；
图18为血滞通胶囊精密度试验全谱相似度评价；
图19为血滞通胶囊稳定性试验全谱相似度评价；
图20为血滞通胶囊重复性试验全谱相似度评价；
图21为腺苷、紫丁香苷对照品溶液的高效液相色谱图；
图22为血滞通胶囊供试品溶液的高效液相色谱图；
图23为血滞通胶囊阴性对照品溶液的高效液相色谱图；
图24为对照品溶液高效液相色谱图中腺苷峰的纯度分析；
图25为对照品溶液高效液相色谱图中紫丁香苷峰的纯度分析；
图26为血滞通胶囊供试品溶液高效液相色谱图中腺苷峰的纯度分析；
图27为血滞通胶囊供试品溶液高效液相色谱图中紫丁香苷峰的纯度分析；
图28为50％甲醇超声样品色谱图；
图29为C18预制小柱纯化样品色谱图；
图30为D101大孔树脂纯化样品色谱图；
图31为中性氧化铝柱纯化样品色谱图。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。
实施例1血滞通胶囊指纹图谱的建立
1、实验材料
1.1样品
血滞通胶囊由吉林省东方制药有限公司提供，共20批，批号分别为：20120804、20120810、20120903、20120906、20120907、20130102、20130103、20130104、20130105、20130706、20130707、20130902、20140408、20140409、20140410、20150101、20150502、20150503、20150603、20150604。薤白药材4批，批号分别为：YZ-31-150501、YZ-31-141101、YZ-31-140901、YZ-31-140801。中间体4批，批号分别为：20150514、20150601、20150602、20150603。
1.2仪器与试剂
1.2.1仪器
岛津LC-20AT高效液相色谱仪，LC-solution工作站(日本岛津)。中药指纹图谱相似度评价系统软件2.0版；Agilent 1200Series高效液相色谱仪，Agilent Chem Station色谱工作站(美国安捷伦)。KQ－200超声波清洗仪(昆山舒美)。
1.2.2色谱柱
Agilent C18(5μm,250×4.6mm)；
Grace Apollo C18(5μm,250×4.6mm)；
Shiseido C18(5μm,250×4.6mm)。
保护柱：Auto Science C18。
1.2.3试剂
甲醇(Fisher，色谱纯)；水(超纯水)；甲醇(优级纯，北京化工厂)；乙醇(优级纯，北京化工厂)；100－200目中性氧化铝层析用(国药集团化学试剂有限公司)。
2、供试溶液的制备
2.1供试品溶液的制备
取装量差异项下的本品内容物，研匀，精密称取约2g，置具塞锥形瓶中，精密加入50％甲醇50ml，密塞，称定重量，超声处理30分钟(功率250W，频率40KHZ)，放冷，滤过，取续滤液10ml，蒸干，残渣加50％甲醇约5ml分多次加在中性氧化铝柱(100-200目，4g，内径1cm)上，用50％甲醇90ml洗脱，收集流出液及洗脱液，蒸干，残渣加50％甲醇定容至2ml量瓶中，摇匀，即得。
2.2参照物溶液的制备
血滞通胶囊样品经HPLC分析出现多个色谱峰，以腺苷、紫丁香苷为主要成分。因紫丁香苷积分面积在指纹图谱中所占的比例较大且相对稳定，因此选定紫丁香苷作为参照物。制备方法如下：
取腺苷、紫丁香苷对照品适量，精密称定，分别加50％甲醇制成每1ml含腺苷、紫丁香苷20μg的溶液，即得。
3、色谱试验条件
色谱实验条件选择的目的是通过比较实验，从中选取相对简单易行的方法和条件，获取足以代表品种特征以及信息量足够的指纹图谱，以满足指纹图谱的专属性、重现性和普遍适用性的要求。其中，指纹图谱的色谱条件是研究检测方法过程中最重要、关键性的内容。
3.1色谱柱的选择
根据文献报道，血滞通胶囊的原料薤白药材中主要含有甾体皂苷、氮类化合物、挥发油等，其中紫丁香苷、腺苷等是其主要的活性成分。根据其理化性质，其指纹图谱检测采用反相高效液相色谱法。由于不同生产厂家不同牌号的色谱柱因选用的硅胶原料、键合条件、封尾情况等的差异，致使在性能上互有差异，因此需要通过实验比较，选择合适的色谱柱。
色谱条件：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相A为水，B为甲醇，按表2程序进行梯度洗脱，流速为0.8ml/min；柱温为40℃；进样量为10μl；检测波长为220nm。
试验中在其它色谱条件相同的情况下，分别采用以下色谱柱：Agilent C18(5μm,250×4.6mm)，Grace Apollo C18(5μm,250×4.6mm)，Shiseido C18(5μm,250×4.6mm)。
供试品溶液应用不同色谱柱的检测结果见图1、图2和图3。试验结果表明，在GraceApollo C18(4.6mm×250mm 5μm)色谱柱中，各峰分离完全、分布较均匀，保留时间适中，整体指纹性好。因此，本发明确定选用Grace Apollo C18(4.6mm×250mm5μm)色谱柱。
3.2检测波长的选择
文献报道的检测波长常常是含量测定时某一特定成分的测定波长，不一定完全适合指纹图谱的需要。为了获取多层次的信息，需要选择数个不同的检测波长，为此，本发明在实验中在全波长检测获得3D指纹图谱(见图4)。同时选定了220nm、230nm、254nm、265nm、290nm、320nm多波长进行检测(色谱条件同3.1)，结果见图5-图10。
试验结果表明，在220nm处采集的色谱图，各峰比例适中，整体指纹性好，因此本发明选定220nm为检测波长。
3.3流动相的选择
为使各成分分离完全，相对保留时间稳定，出峰时间缩短，确定采用二元低压梯度洗脱，以①A：0.1％磷酸溶液；B：乙腈为流动相系统：流动相B：10～85％，60分钟线性梯度洗脱。②A：0.1％磷酸溶液；B：甲醇为流动相系统：流动相B：20～80％：40分钟线性梯度洗脱；③A：水；B：乙腈为流动相系统：15～22％，0-30min；22～50％，30-35min；50～85％，35-60min。④A：水；B：甲醇为流动相系统：0～15min，A:95→85％；15～20min，A:85→80％；20～30min，A:80→60％；30～45min，A:60→55％；45～50min，A:55→95％；50～55min，A:45→5％梯度洗脱(上述百分含量均为体积百分比，其它色谱条件同3.1)。结果见图11－图14。
从上述结果可见，采用④流动相系统谱图上各主要色谱峰分离度好，保留时间适中，且能保证所有成分色谱峰在50分钟内全部出完，因此确定④为本法流动相。
3.4柱温的选择
柱温的选择与恒定是指纹图谱技术稳定的影响因素之一。适宜的柱温不仅影响色谱峰的分离效果，而且柱温发生变化将导致色谱峰保留时间的迁移，技术参数的设置就失去了意义，因此柱温必须限定。而且，在分离效果相同时，应尽可能选定低温，以延长色谱柱填料的寿命。为此，在实验中分别设定柱温25℃、30℃、40℃、45℃。结果表明，在其他色谱条件相同的情况下(其它色谱条件同3.1)，以在40℃条件下，各峰分离效果最好，且柱压低。因此，确定柱温40℃。
3.5进样量的选择
进样量对指纹图谱的结果影响不大，但加大进样量，可以减弱梯度洗脱时基线漂移的程度；但是色谱柱的载样量有一定的限度，进样量过大，色谱柱超载，可导致色谱峰宽增加或色谱峰尖钝化，并影响柱的寿命。经实验，血滞通胶囊供试品溶液进样量在5～20μl之间即可。
3.6指纹图谱时间段选择
12min以前由于溶剂峰影响指纹性不强，另外由于流动相梯度的影响，供试品色谱峰在45min以前，指纹性较强的特征峰均已流出，由于流动相梯度的影响45min后基线不稳定，所以截取12－45min时间段作为供批品的指纹区间。
3.7指纹图谱峰归属及S峰的确认
分别称取紫丁香苷、腺苷对照品适量，配成对照品溶液，按照上述色谱条件(色谱条件同3.1)，注入液相色谱仪，通过保留时间确定供试品中标准色谱峰归属。
本发明按照上述优化的色谱条件，对18批血滞通胶囊样品建立了HPLC图谱，通过从18批血滞通胶囊样品图谱中筛查共性的色谱峰，本发明在12min-45min时间区间内，选择峰面积较大的主要色谱峰-四个色谱峰作为共有峰，分别标记为峰1、峰2、峰3及峰4。
由色谱图中的色谱峰保留时间可知，峰1为腺苷的色谱峰，峰3为紫丁香苷的色谱峰。由于紫丁香苷峰面积占总峰面积比值较大，并且是血滞通胶囊中活血、降脂的主要活性成分，故将峰3(紫丁香苷色谱峰)作为标准峰S。18批血滞通胶囊样品图谱在12min-45min时间内4个特征峰的相对保留时间见表1。
本发明由图得到，以紫丁香苷峰为标准峰，各共有峰的相对保留时间为：峰1为0.515-0.593、峰2为0.735-0.845、峰3为1.000、峰4为1.168-1.344。各共有峰相对保留时间应在规定值的范围内。
本发明所建立的血滞通胶囊指纹图谱见图15，腺苷及紫丁香苷对照品色谱图见图16-17。
表1 18批血滞通胶囊样品图谱中各共有峰的相对保留时间
3.8色谱条件的建立
综上，本发明确定血滞通胶囊HPLC指纹图谱的色谱条件为：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(色谱柱：Grace Apollo C18 4.6mm×250mm 5μm)；流动相A为水，B为甲醇，按下表程序(表2)进行梯度洗脱，流速为0.8ml/min；柱温为40℃；进样量为10μl；检测波长为220nm。理论板数按紫丁香苷峰计算应不低于3000。
表2洗脱程序(体积比)
4、方法学验证
4.1精密度试验
取同一份血滞通胶囊样品(批号：20150501)，按照上述供试品制备方法制备供试品溶液，按上述色谱条件注入液相色谱仪，连续进样6次，记录色谱图，以3号紫丁香苷为参比峰，计算各共有峰的相对保留时间及相对峰面积，及它们的RSD。结果见表3、4。用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》软件计算精密度试验的相似度，结果见图18和表5。
表3血滞通胶囊精密度试验(相对保留时间)
表4血滞通胶囊精密度试验(相对峰面积比值)
结果显示，精密度实验中各共有峰的相对保留时间、相对峰面积的RSD均小于3％，表明仪器等整个检测系统的精密度良好。用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》软件评价及计算，精密度试验相似度为0.9以上。
表5血滞通胶囊精密度试验相似度评价结果
4.2稳定性试验
取血滞通样品(批号：20150503)，按照上述供试品溶液制备方法以及色谱条件，每隔一定时间测定一次，考察相对峰面积比值及相对保留时间的稳定性，结果见表6、表7。
结果显示，血滞通样品供试品溶液在12小时内通过HPLC分析结果稳定，各共有峰的相对保留时间的RSD均小于1％；相对峰面积比值的RSD小于3％。用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》软件计算，稳定性试验相似度为0.7以上(表8、图19)。结果表明，室温保存下12小时内血滞通样品供试品溶液稳定性良好。
表6血滞通样品稳定性试验(相对保留时间)
表7血滞通样品稳定性试验(相对峰面积比值)
表8血滞通胶囊稳定性试验相似度评价结果
4.3重复性试验
取血滞通胶囊样品(批号：20150501)六份，按照上述色谱条件与方法，分别制备供试品溶液，进样，考察标准峰相对峰面积比值及相对保留时间的重复性，结果见表9，10。结果表明，6份供试品中相对保留时间RSD均小于1％，及相对峰面积比值的RSD均小于3％，表明方法的重现性良好。
表9 血滞通胶囊重复性试验(相对保留时间)
表10 血滞通胶囊重复性试验(相对峰面积比值)
用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》软件计算，重复性试验相似度结果均大于0.9(表11、图20)。
表11血滞通胶囊重复性试验相似度评价结果
5、血滞通样品指纹图谱相似度分析结果
选用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》软件2.0版计算，对20批血滞通胶囊样品指纹图谱的相似度评价结果表明，相似度在0.74以上，相似度较高。
实施例2血滞通胶囊的高效液相色谱鉴别
1、实验材料同实施例1指纹图谱研究。
2、供试溶液的制备同实施例1指纹图谱研究。
3、色谱实验条件同实施例1指纹图谱研究。
4、供试品制备条件的筛选同实验例1。
5、方法学验证
5.1精密度试验：同实施例1指纹图谱研究。
5.2.稳定性试验：同实施例1指纹图谱研究。
5.3重复性试验：同实施例1指纹图谱研究。
5.4专属性试验
血滞通胶囊处方中只含有薤白一味药材，其它均为辅料，按样品及供试品溶液制备方法制成阴性对照溶液，在此色谱条件下，辅料均没有干扰峰，具体见图21-23。
6、高效液相色谱图鉴别的建立
按照实施例1所述的供试品溶液制备方法及色谱条件，取15批血滞通胶囊样品进行测定。以腺苷、紫丁香苷对照品为参照物，按样品制法及供试品溶液的制备方法制成不含薤白药材的阴性对照溶液，对照品及供试品的高效液相色谱图中腺苷、紫丁香苷峰保留时间结果见表12。对照品、供试品及阴性对照品的高效液相色谱图见图21-23，对照品溶液及血滞通胶囊供试品溶液高效液相色谱图中腺苷及紫丁香苷峰纯度分析图见图24-27。
表12 15批样品保留时间
由以上结果可知，供试品高效液相色谱图中均出现与腺苷、紫丁香苷对照品相应保留时间的色谱峰，重现性好、专属性强。由高效液相的纯度分析可知，在供试品溶液与对照品溶液的高效液相色谱图中与腺苷及紫丁香苷对照品相对应色谱峰的紫外吸收图一致，并且在相应保留时间处的色谱峰纯度均达100％，说明该液相条件分离度良好，因此该液相鉴别能够作为血滞通胶囊的高效液相色谱鉴别。
实验例1血滞通胶囊指纹图谱建立中供试品制备条件的筛选
1、提取溶剂的选择
本发明分别选择了30％甲醇、50％甲醇、甲醇、50％乙醇及乙醇(均为体积百分比)对血滞通胶囊进行提取，对比HPLC色谱峰(供试溶液制备的其他参数以及色谱实验条件均同实施例1)。结果表明(图28)，50％甲醇作为提取溶剂的色谱峰峰面积最大，提取效率最好，整体图貌最佳。故本发明选择50％甲醇作为血滞通胶囊的提取溶剂。
2、提取方式的选择
本发明分别超声提取30分钟1次，超声提取30分钟2次(功率250W，频率40KHZ)和加热回流提取1小时制备供试液，按上述实施例1已建立的色谱条件进样。对比结果发现，超声提取与加热回流提取的提取效率相差不大，且一次超声提取30分钟即可提取完全。因此，考虑操作的方便性，本发明选择一次超声提取30分钟作为血滞通胶囊供试液制备的提取方式。
3、供试品纯化方法的选择
因血滞通胶囊的工艺中采用了乙醇渗漉的提取方式，成分中含有大量极性小的杂质。用50％甲醇超声提取时，虽然紫丁香苷峰可以较好的分离，但是杂质较多，高效液相图谱的基线很不稳定(见图28)。根据杂质的理化性质，本发明采用了C18预制小柱、D101大孔树脂及中性氧化铝方法对供试品溶液进行了纯化(见图29-31)。色谱结果表明，C18预制小柱虽然基线较好，但相关峰均减少，指纹性不强；大孔树脂柱对紫丁香苷峰吸附过多；中性氧化铝柱即可使基线平稳，又能去除极性较小的杂质，指纹性最佳。因此，本发明采用中性氧化铝柱层析对供试品溶液进行纯化。
4、供试品制备条件的建立
综上所述，本发明建立血滞通胶囊HPLC指纹图谱的供试液制备条件为：
取装量差异项下的本品内容物，研匀，精密称取约2g，置具塞锥形瓶中，精密加入50％甲醇50ml，密塞，称定重量，超声处理30分钟(功率250W，频率40KHZ)，放冷，滤过，取续滤液10ml，蒸干，残渣加50％甲醇约5ml分多次加在中性氧化铝柱(100-200目，4g，内径1cm)上，用50％甲醇90ml洗脱，收集流出液及洗脱液，蒸干，残渣加50％甲醇定容至2ml量瓶中，摇匀，即得。

Claims (4)

1.一种血滞通胶囊指纹图谱的建立方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将血滞通胶囊内容物加入50%甲醇为提取溶剂进行提取，得到提取液，纯化，得到供试品溶液；
（2）将供试品溶液进行高效液相色谱分析，获得高效液相色谱图；所述高效液相色谱分析的色谱条件包括：色谱柱为Grace Apollo C18色谱柱，规格为4.6mm×250mm，5μm；十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相A为水，B为甲醇，进行梯度洗脱；
所述梯度洗脱的程序包括：按体积百分比计，0-15min，A：95→85%，B：5→15%；15-20min，A：85→80%，B：15→20％；20-30min，A：80→60%，B：20→40％；30-45min，A：60→55%，B：40→45％；45-50min，A：55→95%，B：45→5％；
流速为0.8ml/min；柱温为40℃；进样量为10μl；检测波长为220nm；
（3）从高效液相色谱图的色谱峰中选择共有峰，得到血滞通胶囊指纹图谱；所述共有峰的选择包括：在12min-45min时间区间内，从多批供试品溶液高效液相色谱图中选择四个色谱峰作为共有峰，分别标记为峰1、峰2、峰3及峰4；以紫丁香苷峰为标准峰，各共有峰的相对保留时间为：峰1的相对保留时间为0.515-0.593，峰2的相对保留时间为0.735-0.845，峰3的相对保留时间为1.000，峰4的相对保留时间为1.168-1.344；
其中，所述纯化采用中性氧化铝柱层析，所述中性氧化铝柱层析纯化包括：将提取液滤过，取续滤液，蒸干；将蒸干后得到的残渣加50%甲醇溶解，加在中性氧化铝柱上，用50%甲醇洗脱，收集流出液及洗脱液，蒸干；将蒸干后得到的残渣用50%甲醇溶解，即得；其中，所述中性氧化铝柱中的中性氧化铝的用量为4g，所述中性氧化铝的粒度为100-200目。
2.按照权利要求1所述的建立方法，其特征在于：按照g/ml计，步骤（1）中，血滞通胶囊内容物：50%甲醇=2：50；所述提取的方式为超声提取30分钟；其中，所述超声的功率为250W，频率为40KHZ。
3.一种血滞通胶囊的高效液相色谱鉴别方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将待检测血滞通胶囊内容物加入50%甲醇为提取溶剂进行提取，得到提取液，纯化，得到供试品溶液；
（2）取腺苷和紫丁香苷对照品，分别制备对照品溶液；
（3）将供试品溶液与对照品溶液分别进行高效液相色谱分析，如果供试品溶液的高效液相色谱图中同时出现与腺苷、紫丁香苷对照品的保留时间一致的色谱峰，则判定待检测血滞通胶囊的质量合格；
步骤（3）所述高效液相色谱分析的色谱条件包括：色谱柱为Grace Apollo C18色谱柱，规格为4.6mm×250mm，5μm；十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相A为水，B为甲醇，进行梯度洗脱；流速为0.8ml/min；柱温为40℃；进样量为10μl；检测波长为220nm；
所述梯度洗脱的程序包括：按照体积百分比计，0-15min，A：95→85%，B：5→15%；15-20min，A：85→80%，B：15→20％；20-30min，A：80→60%，B：20→40％；30-45min，A：60→55%，B：40→45％；45-50min，A：55→95%，B：45→5％；
其中，所述纯化采用中性氧化铝柱层析；所述中性氧化铝柱层析纯化包括：将提取液滤过，取续滤液，蒸干；将蒸干后得到的残渣加50%甲醇溶解，加在中性氧化铝柱上，用50%甲醇洗脱，收集流出液及洗脱液，蒸干；将蒸干后得到的残渣用50%甲醇溶解，即得；其中，所述中性氧化铝柱中的中性氧化铝的用量为4g，所述中性氧化铝的粒度为100-200目。
4.按照权利要求3所述的高效液相色谱鉴别方法，其特征在于：步骤（1）中，按照g/ml计，血滞通胶囊内容物：50%甲醇=2：50；所述提取的方式为超声提取30分钟；其中，所述超声的功率为250W，频率为40KHZ；步骤（2）所述对照品溶液的制备包括：将腺苷和紫丁香苷对照品分别用50%甲醇溶解，使每1ml对照品溶液中含腺苷或紫丁香苷20μg。
CN201710519636.0A 2017-06-30 2017-06-30 血滞通胶囊的指纹图谱及高效液相色谱鉴别方法 Active CN107202853B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710519636.0A CN107202853B (zh) 2017-06-30 2017-06-30 血滞通胶囊的指纹图谱及高效液相色谱鉴别方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710519636.0A CN107202853B (zh) 2017-06-30 2017-06-30 血滞通胶囊的指纹图谱及高效液相色谱鉴别方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN107202853A CN107202853A (zh) 2017-09-26
CN107202853B true CN107202853B (zh) 2018-09-11

Family

ID=59910626

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201710519636.0A Active CN107202853B (zh) 2017-06-30 2017-06-30 血滞通胶囊的指纹图谱及高效液相色谱鉴别方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN107202853B (zh)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108169386B (zh) * 2018-03-15 2020-09-18 吉林修正药业新药开发有限公司 一种颈腰康胶囊的hplc特征图谱的构建方法
CN113759057B (zh) * 2021-08-06 2023-07-14 北京康仁堂药业有限公司 一种薤白水提取物及其制剂的特征图谱及其构建方法

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101708274B (zh) * 2009-12-23 2014-03-05 贵州益佰制药股份有限公司 治疗胸痹心痛的滴丸制剂的检测方法
CN102120752B (zh) * 2010-01-11 2014-09-17 广州医学院第二附属医院 一种具有抗血小板活化、聚集及炎症作用的化合物及其制备方法和用途
CN102641407B (zh) * 2012-04-18 2014-02-26 皖南医学院 瓜蒌薤白颗粒的制备方法及检测方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN107202853A (zh) 2017-09-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN111999423B (zh) 一种颈痛颗粒指纹图谱的建立方法及其应用
CN108717095A (zh) 一种枇杷叶或含枇杷叶原料的药物的检测方法及鉴别、含量测定方法
CN111999395A (zh) 一种药物制剂的指纹图谱检测方法
CN109374764B (zh) 八味龙钻颗粒hplc指纹图谱及主要成分含量测定方法
CN101216466B (zh) 枸杞hplc指纹图谱的建立方法及其标准指纹图谱
CN107202853B (zh) 血滞通胶囊的指纹图谱及高效液相色谱鉴别方法
CN112782308B (zh) 一种杜仲补天素丸的hplc指纹图谱的建立方法
CN111289648B (zh) 一种中药复方制剂指纹图谱的建立方法及其指纹图谱
CN103048408B (zh) 活血止痛膏的特征图谱测定和其质量检测方法
CN108693289B (zh) 一种人字果药材中木兰花碱的含量测定方法
CN109142563A (zh) 一种龟龄集uplc指纹图谱的构建方法及其应用
CN114942291A (zh) 潜阳育阴颗粒的质量检测方法
CN111929378B (zh) 一种清达颗粒中天麻6种指标成分的含量测定方法
CN107607665A (zh) 一种苗药山豆根及其中药制剂质量控制方法
CN101953868B (zh) 蒺藜总皂苷的检测方法
CN103575823A (zh) 一种糖敏灵制剂中8种化学成分的检测方法
CN113917012B (zh) 一种定坤丹的特征图谱及其构建方法、应用
CN114894922B (zh) 一种绞股蓝水提物的检测及其质量控制方法
CN116008418B (zh) 雪白睡莲花药材的hplc指纹图谱及判定含量模型的构建方法及雪白睡莲花的鉴别方法
CN109541099B (zh) 一种白芍根茎或其提取物的鉴别方法
CN114965776B (zh) 小儿黄龙颗粒的特征图谱的建立方法以及其标准特征图谱与应用
CN113884595B (zh) 一种小续命汤基准样品的指纹图谱的测定方法
CN115032316A (zh) 一种肝豆灵片的质量评价方法
CN107367553B (zh) 丹莪妇康煎膏的指纹图谱建立方法及其标准指纹图谱和应用
CN117110449A (zh) Hplc法测定通痹活络丸中二苯乙烯苷的含量

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant