CN103115997B - 一种治疗直肠炎药物的质量控制方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种治疗直肠炎药物的质量控制方法，分别以薄层色谱法鉴别药物中的地榆、三七、白及、大黄和仙鹤草，以紫外-可见分光光度法测定药物中鞣质的含量，以液相色谱法测定药物中的游离蒽醌含量。本发明建立的质量控制方法中，药材鉴别方法成熟可行，专属性强，阴性无干扰，含量测定方法操作容易，精密度高，重现性好，使用本发明的质量控制方法能够精确、稳定地控制药物的质量，以适应药物的工业化稳定生产。

Description

一种治疗直肠炎药物的质量控制方法

技术领域

本发明涉及一种用于治疗直肠炎的中药药物，特别是涉及该药物的质量控制方法。

背景技术

肠瑞灌肠散是主要用于消除放射性直肠炎（热毒伤络型）所致的腹痛、腹泻、粘液血便、里急后重、肛门灼痛坠痛等病痛的中药制剂，处方由地榆、仙鹤草、儿茶、白及等七味中药组成，功能解毒清热、祛腐生肌、凉血止血，共奏祛腐解毒，止血生肌之功。经多年临床应用，证实药物组方合理，疗效确切。

肠瑞灌肠散为散剂，目前已经明确了科学合理的工艺提取路线，并确定了工艺中的关键技术参数，工艺稳定，适合工业化大生产要求。肠瑞灌肠散的具体制备工艺为：地榆1170g、三七117g、儿茶117g、白及1170g、仙鹤草585g、阿胶234g、大黄234g，将三七、阿胶粉碎成极细粉；地榆、仙鹤草、儿茶加水煎煮三次，每次1小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩至60℃相对密度为1.08～1.10的清膏；白及加水煎煮三次，每次1小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩至60℃相对密度为1.03～1.05的清膏；大黄用70%乙醇回流提取三次，每次1小时，滤过，合并滤液，回收乙醇并浓缩至50℃相对密度为1.03～1.05的清膏，与上述清膏及三七、阿胶极细粉混匀，干燥，粉碎成最细粉，与适量淀粉充分混匀，制成1000g，即得。

为进一步控制肠瑞灌肠散的药物质量，需要提供科学合理的药物质量控制方法，以适应药物的工业化稳定生产。

发明内容

本发明的目的是提供一种上述治疗直肠炎药物的质量控制方法，本发明的质量控制方法操作容易，重现性好，质量控制精确、稳定。

本发明提供的治疗直肠炎药物的质量控制方法适合于由以下重量份数的原料药制备而成的药物：10份地榆、1份三七、1份儿茶、10份白及、5份仙鹤草、2份阿胶、2份大黄。质量控制方法包括鉴别方法和含量测定方法。

其中，所述鉴别方法包括如下鉴别：

1）取所述药物3g，加甲醇20ml，回流提取1小时，滤过，滤液蒸干，残渣加水20ml使溶解，用乙醚振摇洗涤3次，每次20ml，合并乙醚液，弃去，用水饱和的正丁醇振摇提取3次，每次20ml，合并正丁醇液，用氨试液洗涤3次，每次15ml，弃去氨液，分取正丁醇液，用正丁醇饱和的水洗涤3次，每次15ml，正丁醇液回收溶剂至干，残渣加甲醇2ml使溶解，作为供试品溶液；另取地榆对照药材3g、三七对照药材1g，分别同法制成对照药材溶液；照薄层色谱法试验，吸取上述三种溶液各5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷:甲醇:水=13:7:2混合溶液10℃以下放置分层的下层溶液为展开剂，展开，取出晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，供试品色谱中，在与各对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；

2）取所述药物2g，加70%甲醇20ml，超声处理30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加水10ml使溶解，用乙醚振摇提取2次，每次20ml，合并乙醚液，挥干，残渣加甲醇4ml使溶解，加在100～200目中性氧化铝柱上，用甲醇25ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液；另取白及对照药材2g，同法制成对照药材溶液；照薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各15μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷:乙酸乙酯:甲醇=6:2.5:1为展开剂，展开，取出晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；

3）取所述药物3g，加甲醇30ml，超声处理30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加水20ml使溶解，再加盐酸2ml，加热回流30分钟，立即冷却，用乙醚振摇提取3次，每次10ml，合并乙醚液，挥干，残渣加三氯甲烷1ml使溶解，作为供试品溶液；另取大黄对照药材1g，同法制成对照药材溶液；照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液10μl、对照药材溶液4μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以30～60℃石油醚:甲酸乙酯:甲酸=15:5:1混合溶液的上层溶液为展开剂，展开，取出晾干，置365nm紫外光灯下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同的橙黄色荧光斑点；

4）取所述药物4g，加60～90℃石油醚30ml，回流提取1.5小时，滤过，滤液挥干，残渣加三氯甲烷1ml使溶解，作为供试品溶液；另取仙鹤草对照药材3g，同法制成对照药材溶液；照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液10μl、对照药材溶液5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷:乙酸乙酯:冰醋酸=25:5:1为展开剂，展开，取出晾干，置365nm紫外光灯下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。

所述含量测定方法包括鞣质含量和游离蒽醌含量的测定。

本发明具体以下述紫外-可见分光光度法测定所述鞣质的含量：

1)对照品溶液的制备：精密称取没食子酸对照品50mg，置100ml棕色量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，精密量取5ml，置50ml棕色量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，即得每1ml含没食子酸0.05mg的溶液；

2)标准曲线的制备：精密量取对照品溶液0.5ml、1.0ml、2.0ml、3.0ml、4.0ml，分别置25ml棕色量瓶中，各加磷钼钨酸试液1ml，再分别加水11.5ml、11ml、10ml、9ml、8ml，用29%碳酸钠溶液稀释至刻度，摇匀，放置30分钟，以相应试剂为空白，照紫外-可见分光光度法，在760nm波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线；

3)供试品溶液的制备：取所述药物0.2g，精密称定，置50ml棕色量瓶中，加水稀释至刻度，功率150W、频率40KHz超声处理30分钟，滤过，过0.8μm滤膜，精密量取续滤液5ml，置50ml棕色量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，即得；

4)总酚含量的测定：精密量取供试品溶液2ml，置25ml棕色量瓶中，加入磷钼钨酸试液1ml，加水10ml，用29%碳酸钠溶液稀释至刻度，摇匀放置30分钟，以相应试剂为空白，照紫外-可见分光光度法，在760nm波长处测定吸光度，从标准曲线中读出供试品溶液中没食子酸的量，计算即得；

5)不被吸附的多酚含量的测定：精密量取供试品溶液25ml，加至已盛有干酪素0.6g的100ml具塞锥形瓶中，密塞，置30℃水浴中保温1小时，时时振摇，取出，放冷，摇匀，滤过，弃去初滤液，精密量取续滤液2ml，置25ml棕色量瓶中，加入磷钼钨酸试液1ml，加水10ml，用29%碳酸钠溶液稀释至刻度，摇匀，放置30分钟，以相应试剂为空白，照紫外-可见分光光度法，在760nm波长处测定吸光度，从标准曲线中读出供试品溶液中没食子酸的量，计算即得；

6)按下式计算鞣质的含量：鞣质含量=总酚含量-不被吸附的多酚含量。

本发明同时以下述高效液相色谱法测定所述游离蒽醌的含量：

1)色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相甲醇:0.1%磷酸溶液=81:19，流速1.0ml/分钟，检测波长254nm，色谱柱理论板数按大黄素峰计算不低于3000；

2)对照品溶液的制备：精密称取芦荟大黄素对照品、大黄酸对照品、大黄素对照品、大黄酚对照品、大黄素甲醚对照品适量，加甲醇制成每1ml含芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚各100μg，大黄素甲醚70μg的溶液；分别精密量取上述对照品溶液各2ml，混匀，即得每1ml中含芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚各20μg、大黄素甲醚14μg的对照品溶液；

3)供试品溶液的制备：取所述药物1.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25ml，称定重量，加热回流1小时，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过；精密量取续滤液15ml，置烧瓶中，挥去溶剂，加8%盐酸溶液25ml，超声处理2分钟，再加三氯甲烷25ml，加热回流1小时，放冷，置分液漏斗中，用少量三氯甲烷洗涤容器，并入分液漏斗中，分取三氯甲烷层，酸液再用三氯甲烷提取3次，每次25ml，合并三氯甲烷液，减压回收溶剂至干，残渣加甲醇使溶解，转移至10ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得；

4)分别吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定即得。

本发明建立了治疗直肠炎药物的质量控制方法，所建立的方法中，药材的鉴别方法成熟可行，专属性强，阴性无干扰，含量测定方法操作容易，精密度高，重现性好，使用本发明的质量控制方法能够精确、稳定地控制肠瑞灌肠散的药物质量，以适应药物的工业化稳定生产。

附图说明

图1为大黄素、大黄酸、大黄酚、芦荟大黄素、大黄素甲醚对照品溶液的液相色谱图。

图2为供试品溶液的液相色谱图。

图3为阴性对照溶液的液相色谱图。

具体实施方式

实施例1。

处方：地榆1170g、三七117g、儿茶117g、白及1170g、仙鹤草585g、阿胶234g、大黄234g。

制法：以上七味，三七、阿胶粉碎成极细粉，备用。地榆、仙鹤草、儿茶三味加水煎煮三次，每次1小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩至相对密度为1.08～1.10（60℃）的清膏，备用。白及加水煎煮三次，每次1小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩至相对密度为1.03～1.05（60℃）的清膏，备用。大黄用70%乙醇回流提取三次，每次1小时，滤过，合并滤液，回收乙醇并浓缩至相对密度为1.03～1.05 (50℃) 的清膏，与上述清膏及三七、阿胶的极细粉混匀，干燥，粉碎成最细粉，与适量淀粉充分混匀，制成1000g，即得。

性状：本品为棕色至棕褐色粉末；气微。

功能与主治：解毒清热，祛腐生肌，凉血止血。适用于放射性直肠炎（热毒伤络型）。症见腹痛、腹泻、粘液血便、里急后重、肛门灼痛坠痛等。

用法与用量：直肠保留灌肠给药。一次1袋，一日1次。

规格：每袋装8g。

贮藏：密封、避光保存。

实施例2：地榆和三七的薄层鉴别。

取实施例1药物3g，加甲醇20ml，回流提取1小时，滤过，滤液蒸干，残渣加水20ml使溶解，用乙醚振摇洗涤3次，每次20ml，合并乙醚液，弃去，用水饱和的正丁醇振摇提取3次，每次20ml，合并正丁醇液，用氨试液洗涤3次，每次15ml（弃去氨液），分取正丁醇液，用正丁醇饱和的水洗涤3次，每次15ml，正丁醇液回收溶剂至干，残渣加甲醇2ml使溶解，作为供试品溶液。另取地榆对照药材3g、三七对照药材1g分别同法制成对照药材溶液。照薄层色谱法（中国药典2010版一部附录VI B）试验，吸取上述三种溶液各5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-水（13:7:2）10℃以下放置分层的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与各对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。

地榆根部约含三萜皂苷类化合物2.4～4.0%，如地榆苷Ⅰ、Ⅱ；地榆皂苷A、B、E等，为地榆的特征性成分。三七中亦含有较多的皂苷类成分，可以作为特征性成分进行鉴别。由于地榆同三七的鉴别成分都属于皂苷类成分，所以采用同一个供试品即可。由图1可知，供试品中各皂苷类成分斑点清晰，特征性强，阴性不干扰，方法重现性好。

实施例3：白及的薄层鉴别。

取实施例1药物2g，加70%甲醇20ml，超声处理30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加水10ml使溶解，用乙醚振摇提取2次，每次20ml，合并乙醚液，挥干，残渣加甲醇4ml使溶解，加在中性氧化铝柱（100～200目，3g，内径为1.2cm）上，用甲醇25ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液。另取白及对照药材2g，同法制成对照药材溶液。照薄层色谱法（中国药典2010版一部附录VI B）试验，吸取上述两种溶液各15μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷-乙酸乙酯-甲醇（6:2.5:1）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点2。

实施例4：大黄的薄层鉴别。

取实施例1药物3g，加甲醇30ml，超声处理30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加水20ml使溶解，再加盐酸2ml，加热回流30分钟，立即冷却，用乙醚振摇提取3次，每次10ml，合并乙醚液，挥干，残渣加三氯甲烷1ml使溶解，作为供试品溶液。另取大黄对照药材1g，同法制成对照药材溶液。照薄层色谱法（中国药典2010版一部附录VI B）试验，吸取供试品溶液10μl、对照药材溶液4μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚（30～60℃）-甲酸乙酯-甲酸（15:5:1）的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯（365nm）下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同的橙黄色荧光斑点3。

大黄中含有的游离型蒽醌包括大黄素、大黄酚、大黄素甲醚、芦荟大黄素和大黄酸，可以作为特征性成分进行鉴别。采用大黄对照药材作对照，供试品中各游离蒽醌类成分斑点比较特征，阴性不干扰，方法重现性好。

实施例5：仙鹤草的薄层鉴别。

取实施例1药物4g，加石油醚（60～90℃）30ml，回流提取1.5小时，滤过，滤液挥干，残渣加三氯甲烷1ml使溶解，作为供试品溶液。另取仙鹤草对照药材3g，同法制成对照药材溶液。照薄层色谱法（中国药典2010版一部附录VI B）试验，吸取供试品溶液10μl、对照药材溶液5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷-乙酸乙酯-冰醋酸（25:5:1）为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯（365nm）下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点4。

实施例6：鞣质含量的测定。

实施例1药物中的君药为地榆，故首选其所含有效成分进行含量测定。地榆主要含有鞣质、皂苷及黄酮类物质，中国药典2010版一部中地榆药材及饮片均以鞣质和没食子酸为含量测定项，另外，其它药味如仙鹤草、大黄、儿茶均含有较多的鞣质，现代药理学试验证明，鞣质类成分具有止血、促进溃疡愈合的作用，故以鞣质作为制剂含量测定标准之一。

1、仪器与试药。

TU-1901双光束紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）；KQ3200DB型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；电子天平（德国赛多利斯BP211D）。碳酸钠及其它化学试剂为分析纯，没食子酸对照品（批号：110831-200302）购自中国药品生物制品检定所。

肠瑞灌肠散(批号：20100601、20101001、20101002、20101003)，由山西振东制药股份有限公司提供。

2、供试品溶液的制备。

取实施例1药物约0.2g，精密称定，置50ml棕色量瓶中，加水稀释至刻度，超声处理（功率150W，频率40KHz）30分钟，滤过，过0.8μm的滤膜，精密量取续滤液5ml，置50ml棕色量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，即得。

3、对照品溶液的制备。

精密称取没食子酸对照品50.4mg，置100ml棕色量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，精密量取5ml，置50ml棕色量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，即得每1ml含没食子酸0.0504mg的溶液。

4、标准曲线的制备。

精密量取对照品溶液0.5ml、1.0ml、2.0ml、3.0ml、4.0ml，分别置25ml棕色量瓶中，各加磷钼钨酸试液1ml，再分别加水11.5ml、11ml、10ml、9ml、8ml，用29%碳酸钠溶液稀释至刻度，摇匀，放置30分钟，以相应的试剂为空白，照紫外-可见分光光度法，在760nm波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，得线性回归方程为Y=85.0825X+0.011（R²=0.9997）。结果表明，没食子酸在0.0252mg～0.2016mg范围内，吸光度与浓度有良好的线性关系，见表1。

5、鞣质含量的测定。

总酚：精密量取供试品溶液2ml，置25ml棕色量瓶中，加入磷钼钨酸试液1ml，加水10ml，用29%碳酸钠溶液稀释至刻度，摇匀放置30分钟，以相应的试剂为空白，照紫外-可见分光光度法，在760nm波长处测定吸光度，从标准曲线中读出供试品溶液中没食子酸的量（mg），计算，即得。

不被吸附的多酚：精密量取供试品溶液25ml，加至已盛有0.6g干酪素的100ml具塞锥形瓶中，密塞，置30℃水浴中保温1小时，时时振摇，取出，放冷，摇匀，滤过，弃去初滤液，精密量取续滤液2ml，置25ml棕色量瓶中，照标准曲线的制备项下方法，自“加入磷钼钨酸试液1ml”起，加水10ml，依法测定吸光度，从标准曲线中读出供试品溶液中没食子酸的量（mg），计算，即得。

按下式计算鞣质的含量：鞣质含量=总酚量–不被吸附的多酚量。

6、精密度试验。

精密吸取浓度为0.0504mg/ml没食子酸对照品溶液2ml，依法处理，显色后的对照品溶液，连续测定6次，结果如表2，吸光度值的RSD=0.27%(n=6)。

7、稳定性试验。

取显色后的供试品溶液，分别于0，15，30，45，60，75和90min测定吸光度。结果供试品溶液在显色30min后至90min内吸光度稳定，RSD=3.43%(n=7)，见表3。

8、重复性试验。

取同一批样品（批号：20100601）0.2g，共5份，精密称定，按供试品溶液的制备方法制备5份供试品溶液，依法处理，进行测定，记录吸光度值，本批样品鞣质含量为65.38mg/g，结果RSD=0.81%，表明本方法重现性好，见表4。

9、加样回收率试验。

精密称取已知含量的同一批（批号：20100601）样品6份，分别精密加入没食子酸对照品，按供试品溶液制备方法，制备6份供试品溶液，测定，记录吸光度值并计算含量，平均回收率98.36%，RSD=2.10%(n＝6)，见表5。

10、样品测定。

分别取三批中试样品（批号：20101001、20101002、20101003）各0.2g，精密称定，按上述制备项下方法，依法测定吸光度，根据标准曲线计算出供试品溶液中没食子酸的含量（mg/袋），测定结果见表6。

根据三批样品的测定结果，并结合君药地榆中鞣质含量限度及装量差异，规定药品每袋鞣质含量以没食子酸（C₇H₆O₅）计，不少于400mg。

实施例7：游离蒽醌含量的测定。

实施例1药物中，大黄具有解毒泻热，化瘀止血的功效，其含有多种蒽醌类物质，中国药典2010版一部中收载大黄药材以芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚为含量测定项，研究表明该类成分为止血、抗菌和消炎的有效成分之一，故以游离蒽醌类物质芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚作为制剂含量测定标准之一。

1、仪器与试药。

美国HP1100高效液相色谱仪：包括HPG1322A真空脱气泵，HPG1311A四元泵，HPG1313A ALS自动进样器，HPG1315DAD二极管阵列检测器，HP chemstation system化学工作站；KQ3200DB型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；电子天平（德国赛多利斯BP211D）。乙腈为色谱纯（天津四友试剂厂）；水为重蒸馏水；磷酸及其它化学试剂为分析纯；芦荟大黄素对照品（批号：110795-201007）、大黄酸对照品（批号：110757-200206）、大黄素对照品（批号：110756-200110）、大黄酚对照品（批号：110796-200615）和大黄素甲醚对照品（批号：110758-200611）购自中国药品生物制品检定所。

肠瑞灌肠散(批号：20100601、20101001、20101002、20101003)，由山西振东制药股份有限公司提供。

2、色谱条件。

伊利特BP-ODS色谱柱，5μm，4.6×250mm；以甲醇-0.1%磷酸溶液（81:19）为流动相；流速1.0ml/分钟；检测波长254nm。理论板数按大黄素峰计算不低于3000。

3、对照品溶液的制备。

精密称取芦荟大黄素对照品、大黄酸对照品、大黄素对照品、大黄酚对照品、大黄素甲醚对照品适量，加甲醇制成每1ml含芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚各100μg，大黄素甲醚70μg的溶液；分别精密量取上述对照品溶液各2ml，混匀，即得每1ml中含芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚各20μg、大黄素甲醚14μg的对照品溶液。

4、供试品溶液的制备。

取实施例1药物约1.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25ml，称定重量，加热回流1小时，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过。精密量取续滤液15ml，置烧瓶中，挥去溶剂，加8%的盐酸溶液25ml，超声处理2分钟，再加三氯甲烷25ml，加热回流1小时，放冷，置分液漏斗中，用少量三氯甲烷洗涤容器，并入分液漏斗中，分取三氯甲烷层，酸液再用三氯甲烷提取3次，每次25ml，合并三氯甲烷液，减压回收溶剂至干，残渣加甲醇使溶解，转移至10ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

5、游离蒽醌含量的测定。

分别吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

6、空白试验。

照供试品溶液的制备条件制备阴性对照溶液，再按上述色谱条件，吸取供试品溶液、对照品溶液、阴性对照溶液各10μl，分别注入液相色谱仪中，测定，记录色谱图。结果供试品溶液色谱中，在与对照品色谱峰相同保留时间处有相同的色谱峰，阴性对照无干扰峰，见图1-3。

7、线性关系的考察。

分别精密吸取芦荟大黄素对照品溶液(21.4μg/ml)、大黄酸对照品溶液(21.4μg/ml)、大黄素对照品溶液(21.8μg/ml)、大黄酚对照品溶液(20.3μg/ml)、大黄素甲醚对照品溶液(13.8μg/ml)1、3、5、10、15、20、25μl，注入液相色谱仪中，按上述色谱条件测定，记录峰面积，得回归方程为：芦荟大黄素Y=3.0607X-3.9587(R²=1)，大黄酸Y=2.3078X-2.0146(R²=1)，大黄素Y=3.8258X-6.9067(R²=1)，大黄酚Y=5.1803X-10.911（R²=1），大黄素甲醚Y=3.4019X-7.8215(R²=1)；结果表明，芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚在相应的范围内，峰面积与进样量有良好的线性关系。见表7。

8、精密度试验。

精密吸取芦荟大黄素对照品溶液(21.4μg/ml)、大黄酸对照品溶液(21.4μg/ml)、大黄素对照品溶液(21.8μg/ml)、大黄酚对照品溶液(20.3μg/ml)、大黄素甲醚对照品溶液(13.8μg/ml)10μl，按上述色谱条件重复进样6次，测定峰面积，芦荟大黄素的RSD=0.55%、大黄酸的RSD=0.69%、大黄素的RSD=0.64%、大黄酚的RSD=0.57%、大黄素甲醚RSD=0.67%，结果表明精密度良好。见表8。

9、稳定性试验。

精密吸取供试品溶液（批号：20100601），分别于0、2、4、6、8、10h按“2”项下色谱条件进行含量测定，结果RSD=0.57%，表明供试品10小时内稳定性良好，见表9。

10、重复性试验。

精密称取同一批样品（批号：20100601）1.0g，共6份，按供试品溶液的制备方法，制备6份供试品溶液，分别进样，进行测定，记录峰面积，结果总游离蒽醌的RSD=0.54%，本批样品总游离蒽醌的含量为1.737mg/g，表明本方法重现性好，见表10。

11、加样回收率试验。

精密称取已知含量的同一批（批号：20100601）样品5份，分别精密加入芦荟大黄素对照品、大黄酸对照品、大黄素对照品、大黄酚对照品、大黄素甲醚对照品，按供试品溶液制备方法，制备5份供试品溶液，分别进样，测定，记录峰面积并计算含量，结果见表11。

12、样品测定。

精密称取三批中试样品（批号：20101001、20101002、20101003），按上述制备项下方法，制备供试品溶液，分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，按上述色谱条件测定，以外标一点法计算样品中总游离蒽醌的含量，测定结果见表12。

根据三批样品的测定结果，结合生产工艺中游离蒽醌的转移率，以及大黄饮片的含量限度及装量差异，规定药品每袋含游离蒽醌总量以芦荟大黄素（C₁₅H₁₀O₅）、大黄酸（C₁₅H₈O₆）、大黄素（C₁₅H₁₀O₅）、大黄酚（C₁₅H₁₀O₄）和大黄素甲醚（C₁₆H₁₂O₅）计，不少于8mg。

Claims (1)

1.一种治疗直肠炎药物的检测方法，所述治疗直肠炎药物是由以下重量份数的原料药制备而成的药物：10份地榆、1份三七、1份儿茶、10份白及、5份仙鹤草、2份阿胶、2份大黄，其特征在于所述检测方法中的鉴别方法包括如下鉴别：

1）取所述药物3g，加甲醇20ml，回流提取1小时，滤过，滤液蒸干，残渣加水20ml使溶解，用乙醚振摇洗涤3次，每次20ml，合并乙醚液，弃去，用水饱和的正丁醇振摇提取3次，每次20ml，合并正丁醇液，用氨试液洗涤3次，每次15ml，弃去氨液，分取正丁醇液，用正丁醇饱和的水洗涤3次，每次15ml，正丁醇液回收溶剂至干，残渣加甲醇2ml使溶解，作为供试品溶液；另取地榆对照药材3g、三七对照药材1g，分别同法制成对照药材溶液；照薄层色谱法试验，吸取上述三种溶液各5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷:甲醇:水=13:7:2混合溶液10℃以下放置分层的下层溶液为展开剂，展开，取出晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，供试品色谱中，在与各对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；

2）取所述药物2g，加70%甲醇20ml，超声处理30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加水10ml使溶解，用乙醚振摇提取2次，每次20ml，合并乙醚液，挥干，残渣加甲醇4ml使溶解，加在100～200目中性氧化铝柱上，用甲醇25ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液；另取白及对照药材2g，同法制成对照药材溶液；照薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各15μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷:乙酸乙酯:甲醇=6:2.5:1为展开剂，展开，取出晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；

3）取所述药物3g，加甲醇30ml，超声处理30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加水20ml使溶解，再加盐酸2ml，加热回流30分钟，立即冷却，用乙醚振摇提取3次，每次10ml，合并乙醚液，挥干，残渣加三氯甲烷1ml使溶解，作为供试品溶液；另取大黄对照药材1g，同法制成对照药材溶液；照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液10μl、对照药材溶液4μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以30～60℃石油醚:甲酸乙酯:甲酸=15:5:1混合溶液的上层溶液为展开剂，展开，取出晾干，置365nm紫外光灯下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同的橙黄色荧光斑点；

4）取所述药物4g，加60～90℃石油醚30ml，回流提取1.5小时，滤过，滤液挥干，残渣加三氯甲烷1ml使溶解，作为供试品溶液；另取仙鹤草对照药材3g，同法制成对照药材溶液；照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液10μl、对照药材溶液5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷:乙酸乙酯:冰醋酸=25:5:1为展开剂，展开，取出晾干，置365nm紫外光灯下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；

所述检测方法中的含量测定方法包括鞣质含量和游离蒽醌含量的测定：

以下述紫外-可见分光光度法测定所述鞣质的含量：

1)对照品溶液的制备：精密称取没食子酸对照品50mg，置100ml棕色量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，精密量取5ml，置50ml棕色量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，即得每1ml含没食子酸0.05mg的溶液；

2)标准曲线的制备：精密量取对照品溶液0.5ml、1.0ml、2.0ml、3.0ml、4.0ml，分别置25ml棕色量瓶中，各加磷钼钨酸试液1ml，再分别加水11.5ml、11ml、10ml、9ml、8ml，用29%碳酸钠溶液稀释至刻度，摇匀，放置30分钟，以相应试剂为空白，照紫外-可见分光光度法，在760nm波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线；

3)供试品溶液的制备：取所述药物0.2g，精密称定，置50ml棕色量瓶中，加水稀释至刻度，功率150W、频率40KHz超声处理30分钟，滤过，过0.8μm滤膜，精密量取续滤液5ml，置50ml棕色量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，即得；

4)总酚含量的测定：精密量取供试品溶液2ml，置25ml棕色量瓶中，加入磷钼钨酸试液1ml，加水10ml，用29%碳酸钠溶液稀释至刻度，摇匀放置30分钟，以相应试剂为空白，照紫外-可见分光光度法，在760nm波长处测定吸光度，从标准曲线中读出供试品溶液中没食子酸的量，计算即得；

5)不被吸附的多酚含量的测定：精密量取供试品溶液25ml，加至已盛有干酪素0.6g的100ml具塞锥形瓶中，密塞，置30℃水浴中保温1小时，时时振摇，取出，放冷，摇匀，滤过，弃去初滤液，精密量取续滤液2ml，置25ml棕色量瓶中，加入磷钼钨酸试液1ml，加水10ml，用29%碳酸钠溶液稀释至刻度，摇匀，放置30分钟，以相应试剂为空白，照紫外-可见分光光度法，在760nm波长处测定吸光度，从标准曲线中读出供试品溶液中没食子酸的量，计算即得；

6)按下式计算鞣质的含量：鞣质含量=总酚含量-不被吸附的多酚含量；

以下述高效液相色谱法测定所述游离蒽醌的含量：

1)色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相甲醇:0.1%磷酸溶液=81:19，流速1.0ml/分钟，检测波长254nm，色谱柱理论板数按大黄素峰计算不低于3000；

2)对照品溶液的制备：精密称取芦荟大黄素对照品、大黄酸对照品、大黄素对照品、大黄酚对照品、大黄素甲醚对照品适量，加甲醇制成每1ml含芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚各100μg，大黄素甲醚70μg的溶液；分别精密量取上述对照品溶液各2ml，混匀，即得每1ml中含芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚各20μg、大黄素甲醚14μg的对照品溶液；

3)供试品溶液的制备：取所述药物1.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25ml，称定重量，加热回流1小时，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过；精密量取续滤液15ml，置烧瓶中，挥去溶剂，加8%盐酸溶液25ml，超声处理2分钟，再加三氯甲烷25ml，加热回流1小时，放冷，置分液漏斗中，用少量三氯甲烷洗涤容器，并入分液漏斗中，分取三氯甲烷层，酸液再用三氯甲烷提取3次，每次25ml，合并三氯甲烷液，减压回收溶剂至干，残渣加甲醇使溶解，转移至10ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得；

4)分别吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定即得。