CN108181416B - 一种测定茶叶1，2，6三没食子酰-β-D-葡萄糖的方法及其用途 - Google Patents
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Abstract
一种测定茶叶1，2，6三没食子酰‑β‑D‑葡萄糖的方法及其用途，属于茶叶检测方法技术领域。采用以下方法制备：1）茶样制备；2）样品提取；3）样品测定：采用超高压液相色谱‑飞行时间质谱仪进行1，2，6三没食子酰‑β‑D‑葡萄糖含量测定。上述一种测定茶叶1，2，6三没食子酰‑β‑D‑葡萄糖在茶树品种选育中及用途，具有准确、高效的特点，可大大提高相关品种选育进度，同时也是研究茶叶1，2，6三没食子酰‑β‑D‑葡萄糖合成机理的理想方法。
Description
技术领域
本发明属于茶叶检测方法技术领域，具体为一种测定茶叶1，2，6三没食子酰-β-D-葡萄糖的方法及其用途。
背景技术
1，2，6三没食子酰-β-D-葡萄糖是一类重要的多酚类化合物。现有研究表明该物质具有抗肝癌、抑制肿瘤、抑制HIV与靶细胞融合及抗多重耐药菌等作用。但目前市场上没有该物质的标准品，大多数植物1，2，6三没食子酰-β-D-葡萄糖含量也很低，如何发现和利用该物质是目前农业、医药行业的一大难题。茶叶富含多酚类物质，但一般品种1，2，6三没食子酰-β-D-葡萄糖含量很低，变异范围在0-6.6 mg/g之间。因此，如何检测茶叶中的1，2，6三没食子酰-β-D-葡萄糖含量，同时培育富含1，2，6三没食子酰-β-D-葡萄糖的茶树品种是目前亟待解决的一大难题。
发明内容
针对上述问题，本发明的目的在于设计提供一种测定茶叶1，2，6三没食子酰-β-D-葡萄糖的方法及其用途的技术方案，具有准确、高效的特点，可大大提高相关品种选育进度，同时也是研究茶叶1，2，6三没食子酰-β-D-葡萄糖合成机理的理想方法。
所述的一种测定茶叶1，2，6三没食子酰-β-D-葡萄糖的方法，其特征在于采用以下方法制备：
1）茶样制备：在春茶季节采摘待测茶叶样品，制成干茶后用磨样机磨成茶粉；
2）样品提取：准确称取茶样0.15-0.25 g，加4-6mL的65-70%甲醇溶液，65-75℃水浴浸提9-11 min，每隔5 min摇动一次，冷却至室温，转入离心机在3200-3600r/min转速下离心9-11 min，取出上清液后再加4-6ml65-70%甲醇溶液提取一次，合并提取液定容至10mL，摇匀，吸取2 mL提取液至10 mL刻度管内，加8 mL稳定液定容，过0.45μm有机微孔滤膜，取滤液用于后续测定；
3）样品测定：采用超高压液相色谱-飞行时间质谱仪进行1，2，6三没食子酰-β-D-葡萄糖含量测定；
流动相：0.1%甲酸水溶液（A）-含0.1%甲酸的乙腈（B），线性梯度洗脱：0/5分钟/B%、15/95分钟/B%、 18/95分钟/B%；柱温28-32℃，流速0.8-1.2 mL·min-1，检测波长254 nm；进样量10μL；
质谱条件：大气压电喷雾离子源（ESI）,负离子模式检测，电压为-4.5 kV，温度530-560◦C；阳离子模式检测电压为+5.5 kV，温度580-620◦C；雾化气压力45-55psi，碎片电压30-70 V，质谱m/z扫描范围为100–2000；
1，2，6三没食子酰-β-D-葡萄糖出峰时间在29-30分钟，分子量大小为636.1，[M+NH4]+/[M−H]−为654/635, 二级质谱特征碎片为负离子模式（169，313，465，483，635）和阳离子模式（153，467）；1，2，6三没食子酰-β-D-葡萄糖相对含量由儿茶素标样EGCG进行换算。
所述的一种测定茶叶1，2，6三没食子酰-β-D-葡萄糖的方法，其特征在于步骤2）中：甲醇溶液浓度为70%甲醇溶液，水浴温度为70℃，浸提时间为10 min，离心机转速为3500r/min，离心时间为10 min。
所述的一种测定茶叶1，2，6三没食子酰-β-D-葡萄糖的方法，其特征在于步骤3）中：柱温30℃，流速1.0 mL·min-1。
所述的一种测定茶叶1，2，6三没食子酰-β-D-葡萄糖的方法，其特征在于步骤3）中：负离子模式检测，温度550◦C；阳离子模式检测，温度600◦C；雾化气压力50psi，碎片电压40-50 V，质谱m/z扫描范围为500-1000。
所述的一种测定茶叶1，2，6三没食子酰-β-D-葡萄糖的方法，其特征在于步骤3）中：1，2，6三没食子酰-β-D-葡萄糖出峰时间在29.6分钟。
所述的一种测定茶叶1，2，6三没食子酰-β-D-葡萄糖在茶树品种选育中的应用。
上述一种测定茶叶1，2，6三没食子酰-β-D-葡萄糖的方法及其用途，具有准确、高效的特点，可大大提高相关品种选育进度，同时也是研究茶叶1，2，6三没食子酰-β-D-葡萄糖合成机理的理想方法。
附图说明
图1为普通茶树品种茶叶的色谱图；
图2为富含1，2，6三没食子酰-β-D-葡萄糖茶树品种茶叶的色谱图；
图中：色谱图中的8个峰分别为1. EGC; 2. C; 3. 咖啡碱; 4. EC; 5. EGCG; 6.GCG; 7. 1，2，6三没食子酰-β-D-葡萄糖; 8. ECG。
具体实施方式
以下结合具体实施例和附图对本发明作进一步说明。
实施例1
1）茶样制备：在春茶季节采摘待测茶叶样品（一芽一叶或一芽二叶），制成干茶后用磨样机磨成茶粉。
2）样品提取：准确称取茶样0.2 g，加5 mL提取液（70%甲醇溶液），70℃水浴浸提10min（每隔5 min摇动一次），冷却至室温，转入离心机在3500r/min转速下离心10 min，取出上清液后再加5ml提取液提取一次，合并提取液定容至10 mL，摇匀。吸取2 mL提取液至10mL刻度管内，加8 mL稳定液定容，过0.45μm有机微孔滤膜，取滤液用于后续测定。
3）样品测定：采用UPLC-Q-TOF-MS/MS超高压液相色谱-飞行时间质谱仪进行1，2，6三没食子酰-β-D-葡萄糖含量测定。使用美国Waters 公司的UPLC和C18色谱柱 (1.7 μm,2.1 × 50 mm) 。流动相：0.1%甲酸水溶液（A）-含0.1%甲酸的乙腈（B），线性梯度洗脱：0/5,15/95, 18/95 (分钟/B%)；柱温30℃，流速1.0 mL·min-1，检测波长254 nm；进样量10μL。质谱选择AB TripleTOF 5600plus系统。质谱条件：大气压电喷雾离子源（ESI）,负离子模式检测，电压为-4.5 kV，温度550◦C。阳离子模式检测电压为+5.5 kV，温度600◦C。雾化气压力50psi，碎片电压50 ± 20 V，质谱m/z扫描范围为100–2000。1，2，6三没食子酰-β-D-葡萄糖出峰时间在29.6分钟左右，分子量大小为636.1，[M+NH4]+/[M−H]−为654/635, 二级质谱特征碎片为负离子模式（169，313，465，483，635）和阳离子模式（153，467）。1，2，6三没食子酰-β-D-葡萄糖相对含量由儿茶素标样EGCG进行换算。
实施例2
1）茶样制备：在春茶季节采摘待测茶叶样品，制成干茶后用磨样机磨成茶粉；
2）样品提取：准确称取茶样0.15 g，加4mL的65%甲醇溶液，65℃水浴浸提9 min，每隔5 min摇动一次，冷却至室温，转入离心机在3200r/min转速下离心9min，取出上清液后再加4ml的65%甲醇溶液提取一次，合并提取液定容至10 mL，摇匀，吸取2 mL提取液至10 mL刻度管内，加8 mL稳定液定容，过0.45μm有机微孔滤膜，取滤液用于后续测定；
3）样品测定：采用超高压液相色谱-飞行时间质谱仪进行1，2，6三没食子酰-β-D-葡萄糖含量测定；
流动相：0.1%甲酸水溶液（A）-含0.1%甲酸的乙腈（B），线性梯度洗脱：0/5分钟/B%、15/95分钟/B%、 18/95分钟/B%；柱温28℃，流速0.8mL·min-1，检测波长254 nm；进样量10μL；
质谱条件：大气压电喷雾离子源（ESI）,负离子模式检测，电压为-4.5 kV，温度530◦C；阳离子模式检测电压为+5.5 kV，温度580◦C；雾化气压力45psi，碎片电压30 V，质谱m/z扫描范围为100；
1，2，6三没食子酰-β-D-葡萄糖出峰时间在29分钟，分子量大小为636.1，[M+NH4]+/[M−H]−为654/635, 二级质谱特征碎片为负离子模式（169，313，465，483，635）和阳离子模式（153，467）；1，2，6三没食子酰-β-D-葡萄糖相对含量由儿茶素标样EGCG进行换算。
实施例3
1）茶样制备：在春茶季节采摘待测茶叶样品，制成干茶后用磨样机磨成茶粉；
2）样品提取：准确称取茶样0.25 g，加6mL的70%甲醇溶液， 75℃水浴浸提11 min，每隔5 min摇动一次，冷却至室温，转入离心机在3600r/min转速下离心11 min，取出上清液后再加6ml的65%甲醇溶液提取一次，合并提取液定容至10 mL，摇匀，吸取2 mL提取液至10mL刻度管内，加8 mL稳定液定容，过0.45μm有机微孔滤膜，取滤液用于后续测定；
3）样品测定：采用超高压液相色谱-飞行时间质谱仪进行1，2，6三没食子酰-β-D-葡萄糖含量测定；
流动相：0.1%甲酸水溶液（A）-含0.1%甲酸的乙腈（B），线性梯度洗脱：0/5分钟/B%、15/95分钟/B%、 18/95分钟/B%；柱温32℃，流速1.2 mL·min-1，检测波长254 nm；进样量10μL；
质谱条件：大气压电喷雾离子源（ESI）,负离子模式检测，电压为-4.5 kV，温度560◦C；阳离子模式检测电压为+5.5 kV，温度620◦C；雾化气压力55psi，碎片电压70 V，质谱m/z扫描范围为2000；
1，2，6三没食子酰-β-D-葡萄糖出峰时间在29-30分钟，分子量大小为636.1，[M+NH4]+/[M−H]−为654/635, 二级质谱特征碎片为负离子模式（169，313，465，483，635）和阳离子模式（153，467）；1，2，6三没食子酰-β-D-葡萄糖相对含量由儿茶素标样EGCG进行换算。
本发明还通过相应的试验数据进一步说明本发明的有益效果。
试验一：
试验分析了3个茶树品种两批春茶样及1批夏茶样的儿茶素及采用实施例1所述方法的1，2，6三没食子酰-β-D-葡萄糖含量差异（表1，图1），结果发现中茗66的1，2，6三没食子酰-β-D-葡萄糖含量最高达到43.4mg/g，较福鼎大白茶提高了4倍，较龙曲1提高了10倍，是富含1，2，6三没食子酰-β-D-葡萄糖的茶树品种。因此，认为该方法适用于茶叶1，2，6三没食子酰-β-D-葡萄糖含量的测定，特别对于茶树相关品种的选育十分必要。采用实施例2-3所述方法，也能取得本发明所述的有益效果。
Claims (2)
1.一种测定茶叶1，2，6三没食子酰-β-D-葡萄糖的方法，其特征在于采用以下方法测定：
1）茶样制备：在春茶季节采摘待测茶叶样品，制成干茶后用磨样机磨成茶粉；
2）样品提取：准确称取茶样0.15-0.25 g，加4-6mL的70%甲醇溶液，70℃水浴浸提10min，每隔5 min摇动一次，冷却至室温，转入离心机在3500r/min转速下离心10min，取出上清液后再加4-6ml65-70%甲醇溶液提取一次，合并提取液定容至10 mL，摇匀，吸取2 mL提取液至10 mL刻度管内，加8 mL稳定液定容，过0.45μm有机微孔滤膜，取滤液用于后续测定；
3）样品测定：采用超高压液相色谱-飞行时间质谱仪进行1，2，6三没食子酰-β-D-葡萄糖含量测定；
使用美国Waters公司的UPLC C18色谱柱，C18色谱柱规格为1.7μm，2.1×50mm；
流动相：流动相A为0.1%甲酸水溶液，流动相B为含0.1%甲酸的乙腈，线性梯度洗脱：0/5分钟/B%、15/95分钟/B%、 18/95分钟/B%；柱温30℃，流速1.0 mL·min-1，检测波长254 nm；进样量10μL；
质谱条件：大气压电喷雾离子源，负离子模式检测，电压为-4.5 kV，温度550◦C；阳离子模式检测电压为+5.5 kV，温度600◦C；雾化气压力50psi，碎片电压40-50 V，质谱m/z扫描范围为500–1000；
1，2，6三没食子酰-β-D-葡萄糖出峰时间在29-30分钟，分子量大小为636.1，[M+NH4]+/[M−H]−为654/635，二级质谱特征碎片分为负离子模式和阳离子模式，负离子模式的二级质谱特征碎片为169，313，465，483，635，阳离子模式的二级质谱特征碎片为153，467；1，2，6三没食子酰-β-D-葡萄糖相对含量由儿茶素标样EGCG进行换算。
2.如权利要求1所述的一种测定茶叶1，2，6三没食子酰-β-D-葡萄糖的方法，其特征在于步骤3）中：1，2，6三没食子酰-β-D-葡萄糖出峰时间在29.6分钟。
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Application publication date: 20180619 Assignee: Xianju Xianyu Ye Tea Industry Co.,Ltd. Assignor: TEA Research Institute CHINESE ACADEMY OF AGRICULTURAL SCIENCES Contract record no.: X2023980054263 Denomination of invention: A method for determining 1,2,6-triglycerides in tea leaves- b- The method and application of D-glucose Granted publication date: 20201208 License type: Common License Record date: 20231227 Application publication date: 20180619 Assignee: Jinyun Longyuan Tea Co.,Ltd. Assignor: TEA Research Institute CHINESE ACADEMY OF AGRICULTURAL SCIENCES Contract record no.: X2023980054258 Denomination of invention: A method for determining 1,2,6-triglycerides in tea leaves- b- The method and application of D-glucose Granted publication date: 20201208 License type: Common License Record date: 20231227 |
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