CN110376298B

CN110376298B - 一种铁皮石斛中残留农药的检测方法

Info

Publication number: CN110376298B
Application number: CN201910511383.1A
Authority: CN
Inventors: 曹君; 胡雨涵; 王秋燕; 杨娟; 董新; 杜丽晶
Original assignee: Hangzhou Normal University
Current assignee: Hangzhou Normal University
Priority date: 2019-06-13
Filing date: 2019-06-13
Publication date: 2022-04-19
Anticipated expiration: 2039-06-13
Also published as: CN110376298A

Abstract

本发明涉及新型农药检测技术领域，为解决现有农作物残留农药检测方法存在的分析时间长、能耗高、重现性差、回收率和灵敏度低的问题，提供了一种铁皮石斛中残留农药的检测方法，包括以下步骤：(1)将生物质吸附剂填装固相萃取小柱并活化；(2)将铁皮石斛样品溶液离心，淋洗固相萃取小柱，得洗脱液；(3)离心过滤，采用超高效液相色谱串联四级杆飞行时间质谱仪分析检测。本发明将微波化学合成法与微型固相萃取方法结合应用于本项工作，节省了分析时间，减少了能量消耗，可靠，准确，重现性好，回收率高，提取效率高效且灵敏度显著增加。

Description

一种铁皮石斛中残留农药的检测方法

技术领域

本发明涉及新型农药检测技术领域，尤其涉及一种铁皮石斛中残留农药的检测方法。

背景技术

铁皮石斛是最重要的传统中草药之一，属于石斛属物种，兰科植物。石斛兰提供了许多清除热量，改善视力等功能，维持胃张力，促进生产体液和免疫调节作用。一般培育铁皮石斛需要很多年才能培育出铁皮石斛商业基础和杀虫剂被广泛用于保护作物免受昆虫和疾病的侵害，导致植物中农药的积累。有机磷农药(OPPs)是一类独特的广谱杀虫剂，常用于预防广泛的作物病害，包括蔬菜，水果和谷物。然而，OPP具有固有毒性，可能导致水资源，粮食供应和生态系统平衡的严重风险，甚至对作物污染和农药残留对人类健康，特别是儿童健康造成危险或永久性后果。例如，三唑磷的人口服致死剂量为0.006mg/kg。此外，神经毒性OPPs的一些成员不可逆地控制酶乙酰胆碱酯酶(AChE)的活性，导致神经递质ACh的积累，其表现出中枢神经系统的功能障碍和语言障碍的严重症状，并最终导致呼吸麻痹甚至死亡。

目前，国内外对于蔬菜水果中有机磷农药多残留的检测方法主要是气相色谱法(GC)、气相色谱串联质谱法(GC-MS/MS)及液相色谱串联质谱法(HPLC-MS/MS)等。而有关铁皮石斛中有机磷农药多残留同时检测的报道较少。所以迫切需要开发用于检测和提取环境和作物中有机磷等农药残留的高灵敏度，快速，便携和可靠的方法。

中国专利文献上公开了“一种人工种植铁皮石斛农药残留量的控制方法”，申请公布号为CN108935037A，该发明公开了一种铁皮石斛中多菌灵农药的检测方法，既可以有效地提取铁皮石斛茎叶中农药残留，又可以完全去除杂质干扰，简便、省时，结果准确。但是，该发明的检测方法是对铁皮石斛本身进行农药残留分析检测，存在着重现性差、回收率和灵敏度低的问题。

发明内容

本发明为了克服现有农作物残留农药检测方法存在的分析时间长、能耗高、重现性差、回收率和灵敏度低的问题，提供了一种铁皮石斛中残留农药的检测方法，该方法将微波化学合成法与微型固相萃取方法相结合，节省了分析时间，减少了能量消耗，可靠，准确，重现性好，回收率高，提取效率高效且灵敏度显著增加。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种铁皮石斛中残留农药的检测方法，包括以下步骤：

(1)将生物质吸附剂填装固相萃取小柱并活化；活化过程为1ml甲醇和1ml纯水分别洗脱；生物质吸附剂加入量为30mg；

(2)将铁皮石斛样品溶液离心，取上清液淋洗固相萃取小柱，得洗脱液；该步骤中，离心转速为3000rpm；

(3)将洗脱液离心过滤，采用超高效液相色谱串联四级杆飞行时间质谱仪分析检测。该步骤中，优选安捷伦1290超高效液相色谱串联安捷伦6590四级杆飞行时间质谱仪，控制离心转速为13000rpm；过滤内径为0.22μm滤膜。

本发明从废弃农业材料中获得的功能性碳用于从天然药用植物中检测多类农药残留，以生物质吸附剂作为固相萃取吸附剂，洗脱液离心过滤通过超高效液相色谱串联四级杆飞行时间质谱仪分析目标化合物，用于铁皮石斛中多种残留农药的检测，解决了常规农药检测方法中种类较少、分析时间较长、灵敏度较低等缺点。所述铁皮石斛中残留农药为喹硫磷、水胺硫磷、灭草隆、非草隆、敌草隆、西玛津、莠去津和百草枯。

作为优选，步骤(3)中，超高效液相色谱分析条件为：流动相由A相和B相组成，所述A相为0.1％甲酸水溶液，所述B相为甲醇，流动相流速控制在0.400mL/min；洗脱梯度条件如下：0-1min，70％A-30％B；1-3min，60％A-40％B；3-7min，40％A-60％B；7-8min，0％A-100％B；8-9min，70％A-30％B；进样体积为2μL。

作为优选，步骤(3)中，四级杆飞行时间质谱分析条件为：气体温度350℃；干燥气流量12L/min；毛细管电压，3.5kV；雾化器压力，45psig；射频电压，65V；碎裂电压，165V；八极RF，750V。

作为优选，步骤(1)中，所述生物质吸附剂按照以下步骤制得：

(a)将山楂叶样品粉碎成粉末并过40目筛，得山楂叶粉末；该范围颗粒大小均匀适中，方便后续微波合成活性炭的处理；

(b)在山楂叶粉末中加入水和酸碱试剂，混合均匀，微波合成粗产物；微波合成省时快捷，操作简单，能耗较低，同时所得产物方便进行后续的分析处理过程；加入酸碱试剂的目的是为了在活性炭的制备过程中去除反应过程中未反应的杂质材料；

(c)对粗产物过滤，调节pH值为中性，烘干，即得生物质吸附剂。烘干温度优选110℃，烘干时间为10h。

本发明的要点在于山楂叶粉末与酸性试剂水溶液在微波合成仪中进行微波合成生物质吸附剂，通过微波辅助合成方法形成，将微波化学合成方法和微型固相萃取方法巧妙地结合起来，解决了常规农药检测方法中种类较少、分析时间较长、灵敏度较低等缺点。选择非传统商品化吸附剂山楂叶作为生物质吸附剂的原料，使用常见植物的废弃物取代吸附材料是本发明的一个亮点。

作为优选，步骤(b)中，每克山楂叶粉末中加入水10mL；每克山楂叶粉末中加入酸碱试剂0.05～0.5g。

本发明必须严格控制酸碱试剂的用量，随着酸碱试剂用量增加，所有目标分析物的色谱峰容量均有所增加，且在每克山楂叶粉末中加入酸碱试剂0.05～0.5g用量时达到最大提取效率。此外，随着盐酸试剂的用量进一步增加时，八种目标分析物的提取效率均降低。

作为优选，步骤(b)中，所述酸碱试剂选自盐酸、硫酸、氢氧化钠和氢氧化钾中的一种。

作为优选，所述酸碱试剂为质量分数为36～38％的盐酸。

通过酸微波化的吸附剂比通过碱微波化的吸附剂更高效的富集的目标化合物的效率。可能的原因是农药化合物的有机结构被碱破坏，导致吸附容量和提取效率降低。浓盐酸提供比浓硫酸更好的富集倍率，可能是浓盐酸的分子量最小，脱氧能力强，氧化弱于硫酸，使目标分析物吸附更多。因此，本发明优选浓盐酸微波合成后的山楂叶样品可以作为最合适的生物质吸附剂。

作为优选，所述盐酸与山楂叶粉末的质量比为1:10，该比例可达到八种目标分析物的最大提取效率。

作为优选，步骤(b)中，微波合成的温度控制在90～170℃；时间控制在10～60min。

当微波合成的温度过高(大于170℃)时，提取效率明显下降，可能的原因是由于生物质吸附剂结构的降解或活性炭样品的坍塌导致；微波合成的温度过低(低于90℃)时，不足以使山楂叶碳化成为活性炭或碳化及其不充分。

作为优选，步骤(b)中，所述微波合成的温度控制在150℃；时间控制在30min。

微波合成温度高达150℃时，除喹硫磷外提取产率明显增加，可能与溶剂粘度和表面张力的下降相对应，这表明控制微波合成温度可以保持吸附剂的稳定性和分子间相互作用，并获得高的提取率。随着温度进一步升高至170℃，观察到提取效率明显下降。可能的原因是由于吸附剂结构的降解或活性炭样品的坍塌导致。因此，本发明进一步优选150℃为最佳微波合成温度。

当微波合成时间从10min延长到30min时达到最大值，而微波合成时间增加到60min时，提取效率开始逐渐降低。这种现象的原因可能是由于延长微波合成时间加速了碳化过程和改变了孔隙和结构，从而提高了吸附剂的产率和吸附能力，随着时间进一步增加到60min达到一定值时，活性炭的孔隙和结构将通过加热而不灼烧，这会降低吸附容量并降低测试化合物的提取效率。因此，本发明进一步优选30min的微波合成时间。

因此，本发明具有如下有益效果：将微波化学合成法与微型固相萃取方法结合应用于本项工作，节省了分析时间，减少了能量消耗，可靠，准确，重现性好，回收率高，提取效率高效且灵敏度显著增加。

附图说明

图1是铁皮石斛样品的微波化学辅助微固相提取法的工作流程图。

图2是农药对照品混合溶液的总离子色谱流图和提取离子色谱流图。

图2中1，2，3，4，5，6，7，8分别代表不同的农药成分，化合物1为喹硫磷，化合物2为水胺硫磷，化合物3为灭草隆，化合物4为非草隆，化合物5为敌草隆，化合物6为西玛津，化合物7为莠去津，化合物8为百草枯。

具体实施方式

下面通过具体实施例，并结合附图，对本发明的技术方案作进一步具体的说明。

在本发明中，若非特指，所有设备和原料均可从市场购得或是本行业常用的，下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域常规方法。

本发明实施例中对照品混合溶液的制备方法为：分别称取喹硫磷、水胺硫磷、灭草隆、非草隆、敌草隆、西玛津、莠去津和百草枯对照品适量，精密称定，分别置于棕色量瓶中，各自加入甲醇制成每1mL含1000μg的对照品溶液。分别移取10μL的对照品溶液置于同一棕色量瓶中，再加入9920μL纯净水制成1μg/mL的对照品混合溶液，4℃条件下储存备用。农药对照品混合溶液的总离子色谱流图和提取离子色谱流图如图2所示。

本发明实施例中分析检测是通过安捷伦1290超高效液相色谱串联安捷伦6590四级杆飞行时间质谱仪对铁皮石斛样品(或对照品混合溶液)中有效成分的含量来进行表征的。

超高效液相色谱分析条件为：

本发明采用的仪器为安捷伦1290超高效液相色谱(圣克拉拉，美国加利福尼亚州)，配备有真空抽气泵，自动进样器，恒温柱温箱，紫外检测器。目标分析物的分离在安捷伦Eclipse Plus C8RRHD(2.1×50mm，1.8μm)色谱柱，柱温为30℃条件下进行。流动相由0.1％甲酸水溶液(A)和甲醇(B)组成，流动相流速保持在0.400mL/min。洗脱梯度条件如下：0-1min，70％A-30％B；1-3min，60％A–40％B；3-7min，40％A–60％B；7-8min，0％A–100％B；8-9min，70％A–30％B；进样体积为2μL。

四级杆飞行时间质谱分析条件为：

本发明采用的仪器为安捷伦6530四级杆飞行时间质谱系统以正电喷雾电离模式进行检测和定性分析。质谱条件如下：气体温度350℃；干燥气流量12L/min；毛细管电压，3.5kV；雾化器压力，45psig；射频电压，65V；碎裂电压，165V；八极RF，750V。

实施例

在本实施例中，通过从浙江诸暨铁皮石斛样品中检测喹硫磷、水胺硫磷、灭草隆、非草隆、敌草隆、西玛津、莠去津和百草枯8种不同种类农药残留，参照图1的工作流程图，评价微波合成化学结合微型固相提取法在本发明中的适用性。

(1)制备生物质吸附剂：

(a)将山楂叶样品粉碎成粉末并过40目筛，得山楂叶粉末；

(b)在山楂叶粉末中加入水和盐酸(36wt％，杭州双林化工试剂厂)，混合均匀，微波合成粗产物；微波合成的温度控制在150℃；时间控制在30min；盐酸与山楂叶粉末的质量比为1:10，每克山楂叶粉末中加入水10mL；

(c)对粗产物过滤，调节pH值为中性，烘干，即得生物质吸附剂；

(2)精确称量5.0g铁皮石斛样品粉末转移到15.0mL离心管中，然后将10.0mL甲醇加入离心管中涡旋1分钟以实现均匀混合。然后将混合物以最大速度振荡10.0分钟以从样品中提取农药残留，并以9980rpm的速度离心6.0分钟以将提取溶液与样品分离。最后将0.1mL上清液移入另一离心管中用水定容至10mL。称量30.0mg步骤(1)制备的生物质吸附剂材料加入1.0-mL固相萃取柱中并用筛板填充。然后用1.0mL甲醇和1.0mL纯水活化该柱，将10mL铁皮石斛样品溶液以0.5ml·min^-1的速度通过含有吸附剂的萃取柱，弃去滤液。用100μL甲醇洗脱并收集到1.5mL离心管中。离心5分钟。离心分离后通过0.22μm一次性尼龙滤膜过滤获得样品溶液，转移至液相进样瓶中，分别进行超高效液相色谱串联四级杆飞行时间质谱分析检测。

超高效液相色谱及四级杆飞行时间质谱分析条件如上所述。

经测定，浙江诸暨产铁皮石斛药材中喹硫磷的含量为0.401μg/g，灭草隆的含量为0.016μg/g，非草隆的含量为0.948μg/g，敌草隆的含量为0.001μg/g，西玛津的含量为0.018μg/g，莠去津的含量为0.030μg/g，未检测到水胺硫磷和百草枯。

为了进一步验证本方法的可行性，进行了方法学的考察包括日内精密度、日间精密度、重现性、定量限和检测限以及加样回收率。

日内精密度

分别称取喹硫磷、水胺硫磷、灭草隆、非草隆、敌草隆、西玛津、莠去津和百草枯的对照品适量，精密称定，分别置于棕色量瓶中，各自加入甲醇制成每1mL含1000μg的对照品溶液。分别移取50μL的对照品溶液置于同一棕色量瓶中，再加入900μL的甲醇制成50μg/mL的对照品混合溶液，即可用超高效液相色谱串联四级杆飞行时间质谱对其进行分析检测。在同一天内对同一对照品混合溶液连续进样6次，获得日内精密度，其结果如表1所示。喹硫磷的保留时间和峰面积的相对标准偏差(RSD)为0.052％和0.711％。水胺硫磷的保留时间和峰面积的相对标准偏差(RSD)为0.070％和2.682％。灭草隆的保留时间和峰面积的相对标准偏差(RSD)为0.102％和0.678％。非草隆的保留时间和峰面积的相对标准偏差(RSD)为0.566％和1.496％。敌草隆的保留时间和峰面积的相对标准偏差(RSD)为0.251％和1.322％。西玛津的保留时间和峰面积的相对标准偏差(RSD)为0.099％和0.924％。莠去津的保留时间和峰面积的相对标准偏差(RSD)为0.195％和1.976％。百草枯的保留时间和峰面积的相对标准偏差(RSD)为0.341％和1.188％。

日间精密度

分别称取喹硫磷、水胺硫磷、灭草隆、非草隆、敌草隆、西玛津、莠去津和百草枯的对照品适量，精密称定，分别置于棕色量瓶中，各自加入甲醇制成每1mL含1000μg的对照品溶液。分别移取50μL的对照品溶液置于同一棕色量瓶中，再加入900μL的甲醇制成50μg/mL的对照品混合溶液，即可用超高效液相色谱串联四级杆飞行时间质谱对其进行分析检测。在三天内对同一对照品混合溶液连续进样6次，获得日内精密度，其结果如表1所示。喹硫磷的保留时间和峰面积的相对标准偏差(RSD)为0.17％和1.46％。水胺硫磷的保留时间和峰面积的相对标准偏差(RSD)为0.04％和2.80％。灭草隆的保留时间和峰面积的相对标准偏差(RSD)为0.47％和1.12％。非草隆的保留时间和峰面积的相对标准偏差(RSD)为0.57％和2.28％。敌草隆的保留时间和峰面积的相对标准偏差(RSD)为0.23％和1.23％。西玛津的保留时间和峰面积的相对标准偏差(RSD)为0.44％和1.42％。莠去津的保留时间和峰面积的相对标准偏差(RSD)为0.25％和1.40％。百草枯的保留时间和峰面积的相对标准偏差(RSD)为0.38％和1.11％。

定量限和检测限

在最优条件下，根据标准溶液的浓度及其测量的峰面积绘制校准曲线，求出直线回归方程式。所有标准曲线都具有良好的线性，且相关系数r²均高于0.99。以3倍和10倍的信噪噪声(S/N)来确定每个分析物的检测限(LOD)和定量限(LOQ)。其结果如表1所示，喹硫磷的LOD和LOQ分别为0.1ng/mL和0.34ng/mL，灭草隆的LOD和LOQ分别为0.08ng/mL和0.28ng/mL，非草隆的LOD和LOQ分别为0.14ng/mL和0.48ng/mL，敌草隆的LOD和LOQ分别为0.58ng/mL和1.92ng/mL，西玛津的LOD和LOQ分别为0.43ng/mL和1.44ng/mL，莠去津的LOD和LOQ分别为1.35ng/mL和4.49ng/mL，百草枯的LOD和LOQ分别为0.66ng/mL和2.2ng/mL。

表1方法的线性回归数据、精密度、检测限、定量限

重现性

以浙江诸暨产的铁皮石斛样品粉末为原料，经优化后的最优条件提取三次，测定了所建立的微波合成化学辅助微型固相提取方法的重现性。

将精确称量5.0g铁皮石斛样品粉末转移到15.0mL离心管中，然后将10.0mL甲醇加入离心管中涡旋1分钟以实现均匀混合。然后将混合物以最大速度振荡10.0分钟以从样品中提取农药残留，并以9980rpm的速度离心6.0分钟以将提取溶液与样品分离。最后将0.1mL上清液移入另一离心管中用水定容至10mL。称量30.0mg吸附剂材料加入1.0-mL固相萃取柱中并用筛板填充。然后用1.0mL甲醇和1.0mL纯水活化该柱，将10mL铁皮石斛样品溶液以0.5ml·min^-1的速度通过含有吸附剂的萃取柱，弃去滤液。用100μL甲醇洗脱并收集到1.5mL离心管中。离心5分钟。离心分离后通过0.22μm一次性尼龙滤膜过滤获得样品溶液，转移至液相进样瓶中，分别进行超高效液相色谱串联四级杆飞行时间质谱分析检测。超高效液相色谱及四级杆飞行时间质谱分析条件同(2)所述。参照上述实验步骤，平行做三组，进行考察，其结果如表2所示。

加样回收率

表2中所列的经过最优条件从浙江诸暨产铁皮石斛样品中检测8中农药残留含量。通过在铁皮石斛样品中加入低和高浓度的两种对照品混合溶液，对目标分析物的回收率进行了测试，并通过超高效液相色谱串联四级杆飞行时间质谱进行检测，其结果如表2所示。

表2铁皮石斛样品中农药残留含量、加样回收率及重现性

结果显示本发明的方法是一种可靠，准确，灵敏的方法，重现性好，回收率高。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。

Claims

1.一种铁皮石斛中残留农药的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将生物质吸附剂填装固相萃取小柱并用甲醇和纯水活化该柱；

(2)称量铁皮石斛样品粉末，将甲醇加入涡旋混合，然后振荡混合物并离心，最后将0.1ml上清液用水定容至10ml，得到铁皮石斛样品溶液，取10ml铁皮石斛样品溶液淋洗固相萃取小柱，甲醇洗脱收集得洗脱液；

(3)将洗脱液离心过滤，采用超高效液相色谱串联四级杆飞行时间质谱仪分析检测喹硫磷、水胺硫磷、灭草隆、非草隆、敌草隆、西玛津、莠去津和百草枯8种不同种类农药残留；

步骤(1)中，所述生物质吸附剂按照以下步骤制得：

(a)将山楂叶样品粉碎成粉末并过40目筛，得山楂叶粉末；

(b)在山楂叶粉末中加入水和盐酸，混合均匀，微波合成粗产物，微波合成的温度控制在90～170℃；时间控制在10～60min；

步骤(3)中，超高效液相色谱分析条件为：Eclipse Plus C8 RRHD，2.1*50mm，1.8μm色谱柱，柱温为30℃，流动相由A相和B相组成，所述A相为0.1％甲酸水溶液，所述B相为甲醇，流动相流速控制在0.400mL/min；洗脱梯度条件如下：0-1min，70％A-30％B；1-3min，60％A-40％B；3-7min，40％A-60％B；7-8min，0％A-100％B；8-9min，70％A-30％B；进样体积为2μL；

四级杆飞行时间质谱以正电喷雾电离模式进行检测，质谱条件如下：气体温度350℃；干燥气流量12L/min；毛细管电压，3.5kV；雾化器压力，45psig；射频电压，65V；碎裂电压，165V；八极RF，750V。

2.根据权利要求1所述的一种铁皮石斛中残留农药的检测方法，其特征在于，步骤(b)中，每克山楂叶粉末中加入水10mL；每克山楂叶粉末中加入质量分数为36～38％的盐酸0.05～0.5g。

3.根据权利要求1所述的一种铁皮石斛中残留农药的检测方法，其特征在于，所述盐酸与山楂叶粉末的质量比为1:10。

4.根据权利要求1所述的一种铁皮石斛中残留农药的检测方法，其特征在于，步骤(b)中，所述微波合成的温度控制在150℃；时间控制在30min。