CN111413419B

CN111413419B - 一种中药的多中心切割分离方法

Info

Publication number: CN111413419B
Application number: CN201911071854.8A
Authority: CN
Inventors: 曹君; 王秋燕; 胡雨涵; 杨娟
Original assignee: Hangzhou Normal University
Current assignee: Hangzhou Normal University
Priority date: 2019-11-05
Filing date: 2019-11-05
Publication date: 2022-05-27
Anticipated expiration: 2039-11-05
Also published as: CN111413419A

Abstract

本发明涉及中药有效成分分离技术领域，为解决传统石斛属植物中痕量化合物分析灵敏度及分辨率低的问题，提供了一种中药的多中心切割分离方法，包括以下步骤：(1)将原料中药材粉碎，过三号筛，得中药粉末；(2)将中药粉末与分散剂混合研磨，得混合物；(3)将混合物填充入固相萃取小柱，经洗脱、离心，进样分析分离效果。本发明在多中心切割模式下，利用2D‑LC‑QTOF‑MS分离鉴定铁皮石斛、金钗石斛、鼓槌石斛中有效成分巧妙结合，能便捷高效地分离中药中的痕量成分。

Description

一种中药的多中心切割分离方法

技术领域

本发明涉及中药有效成分分离技术领域，尤其涉及一种中药的多中心切割分离方法。

背景技术

二维超高效液相色谱是一种理想的、功能强大的分析工具，引起了人们巨大的兴趣。在二维超高效液相色谱体系中，多中心切割模式占据主要地位。在多中心切割模式下，只将来自一维色谱柱分离之后的样品的特定部分转移到二维色谱柱进项二次分离及检测。通常，在多中心切割模式下，二维的总运行时间比一维的收集时间长。同时，在此基础上将二维超高效液相色谱与四极杆飞行时间质谱联用(Q-TOF-MS)，旨在大幅度提高复杂样品的分离能力，获取互补信息。此外，多中心切割模式与Q-TOF-MS联用可实现分离复杂化合物，如多肽、蛋白和中药等。

此外，各种色谱技术被用来分析和分离石斛属植物中的有效成分，例如，高效液相色谱，近红外光谱，高效液相色谱-光电二极管阵列检测-高分辨质谱，高性能薄层色谱，气相色谱与质谱联用等。然而，在这些色谱技术及检测器中，由于石斛属植物及其近缘植物的有效成分具有高度的相似性，因此鉴定它们仍然困难重重。此外，这些技术会导致消耗大量有机试剂，延长分析时间，浪费巨大的成本和获得较差的灵敏度及分辨率。因此，利用高灵敏度的色谱技术对石斛属植物中痕量化合物进行分析是十分必要和迫切的。

发明内容

本发明为了克服传统石斛属植物中痕量化合物分析灵敏度及分辨率低的问题，提供了一种高灵敏度的中药的多中心切割分离方法。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种中药的多中心切割分离方法，包括以下步骤：

(1)将原料中药材粉碎，过三号筛，得中药粉末；

(2)将中药粉末与分散剂混合研磨，得混合物；

(3)将混合物填充入固相萃取小柱，经洗脱、离心，进样分析分离效果。

本发明的分离方法检测环节创意新颖，思路巧妙，成功采用在多中心切割模式下二维高效液相与质谱联用作为分离方法用于中药中有效成分提取和分离的领域，并成功鉴定铁皮石斛、金钗石斛、鼓槌石斛中的痕量成分。经过改良的提取方法处理之后，实验的灵敏度和重现性大大提高，使得在鉴定石斛属中药中的有效痕量成分更加精准有效。

该分离检测体系具备一系列优异突出的特性：操作步骤简洁明了、化合物分离度高、仪器稳定性和灵敏度良好本发明的要点在于在多中心切割模式下采用2D-LC-QTOF-MS分离鉴定铁皮石斛、金钗石斛、鼓槌石斛中有效成分巧妙结合，充分发挥了其分离度高、灵敏度高、重现性好的优点，用这技术分离中药中的成分，可以取得前所未有、立竿见影的效果。本发明技术的简单适用性以及它便捷可重复性使其成为中药分离研究中的有用工具，采用的分散剂以及提取方法，不仅稳定，而且具备一系列优异突出的性质：提高分辨率；增加提取效率；消耗较少的有机试剂、样品量和提取时间，较为环保绿色。

作为优选，步骤(2)中，所述分散剂与中药粉末的质量比为(1～2):1。

作为优选，步骤(3)中，洗脱工艺为：以0.3～0.5mL/min流速用200μL纯甲醇洗脱。

作为优选，步骤(3)中，离心工艺为：在12000～13500rpm转速下离心5～10min。

作为优选，步骤(3)中，进样分析的工艺为：通过两个Agilent 1290超高效液相与Agilent 6545质谱联用测定中药中有效成分来表征该分离方法的有效性。

作为优选，所述中药为石斛属植物，所述石斛属植物中包括以下有效成分：香草酸、丁香酸、芹菜素-6,8-二-c-β-d-葡萄糖苷、对羟基肉桂酸、阿魏酸、牡荆素葡萄糖苷、牡荆素鼠李糖苷、牡荆素、芦丁、柚皮苷、柚皮素、木犀草素、毛兰素、石斛酚、石斛碱、滨篙内酯、石斛醚碱、对羟基苯丙酸、金圣草素、小檗碱、壬二酸、圣草酚、豆甾醇、谷甾醇、鼓槌菲、十六烷酸、腺苷酸、尿苷、鸟嘌呤核苷、软木三萜酮和丁香醛。

作为优选，所述石斛属植物包括铁皮石斛、金钗石斛和鼓槌石斛。本方法应用范围广泛，无论是铁皮石斛还是金钗石斛、鼓槌石斛，均能用本发明方法进行分离。本发明所述的测定铁皮石斛、金钗石斛和鼓槌石斛这三方面的应用亦属首例。

作为优选，步骤(3)中，进样分析的质谱条件为：

离子源为Dual AJS源，质量范围设定为m/z 100-700,采样频率，6spectra/s。雾化器气压，45psig；鞘气流速，11L/min；skimmer电压，65V；鞘气温度，350℃；毛细管电压，3500V；碰撞能，175V；八级杆RF，750V；喷嘴电压1000V；干燥气流速，12L/min；干燥气温度，350℃。多中心切割模式所获得的数据是用2D Chrom Creator和MassHunter软件处理的。

作为优选，一维液相条件为：

色谱柱：SB C18(2.1×100mm,1.8μm)，柱温：50℃，进样量：2.0μL，检测波长：270nm，采样频率：40Hz，流速：0.07mL/min,流动相：A：0.05％甲酸水，B：甲醇。梯度洗脱：0-3min，20-40％B；3-22min，40-50％B；22-25min，50-90％B；25-29min，90-100％B；29-40min，100-100％B。

作为优选，2D-LC色谱条件为：

色谱柱：Poroshell 120Bonus(3.0×50mm，1.8μm)，检测波长，270nm；采样频率，80Hz；柱温，50℃；流动相：A：0.05％甲酸水，B：乙腈。在多中心切割模式下，梯度停止时间为1.5min，梯度周期为2.0min，二维流速为1.0mL/min。梯度洗脱：初始梯度：0min，10％B；1.5min，60％B。

因此，本发明具有如下有益效果：本发明提供了一种新的分离技术，该技术在多中心切割模式下，利用2D-LC-QTOF-MS分离鉴定铁皮石斛、金钗石斛、鼓槌石斛中有效成分巧妙结合，能便捷高效地分离中药中的痕量成分。

附图说明

图1是本发明的工艺流程图。

图2是多中心切割模式下的二维色谱图。

图2中，1-16分别代表石斛属植物中不同的有效成分：1，香草酸；2，丁香酸；3，芹菜素-6,8-二-c-β-d-葡萄糖苷；4，对羟基肉桂酸；5，阿魏酸；6，牡荆素葡萄糖苷；7，牡荆素鼠李糖苷；8，牡荆素；9，芦丁；10，柚皮苷；11，柚皮素；12，木犀草素；13，毛兰素；14，石斛酚；15，石斛碱；16，滨篙内酯。

图3是不同石斛属植物的有效成分提取图。

图3中：A1、A2、B1、B2、C1、C2分别代表质谱的正负离子模式下不同的石斛样品：A1，铁皮石斛的负离子模式；A2，铁皮石斛的正离子模式；B1，金钗石斛的负离子模式；B2，金钗石斛的正离子模式；C1，鼓槌石斛的负离子模式；C2，鼓槌石斛的正离子模式。图中，1-31分别代表石斛属植物中不同的有效成分，分别为：1，香草酸；2，丁香酸；3，芹菜素-6,8-二-c-β-d-葡萄糖苷；4，对羟基肉桂酸；5，阿魏酸；6，牡荆素葡萄糖苷；7，牡荆素鼠李糖苷；8，牡荆素；9，芦丁；10，柚皮苷；11，柚皮素；12，木犀草素；13，毛兰素；14，石斛酚；15，石斛碱；16，滨篙内酯；17，石斛醚碱；18，对羟基苯丙酸；19，金圣草素；20，小檗碱；21，壬二酸；22，圣草酚；23，豆甾醇；24，谷甾醇；25，鼓槌菲；26，十六烷酸；27，腺苷酸；28，尿苷；29，鸟嘌呤核苷；30，软木三萜酮；31，丁香醛。

具体实施方式

下面通过具体实施例，并结合附图，对本发明的技术方案作进一步具体的说明。

在本发明中，若非特指，所有设备和原料均可从市场购得或是本行业常用的，下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域常规方法。

本发明以下实施例中的质谱条件设置如下：

离子源为Dual AJS源，质量范围设定为m/z 100-700,采样频率，6spectra/s。雾化器气压，45psig；鞘气流速，11L/min；skimmer电压,65V；鞘气温度，350℃；毛细管电压,3500V；碰撞能,175V；八级杆RF,750V；喷嘴电压1000V；干燥气流速，12L/min；干燥气温度,350℃。

多中心切割模式所获得的数据是用2D Chrom Creator和MassHunter软件处理的。

本发明以下实施例中的一维液相条件设置如下：

色谱柱：SB C₁₈(2.1×100mm,1.8μm)，柱温：50℃，进样量：2.0μL，检测波长：270nm，采样频率：40Hz，流速：0.07mL/min,流动相：A：0.05％甲酸水，B：甲醇。梯度洗脱：0-3min,20-40％B；3-22min,40-50％B；22-25min,50-90％B；25-29min,90-100％B；29-40min,100-100％B。

2D-LC色谱条件为：

色谱柱：Poroshell 120Bonus(3.0×50mm,1.8μm)，检测波长，270nm；采样频率，80Hz；柱温，50℃；流动相：A：0.05％甲酸水，B：乙腈。在多中心切割模式下，梯度停止时间为1.5min，梯度周期为2.0min,二维流速为1.0mL/min。梯度洗脱：初始梯度：0min,10％B；1.5min,60％B。

实施例1

(1)参照图1的工艺流程图，将铁皮石斛粉碎，过三号筛，得铁皮石斛粉末；

(2)取干净的玛瑙研钵，加入铁皮石斛粉末25mg，接着准确称取分散剂25mg，将其分别加入研钵中，研磨5分钟，得混合物；

(3)将充分研磨过后的混合物转移至聚丙乙烯的固相萃取小柱里；

(4)以0.3mL/min流速用200μL甲醇对铁皮石斛粉末和分散剂混合物洗脱，洗脱至1.5mL离心管里；

(5)将1.5mL离心管置于超高速离心机中，在12000rpm转速下离心10分钟，取上层清液装样，进样分析，按照上述条件，通过两个Agilent 1290超高效液相与Agilent 6545质谱联用测定中药中有效成分来表征该分离方法的有效性。

实施例2

(4)以0.5mL/min流速用200μL甲醇对铁皮石斛粉末和分散剂混合物洗脱，洗脱至1.5mL离心管里；

(5)将1.5mL离心管置于超高速离心机中，在13000rpm转速下离心8分钟，取上层清液装样，进样分析，按照上述条件，通过两个Agilent 1290超高效液相与Agilent 6545质谱联用测定中药中有效成分来表征该分离方法的有效性。

实施例3

(1)参照图1的工艺流程图，将金钗石斛粉碎，过三号筛，得金钗石斛粉末；

(2)取干净的玛瑙研钵，加入金钗石斛粉末25mg，接着准确称取分散剂50mg，将其分别加入研钵中，研磨10分钟，得混合物；

(4)以0.4mL/min流速用200μL甲醇对金钗石斛粉末和分散剂混合物洗脱，洗脱至1.5mL离心管里；

(5)将1.5mL离心管置于超高速离心机中，在13500rpm转速下离心5分钟，取上层清液装样，进样分析，按照上述条件，通过两个Agilent 1290超高效液相与Agilent 6545质谱联用测定中药中有效成分来表征该分离方法的有效性。

考察多中心切割对分析物分离的影响：

1.1.通过将每个纯标准品以1000μg/mL的浓度溶解在甲醇中来获得混合标准储备溶液，并在4℃下储存。在使用前用甲醇稀释储备溶液来制备50μg/mL的标准溶液。

1.2在多中心切割模式的最优条件下，用2D-LC-QTOF-MS分析结果。

实验结果见图2：9次中心切割分别发生在13.08分钟、13.65分钟、14.22分钟、15.81分钟、16.44分钟、17.01分钟、18.49分钟、19.06分钟和19.63分钟。第二个碎片检测出主要是芹菜素-6,8-二-c-β-d-葡萄糖苷和香草酸。丁香酸和芹菜素-6,8-二-c-β-d-葡萄糖苷被成功分离和识别(碎片3)。碎片4和8组分分别为对羟基肉桂酸和芦丁。从碎片5中可以看出，牡荆素葡萄糖苷和对羟基肉桂酸被成功分离并检测。检测到的碎片6主要为牡荆素葡萄糖苷和牡荆素鼠李糖苷；碎片7主要为牡荆素和阿魏酸。最后，碎片9被成功地鉴定为芦丁和柚皮苷。与全二维模式相比，多中心切割模式显著提高了黄酮类化合物的分离能力。因此，利用多中心切割模式的2D-LC-QTOF-MS，可以一次性成功的分离并鉴定16种化合物，其中大部分为黄酮类化合物。

考察铁皮石斛、金钗石斛、鼓槌石斛成分差异的影响

2.1取3个干净的玛瑙研钵，分别加入铁皮石斛、金钗石斛、鼓槌石斛粉末25mg，接着准确称取三份分散剂25mg，将其分别加入研钵中,研磨5分钟。

2.2将充分研磨过后的均匀混合物转移至聚丙乙烯的固相萃取小柱里。

2.3用200μL甲醇对中药材和分散剂混合物洗脱，洗脱至1.5mL离心管里。

2.4将1.5mL离心管置于超高速离心机中，在13000rpm转速下离心5分钟，取上层清液装样，进样分析，实验结果如下表1所示。

表1.实验结果

-:未检测到；▲:检测到的。

由表1可知，石斛属植物的31种化合物通过2D-LC-QTOF-MS被成功的鉴别。用方程

求得分子量误差。分子量误差值在-4.03-7.52ppm之间，说明该仪器具有较高的灵敏度。在这些目标化合物中，铁皮石斛中没有检测到1、2、4、5、8、16、18、23、27、28、30和31化合物；金钗石斛中没有检测到4、12、16、27、28、30和31化合物；鼓槌石斛中没有检测到1、9、12、16和23化合物。因此，2D-LC-QTOF-MS成功地检测和鉴定了石斛属植物中不同种类的化合物。

不同石斛属植物的有效成分提取图如图3所示，图中，A1、A2、B1、B2、C1、C2分别代表质谱的正负离子模式下不同的石斛样品，分别为：A1，铁皮石斛的负离子模式；A2，铁皮石斛的正离子模式；B1，金钗石斛的负离子模式；B2，金钗石斛的正离子模式；C1，鼓槌石斛的负离子模式；C2，鼓槌石斛的正离子模式。图中，1-31分别代表石斛属植物中不同的有效成分，分别为：1，香草酸；2，丁香酸；3，芹菜素-6,8-二-c-β-d-葡萄糖苷；4，对羟基肉桂酸；5，阿魏酸；6，牡荆素葡萄糖苷；7，牡荆素鼠李糖苷；8，牡荆素；9，芦丁；10，柚皮苷；11，柚皮素；12，木犀草素；13，毛兰素；14，石斛酚；15，石斛碱；16，滨篙内酯；17，石斛醚碱；18，对羟基苯丙酸；19，金圣草素；20，小檗碱；21，壬二酸；22，圣草酚；23，豆甾醇；24，谷甾醇；25，鼓槌菲；26，十六烷酸；27，腺苷酸；28，尿苷；29，鸟嘌呤核苷；30，软木三萜酮；31，丁香醛。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。

Claims

1.一种中药的多中心切割分离方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）将原料中药材粉碎，过三号筛，得中药粉末；

（2）将中药粉末与分散剂混合研磨，得混合物；

（3）将混合物填充入固相萃取小柱，经洗脱、离心，进样分析分离效果；

步骤（3）中，进样分析的工艺为：通过两个Agilent 1290超高效液相与Agilent 6545质谱联用测定中药中有效成分来表征该分离方法的有效性；

一维液相条件为：

色谱柱：SB C18 ，2.1 ×100 mm, 1.8 μm，柱温：50 ℃，进样量：2.0 μL，检测波长：270nm，采样频率：40 Hz，流速：0.07 mL/min, 流动相：A：0.05%甲酸水，B：甲醇，梯度洗脱：0-3min，20-40% B；3-22 min，40-50% B; 22-25 min，50-90% B；25-29 min，90-100% B；29-40min，100-100% B；

2D-LC色谱条件为：

色谱柱：Poroshell 120 Bonus ，3.0×50 mm，1.8μm，检测波长，270 nm；采样频率，80Hz；柱温，50 ℃；流动相：A：0.05%甲酸水，B：乙腈，在多中心切割模式下，梯度停止时间为1.5 min，梯度周期为2.0 min，二维流速为1.0 mL/min，梯度洗脱：初始梯度：0 min，10% B；1.5 min，60% B；

中心切割分别发生在13.08分钟、13.65分钟、14.22分钟、15.81分钟、16.44分钟、17.01分钟、18.49分钟、19.06分钟和19.63分钟；

所述中药为石斛属植物，所述石斛属植物中包括以下有效成分：香草酸、丁香酸、芹菜素-6,8-二-c-β-d-葡萄糖苷、对羟基肉桂酸、阿魏酸、牡荆素葡萄糖苷、牡荆素鼠李糖苷、牡荆素、芦丁、柚皮苷、柚皮素、木犀草素、毛兰素、石斛酚、石斛碱、滨篙内酯、石斛醚碱、对羟基苯丙酸、金圣草素、小檗碱、壬二酸、圣草酚、豆甾醇、谷甾醇、鼓槌菲、十六烷酸、腺苷酸、尿苷、鸟嘌呤核苷、软木三萜酮和丁香醛。

2.根据权利要求1所述的一种中药的多中心切割分离方法，其特征在于，步骤（2）中，所述分散剂与中药粉末的质量比为（1~2）:1。

3.根据权利要求1所述的一种中药的多中心切割分离方法，其特征在于，步骤（3）中，洗脱工艺为：以0.3~0.5 mL/min流速用200 μL纯甲醇洗脱。

4.根据权利要求1所述的一种中药的多中心切割分离方法，其特征在于，步骤（3）中，离心工艺为：在12000~13500 rpm转速下离心5~10 min。

5.根据权利要求4所述的一种中药的多中心切割分离方法，其特征在于，所述石斛属植物包括铁皮石斛、金钗石斛和鼓槌石斛。