CN108445114B - 一种筛选金银花中微量神经氨酸酶抑制剂的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种2D‑HPLC‑AS/UF与ESI‑TOF/MS方法用于筛选和表征金银花中微量神经氨酸酶抑制剂。采用本方法，从金银花提取物中共发现了44种具有神经氨酸酶抑制活性化合物，并且通过与标准和参考文献对比进行了初步鉴别。该方法具有高效，低能耗，目标性较强的优点，为复杂的天然药物中微量神经氨酸酶抑制剂的快速筛选鉴别提供了方法和技术支持。

Description

一种筛选金银花中微量神经氨酸酶抑制剂的方法
技术领域
本发明涉及中草药化合物分离领域，具体涉及一种2D-HPLC-AS/UF与ESI-TOF/MS联用用于筛选和表征金银花中微量神经氨酸酶抑制剂的方法。
背景技术
流行性感冒是由流感病毒引起的急性呼吸道感染，具有传染性强，发病率高，容易引起暴发流行或大流行等特点。抗流感病毒药物的作用靶点是病毒的自身结构、酶和复制机理，所以抗流感病毒药物的有效成分在攻击病毒的时，往往会对宿主细胞产生不良反应。因此，抗流感病毒药物的研发十分困难。目前，预防流感的主要途径是接种流感疫苗，但是流感病毒基因突变率高，现有的抗流感疫苗对新型流感病毒往往失效，故注射疫苗不可能获得永久的免疫力。特别是近年来，新型流感不断爆发，给人类健康带来了严重的危害。神经氨酸酶(neuraminidase,NA)是流感病毒表面一种重要的病毒表面糖蛋白，具有糖苷外切酶活性，可以水解唾液酸(sialic acid)残基与邻近寡糖之间的α-糖苷键，是流感治疗药物的主要作用靶点之一。目前，神经氨酸酶抑制剂已成为各国普遍采用的治疗流感的药物。然而，由于现有的抗流感药物仍然存在数量少、疗效不理想且不良反应较大等特点，急需开发高效低毒的新型抗流感药物。
中药作为我国传统的药物已经有两千多年预防治疗传染病的历史,在防治流感病毒中显示良好的效果，有着不良反应低，不易产生耐药性的独特优点。研究表明抗流感病毒天然药物成分主要有两类：一类是多酚类物质，它即可抑制流感病毒的吸附，也能抑制RNA和流感病毒蛋白质合成；一类是可抑制流感病毒神经氨酸酶的活性的黄酮类物质。
金银花为忍冬科忍冬属植物忍冬Lonicera japonicaThunb.的干燥花蕾或初开的花，是大宗常用中药材，山东和河南是金银花主要的产地和栽培地。《名医别录》记载，其性寒、味甘，归肺、心、胃经，具有疏散风热、清热解毒的功效，主要用于治疗丹毒、热毒血痢、风热感冒、喉痹、温病发热等症。金银花作为我国传统的中药材，药用价值高且具有广阔的市场前景。例如，在用于治疗上呼吸道感染、感冒的中成药里，金银花的使用率最高。我们生活中的常见药，比如：双黄连口服液、银黄颗粒、维C银翘片、清开灵、连花清瘟胶囊、银花泌炎灵胶囊、银黄含化片等中药中，都含有金银花。目前为止，金银花抗流感的药效物质基础仍不明确。基于传统的天然药化研究思路在中药活性成分发现过程中发挥了重要作用，但同时存在许多不足之处，如：靶向性差、耗时长、成本高，对于含量较低的活性成分容易造成丢失。金银花的化学成分含量众多，且含量差异较大，采用传统的研究方法不能满足快速发现金银花抗流感病毒有效成分的需求。因此，建立高效快速灵敏的筛选方法，从中药复杂基质中筛选出有效的抗流感活性成分，为进一步发现创新药物先导化合物，研制创新药物具有重要意义。
亲和超滤质谱联用技术是上世纪九十年代发展起来的一种活性成分快速发现技术。其基本原理是：在一定的压力下，使小分子溶质和溶剂穿过一定孔径的特制的薄膜，而使大分子溶质不能透过，留在膜的一边，从而使大分子物质得到了部分的纯化。具有操作简单、靶向性强、成本低、灵敏度高等优点，近年来在中药活性成分的筛选中也有应用报道。但由于受到方法灵敏度的限制，在复杂基质中微量活性成分的筛选中有一定的局限性。
发明内容
为了解决以上问题，本发明提出一种基于亲和超滤二维液相色谱质谱联用技术(UF-2D-HPLC-ESI-MS)技术的金银花微量抗流感成分快速筛选技术研究，为金银花抗病毒成分的快速探明提供一种新方法。本发明方法可以一次性筛选得到44种具有潜在神经氨酸酶抑制活性的化合物，经质谱鉴别，对其中23种成分进行了初步鉴别，并对17种进行了活性验证。
本发明目的之一在于提供一种从金银花中筛选微量神经氨酸酶抑制剂的方法，向金银花粉中加入提取试剂超声提取得到提取物，采用半制备液相色谱将金银花提取物分离，再经高效液相进一步分离并结合超滤质谱技术进行筛选和鉴别，其特征在于，半制备液相色谱对提取物采用四段分离。
本发明研究过程中发现，四段组分分离筛选得到44种化合物，而直接筛选，则只能筛选得到7种化合物。
优选的，上述筛选方法的步骤如下：
(1)将金银花粉与提取溶剂置于塞式烧瓶中，一定温度下超声提取；将超声后的滤液过滤合并，减压蒸干，用甲醇复溶后，过滤膜备用；
(2)将步骤(1)中制得的样品通过半制备液相色谱系统进行样品分段，将洗脱得到的高组分含量进行合并，得到组分A、组分B、组分C、组分D；
(3)通过高效液相色谱系统对组分A、组分B、组分C、组分D进行梯度洗脱分离，通过质谱仪进行质谱鉴定。
优选的，步骤(1)的具体操作为：将金银花粉和提取溶剂置于塞式烧瓶中，在25℃下控温条件下超声提取30min，重复一次；将超声后的滤液过滤合并，减压蒸干；用50％甲醇复溶，过0.45μm滤膜备用。
进一步优选的，步骤(1)中金银花粉：提取溶剂的配比为10g：1L。
优选的，上述步骤(2)的具体操作为：将步骤(1)中制得的样品通过RIGOL-3245半制备液相色谱系统进行样品分段，将洗脱得到的高组分含量进行合并，得到组分A、组分B、组分C、组分D；其中，半制备液相色谱系统采用梯度洗脱条件，流动相为：A相-含0.2％甲酸的水和B相-甲醇，流速为3mL/min，检测波长为280nm，进样量为200μL。
进一步优选的，该半制备液相色谱系统梯度洗脱程序如下：0min，10％B相；0-20min，10％～40％B相；20-30min，40％～60％B相；30-35min，60％～80％B相；35-40min，80％～100％B相；40-50min，100％B相。
优选的，上述步骤(3)的具体操作为：采用Agilent1260高效液相色谱系统完成对组分A、组分B、组分C、组分D进行梯度洗脱分离，所述质谱仪为ESI-Q-TOF质谱仪。
进一步优选的，上述组分A,B,C,D的液相分离条件如下：
A组：Xbridge Amide(4.6×250mm，3.5μm)色谱柱，洗脱溶剂A相(含0.8％甲酸，10mM甲酸铵的水)和B相(乙腈)。梯度洗脱程序为：0min，96％B相；0-5min，96％～93％B相；5-20min，93％～93％B相；20-25min，93％～82％B相；25-30min，82％～82％B相；30-50min，82％～70％B相；50-51min，70％～50％B相；51-60min，50％B相。流速为1.0mL/min，检测波长设为262nm，注射量为10μL。
B组：Symmetry C18(4.6×250mm，5μm)色谱柱，洗脱溶剂为A相(含0.8％甲酸的水)和B相(乙腈)梯度洗脱程序为：0min，10％B相；0-5min，10％～13％B相；5-15min，13％～13％B相；5-20min，13％～14％B相；20-45min，14％～19％B相；45-50min，19％～25％B相；50-51min，25％～100％B相；51-60min，100％B相。流速设定为0.8mL/min，检测波长设为280nm。进样量为20μL。
C组：XSELECTTM HSS T3(3×150mm，3.5μm)色谱柱，洗脱溶剂A相(含0.8％甲酸，10mm甲酸铵的水)和B相(乙腈)。梯度洗脱程序为：0min，14％B相；0-20min，14％-14％B相；20-30min，14％-17％B相；30-45min，17％-23％B相；45-60min，23％-25％B相；60-75min，25％-35％B相；75-85min，35％-100％B相；85-95min，100％B相。流速为0.5mL/min，检测波长设为262nm。进样量为10μL。
D组：kromasil C18(4.6×250mm，5μm)色谱柱，洗脱溶剂为A相(含0.5％甲酸的水)和B相(乙腈)。梯度洗脱程序为：0min，10％B相；0-15min，10％-20％B相；15-20min，20％-22％B相；20-35min，22％-23％B相；35-45min，23％-50％B相；45-55min，50％-100％相；55-60min，100％B相。流速设定为0.8mL/min，检测波长设为262nm。进样量为10μL。
上述质谱扫描条件如下：扫描范围为m/z 50-1500；破碎电压设定为100V，毛细管电压设定为4500V，温度为350℃；高纯氮的流量控制在10.0L/min；所述D组的进样量为2μL，所述A组、B组、C组进样量均为5μL。
优选的，上述筛选方法中，所用的提取试剂分别为水、80％乙醇、乙酸乙酯和石油醚。
本发明目的之二在于提供一种同时提取多种绿原酸类物质的方法，即上述筛选方法。本发明筛选方法经筛选可以一次性得到44种具有神经氨酸酶抑制活性的物质，其中包括绿原酸、新绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C等多种本领域公知具有抗病毒活性的物质。因此本发明筛选方法同样可以作为一种同时提取多种绿原酸类物质的方法。
本发明的有益效果
1.本发明提出一种展基于亲和超滤二维液相色谱质谱联用技术(UF-2D-HPLC-ESI-MS)技术的金银花微量抗流感成分快速筛选技术研究，能够一次性筛选44种具有神经氨酸酶抑制活性的物质，具有十分优越的技术效果。
2.本发明研究过程中发现，采用四种组分分断分离相比直接分离具有良好的筛选效果，可实现微量活性组分的富集，为日后中草药活性部位的提取提供了宝贵的研究思路。
附图说明
构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本申请的进一步理解，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。
图1金银花提取物的半制备HPLC色谱图；
图2金银花提取物总样以及制备出的不同组分UF-LC/MS筛选图。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
本发明中所使用的Agilent1260系列高效液相色谱系统购自美国安捷伦科技；高速离心机购自上海安亭；TecanM20系列多功能酶标仪购于瑞士帝肯集团有限公司，MICROTESTTM96酶标板购于波士顿狄金森公司；SB-5200D系列高功率超声波清洗仪购于宁波新芝公司。
2-N-morphine Lin-ethyl sulfonic acid(MES)，神经氨酸酶和2-(4-methylumbelliferyl)-D-nacetylneuraminic均购于sigma公司(美国)；金银花样品购于济南漱玉平民大药房，经山东科学院王晓教授鉴定为忍冬科植物干燥花蕾-金银花。甲醇为色谱纯,其他试剂均为分析纯。实验用水为超纯水(Millipore Q-Plus系统，美国)。
正如背景技术部分所介绍的，传统的研究方法不能满足快速发现金银花抗流感病毒有效成分的需求，本发明针对该技术问题提出了一种基于亲和超滤二维液相色谱质谱联用技术(UF-2D-HPLC-ESI-MS)技术的金银花微量抗流感成分快速筛选技术。
本发明的一种典型实施方式中，提供一种从金银花中筛选神经氨酸酶抑制剂的方法，向金银花粉中加入提取试剂超声提取得到提取物，采用半制备液相色谱将金银花提取物分离，再经高效液相进一步分离并结合超滤质谱技术进行筛选和鉴别，其特征在于，半制备液相色谱对提取物采用四段分离。
优选的实施方案中，上述筛选方法的步骤如下：
(1)将金银花粉与提取溶剂置于塞式烧瓶中，一定温度下超声提取；将超声后的滤液过滤合并，减压蒸干，用甲醇复溶后，过滤膜备用；
(2)将步骤(1)中制得的样品通过半制备液相色谱系统进行样品分段，将洗脱得到的高组分含量进行合并，得到组分A、组分B、组分C、组分D；
(3)通过高效液相色谱系统对组分A、组分B、组分C、组分D进行梯度洗脱分离，通过质谱仪进行质谱鉴定。
优选的实施方案中，步骤(1)中：将金银花粉和提取溶剂置于塞式烧瓶中，在25℃下控温条件下超声提取30min，重复一次；将超声后的滤液过滤合并，减压蒸干；用50％甲醇复溶，过0.45μm滤膜备用。其中，金银花粉：提取溶剂＝10g：1L。
优选的实施方案中，步骤(2)中：将步骤(1)中制得的样品通过RIGOL-3245半制备液相色谱系统进行样品分段，将洗脱得到的高组分含量进行合并，得到组分A、组分B、组分C、组分D；所述半制备液相色谱系统采用梯度洗脱条件，流动相为：A相-含0.2％甲酸的水和B相-甲醇，流速为3mL/min，检测波长为280nm，进样量为200μL。
进一步优选的实施方案中，上述梯度洗脱程序如下：0min，10％B相；0-20min，10％～40％B相；20-30min，40％～60％B相；30-35min，60％～80％B相；35-40min，80％～100％B相；40-50min，100％B相。
优选的实施方案中，步骤(3)中，采用Agilent1260高效液相色谱系统完成对组分A、组分B、组分C、组分D进行梯度洗脱分离，所用的质谱仪为G6520Q-TOF质谱仪。
进一步优选的实施方案中，采用Agilent1260高效液相色谱系统完成对组分A、组分B、组分C、组分D进行梯度洗脱的条件如下：
A组：Xbridge Amide，规格为4.6×250mm，3.5μm的色谱柱，洗脱溶剂为A相-含0.8％甲酸，10mM甲酸铵的水和B相-乙腈；梯度洗脱程序为：0min，96％B相；0-5min，96％～93％B相；5-20min，93％～93％B相；20-25min，93％～82％B相；25-30min，82％～82％B相；30-50min，82％～70％B相；50-51min，70％～50％B相；51-60min，50％B相；流速为1.0mL/min，检测波长设为262nm，注射量为10μL；
B组：Symmetry C18，规格为4.6×250mm，5μm的色谱柱，洗脱溶剂为A相-含0.8％甲酸的水和B相-乙腈；梯度洗脱程序为：0min，10％B相；0-5min，10％～13％B相；5-15min，13％～13％B相；5-20min，13％～14％B相；20-45min，14％～19％B相；45-50min，19％～25％B相；50-51min，25％～100％B相；51-60min，100％B相；流速设定为0.8mL/min，检测波长设为280nm，进样量为20μL；
C组：XSELECTTM HSS T3，规格为3×150mm，3.5μm的色谱柱，洗脱溶剂A相-含0.8％甲酸，10mm甲酸铵的水和B相-乙腈；梯度洗脱程序为：0min，14％B相；0-20min，14％-14％B相；20-30min，14％-17％B相；30-45min，17％-23％B相；45-60min，23％-25％B相；60-75min，25％-35％B相；75-85min，35％-100％B相；85-95min，100％B相；流速为0.5mL/min，检测波长设为262nm；进样量为10μL；
D组：kromasil C18，规格为4.6×250mm，5μm的色谱柱，洗脱溶剂为A相-含0.5％甲酸的水和B相-乙腈；梯度洗脱程序为：0min，10％B相；0-15min，10％-20％B相；15-20min，20％-22％B相；20-35min，22％-23％B相；35-45min，23％-50％B相；45-55min，50％-100％B相；55-60min，100％B相；流速设定为0.8mL/min，检测波长设为262nm；进样量为10μL；
上述质谱仪扫描条件如下：扫描范围为m/z 50-1500；破碎电压设定为100V，毛细管电压设定为4500V，温度为350℃；高纯氮的流量控制在10.0L/min；所述D组的进样量为2μL，所述A组、B组、C组进样量均为5μL。
优选的，上述筛选方法中，所使用的提取试剂为水，80％乙醇，乙酸乙酯和石油醚。
本发明的又一种典型实施方式中，提供一种同时提取多种绿原酸类物质的方法，即上述从金银花中筛选神经氨酸酶抑制剂的方法。
以下结合具体实施例对本发明的方案进行说明：
实施例1
1.样品前处理
将0.5g金银花粉和50mL提取溶剂加入塞锥形瓶中，置于超声中25℃超声提取30min，提取液经抽滤后，将滤液减压蒸发至干。加入2mL50％(v/v)的甲醇溶液将残留物复溶，过0.22μm微孔滤膜后在4℃贮存备用。四种提取溶液分别是水，80％乙醇，乙酸乙酯和石油醚。
溶液配制：缓冲液1由含有33mmol/L MES和4mmol/L CaCl2的超纯水制成，其pH为6.5。缓冲液2由含有33mmol/L MES、4mmol/L CaCl2和10％异丙醇的超纯水制成，其pH为6.5。精密称定芹菜素标准品1mg，在容量瓶中定容为1mg/mL的芹菜素标准溶液作为阳性对照。
2.semi-prep-HPLC分离的组分
用RIGOL-3245半制备液相色谱系统完成样品分段。具体条件如下：梯度洗脱程序为：0min，10％B相；0-20min，10％～40％B相；20-30min，40％～60％B相；30-35min，60％～80％B相；35-40min，80％～100％B相；40-50min，100％B相。流动相A为(含0.2％甲酸的水)和B(甲醇)。流速为3mL/min，检测波长为280nm。进样量为200μL，样品分为四个部分，收集到的液体在减压条件下蒸干，用50％甲醇复溶，经过0.22μm微孔膜过滤后，可用于后续分析、鉴定和筛选。
通过半制备液相色谱柱洗脱出的几种高含量组分被选择并合并为组分D，强极性组分22min之前部分合并为组分A，收集其他洗脱液，分别定义为B组分和C组分。附图1显示了金银花提取物的semi-prep-HPLC分离图。
3.UF-HILIC/RP-HPLC分析
采用Agilent1260高效液相色谱系统完成样品的分段分析。需针对四个组分分别优化出四个不同的液相分离条件和质谱鉴定条件，以获得更多的色谱分离峰并获得较好的分离效果。
上述组分A,B,C,D的液相分离条件如下：
A组：Xbridge Amide(4.6×250mm，3.5μm)色谱柱，洗脱溶剂A相(含0.8％甲酸，10mM甲酸铵的水)和B相(乙腈)。梯度洗脱程序为：0min，96％B相；0-5min，96％～93％B相；5-20min，93％～93％B相；20-25min，93％～82％B相；25-30min，82％～82％B相；30-50min，82％～70％B相；50-51min，70％～50％B相；51-60min，50％B相。流速为1.0mL/min，检测波长设为262nm，注射量为10μL。
B组：Symmetry C18(4.6×250mm，5μm)色谱柱，洗脱溶剂为A相(含0.8％甲酸的水)和B相(乙腈)梯度洗脱程序为：0min，10％B相；0-5min，10％～13％B相；5-15min，13％～13％B相；5-20min，13％～14％B相；20-45min，14％～19％B相；45-50min，19％～25％B相；50-51min，25％～100％B相；51-60min，100％B相。流速设定为0.8mL/min，检测波长设为280nm。进样量为20μL。
C组：XSELECTTM HSS T3(3×150mm，3.5μm)色谱柱，洗脱溶剂A相(含0.8％甲酸，10mm甲酸铵的水)和B相(乙腈)。梯度洗脱程序为：0min，14％B相；0-20min，14％-14％B相；20-30min，14％-17％B相；30-45min，17％-23％B相；45-60min，23％-25％B相；60-75min，25％-35％B相；75-85min，35％-100％B相；85-95min，100％B相。流速为0.5mL/min，检测波长设为262nm。进样量为10μL。
D组：kromasil C18(4.6×250mm，5μm)色谱柱，洗脱溶剂为A相(含0.5％甲酸的水)和B相(乙腈)。梯度洗脱程序为：0min，10％B相；0-15min，10％-20％B相；15-20min，20％-22％B相；20-35min，22％-23％B相；35-45min，23％-50％B相；45-55min，50％-100％相；55-60min，100％B相。流速设定为0.8mL/min，检测波长设为262nm。进样量为10μL。
上述质谱扫描条件如下：扫描范围为m/z 50-1500；破碎电压设定为100V，毛细管电压设定为4500V，温度为350℃；高纯氮的流量控制在10.0L/min；所述D组的进样量为2μL，所述A组、B组、C组进样量均为5μL。
通过UF-HPLC方法筛选组分中潜在的NIs，实验条件参考已有的报道并稍作修改。首先研究制备出的四个馏分的HPLC条件。对于溶解在第一组分中的强极性化合物，选择HILIC柱对目标组分进行分离效果较好。其他三个部分通过RP-HPLC在优化条件下进行分析。见附图2。由图2可以看出，金银花提取物进行分段制备后在进行筛选筛选出的潜在的神经氨酸酶抑制剂的数量较总样直接筛选筛出的较多，其中段A筛出23种化合物，段B筛出5种化合物，段C筛出14种化合物段，D筛出2种化合物，四段组分共筛出44个化合物，而直接筛选，筛出7个化合物，明显少于分段筛选筛出的数量。
结果与讨论
1.金银花不同提取物的NA抑制活性
金银花中含有多种化学成分，如黄酮类，有机酸类，萜类等。不同极性溶剂提取的成分种类和含量不同，其神经氨酸酶抑制剂活性也不同。通过基于酶标仪的体外测定来评估不同溶剂提取溶剂如H2O，80％乙醇，乙酸乙酯和石油醚提取组分的NA抑制活性。结果如表1所示。
表1.不同提取物的NA抑制活性
Figure BDA0001688340650000101
如表1所示，忍冬不同溶剂提取物中NA抑制活性存在显着差异。其中，80％乙醇提取物(1000mg/L)显示出较强的抗氧化活性，抑制率分别为55.78±1.15％。进一步研究了不同浓度(50,80,100,150,200,300,400,500mg/L)的80％甲醇提取物对神经氨酸酶的抑制作用。结果表明，金银花80％乙醇提取物显示出明显的量效关系。抑制50％神经氨酸酶活性所需的金银花80％乙醇提取物的浓度为745.3±3.37mg/L。因此选择它进行进一步研究，以便从金银花中找到更全面的潜在神经氨酸酶抑制剂。
2.活性化合物鉴别
本研究利用DAD-ESI-TOF/MS对筛选出的神经氨酸酶抑制剂进行了初步鉴别。通过将保留时间(Rt)，紫外光谱，质谱碎片离子与参考文献进行对比，23种具有神经氨酸酶抑制活性的化合物被初步鉴定，结果见表2。
表2.通过ESI-Q-TOF/MS在金银花中鉴定NI的保留时间(Rt)，MS和UV数据
Figure BDA0001688340650000102
Figure BDA0001688340650000111
3.神经氨酸酶抑制活性评价
3.1样品前处理
将0.5g金银花粉和50mL提取溶剂加入塞锥形瓶中，置于超声中25℃超声提取30min，提取液经抽滤后，将滤液减压蒸发至干。加入2mL50％(v/v)的甲醇溶液将残留物复溶，过0.22μm微孔滤膜后在4℃贮存备用。四种提取溶液分别是水，80％乙醇，乙酸乙酯和石油醚。
溶液配制：缓冲液1由含有33mmol/LMES和4mmol/LCaCl2的超纯水制成，其pH为6.5。缓冲液2由含有33mmol/LMES、4mmol/LCaCl2和10％异丙醇的超纯水制成，其pH为6.5。精密称定芹菜素标准品1mg，在容量瓶中定容为1mg/mL的芹菜素标准溶液作为阳性对照。
3.2不同溶剂提取物的活性筛选
酶活筛选试验是通过对以前的方法稍作修改而进行的。本试验需采用TecanM20系列多功能酶标仪和96孔酶标板等材料。首先，将提取物分别稀释至0.05mg/mL和1mg/mL。然后，将50μL金银花、30μL NA溶液(1U/mL)和80μL缓冲液1加入到96孔板中，使总体积为160μL。缓冲液1(pH6.5)含有33mmol/L MES和4mmol/L CaCl2。混匀后将该混合物置于恒温培养箱中，在37℃下恒温孵育30min。在此过程中，在提取物中具有潜在神经氨酸酶抑制活性的化合物将与神经氨酸酶完全键合成大分子复合体，留下单体形式的非活性成分。然后加入NA荧光底物2’-(4-methylumbelliferyl)-D-Nacetylneuraminic acid 20μL，在37℃下恒温孵育1小时，在此反应过程中荧光物质得以释放。然后，在反应体系中加入100μL的终止剂(0.5M甘氨酸，pH10.7)以终止反应。最后，用TecanM20系列酶标仪在激发波长355nm，发射波长为460nm条件下进行测定。对照组用50μL50％(v/v)甲醇代替样品(金银花提取物)。空白组除需用等量的缓冲液代替NA外均与对照组相同。抑制率(％)的计算公式为：(A对比-A样品)/(A对比-A空白)×100，其中A样品、A对照和A空白分别表示实验组、对照组和空白组的荧光吸收值。半数抑制率(IC50)可通过配制六种不同浓度的提取物检测抑制率得出的标准曲线来进行计算。以样品浓度为横坐标，以抑制率为纵坐标绘制标准曲线，计算IC50。通过活性筛选试验，选择最合适的提取溶剂，来进行后续的实验。
3.3神经氨酸酶抑制活性评价
为了验证金银花中筛选出的神经氨酸酶抑制剂的活性，使用体外酶活测定法(表3中显示)评估相关化合物的神经氨酸酶抑制活性(芹菜素为阳性对照)。从表3可以初步推断出，不同类型化合物的神经氨酸酶抑制活性：有机酸类最高，其次是黄酮类，核苷类和环烯醚萜苷类稍低。IC50测定表明这些化合物均具有较好的神经氨酸酶抑制活性，其中异绿原酸B、绿原酸、木犀草素、新绿原酸的IC50值均小于阳性对照芹菜素，表明金银花中含有多种具有神经氨酸酶抑制活性的化学成分。
表3.化合物的NA抑制活性
Figure BDA0001688340650000131
a：浓度为20μg/mL时的抑制率
以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种从金银花中筛选神经氨酸酶抑制剂的方法，其特征在于，步骤如下：
(1)将金银花粉与提取溶剂置于塞式烧瓶中，一定温度下超声提取；将超声后的滤液过滤合并，减压蒸干，用甲醇复溶后，过滤膜备用；
(2)将步骤(1)中制得的样品通过半制备液相色谱系统进行样品分段，将洗脱得到的高组分含量进行合并，得到组分A、组分B、组分C、组分D；(3)
通过高效液相色谱系统对组分A、组分B、组分C、组分D进行梯度洗脱分离，通过质谱仪进行质谱鉴定；所述组分A,组分B,组分C,组分D的液相分离条件如下：
A组：Xbridge Amide，规格为4.6×250mm，3.5μm的色谱柱，洗脱溶剂为A相-含0.8％甲酸，10mM甲酸铵的水和B相-乙腈；梯度洗脱程序为：0min，96％B相；0-5min，96％～93％B相；5-20min，93％～93％B相；20-25min，93％～82％B相；25-30min，82％～82％B相；30-50min，82％～70％B相；50-51min，70％～50％B相；51-60min，50％B相；流速为1.0mL/min，检测波长设为262nm，注射量为10μL；
B组：Symmetry C18，规格为4.6×250mm，5μm的色谱柱，洗脱溶剂为A相-含0.8％甲酸的水和B相-乙腈；梯度洗脱程序为：0min，10％B相；0-5min，10％～13％B相；5-15min，13％～13％B相；5-20min，13％～14％B相；20-45min，14％～19％B相；45-50min，19％～25％B相；50-51min，25％～100％B相；51-60min，100％B相；流速设定为0.8mL/min，检测波长设为280nm，进样量为20μL；
C组：XSELECTTM HSS T3，规格为3×150mm，3.5μm的色谱柱，洗脱溶剂A相-含0.8％甲酸，10mm甲酸铵的水和B相-乙腈；梯度洗脱程序为：0min，14％B相；0-20min，14％-14％B相；20-30min，14％-17％B相；30-45min，17％-23％B相；45-60min，23％-25％B相；60-75min，25％-35％B相；75-85min，35％-100％B相；85-95min，100％B相；流速为0.5mL/min，检测波长设为262nm；进样量为10μL；
D组：kromasil C18，规格为4.6×250mm，5μm的色谱柱，洗脱溶剂为A相-含0.5％甲酸的水和B相-乙腈；梯度洗脱程序为：0min，10％B相；0-15min，10％-20％B相；15-20min，20％-22％B相；20-35min，22％-23％B相；35-45min，23％-50％B相；45-55min，50％-100％B相；55-60min，100％B相；流速设定为0.8mL/min，检测波长设为262nm；进样量为10μL；
质谱扫描条件如下：扫描范围为m/z 50-1500；破碎电压设定为100V，毛细管电压设定为4500V，温度为350℃；高纯氮的流量控制在10.0L/min；所述D组的进样量为2μL，所述A组,B组,C组进样量均为5μL。
2.如权利要求1所述的一种从金银花中筛选神经氨酸酶抑制剂的方法，其特征在于，步骤(1)的具体操作为：将金银花粉和提取溶剂置于塞式烧瓶中，在25℃下控温条件下超声提取30min，重复一次；将超声后的滤液过滤合并，减压蒸干；用50％甲醇复溶，过0.45μm滤膜备用。
3.如权利要求1所述的一种从金银花中筛选神经氨酸酶抑制剂的方法，其特征在于，所述金银花粉：提取溶剂＝10g：1L。
4.如权利要求1所述的一种从金银花中筛选神经氨酸酶抑制剂的方法，其特征在于，步骤(2)的具体操作为：将步骤(1)中制得的样品通过RIGOL-3245半制备液相色谱系统进行样品分段，将洗脱得到的高组分含量进行合并，得到组分A、组分B、组分C、组分D；所述半制备液相色谱系统采用梯度洗脱条件，流动相为：A相-含0.2％甲酸的水和B相-甲醇，流速为3mL/min，检测波长为280nm，进样量为200μL。
5.如权利要求4所述的一种从金银花中筛选神经氨酸酶抑制剂的方法，其特征在于，所述梯度洗脱程序如下：0min，10％B相；0-20min，10％～40％B相；20-30min，40％～60％B相；30-35min，60％～80％B相；35-40min，80％～100％B相；40-50min，100％B相。
6.如权利要求1所述的一种从金银花中筛选神经氨酸酶抑制剂的方法，其特征在于，步骤(3)的具体操作为：采用Agilent1260高效液相色谱系统完成对组分A、组分B、组分C、组分D进行梯度洗脱分离，所述质谱仪为ESI-Q-TOF质谱仪。
7.如权利要求1所述的一种从金银花中筛选神经氨酸酶抑制剂的方法，其特征在于，所述提取试剂为水，80％乙醇，乙酸乙酯和石油醚。
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