CN109270179B - 一种筛选麦冬中iNOS抑制剂的方法及筛选所得iNOS抑制剂 - Google Patents

一种筛选麦冬中iNOS抑制剂的方法及筛选所得iNOS抑制剂 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种筛选麦冬中iNOS抑制剂的方法及筛选所得iNOS抑制剂。首先，经过分子对接及化学纯品iNOS抑制实验验证，本发明公开的筛选方法可以有效、可靠地筛选得到麦冬中具有iNOS抑制活性的化合物，包括：Pennogenin‑3‑O‑α‑L‑rhamnopyranosyl‑(1→2)‑β‑D‑xylopyranosyl‑(1→4)‑β‑D‑glucopyranoside、麦冬黄烷酮A、甲基麦冬黄烷酮A、甲基麦冬黄烷酮B、麦冬皂苷D和麦冬皂苷D′；其次，从另一个角度，本发明公开的方法可以用于靶向富集麦冬中的上述iNOS抑制剂；再次，麦冬中的上述化学成分为首次被发现具有iNOS抑制活性，因而可以制备成iNOS抑制剂用于治疗高血压、神经变性、类风湿性关节炎、结肠炎、癌症等NO过量引起的疾病。

Description

一种筛选麦冬中iNOS抑制剂的方法及筛选所得iNOS抑制剂
技术领域
本发明属于医药领域，涉及中药活性成分筛选发现，具体涉及一种筛选麦冬中iNOS抑制剂的方法及筛选所得iNOS抑制剂。
背景技术
一氧化氮(NO)是体内一种重要的生物信号分子，参与调节多种生理病理过程，如神经传导、血压调节以及免疫反应等。内源性NO的主要来源是一氧化氮合酶。一氧化氮合酶(NOS)的主要功能是催化L-精氨酸生成NO和L-瓜氨酸。根据其分布部位的不同被分为三种类型：神经型(nNOS)、内皮型(eNOS)和诱导型(iNOS)。nNOS和eNOS均为组成型，它们具有Ca2+依赖性。而iNOS则为诱导型，需要刺激且无Ca2+依赖性。iNOS在激活状态下可大量产生NO，其产量远远大于nNOS和eNOS产生的NO。过量的NO会引起DNA损伤、线粒体呼吸抑制等，从而参与疾病的病理过程，包括高血压，神经变性，类风湿性关节炎，结肠炎，癌症等。现代研究表明，通过抑制iNOS来预防NO的过量产生可能是治疗这些疾病的潜在策略。目前的研究表明，iNOS抑制剂多为合成药物，而合成药物多会导致不良反应，因此，寻找天然的iNOS抑制剂对于新药的研发具有一定的指导意义。
中药作为中华民族防病治病的物质基础，具有中医药理论和大量的临床实践作为支撑，其来源广泛，资源丰富，是新药研发的重要来源之一。同时，人们越来越关注从中药中筛选高效酶抑制剂。因此，从中药中筛选iNOS抑制剂具有重要价值。
中药麦冬(Ophiopogonjaponicus(Thunb.)Ker-Gawl.)是百合科沿阶草属多年生常绿草本植物麦冬的干燥块根。其性微寒，味甘、微苦，归心、肺、胃经。麦冬作为一种传统中药，已被广泛用于治疗炎症和心血管疾病。
发明内容
本发明旨在提供一种筛选麦冬中iNOS抑制剂的方法及筛选所得iNOS抑制剂。
本发明上述目的通过如下技术方案实现：
一种筛选麦冬中iNOS抑制剂的方法，包括如下步骤：
(1)称取麦冬药材粉末，甲醇提取，过滤，滤液减压浓缩至干，再以水溶解，使用SPE固相萃取柱层析分离，依次以水、20％甲醇-水溶液、甲醇洗脱，收集甲醇洗脱液真空干燥，最后加DMSO复溶得到麦冬样品液，贮存备用；
(2)将麦冬样品液/HEPES缓冲液/诱导型一氧化氮合酶溶液按照体积比1:94:5混合，孵育，之后将混合液加入10KD超滤离心管中，超滤离心，再用50mM醋酸铵缓冲液洗涤，然后将膜上残留部分转入新的超滤离心管中，70％甲醇-水溶液超声后超滤离心，收集滤液，滤液真空干燥，有机溶剂复溶，过滤，此滤液为样品液；
(3)在步骤(2)相同的条件下，将等量失活的诱导型一氧化氮合酶溶液与含麦冬样品液的HEPES缓冲液混合后孵育，同法处理并获取滤液，作为空白滤液；
(4)将步骤(2)、(3)获得的样品液、空白滤液分别通过高效液相色谱-质谱联用技术检测，样品液中浓度显著高于空白滤液中浓度的化合物即为麦冬中iNOS抑制剂。
优选地，步骤(1)用甲醇超声提取。
优选地，步骤(1)真空干燥温度为45℃。
优选地，步骤(2)于37℃水浴恒温孵育45min。
优选地，步骤(2)12000×g、4℃、超滤离心10min。
优选地，步骤(2)用50mM醋酸铵缓冲液洗3次。
优选地，步骤(2)真空干燥温度为45℃。
优选地，步骤(2)复溶的有机溶剂为甲醇。
一种靶向富集麦冬中iNOS抑制剂的方法，包括如下步骤：
(1)称取麦冬药材粉末2.0g，50mL甲醇溶液超声提取，过滤，滤液减压浓缩至干，再以5mL水溶解，使用SPE固相萃取柱层析分离，依次以5mL水、5mL 20％甲醇-水溶液、5mL甲醇洗脱，收集甲醇洗脱液45℃真空干燥，最后加DMSO复溶得到麦冬样品液，贮存备用；
(2)取2μL麦冬样品液加入188μL HEPES缓冲液，再加入10μL诱导型一氧化氮合酶溶液，得混合液体积200μL，37℃水浴恒温孵育45min，之后将混合液加入10KD超滤离心管中，12000×g、4℃、超滤离心10min，再用50mM醋酸铵缓冲液洗涤三次，每次200μL，然后将膜上残留部分转入新的超滤离心管中，70％甲醇-水溶液超声后超滤离心，收集滤液，滤液45℃真空干燥，即得富集有麦冬中iNOS抑制剂的提取物；
所述iNOS抑制剂包括Pennogenin-3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-β-D-xylopyranosyl-(1→4)-β-D-glucopyranoside、麦冬黄烷酮A、甲基麦冬黄烷酮A、甲基麦冬黄烷酮B、麦冬皂苷D和麦冬皂苷D′。
Pennogenin-3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-β-D-xylopyranosyl-(1→4)-β-D-glucopyranoside、麦冬黄烷酮A、甲基麦冬黄烷酮A、甲基麦冬黄烷酮B、麦冬皂苷D或麦冬皂苷D′用于制备iNOS抑制剂的用途。
Pennogenin-3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-β-D-xylopyranosyl-(1→4)-β-D-glucopyranoside、麦冬黄烷酮A、甲基麦冬黄烷酮A、甲基麦冬黄烷酮B、麦冬皂苷D或麦冬皂苷D′用于制备治疗NO过量引起的疾病的药物的用途，NO过量引起的疾病包括：高血压、神经变性、类风湿性关节炎、结肠炎、癌症。
有益效果：首先，经过分子对接及化学纯品iNOS抑制实验验证，本发明公开的筛选方法可以有效、可靠地筛选得到麦冬中具有iNOS抑制活性的化合物，包括：Pennogenin-3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-β-D-xylopyranosyl-(1→4)-β-D-glucopyranoside、麦冬黄烷酮A、甲基麦冬黄烷酮A、甲基麦冬黄烷酮B、麦冬皂苷D和麦冬皂苷D′；其次，从另一个角度，本发明公开的方法可以用于靶向富集麦冬中的上述iNOS抑制剂；再次，麦冬中的上述化学成分为首次被发现具有iNOS抑制活性，因而可以制备成iNOS抑制剂用于治疗高血压、神经变性、类风湿性关节炎、结肠炎、癌症等NO过量引起的疾病。
附图说明
图1为麦冬药材提取液的HPLC-MS图谱；
图2为麦冬药材中与诱导型一氧化氮合酶亲和吸附成分(实线)及非特异性吸附成分(虚线)的HPLC-MS图谱。
具体实施方式
下面结合附图和实施例具体介绍本发明实质性内容，但并不以此限定本发明的保护范围。
实施例1：一种筛选麦冬中iNOS抑制剂的方法
一、实验仪器及试剂
高效液相色谱-荧光检测联用仪(日本岛津公司)；高效液相色谱-Q-TOF-质谱联用仪(美国安捷伦公司)；低温高速离心机(美国赛默飞世尔科技公司)；超纯水处理系统(美国Millipore公司)；超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)；真空干燥箱(上海合恒仪器设备有限公司)。
超滤离心管(美国颇尔)；SupelcleanTM ENVITM-18SPE固相萃取柱(3mL)(美国Sigma)；麦冬药材购自浙江慈溪(经中国药科大学中药学院戚进教授鉴定，确认为来源于百合科沿阶草属植物麦冬的干燥块根)；麦冬皂苷D、麦冬皂苷D′、麦冬黄烷酮A、甲基麦冬黄烷酮A、甲基麦冬黄烷酮B和Pennogenin-3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-β-D-xylopyranosyl-(1→4)-β-D-glucopyranoside均来源于实验室提取分离获得(纯度>98％)；诱导型一氧化氮合酶、1400W、N-乙酰-L-半胱氨酸、HEPES、L-精氨酸、L-瓜氨酸均购自美国Sigma公司；色谱级甲醇；色谱级乙腈；色谱级甲酸；色谱级三氟乙酸；超纯水；其他试剂均为分析纯。
二、实验方法
1、麦冬提取液的制备
麦冬药材，粉碎，过60目筛，精密称取粉末2.0g，50mL甲醇溶液超声提取(25℃，30min)，抽滤，滤液减压旋转蒸发至干，提取物以5mL水溶解，并使用SPE固相萃取柱层析分离，依次以5mL水、5mL 20％甲醇-水溶液、5mL甲醇洗脱，收集甲醇洗脱液45℃真空干燥，最后加DMSO复溶得到麦冬样品液，贮存备用。
2、利用iNOS筛选麦冬中与iNOS具有亲和吸附作用的活性成分
(1)取2μL上述步骤所得麦冬样品液加入188uLHEPES缓冲液(pH 7.4,50mM)，再加入10μL诱导型一氧化氮合酶溶液，得混合液体积200μL，37℃水浴恒温孵育45min，让提取物与酶充分作用，得样品混合液；同时，将等量失活的诱导型一氧化氮合酶加入含麦冬样品液的HEPES缓冲液中，同法操作制备空白对照样品混合液。
(2)将上述混合液加入超滤离心管(10,000MW)中，12000×g，4℃，超滤离心10min，弃去上清液以除去未与iNOS亲和吸附的麦冬成分；膜上沉淀进行下一步操作。
(3)向膜上沉淀中加入50mM醋酸铵缓冲液，12000×g，4℃，超滤离心10min，弃去上清液，如此洗涤三次，每次200μL，充分洗去弱亲和吸附的麦冬成分。
(4)然后将膜上残留部分转入新的超滤离心管中，70％甲醇-水溶液超声15min后超滤离心，分别收集滤液，滤液45℃真空干燥，纯甲醇复溶，过0.22μm微孔滤膜，收集样品滤液和空白滤液。
(5)将样品液和空白液分别通过液质联用仪进行检测，比较各峰峰面积，并对具有差异的峰进行化学结构结构鉴定。
3、高效液相色谱-质谱联用检测
分析条件如下：Agilent ZORBAX SB-C18(5um,4.6×250mm)色谱柱；流动相：A相：乙腈-甲醇(7:3)，B相：0.1％甲酸水，梯度洗脱，洗脱梯度见表1。流速：1mL/min；柱温：30℃；检测波长：290nm。质谱采用负离子模式扫描检测；离子源为ESI；氮气流速为9.0L/min，温度为350℃；雾化压力为45psi；毛细管电压为4000V；扫描电压为65V；碰撞能为30V；质量范围m/z：100-2000units。数据采集及处理软件为Agilent B.04.00Mass Hunterqualitativeanalysis workstation。
表1液相洗脱梯度
Figure BDA0001837521530000041
Figure BDA0001837521530000051
4、麦冬潜在活性成分的诱导型一氧化氮合酶抑制活性检测
(1)反相高效液相色谱-荧光检测，分析条件如下：InertSustain C18column(4.6×150mm,5μm)色谱柱；流动相：A相：50％乙腈-水，B相：5％乙腈-15mM硼酸缓冲液-0.1％三氟乙酸(pH 9.4)，梯度洗脱，洗脱梯度见表2；流速：1mL/min；柱温：35℃；激发波长：448nm，发射波长：335nm。
表2液相洗脱梯度
时间(min) A相比例(％)
0 0
10 10
15 10
20 70
25 70
(2)80μL HEPES缓冲液(pH 7.4)(包含1mM DTT，0.5mg/mL BSA，10μM FMN，10μMFAD，30μM BH4，20μM L-精氨酸)，10μL iNOS(1.25U/mL)，10μL麦冬潜在活性成分溶液，混匀，室温预孵育15min，再加入10μL 8mM NADPH以触动反应，37℃水浴共孵育20min，最后加入600μL冰乙腈终止反应，再45℃真空干燥，得酶活检测样品，-20℃贮存，备用。以1400W(已知的iNOS抑制剂)作为阳性对照。
酶活检测样品用600μL超纯水复溶，3500×g离心20min，取上清190μL与60μL邻苯二甲醛/N-乙酰-L-半胱氨酸溶液(摩尔比1:3，pH 9.3±0.05)进行衍生化5min，混合液通过上述(1)进行检测。L-瓜氨酸的峰面积作为iNOS活性指标，抑制率(％)是根据公式计算：
抑制率(％)＝(PAcontrol-PAsample)/(PAcontrol-PAblank)×100
其中，PAsample代表样品组的L-瓜氨酸的峰面积；PAcontrol代表对照组(不加样品)的L-瓜氨酸的峰面积；PAblank代表空白组(不加NADPH)的L-瓜氨酸的峰面积。
5、分子对接
利用Sybyl 6.9分子设计软件构建目标化合物的三维结构，再通过薛定谔软件包对目标化合物与酶进行分子对接。
三、实验结果
1、麦冬中活性成分的化学信息
通过HPLC-Q-TOF-MS/MS在线检测，对比对照品并结合质谱谱图的碎片解析，共鉴定出7个化学成分。结果见表3。这些化合物与iNOS的相互作用均为首次报道。
表3麦冬中与iNOS亲和吸附的活性成分的结构鉴定
Figure BDA0001837521530000061
a代表与对照品对比鉴定的化合物
2、麦冬中活性成分的诱导型一氧化氮合酶抑制活性
通过对不同浓度的麦冬中能与诱导型一氧化氮合酶亲和吸附的活性成分进行抑制活性检测，并计算其IC50，如表4所示，麦冬中的3种皂苷类成分及3种高异黄酮类成分均对诱导型一氧化氮合酶表现出抑制活性，且呈浓度依赖性，其中皂苷类成分的抑制活性均高于高异黄酮类成分，麦冬皂苷D′的抑制作用最强，其半数抑制浓度IC50为22.65μM。阳性对照1400W具有较强的抑制作用，其半数抑制浓度IC50为0.10μM，这与文献报道近视，从而证明该活性检测方法的可靠性。活性验证的结果也表明本方法的筛选结果可靠。
表4麦冬中活性成分对诱导型一氧化氮合酶的活性抑制
Figure BDA0001837521530000071
3、分子对接
分子对接结果如表5所示，分子对接结果显示，所筛选出的6个活性成分均能与诱导型一氧化氮合酶亲和作用，其对接综合打分Docking score及Emodel提示，麦冬皂苷类成分的活性强于高异黄酮类成分，其结果与活性抑制的结果相一致。
表5分子对接结果
Figure BDA0001837521530000072
Figure BDA0001837521530000081
上述实验结果表明，经过分子对接及化学纯品iNOS抑制实验验证，本发明公开的筛选方法可以有效、可靠地筛选得到麦冬中具有iNOS抑制活性的化合物，包括：Pennogenin-3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-β-D-xylopyranosyl-(1→4)-β-D-glucopyranoside、麦冬黄烷酮A、甲基麦冬黄烷酮A、甲基麦冬黄烷酮B、麦冬皂苷D和麦冬皂苷D′。
实施例2：一种靶向富集麦冬中iNOS抑制剂的方法
包括如下步骤：
步骤1、麦冬提取液的制备
麦冬药材，粉碎，过60目筛，精密称取粉末2.0g，50mL甲醇溶液超声提取(25℃，30min)，抽滤，滤液减压旋转蒸发至干，提取物以5mL水溶解，并使用SPE固相萃取柱层析分离，依次以5mL水、5mL 20％甲醇-水溶液、5mL甲醇洗脱，收集甲醇洗脱液45℃真空干燥，最后加DMSO复溶得到麦冬样品液，贮存备用。
步骤2、利用iNOS靶向富集麦冬中与iNOS具有亲和吸附作用的活性成分，即：Pennogenin-3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-β-D-xylopyranosyl-(1→4)-β-D-glucopyranoside、麦冬黄烷酮A、甲基麦冬黄烷酮A、甲基麦冬黄烷酮B、麦冬皂苷D和麦冬皂苷D′
(1)取2μL上述步骤所得麦冬样品液加入188uLHEPES缓冲液(pH 7.4,50mM)，再加入10μL诱导型一氧化氮合酶溶液，得混合液体积200μL，37℃水浴恒温孵育45min，让提取物与酶充分作用，得样品混合液。
(2)将上述混合液加入超滤离心管(10,000MW)中，12000×g，4℃，超滤离心10min，弃去上清液以除去未与iNOS亲和吸附的麦冬成分；膜上沉淀进行下一步操作。
(3)向膜上沉淀中加入50mM醋酸铵缓冲液，12000×g，4℃，超滤离心10min，弃去上清液，如此洗涤三次，每次200μL，充分洗去弱亲和吸附的麦冬成分。
(4)然后将膜上残留部分转入新的超滤离心管中，70％甲醇-水溶液超声15min后超滤离心，分别收集滤液，滤液45℃真空干燥，纯甲醇复溶，过0.22μm微孔滤膜，收集滤液。
图1为上述步骤1所得麦冬药材提取液的HPLC-MS图谱；图2中实线为步骤2靶向富集所得滤液的HPLC-MS图谱。图1、图2对比可知，上述方法有效地靶向富集了麦冬药材中的iNOS抑制剂，包括：Pennogenin-3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-β-D-xylopyranosyl-(1→4)-β-D-glucopyranoside、麦冬黄烷酮A、甲基麦冬黄烷酮A、甲基麦冬黄烷酮B、麦冬皂苷D和麦冬皂苷D′。
实施例3：Pennogenin-3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-β-D-xylopyranosyl-(1→4)-β-D-glucopyranoside、麦冬黄烷酮A、甲基麦冬黄烷酮A、甲基麦冬黄烷酮B、麦冬皂苷D和麦冬皂苷D′用作iNOS抑制剂的用途
本发明发现，Pennogenin-3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-β-D-xylopyranosyl-(1→4)-β-D-glucopyranoside、麦冬黄烷酮A、甲基麦冬黄烷酮A、甲基麦冬黄烷酮B、麦冬皂苷D、麦冬皂苷D′为有效的iNOS抑制剂，各化合物的IC50值已记载在实施例1中。本领域技术人员知道，iNOS抑制剂可以用于治疗多种NO过量引起的疾病，如高血压、神经变性、类风湿性关节炎、结肠炎、癌症(参考文献：诱导型一氧化氮合酶抑制剂的研究进展，中国药物化学杂志，2017年12月第27卷第6期)，所以，Pennogenin-3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-β-D-xylopyranosyl-(1→4)-β-D-glucopyranoside、麦冬黄烷酮A、甲基麦冬黄烷酮A、甲基麦冬黄烷酮B、麦冬皂苷D或麦冬皂苷D′可以开发成治疗NO过量引起的疾病的药物。
综上，首先，经过分子对接及化学纯品iNOS抑制实验验证，本发明公开的筛选方法可以有效、可靠地筛选得到麦冬中具有iNOS抑制活性的化合物，包括：Pennogenin-3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-β-D-xylopyranosyl-(1→4)-β-D-glucopyranoside、麦冬黄烷酮A、甲基麦冬黄烷酮A、甲基麦冬黄烷酮B、麦冬皂苷D和麦冬皂苷D′；其次，从另一个角度，本发明公开的方法可以用于靶向富集麦冬中的上述iNOS抑制剂；再次，麦冬中的上述化学成分为首次被发现具有iNOS抑制活性，因而可以制备成iNOS抑制剂用于治疗高血压、神经变性、类风湿性关节炎、结肠炎、癌症等NO过量引起的疾病。
上述实施例的作用在于具体介绍本发明的实质性内容，但本领域技术人员应当知道，不应将本发明的保护范围局限于该具体实施例。

Claims (10)

1.一种筛选麦冬中iNOS抑制剂的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)称取麦冬药材粉末，甲醇提取，过滤，滤液减压浓缩至干，再以水溶解，使用SPE固相萃取柱层析分离，依次以水、20％甲醇-水溶液、甲醇洗脱，收集甲醇洗脱液真空干燥，最后加DMSO复溶得到麦冬样品液，贮存备用；
(2)将麦冬样品液/HEPES缓冲液/诱导型一氧化氮合酶溶液按照体积比1:94:5混合，孵育，之后将混合液加入10KD超滤离心管中，超滤离心，再用50mM醋酸铵缓冲液洗涤，然后将膜上残留部分转入新的超滤离心管中，70％甲醇-水溶液超声后超滤离心，收集滤液，滤液真空干燥，有机溶剂复溶，过滤，此滤液为样品液；
(3)在步骤(2)相同的条件下，将等量失活的诱导型一氧化氮合酶溶液与含麦冬样品液的HEPES缓冲液混合后孵育，同法处理并获取滤液，作为空白滤液；
(4)将步骤(2)、(3)获得的样品液、空白滤液分别通过高效液相色谱-质谱联用技术检测，样品液中浓度显著高于空白滤液中浓度的化合物即为麦冬中iNOS抑制剂；
所述iNOS抑制剂包括Pennogenin-3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-β-D-xylopyranosyl-(1→4)-β-D-glucopyranoside、麦冬黄烷酮A、甲基麦冬黄烷酮A、甲基麦冬黄烷酮B、麦冬皂苷D和麦冬皂苷D′；
其中，步骤(4)中所述高效液相色谱-质谱联用技术的参数如下：
高效液相色谱分析条件：Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱，柱长250mm、内径4.6mm、填料粒径5μm；流动相：A相：体积比为7:3的乙腈-甲醇，B相：0.1％甲酸水，梯度洗脱，洗脱梯度如下；流速：1mL/min；柱温：30℃；检测波长：290nm；
Figure FDA0002569937290000011
Figure FDA0002569937290000021
质谱采用负离子模式扫描检测；离子源为ESI；氮气流速为9.0L/min，温度为350℃；雾化压力为45psi；毛细管电压为4000V；扫描电压为65V；碰撞能为30V；质量范围m/z：100-2000units。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(1)真空干燥温度为45℃。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(2)于37℃水浴恒温孵育45min。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(2)12000×g、4℃、超滤离心10min。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(2)用50mM醋酸铵缓冲液洗3次。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(2)真空干燥温度为45℃。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(2)复溶的有机溶剂为甲醇。
8.一种靶向富集麦冬中iNOS抑制剂的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)称取麦冬药材粉末2.0g，50mL甲醇溶液超声提取，过滤，滤液减压浓缩至干，再以5mL水溶解，使用SPE固相萃取柱层析分离，依次以5mL水、5mL 20％甲醇-水溶液、5mL甲醇洗脱，收集甲醇洗脱液45℃真空干燥，最后加DMSO复溶得到麦冬样品液，贮存备用；
(2)取2μL麦冬样品液加入188μL HEPES缓冲液，再加入10μL诱导型一氧化氮合酶溶液，得混合液体积200μL，37℃水浴恒温孵育45min，之后将混合液加入10KD超滤离心管中，12000×g、4℃、超滤离心10min，再用50mM醋酸铵缓冲液洗涤三次，每次200μL，然后将膜上残留部分转入新的超滤离心管中，70％甲醇-水溶液超声后超滤离心，收集滤液，滤液45℃真空干燥，即得富集有麦冬中iNOS抑制剂的提取物；
所述iNOS抑制剂包括Pennogenin-3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-β-D-xylopyranosyl-(1→4)-β-D-glucopyranoside、麦冬黄烷酮A、甲基麦冬黄烷酮A、甲基麦冬黄烷酮B、麦冬皂苷D和麦冬皂苷D′。
9.Pennogenin-3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-β-D-xylopyranosyl-(1→4)-β-D-glucopyranoside、麦冬皂苷D或麦冬皂苷D′用于制备iNOS抑制剂的用途。
10.Pennogenin-3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-β-D-xylopyranosyl-(1→4)-β-D-glucopyranoside、麦冬皂苷D或麦冬皂苷D′用于制备治疗NO过量引起的疾病的药物的用途，NO过量引起的疾病包括：高血压、神经变性、类风湿性关节炎、结肠炎、癌症。
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