CN102735782A - 一种筛选α-葡萄糖苷酶抑制剂的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及分析化学领域，提供了一种筛选α-葡萄糖苷酶抑制剂的方法。该方法将α-葡萄糖苷酶与备检样品孵育，通过超滤薄膜，收集滤渣，加入甲醇-水的混合溶液，超速离心后收集滤液，液相色谱-质谱联用技术分离鉴定得到α-葡萄糖苷酶抑制剂。基于超滤质谱技术，本发明提供的方法灵敏度高、检测迅速、目标受体α-葡萄糖苷酶可以重复利用，适于高通量筛选α-葡萄糖苷酶抑制剂。
Description
技术领域
本发明涉及分析化学领域，特别涉及一种筛选α-葡萄糖苷酶抑制剂的方法。
背景技术
糖尿病是一种多病因引起、以高血糖为特征的内分泌代谢紊乱性疾病。高血糖是由胰岛素分泌不足、胰岛素抵抗或二者共同存在引起的。世界上，糖尿病患者已超过1.7亿，已成为继心血管疾病和肿瘤之后第三大严重威胁人类健康的非传染性疾病。临床上，根据糖尿病发病机制不同，主要分为I型糖尿病(胰岛素依赖型)和II型糖尿病(非胰岛素依赖型)，我国以II型居多。治疗II型糖尿病的药物主要分为：胰岛素及类似物：如赖脯胰岛素等；促胰岛素分泌剂：如磺酰脲类；胰岛素增敏剂：如噻唑烷类衍生物；α-葡萄糖苷酶抑制剂等。
α-葡萄糖苷酶是一种在机体代谢过程中起关键作用的酶，与许多因代谢紊乱失调引起的疾病密切相关。α-葡萄糖苷酶主要由唾液和胰液中α-淀粉酶及小肠刷状缘上皮细胞上的麦芽糖酶、异麦芽糖酶、α-临界糊精酶、蔗糖酶和乳糖酶等组成。食物中的碳水化合物，如淀粉先经α-淀粉酶水解成麦芽糖、麦芽三糖、异麦芽糖和α-临界糊精等，食物在口腔中停留时间短，所以该过程主要在小肠内进行。而后寡糖经小肠刷状缘上皮细胞上各种酶的作用生成葡萄糖及其他单糖，再经小肠黏膜细胞吸收而被机体利用。II型糖尿病患者因胰岛素分泌不足、胰岛素抵抗或二者的共同作用，血液中的葡萄糖进入肝、肌肉和脂肪等组织细胞及在细胞内的氧化利用发生障碍，同时，肝糖输出增多导致高血糖。由于血糖水平超过肾小管吸收葡萄糖的能力，部分血糖随尿排出而形成糖尿病。因此，可以通过降低α-葡萄糖苷酶活性，限制或延缓碳水化合物在消化道内分解为糖类的速度，达到预防和治疗这类疾病的目的。α-葡萄糖苷酶抑制剂的结构类似寡糖，能够与寡糖竞争α-葡萄糖苷酶的结合位点，与α-葡萄糖苷酶结合，抑制酶的活性，减少寡糖分解，从而延缓肠道对单糖特别是葡萄糖吸收，避免了餐后可能发生的血糖过高。与胰岛素及其他口服降糖药相比，α-葡萄糖苷酶抑制剂的显著特点是能有效地阻止糖尿病患者餐后血糖升高，使血糖维持在一定水平。
目前，国内外在α-葡萄糖苷酶抑制剂的研究方面，主要是以对硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷(PNPG)为底物，考察样品对α-葡萄糖苷酶的抑制情况。该方法只能得出样品是否有活性及抑制性的强弱，无法得到活性成分的结构信息。如果要得到具有抑制活性成分的结构信息，还需要进行反复的分离纯化，工艺复杂，且该方法不能高通量地检测活性成分。
发明内容
有鉴于此，本发明提供一种筛选α-葡萄糖苷酶抑制剂的方法。该方法根据受体-配体亲和反应原理，从备检样品中筛选到能够与受体α-葡萄糖苷酶结合的配体，经超滤、液相色谱-质谱联用技术检测，得到α-葡萄糖苷酶抑制剂。该方法灵敏度高、检测迅速、目标受体α-葡萄糖苷酶可以重复利用，适于高通量筛选α-葡萄糖苷酶抑制剂。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种筛选α-葡萄糖苷酶抑制剂的方法，将备检样品与α-葡萄糖苷酶孵育，α-葡萄糖苷酶与备检样品中的活性成分发生亲和反应，通过截留分子量为10000Da的超滤薄膜，收集滤渣，经体积比为1∶1的甲醇-水的混合溶液洗脱，超速离心后收集滤液，通过液相色谱-质谱联用技术进行分离鉴定。
超滤和高效液相色谱-质谱技术联用主要是利用亲和原理，使备选样品中活性成分的混合物与α-葡萄糖苷酶混合，得到α-葡萄糖苷酶-活性成分复合物和未结合的小分子，通过超滤薄膜将未结合的小分子滤除后，上述复合物用有机溶剂处理，将活性成分释放出来，通过高效液相色谱-质谱联用技术，对这些活性成分进行分离和鉴别。
为了验证筛选得到的α-葡萄糖苷酶抑制剂对α-葡萄糖苷酶的抑制活性，本发明提供的方法还包括对α-葡萄糖苷酶抑制活性的检测。
将备检样品与α-葡萄糖苷酶孵育发生亲和反应时，可以将α-葡萄糖苷酶用pH值为6.8的10mmol/L的醋酸铵缓冲液配制成10mmol/L的α-葡萄糖苷酶标准溶液。
作为优选，备检样品可以包含天然产物提取物或中药复方提取物。
优选地，备检样品可以选自黄连地黄提取物、刺五加叶提取物、银杏叶提取物、黄芩提取物。
备检样品的制备可以取原料用乙醇溶液回流提取，合并提取液，浓缩得浸膏；称取上述浸膏用双蒸水悬浮，有机溶剂萃取，分离有机溶剂相和水相；合并水相备用；合并有机溶剂萃取物，蒸除其中的有机溶剂，得到干膏状有机溶剂相样品，备用；蒸除萃取后的水相部分中溶解的少量有机溶剂，用打孔树脂柱层析分离，依次用水和乙醇溶液为流动相洗脱，弃去水洗部分，蒸除乙醇溶液洗脱部分的溶剂，得干膏状样品备用；合并上述干膏状有机溶剂相样品盒干膏状样品，制得上述备检样品，发生亲和反应时，可以用pH值为6.8的10mmol/L的醋酸铵缓冲液稀释成10mmol/L或20mmol/L。
作为优选，将过量备检样品与α-葡萄糖苷酶混合发生亲和反应。
优选地，备检样品与α-葡萄糖苷酶的摩尔比为2∶1。
作为优选，孵育条件为在37℃下孵育15～30min。
优选地，孵育条件为在37℃下孵育30min。
作为优选，本发明中超速离心的条件为10000g离心10～15min。
作为优选，超滤、高速离心后，超滤薄膜用pH值为6.8、10mmol/L的醋酸溶液离心清洗。
优选地，超滤、高速离心后，超滤薄膜用pH值为6.8、10mmol/L的醋酸溶液离心清洗三次，每次用70～100μL的10mmol/L的醋酸溶液洗去未结合的小分子物质。
作为优选，甲醇-水的混合溶液pH值为3.3。
优选地，用10mmol/L的醋酸溶液洗去未结合的小分子物质后，再向滤膜中加入70～100μL甲醇-水的混合溶液，离心力为10000g下离心10～15min，重复3次，收集滤液，冷冻干燥后用40～60μL甲醇-水的混合溶液溶解，进行高效液相色谱-质谱联用测定。
作为优选，在从备选样品黄连地黄提取物中筛选α-葡萄糖苷酶抑制剂时，高效液相色谱的检测条件可以为：
色谱柱：Dikma Diamonsil C18色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)；流动相：乙腈(A)和水(B)；梯度洗脱程序：0～5min，15％A～20％A；5～20min，20％A～25％A；20～25min，25～90％A；流速：0.5mL/min；进样量：10μL。
质谱的检测条件可以为：
采用正离子电离模式，扫描范围：m/z 100-800，实验前质量数均经过校正。喷雾电压为5.0kV，金属加热毛细管温度250℃，金属毛细管电压5V，壳气流速50arbitrary，辅助气流速10arbitrary。最大注入时间为200ms。
作为优选，在从备选样品刺五加叶提取物中筛选α-葡萄糖苷酶抑制剂时，高效液相色谱的检测条件可以为：
色谱柱：Dikma Diamonsil C18色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)；流动相：乙腈(A)和0.5％醋酸(B)；梯度洗脱程序：t＝0min，16％A(84％B)；t＝0～14min，16％A(84％B)；t＝14～30min，16～40％A(84～60％B)；柱温28℃，流速：0.5mL/min；进样量：10μL。
质谱的检测条件可以为：
电喷雾负离子模式，喷雾电压5.0kV，金属毛细管电压5V，金属毛细管加热温度230℃，壳气流速50arbitrary，辅助气流速10arbitrary，扫描范围m/z 100～1000。
作为优选，在从备选样品黄芩提取物中筛选α-葡萄糖苷酶抑制剂时，高效液相色谱的检测条件可以为：
色谱柱：Dikma Diamonsil C18色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)；流动相：(A)0.5％乙酸水溶液；(B)乙腈；梯度洗脱程序：0～20min，15％A～15％B；20～30min，15％～35％B；30～40min，35％～60％B；40～50min，60％～100％B；流速：0.5mL/min；检测波长：254nm；进样量：20μL。
质谱的检测条件可以为：
Agilent RRLC-Q-TOF 6520质谱仪，采用负离子电离模式，扫描范围：m/z 50～1500，实验前质量数均经过校正。干燥气温度：350℃，气体流速：8L/min，喷雾电压：3500V。碰撞气电压：20-55V。
作为优选，在从备选样品银杏叶提取物中筛选α-葡萄糖苷酶抑制剂时，高效液相色谱的检测条件可以为：
色谱柱：Dikma Diamonsil C18色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)；流动相：(A)0.5％乙酸水溶液；(B)乙腈；梯度洗脱程序：0～40min，17％～33％B；40～90min，33％～50％B；90～120min，50％～70％B；流速：0.5mL/min；检测波长：254nm；进样量：20μL。
质谱的检测条件可以为：
采用负离子电离模式，扫描范围：m/z 50～2000，实验前质量数均经过校正。喷雾电压为5.0kV，毛细管温度230℃，毛细管电压5V，壳气为N2，流速50arbitrary。
本发明提供的筛选α-葡萄糖苷酶抑制剂的方法还包括设空白对照组，空白样品可以为不加α-葡萄糖苷酶，终浓度10mmol/L的醋酸铵缓冲液。
本发明还提供了药根碱、黄连碱、巴马汀、小檗碱、芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮苷、1，4-二咖啡酰奎宁酸、1，5-二咖啡酰奎宁酸、4，5-二咖啡酰奎宁酸、黄芩苷、Oroxylin-A-7-O Glu acid、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、木蝴蝶素A、槲皮素、芹黄素或山奈酚在制备α-葡萄糖苷酶抑制剂中的应用。
本发明提供了一种筛选α-葡萄糖苷酶抑制剂的方法，利用亲和反应中配体-受体特异性结合的原理，采用超滤质谱联用技术，从天然产物提取物或中药复方提取物中筛选得到α-葡萄糖苷酶抑制剂，灵敏度高，每次分析仅需5μmol的α-葡萄糖苷酶和备检样品中的活性成分；检测迅速，只需要很短时间就可以从备检样品中快速检测出α-葡萄糖苷酶抑制剂；目标受体α-葡萄糖苷酶可以重复利用；能够在一次试验中检测到多个α-葡萄糖苷酶抑制剂，适于高通量筛选α-葡萄糖苷酶抑制剂。
附图说明
图1示实施例1中空白样品与黄连地黄提取物孵育、超滤后的高效液相色谱图。其中，峰3示药根碱，峰4示黄连碱，峰5示巴马汀，峰6示小檗碱。
图2示实施例1中α-葡萄糖苷酶样品与黄连地黄提取物孵育、超滤后的高效液相色谱图。其中，峰3示药根碱，峰4示黄连碱，峰5示巴马汀，峰6示小檗碱。
图3示实施例1中筛选得到的α-葡萄糖苷酶抑制剂药根碱的质谱图。
图4示实施例1中筛选得到的α-葡萄糖苷酶抑制剂黄连碱的质谱图。
图5示实施例1中筛选得到的α-葡萄糖苷酶抑制剂巴马汀的质谱图。
图6示实施例1中筛选得到的α-葡萄糖苷酶抑制剂小檗碱的质谱图。
图7示实施例2中α-葡萄糖苷酶样品和空白样品分别与刺五加叶提取物孵育、超滤后的高效液相色谱图。其中，虚线示空白样品与刺五加叶提取物孵育、超滤后的高效液相色谱图，实线示α-葡萄糖苷酶样品与刺五加叶提取物孵育、超滤后的高效液相色谱图。峰3示芦丁，峰5示金丝桃苷，峰6示异槲皮苷，峰7示1，4-二咖啡酰奎宁酸，峰8示1，5-二咖啡酰奎宁酸，峰10示斛皮苷，峰11示4，5-二咖啡酰奎宁酸。
图8示实施例2中筛选得到的α-葡萄糖苷酶抑制剂芦丁的质谱图。
图9示实施例2中筛选得到的α-葡萄糖苷酶抑制剂金丝桃苷的质谱图。
图10示实施例2中筛选得到的α-葡萄糖苷酶抑制剂异槲皮苷的质谱图。
图11示实施例2中筛选得到的α-葡萄糖苷酶抑制剂1，4-二咖啡酰奎宁酸的质谱图。
图12示实施例2中筛选得到的α-葡萄糖苷酶抑制剂1，5-二咖啡酰奎宁酸的质谱图。
图13示实施例2中筛选得到的α-葡萄糖苷酶抑制剂斛皮苷的质谱图。
图14示实施例2中筛选得到的α-葡萄糖苷酶抑制剂4，5-二咖啡酰奎宁酸的质谱图。
图15示实施例3中α-葡萄糖苷酶样品和空白样品分别与黄芩提取物孵育、超滤后的高效液相色谱图。其中，虚线示空白样品与黄芩提取物孵育、超滤后的高效液相色谱图，实线示α-葡萄糖苷酶样品与黄芩提取物孵育、超滤后的高效液相色谱图。峰1示黄芩苷，峰2示Oroxylin-A-7-O Glu acid，峰3示汉黄芩苷，峰4示黄芩素，峰5示汉黄芩素，峰6示木蝴蝶素A。
图16示实施例3中筛选得到的α-葡萄糖苷酶抑制剂黄芩苷的质谱图。
图17示实施例3中筛选得到的α-葡萄糖苷酶抑制剂Oroxylin-A-7-O Gluacid、汉黄芩苷的质谱图。
图18示实施例3中筛选得到的α-葡萄糖苷酶抑制剂黄芩素的质谱图。
图19示实施例3中筛选得到的α-葡萄糖苷酶抑制剂汉黄芩素、木蝴蝶素A的质谱图。
图20示实施例4中α-葡萄糖苷酶样品和空白样品分别与银杏叶提取物孵育、超滤后的高效液相色谱图。其中，虚线示空白样品与银杏叶提取物孵育、超滤后的高效液相色谱图，实线示α-葡萄糖苷酶样品与银杏叶提取物孵育、超滤后的高效液相色谱图。峰1示槲皮素，峰2示芹黄素，峰3示山奈酚。
图21示实施例4中筛选得到的α-葡萄糖苷酶抑制剂槲皮素的质谱图。
图22示实施例4中筛选得到的α-葡萄糖苷酶抑制剂芹黄素的质谱图。
图23示实施例4中筛选得到的α-葡萄糖苷酶抑制剂山奈酚的质谱图。
具体实施方式
本发明公开了一种筛选α-葡萄糖苷酶抑制剂的方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
实施例中所使用的材料除有特别说明外，均可通过商业途径从市场上购买获得。Waters2695液相色谱(美国Waters公司)；Finnigan LCQTM离子阱质谱仪(美国ThermoFinnigan公司)；Agilent RRLC-Q-TOF 6520质谱仪(美国Agilent公司)。
质谱是一种灵敏度很高的检测手段，其检测限远远低于红外紫外等检测手段。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1α-葡萄糖苷酶抑制剂的筛选
超滤筛选反应缓冲液的配制：10mmol/L醋酸铵，pH值为6.8；
α-葡萄糖苷酶样品的配制：用10mmol/L醋酸铵缓冲液将α-葡萄糖苷酶标准品分别配成浓度为10mmol/L的标准溶液；
空白样品和样品的超滤筛选：反应总体积200μL，不加α-葡萄糖苷酶，终浓度10mmol/L醋酸铵缓冲液与终浓度为10mmol/L的黄连地黄提取物于37℃孵育30min。吸取100μL转移至截留分子量为10000的YM-10型超滤管中，在离心力10000g下超速离心10min，滤膜加10mmol/L醋酸溶液(pH6.8)离心清洗3次，每次加100μL洗去未结合小分子。再向滤膜中加100μL甲醇-水的混合溶液(体积比为1∶1，pH值为3.30)，在离心力10000g下离心15min释放结合配体，重复3次，收集洗脱液，冷冻干燥后加40μL甲醇-水的混合溶液(体积比为1∶1，pH值为3.30)溶解，高效液相色谱和质谱联用测定。
样品的超滤筛选：反应总体积200μL，终浓度10mmol/L的α-葡萄糖苷酶与终浓度为20mmol/L的黄连地黄提取物于37℃孵育30min。吸取100μL转移至截留分子量为10000的YM-10型超滤管中，离心力10000g下超速离心10min，滤膜加10mmol/L醋酸溶液(pH6.8)离心清洗3次，每次加100μL洗去未结合小分子。再向滤膜中加100μL甲醇-水的混合溶液(体积比为1∶1，pH值为3.30)，离心力10000g下离心15min释放结合配体，重复3次，收集洗脱液，冷冻干燥后加40μL甲醇-水的混合溶液(体积比为1∶1，pH值为3.30)溶解，高效液相色谱和质谱联用测定。
常规方法检测黄连地黄提取物及所得配体对α-葡萄糖苷酶的抑制活性，结果显示，黄连地黄提取物及所得配体对α-葡萄糖苷酶均具有抑制活性。
高效液相色谱的检测条件如下：
色谱柱：Dikma Diamonsil C18色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)；流动相：乙腈(A)和水(B)；梯度洗脱程序：0～5min，15％A～20％A；5～20min，20％A～25％A；20～25min，25～90％A；流速：0.5mL/min；进样量：10μL。
质谱条件如下：
采用正离子电离模式，扫描范围：m/z 100～800，实验前质量数均经过校正。喷雾电压为5.0kV，金属加热毛细管温度250℃，金属毛细管电压5V，壳气流速50arbitrary，辅助气流速10arbitrary。最大注入时间为200ms。
经质谱鉴定，所得一级全谱图中只有单个化合物的离子峰，通过文献比对，即可确定结构；通过二级三级质谱显示，黄连地黄提取物中α-葡萄糖苷酶抑制剂为药根碱、黄连碱、巴马汀、小檗碱。
分析仅需1μmol的α-葡萄糖苷酶和备检样品中的活性成分；检测迅速，只需要25min就可以从备检样品中快速检测出α-葡萄糖苷酶抑制剂；能够在一次试验中检测到4个α-葡萄糖苷酶抑制剂。
实施例2α-葡萄糖苷酶抑制剂的筛选
超滤筛选反应缓冲液的配制：10mmol/L醋酸铵，pH值为6.8；
α-葡萄糖苷酶样品的配制：用10mmol/L醋酸铵缓冲液将α-葡萄糖苷酶标准品分别配成浓度为10mmol/L的标准溶液；
空白样品和样品的超滤筛选：反应总体积150μL，不加α-葡萄糖苷酶，终浓度10mmol/L醋酸铵缓冲液与终浓度为10mmol/L的刺五加叶提取物于37℃孵育15min。吸取80μL转移至截留分子量为10000的YM-10型超滤管中，在离心力10000g下超速离心12min，滤膜加10mmol/L醋酸溶液(pH6.8)离心清洗3次，每次加70μL洗去未结合小分子。再向滤膜中加70μL甲醇-水的混合溶液(体积比为1∶1，pH值为3.30)，在离心力10000g下离心10min释放结合配体，重复3次，收集洗脱液，冷冻干燥后加40μL甲醇-水的混合溶液(体积比为1∶1，pH值为3.30)溶解，高效液相色谱和质谱联用测定。
样品的超滤筛选：反应总体积150μL，终浓度10mmol/L的α-葡萄糖苷酶与终浓度为20mmol/L的刺五加叶提取物于37℃孵育15min。吸取80μL转移至截留分子量为10000的YM-10型超滤管中，离心力10000g下超速离心12min，滤膜加10mmol/L醋酸溶液(pH6.8)离心清洗3次，每次加80μL洗去未结合小分子。再向滤膜中加70μL甲醇-水的混合溶液(体积比为1∶1，pH值为3.30)，离心力10000g下离心10min释放结合配体，重复3次，收集洗脱液，冷冻干燥后加40μL甲醇-水的混合溶液(体积比为1∶1，pH值为3.30)溶解，高效液相色谱和质谱联用测定。
常规方法检测刺五加叶提取物及所得配体对α-葡萄糖苷酶的抑制活性，结果显示，刺五加叶提取物及所得配体对α-葡萄糖苷酶均具有抑制活性。
Waters2695液相色谱与Finnigan LCQTM离子阱质谱联用对所得配体进行鉴定。
高效液相色谱的检测条件如下：
色谱柱：Dikma Diamonsil C18色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)；流动相：乙腈(A)和0.5％醋酸(B)；梯度洗脱程序：t＝0min，16％A(84％B)；t＝0～14min，16％A(84％B)；t＝14～30min，16～40％A(84～60％B)；柱温28℃，流速：0.5mL/min；进样量：10μL。
质谱条件如下：
电喷雾负离子模式，喷雾电压5.0kV，金属毛细管电压5V，金属毛细管加热温度230℃，壳气流速50arbitrary，辅助气流速10arbitrary，扫描范围m/z 100～1000。
刺五加叶提取物中α-葡萄糖苷酶抑制剂质谱鉴定信息见表1。
表1 刺五加叶提取物中α-葡萄糖苷酶抑制剂质谱鉴定
经鉴定，刺五加叶提取物中α-葡萄糖苷酶抑制剂为芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮苷、1，4-二咖啡酰奎宁酸、1，5-二咖啡酰奎宁酸、4，5-二咖啡酰奎宁酸。
分析仅需1μmol的α-葡萄糖苷酶和备检样品中的活性成分；检测迅速，只需要30min就可以从备检样品中快速检测出α-葡萄糖苷酶抑制剂；能够在一次试验中检测到7个α-葡萄糖苷酶抑制剂。
实施例3α-葡萄糖苷酶抑制剂的筛选
超滤筛选反应缓冲液的配制：10mmol/L醋酸铵，pH值为6.8；
α-葡萄糖苷酶样品的配制：用10mmol/L醋酸铵缓冲液将α-葡萄糖苷酶标准品分别配成浓度为10mmol/L的标准溶液；
空白样品和样品的超滤筛选：反应总体积180μL，不加α-葡萄糖苷酶，终浓度10mmol/L醋酸铵缓冲液与终浓度为10mmol/L的黄芩提取物于37℃孵育25min。吸取120μL转移至截留分子量为10000的YM-10型超滤管中，在离心力10000g下超速离心15min，滤膜加10mmol/L醋酸溶液(pH6.8)离心清洗3次，每次加80μL洗去未结合小分子。再向滤膜中加100μL甲醇-水的混合溶液(体积比为1∶1，pH值为3.30)，在离心力10000g下离心15min释放结合配体，重复3次，收集洗脱液，冷冻干燥后加60μL甲醇-水的混合溶液(体积比为1∶1，pH值为3.30)溶解，高效液相色谱和质谱联用测定。
样品的超滤筛选：反应总体积180μL，终浓度10mmol/L的α-葡萄糖苷酶与终浓度为20mmol/L的黄芩提取物于37℃孵育25min。吸取120μL转移至截留分子量为10000的YM-10型超滤管中，离心力10000g下超速离心15min，滤膜加10mmol/L醋酸溶液(pH6.8)离心清洗3次，每次加80μL洗去未结合小分子。再向滤膜中加100μL甲醇-水的混合溶液(体积比为1∶1，pH值为3.30)，离心力10000g下离心15min释放结合配体，重复3次，收集洗脱液，冷冻干燥后加60μL甲醇-水的混合溶液(体积比为1∶1，pH值为3.30)溶解，高效液相色谱和质谱联用测定。
常规方法检测黄芩提取物及所得配体对α-葡萄糖苷酶的抑制活性，结果显示，黄芩提取物及所得配体对α-葡萄糖苷酶均具有抑制活性。
用2695HPLC-DAD型高效液相色谱仪(Waters Co.，Milford，MA，USA)进行高效液相色谱检测，条件如下：
色谱柱：Dikma Diamonsil C18色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)；流动相：(A)0.5％乙酸水溶液；(B)乙腈；梯度洗脱程序：0～20min，15％A～15％B；20～30min，15％～35％B；30～40min，35％～60％B；40～50min，60％～100％B；流速：0.5mL/min；检测波长：254nm；进样量：20μL。
质谱条件如下：
Agilent RRLC-Q-TOF 6520质谱仪，采用负离子电离模式，扫描范围：m/z 50～1500，实验前质量数均经过校正。干燥气温度：350℃，气体流速：8L/min，喷雾电压：3500V。碰撞气电压：20-55V。
黄芩提取物中α-葡萄糖苷酶抑制剂质谱鉴定信息见表2。
表2 黄芩提取物中α-葡萄糖苷酶抑制剂质谱鉴定
经鉴定，黄芩提取物中α-葡萄糖苷酶抑制剂为黄芩苷、Oroxylin-A-7-OGlu acid、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、木蝴蝶素A。
其中，Oroxylin-A-7-O Glu acid和汉黄芩苷为同分异构体，图17中的峰为基峰，但二者极性不同，经液相色谱分离，出峰的顺序不同，根据保留时间的先后，参考文献数据，鉴别得到Oroxylin-A-7-O Glu acid和汉黄芩苷。
汉黄芩素和木蝴蝶素A为同分异构体，图19中的峰为基峰，但二者极性不同，经液相色谱分离，出峰的顺序不同，根据保留时间的先后，参考文献数据，鉴别得到汉黄芩素和木蝴蝶素A。
分析仅需1μmol的α-葡萄糖苷酶和备检样品中的活性成分；检测迅速，只需要50min就可以从备检样品中快速检测出α-葡萄糖苷酶抑制剂；能够在一次试验中检测到6个α-葡萄糖苷酶抑制剂。
实施例4α-葡萄糖苷酶抑制剂的筛选
超滤筛选反应缓冲液的配制：10mmol/L醋酸铵，pH值为6.8；
α-葡萄糖苷酶样品的配制：用10mmol/L醋酸铵缓冲液将α-葡萄糖苷酶标准品分别配成浓度为10mmol/L的标准溶液；
空白样品和样品的超滤筛选：反应总体积200μL，不加α-葡萄糖苷酶，终浓度10mmol/L醋酸铵缓冲液与终浓度为10mmol/L的银杏叶提取物于37℃孵育20min。吸取110μL转移至截留分子量为10000的YM-10型超滤管中，在离心力10000g下超速离心13min，滤膜加10mmol/L醋酸溶液(pH6.8)离心清洗3次，每次加90μL洗去未结合小分子。再向滤膜中加90μL甲醇-水的混合溶液(体积比为1∶1，pH值为3.30)，在离心力10000g下离心13min释放结合配体，重复3次，收集洗脱液，冷冻干燥后加55μL甲醇-水的混合溶液(体积比为1∶1，pH值为3.30)溶解，高效液相色谱和质谱联用测定。
样品的超滤筛选：反应总体积200μL，终浓度10mmol/L的α-葡萄糖苷酶与终浓度为20mmol/L的银杏叶提取物于37℃孵育20min。吸取110μL转移至截留分子量为10000的YM-10型超滤管中，离心力10000g下超速离心13min，滤膜加10mmol/L醋酸溶液(pH6.8)离心清洗3次，每次加90μL洗去未结合小分子。再向滤膜中加90μL甲醇-水的混合溶液(体积比为1∶1，pH值为3.30)，离心力10000g下离心13min释放结合配体，重复3次，收集洗脱液，冷冻干燥后加55μL甲醇-水的混合溶液(体积比为1∶1，pH值为3.30)溶解，高效液相色谱和质谱联用测定。
常规方法检测银杏叶提取物及所得配体对α-葡萄糖苷酶的抑制活性，结果显示，银杏叶提取物及所得配体对α-葡萄糖苷酶均具有抑制活性。
用2695HPLC-DAD型高效液相色谱仪(Waters Co.，Milford，MA，USA)进行高效液相色谱检，测条件如下：
色谱柱：Dikma Diamonsil C18色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)；流动相：(A)0.5％乙酸水溶液；(B)乙腈；梯度洗脱程序：0～40min，17％～33％B；40～90min，33％～50％B；90～120min，50％～70％B；流速：0.5mL/min；检测波长：254nm；进样量：20μL。
质谱条件如下：
采用负离子电离模式，扫描范围：m/z 50～2000，实验前质量数均经过校正。喷雾电压为5.0kV，毛细管温度230℃，毛细管电压5V，壳气为N2，流速50arbitrary。
经鉴定，银杏叶提取物中α-葡萄糖苷酶抑制剂为槲皮素、芹黄素、山奈酚。
分析仅需1μmol的α-葡萄糖苷酶和备检样品中的活性成分；检测迅速，只需要120min就可以从备检样品中快速检测出α-葡萄糖苷酶抑制剂；能够在一次试验中检测到3个α-葡萄糖苷酶抑制剂。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (7)
1.一种筛选α-葡萄糖苷酶抑制剂的方法，其特征在于，将α-葡萄糖苷酶与备检样品孵育，通过截留分子量为10000Da的超滤薄膜后，收集滤渣，加入体积比为1∶1的甲醇-水混合溶液，超速离心后收集滤液高效液相色谱-质谱联用技术检测，得到α-葡萄糖苷酶抑制剂。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括α-葡萄糖苷酶抑制活性的检测。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述孵育条件为在37℃下反应15～30min。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述超速离心为在离心力10000g下离心10～15min。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述备检样品为天然产物提取物或中药复方提取物。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述中药复方提取物为黄连地黄提取物、刺五加叶提取物、银杏叶提取物或黄芩提取物。
7.药根碱、黄连碱、巴马汀、小檗碱、芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮苷、1，4-二咖啡酰奎宁酸、1，5-二咖啡酰奎宁酸、4，5-二咖啡酰奎宁酸、黄芩苷、Oroxylin-A-7-O Glu acid、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、木蝴蝶素A、槲皮素、芹黄素或山奈酚在制备α-葡萄糖苷酶抑制剂中的应用。
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| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20121017 |