CN1685053A - 从植物生物质提取、纯化和转化类黄酮化合物 - Google Patents

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Abstract

从植物生物质制备富含芸香苷的组合物的方法包括用水性溶液提取，和沉淀。酶制品如柚苷酶被用于将芸香苷转化成具有更高价值的组合物，该组合物含有增加比例的异槲皮苷和栎精。

Description

从植物生物质提取、纯化和转化类黄酮化合物
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        从植物生物质提取、纯化和转化类黄酮化合物
发明领域
本发明涉及从植物生物质制备的类黄酮化合物，尤其涉及富集芸香苷的组合物，它们可以被酶促转化成更有价值的类黄酮化合物异槲皮苷和栎精。
背景技术
植物类黄酮化合物通常在植物中以糖苷形式存在，但在一些情况中，它们作为自由的糖苷配基存在。多数糖苷为O-糖苷，最通常单糖苷在7-位。二糖苷通常在-7位和-3位及偶然地在-7和-4’位具有糖。存在其他组合和单-O-糖苷但是不多。C-糖苷以更严格的分布存在，C-6和C-8糖苷是最普遍的(Harbone，1994)。
植物类黄酮化合物具有抗氧化性质(Bors等人，1990)、肿瘤发生中的细胞抑制作用，并且能够抑制宽范围的酶，如血管紧张肽转化酶(ACE)、蛋白质激酶C、酪氨酸蛋白激酶，和拓扑异构酶II。它们被认为是潜在的癌预防剂和心脏保护剂(Manach等人，1996；Skibola和Smith，2000)。还研究了它们作为消炎或抗病毒剂的潜在用途(Middleton和Kandaswami，1993)。Backhaus(1995a)声称生物类黄酮化合物，特别是芸香苷、柠檬素、栎精、桔皮苷或者衍生物是蛋白质切割酶(如透明质酸酶和/或胶原酶)失活的原因，这些蛋白质切割酶促进皮肤老化过程。这些化合物可用于一般的皮肤护理或者美容手术。据报导芸香苷、栎精、异槲皮苷、儿茶素和其他化合物也防止和改善皮肤的老化现象(Arata，1992)。Midori(1994)声称，栎精糖苷、二价金属离子，和甘草提取物一起通过促进人肝脏中的酒精代谢而防止中毒。
芸香苷是由栎精和芸香糖组成的类黄酮化合物糖苷。已经阐明了芸香苷的许多有益的健康效果。这些效果归因于芸香苷的消炎、抗突变、抗肿瘤、抗致癌、平滑肌松弛，和雌激素受体结合活性(Pisha和Pezzuto，1994)。芸香苷也正在被用于治疗毛细血管脆性、脑血栓、视网膜炎和风湿热-相关的出血状况(Griffith等人，1944；Matsubara等人，1985；Iwata等人，1990；Yildzogle-Ari等人，1991)。在低膳食脂肪摄入的情况下，已经报导芸香苷和栎精显著抑制结肠肿瘤的发生(Agullo等人，1994；Deschner，1992)。Backhaus(1995b)声称口服剂量形式和注射液或输注液或者栓剂形式的芸香苷及其衍生物将使逆转录病毒(例如，HIV)失活。芸香苷可用作天然着色剂、氧化抑制剂、维生素、化妆品中的防晒物(芸香苷将吸收紫外线)，和作为功能性食品应用中的成分(匿名，1990a，b)。
可在许多植物中发现芸香苷，这些植物包括荞麦(叶子、花、茎、秆、壳和去壳麦粒)、日本槐树(Sophora japonica)、番茄、三色堇(堇菜科，堇菜属种，Viola sp.，Violaceae)、烟草、连翘、绣球、fava d′anta(Dimorphandragardnerina和Dimorphandra mollis)和桉树(Humphreys，1964)。荞麦被认为能够提供芸香苷的主要膳食来源。Kitabayashi等人(1995)报导荞麦种子的芸香苷含量为0.126到0.359mg/g干重。Oomah和Mazza(1996)报导完整种子和麦壳中芸香苷含量分别为0.47和0.77mg/g干重。他们还报导类黄酮化合物在麦壳中高度浓缩；荞麦种子和麦壳的平均类黄酮化合物含量分别为3.87和13.14mg/g。Prochazka(1985)报导在小心干燥的、处于花期的Czechish荞麦叶子中发现6％芸香苷(wt/wt)。干草产率为600到1000kg/ha，其以4％(wt/wt)芸香苷浓度，达到24-40kg芸香苷/ha。
尽管芸香苷的工业生产的多数细节是专利的并且不在公开文献中描述，但是我们知道Merck GmbH为了商业目的从fava d′anta提取芸香苷。德国Merck GmbH的Heywang和Basedow(1992)用1，4-二噁烷在回流下从fava d′anta(Dimorphandra)的嫩枝(shoot)提取芸香苷。通过室温下结晶回收芸香苷。然而，二噁烷被认为是致癌的。
Huo(中国专利1217329，1999)描述了通过将苦荞麦(tartary buckwheat)种子用水洗涤，粗磨，粗筛，浸入水中，空气中干燥，细磨，浸入可食用醇，60℃以下提取，并过滤来提取芸香苷。Balandina等人(1982)用热水从荞麦种子提取芸香苷以便取出所希望的产物并将其结晶。
Zhai(中国专利CN 1160048，1997)描述了通过用含有1-10％硼砂的饱和石灰水浸泡，并通过加入HCl在pH 1-6下沉淀从槐米(Flos sophorae)提取芸香苷。
Matsumoto和Hamamoto(1990)用甲醇提取，活性炭吸附，然后去吸附，用40％乙醇中的1％氨洗脱，并从20％乙醇重结晶，从Sophoraaugustifolia芽回收芸香苷。
Liu(1991)描述了通过磨粉，石灰水中蒸煮，中和上清液，冷却，过滤，洗涤，并干燥沉淀物从日本槐树(Sophora japonica)芽提取芸香苷的方法。产率为14.2％(wt/wt)，产物含有95.1％(wt/wt)芸香苷。
Sloley等人(2000)报导，尽管金丝桃蒽酮被认为是贯叶金丝桃(Hypericum perforatum)(St.John′s wort，金丝桃)的叶子和花的提取物的标志性化学物，但是其他化合物如贯叶金丝桃素、金丝桃苷、芸香苷和栎精以高得多的浓度存在。他们还发现不同提取物的化学组分谱变化很大。然而，自由基清除能力与栎精含量正相关。16个金丝桃提取物中平均芸香苷和栎精含量分别为2.0和0.3％(wt/wt)。
1克芸香苷可溶解于室温下约8L水中或者200ml沸水中。Zirlin(美国专利3,822,475，1974)公开了防止难溶的类黄酮化合物在酸性软饮料中结晶的方法。将类黄酮化合物与蔗糖混合并加热到焦糖熔化阶段(140-185℃)，溶于水性系统中，并蒸发掉水以得到干燥混合物。
用α-葡糖苷酶(E.C.3.2.1.20)、环麦芽糊精葡聚糖基转移酶(E.C.2.4.1.19)、α-淀粉酶(E.C.3.2.1.1)、葡糖淀粉酶(E.C.3.2.1.3)、β-淀粉酶(E.C.3.2.1.2)，和半乳糖-转移酶(β-半乳糖苷酶)将栎精苷改性成水可溶的黄酮醇苷，参见San-Ei化学工业公司(Chemical Industries Ltd.)和Hayashihara生物化学实验室公司(Biochemical Laboratory Inc.)(Nishimura等人，1992；Suzuki等人，1992a，b；Suzuki等人，1995；Suzuki等人，1996；Washino 1992；Yoneyama等人，1996)所描述的。Hayashihara生物化学实验室公司声称他们成功地产生了水可溶的芸香苷，其水溶解度增加了5000倍以上(匿名，1990a)。
1990年前，栎精被认为是致突变的和致癌的(Manach等人，1996)。代谢动物研究已经表明栎精可被快速转化成非-诱变性的3’-O-甲基栎精代谢物(Morand等人，1998；Skibola和Smith 2000)。更重要地，已报导栎精具有抗细菌、抗病毒、抗氧化、抗增殖、消炎，和抗致癌效果(Crespy等人，1999；Skibola和Smith，2000)。
栎精还对各种肿瘤细胞(Middleton和Kandaswami，1993；Caltagirone等人，2000)、结肠癌细胞(Agullo等人，1994；Deschner，1992)和溃疡(Borrelli和Izzo，2000)表现出强抑制活性。栎精已经被鉴定为低浓度下强拓扑异构酶II抑制剂，类似于癌症治疗中广泛使用的表鬼臼毒素的活性(Skibula和Smith，2000)。
Ishige等人(2001)表明许多类黄酮化合物和相关多酚化合物保护小鼠海马细胞系HT-22和大鼠原代神经元不受谷氨酸盐导致的氧化应激协迫。该发现是重要的，因为氧化应激造成的神经细胞死亡与各种病理相关，包括中风、动脉硬化症、创伤和阿尔茨海默氏和帕金森病。他们的数据表明一些类黄酮化合物(栎精、山奈素和黄颜木素)具有相当的保护性，而其他的(芸香苷、白杨素，和芹菜配基)无活性。在氧化应激的细胞培养物模型中栎精改变谷胱甘肽(GSH)代谢并抑制活性氧种类(ROS)。其作用机理类似于没食子酸丙酯和咖啡酸甲酯的作用机理，但是与维生素E的不同。Noroozi等人(1998)报导栎精在抵抗氧化性DNA损伤方面比芸香苷和维生素C更强。
Ashida等人(2000)报导饮食黄酮醇(栎精和芸香苷)和黄酮拮抗地抑制二氧芑诱导的芳基烃受体(AhR)的转化。栎精在抵消该环境污染物的毒性方面比芸香苷更强。在抗致癌性方面，I期酶氧化、还原或水解致癌物，II期酶缀合或者影响致癌物。Valerio等人(2001)阐明栎精是一种II期酶诱导剂，其刺激II期解毒活性。II期酶还可以清除强氧化剂，并且科学兴趣指向应用它们的活性作为降低癌症危险的方法。使用II期酶诱导剂(许多这些诱导剂在通常的食物中被发现)是增加身体组织中II期酶活性的一种方法。
Agullo等人(1997)报导栎精是磷脂酰肌醇3-激酶(PI 3-激酶；与细胞增殖和转化有关的一种酶)的有效抑制剂。毛地黄黄酮、芹菜配基和杨梅树皮素也显示出这种活性。PI 3-激酶的抑制可能与这些类黄酮化合物的抗肿瘤性质有关。而且，据报导，栎精抑制淋巴细胞酪氨酸激酶活性，并且在I期临床试验中表现出抗肿瘤性质(Ferry等人1996)。
Watanabe等人(1997)报导栎精负责杜仲(Eucommia ulmoides)叶的α-葡糖苷酶抑制剂活性。因为α-葡糖苷酶是催化糖类消化过程中最后一步的酶，所以，上面发现意味着栎精可以抑制饭后高血糖并且可用于糖尿病的治疗，潜在应用于晚期糖尿病并发症、肥胖和相关的失调。栎精还阻断导致山梨糖醇积累的酶，山梨糖醇与糖尿病患者中的神经、眼睛和肾脏损伤有关。然而，还没有人类研究以评估栎精对糖尿病的可能的有益效果(Wang，2000)。
Kato等人(1983)证明在膳食中接受0.5％栎精的小鼠或大鼠，其血清甘油三酯显著降低。栎精的补充也表现出可以有效地减弱食用高胆固醇食物的大鼠中血清和干脏胆固醇的上升(Basarkar，1981)。
从Alpinia urarensis Hay的叶子提取和纯化的栎精及其糖苷表现出血小板凝集-抑制活性。其活性大于作为对照血小板凝集抑制剂的阿司匹林和人参皂甙的活性(Okuyama等人，1996)。
在日本专利公开号06248267中，Nakayama(1994)声称栎精、山奈素、儿茶素或黄杉素可用于食品中或作为药物以预防或治疗由功能失常或清除活动导致的疾病、局部缺血性疾病、风湿症、糖尿病等。
Lutterodt和Abu Raihan(1993)报导栎精具有类似麻醉剂的抗伤害活性，其干扰疼痛传递。50mg栎精/kg体重的剂量将和2.5mg硫酸吗啡/kg具有相同的效果。
可以从草棉(Gossypium herbaceum)、Waldsteinia fragarioides(Michx)、Tratt(蔷薇科，Rosaceae)、鹰爪豆(Spartium junceum L.)(Fabaceae)(Yesilada等人，2000)和欧洲七叶树(Aesculus hippocastanum)的花提取天然异槲皮苷(栎精-3-O-β糖苷)。其还在芹菜种子、茴香种子、木贼、红三叶草和金丝桃(St.John’s wort)中发现。异槲皮苷已经被证明具有几种生物学活性，包括抑制血管紧张肽转化酶(ACE)、抑制前列腺素合成，和抗病毒活性(Abou-Karam和Shier，1992)。
类黄酮化合物的消化吸收中细菌酶的作用是重要的，因为哺乳动物组织不能合成这些水解酶。Griffiths和Barrow(1972)已经证明被无菌大鼠摄入的类黄酮化合物糖苷在粪便中以未被水解的形式回收。糖-糖苷配基键的水解在远端回肠和盲肠中发生。
在跨肠膜的吸收过程中，类黄酮化合物以糖苷配基和/或糖苷形式被吸收并被部分转化成葡糖苷酸、硫酸盐或甲氧基化物(Manach等人，1998)。在血浆中不能检测到游离的栎精。被吸收的小部分类黄酮化合物被肝脏酶代谢，导致极性缀合物在尿中被排泄或者通过胆囊返回到十二指肠。最大部分的被摄入的类黄酮化合物未被吸收，而是被肠内微生物菌群降解。细菌的酶催化一些反应，包括水解、杂环含氧环的切割、脱羟基作用和脱羧基作用。根据所涉及的类黄酮化合物的结构，产生一些酚酸。然后酚酸可被吸收并在肝脏中缀合和O-甲基化，然后可以进入循环(Manach等人，1996)。
Crespy等人(1999)阐明栎精和异槲皮苷的生物利用度比芸香苷的高得多。芸香苷比栎精、异槲皮苷和异鼠李黄素吸收得更慢，因为其必须被盲肠微生物菌群水解，而栎精、异槲皮苷和异鼠李黄素从小肠被吸收(Manach等人，1997)。Morand等人(2000)还证明异槲皮苷比其他栎精形式(栎精、芸香苷和槲皮苷)被更好地吸收。饭后四小时，不管消费的是栎精的哪种形式，在水解的血浆中鉴定到的代谢物都是3’-和4’-甲基栎精。然而，血浆中代谢物的总浓度显著不同：对于异槲皮苷、栎精和芸香苷分别是33.2、11.2和2.5μM。槲皮苷(栎精3-鼠李糖苷)消费后，它们在血清中不能检测到任何代谢物。Gee等，2000表明异槲皮苷比游离的栎精糖苷配基更快地穿过小肠上皮。这些数据建立了类黄酮化合物的生物利用度分级情况，即异槲皮苷＞栎精＞芸香苷。
柚苷酶是一种酶制品，其可以从Penicillium aspergillus、白腐垫壳孢(Coniella diplodiella)、宫部旋孢腔菌(Cochliobolus miyabeanus)、立枯丝核菌(Rhizoctoyaia solanii)、柑桔拟茎点霉(Phomopsis citri)、和斜卧青霉(Penicillium decumbens)的培养物生产。多数商业化柚苷酶制品从斜卧青霉生产。Narikawa等人(1998)推断，斜卧青霉降解芸香苷，但是他们的工作是定性的，并且他们没有指出该降解的结果是什么。
柚苷酶被用于将柚皮苷(narigin)——4’，5，7-三羟基黄烷酮(flavonone)的7-(2-鼠李糖苷-β-葡糖苷)水解成柚皮素(narigenin)。柚苷酶在商业上被用于减弱柑橘果实或果汁中的苦味。Uyeta等人(1981)在茶浸液的研究中使用了柚苷酶。柚苷酶处理对茶浸液的致突变活性的影响类似于用酸或桔皮苷酶处理的效果。然而，他们既没有表征也没有鉴定水解产物。他们鉴定了山奈素、栎精和杨梅树皮素是用人粪便细菌处理的茶浸液中的主要致突变成分。
尽管异槲皮苷似乎是最希望的栎精衍生物，但是市场上还没有该化合物的浓缩或纯的形式——除了非常小的量被用作分析标准。以前没有公开处理荞麦叶材料以回收类黄酮化合物和进一步将这些类黄酮化合物生物转化成高生物可利用度的、性能增强的、高价值产物如异槲皮苷和栎精的方法。以前公开的仅仅是提取和纯化芸香苷的经典实验室方法。
通常，生物体系中发现的天然异槲皮苷和栎精的浓度比芸香苷的低得多。从生物体系提取的异槲皮苷和栎精由于它们的稀有性和生物利用度而要求高得多的价格。现今没有商业上可行的技术将芸香苷(不管来源)生物转化成高生物可利用度的、性能增强的高价值产物如异槲皮苷和栎精。
发明概述
本发明的一个目的是提供自芸香苷衍生的富含异槲皮苷的组合物，以及经济地提供商业上足够量的该组合物以允许将它们用于功能食品、营养药(nutraceutical)、天然健康产品、化妆品和药物应用。
本发明的另一个目的是提供衍生自芸香苷的组合物，其富含比例受控的异槲皮苷和栎精，和提供商业上足够量的这种组合物以允许将它们用于功能食品、营养药、天然健康产品、化妆品和药物应用。
本发明的另一个目的是提供一种方法，在该方法中通过抑制异槲皮苷向栎精的转化而最大化异槲皮苷的产率。在本发明中，这通过加入存在于柚苷酶制品中的β-D-葡糖苷酶活性的抑制剂而实现。
本发明的另一个目的是提供从荞麦得到芸香苷的方法，尤其是提供从荞麦种子收获后残留在大田中的荞麦植物残余物得到芸香苷，从而将廉价的废品转化成更有价值的产品的这种方法。
在第一方面，本发明提供了从含有芸香苷的生物质制备富含芸香苷的组合物的方法，该方法包括使用水性溶液对生物质实施类黄酮化合物提取；过滤溶液得到提取液；让提取液静置以便形成沉淀；收集并干燥沉淀以形成富含芸香苷的组合物。
提取过程中水性溶液优选保持在高于30℃的温度。水性溶液优选为水性醇溶液，醇浓度按体积计大于20％醇，对于最佳结果，其为按体积计50％到100％醇。提取溶液优选被浓缩到其原始体积的约1/5到1/10，然后静置冷却以促进沉淀。
使用本发明的方法，通过相对简单的湿化学手段，无需层析，可以制备具有按重量计70％芸香苷含量的富含芸香苷的组合物。最经济地，使用种子从荞麦地里收获后剩下的作物残余物提供含有芸香苷的生物质。该残余物以前几乎没有任何价值。使用该作物残余物比现有技术中使用处于花期的荞麦具有优势，因为可以收获种子，从而从荞麦作物得到第一级回报。在现有技术中，从荞麦作物获得的总回报来自购买处于花期或者其他成熟前阶段的荞麦作为芸香苷生产的原料。
在另一方面，本发明提供了通过如下方法制备的富含异槲皮苷的组合物，该方法包括提供处于适于酶温育的条件下的其中悬浮有芸香苷的溶液；将含有柚苷酶的酶制品加入该溶液；在温育期间保持适于酶温育的溶液条件；通过将溶液的条件改变成不适于酶活性的条件结束温育期。这些改变包括降低pH和增加溶液的温度。调节温育期的持续时间以控制组合物中异槲皮苷的比例。
在本发明的第三方面提供了通过如下方法制备的富含异槲皮苷的组合物，该方法包括提供处于适于酶温育的条件下的其中悬浮有芸香苷的溶液；将含有柚苷酶或者α-L-鼠李糖苷酶的酶制品加到溶液中；在温育期间保持适于酶温育的溶液条件；通过将溶液的条件改变为不适于酶温育的条件终止温育期。为了得到最佳产率，温度应该为50-55℃并且应该不超过65℃。调节温育期的持续时间以控制组合物中异槲皮苷的比例。温育期最佳为1-48小时。降低pH和增加溶液的温度可以通过使酶制品变性而终止温育期。
组合物中异槲皮苷的比例可以高达约95％。使用含有α-L-鼠李糖苷酶和β-D-葡糖苷酶的酶制品进行酶温育也将芸香苷转化成栎精。可以调节温育期以提供富含不同比例的异槲皮苷和栎精的组合物。
方便地且经济地，该酶制品可以是柚苷酶，其可通过商业途径得到并且是经济的。出售的柚苷酶中有保证含量的β-D-葡糖苷酶用于各种商业用途。与Narikawa等人(1998)揭示的现有技术相反，发现来自斜卧青霉的柚苷酶能够从芸香苷切割糖。
酶α-L-鼠李糖苷酶与芸香苷的温育将芸香苷转化成异槲皮苷。酶β-D-葡糖苷酶与异槲皮苷的温育将异槲皮苷转化成栎精。柚苷酶含有α-L-鼠李糖苷酶和β-D-葡糖苷酶两者，并且可以以经济的量通过商业途径得到。
可以实现有效的、经济的和商业上可行的生物转化而不使用α-L-鼠李糖苷酶和β-D-葡糖苷酶的纯化的或其他昂贵的形式。通过操纵生物转化条件可以定制具有不同比例的芸香苷/异槲皮苷/栎精的组合物。本发明的方法产生具有高度浓缩的芸香苷、异槲皮苷、栎精或它们的混合物的产物，随后可以使用标准生化纯化技术纯化该产物。
在本发明的第四方面，在加入柚苷酶之前向芸香苷溶液加入β-D-葡糖苷酶抑制剂。在优选的实施方案中，β-D-葡糖苷酶抑制剂为D-Δ-葡糖酸内酯。通过抑制柚苷酶制品中的β-D-葡糖苷酶组分，异槲皮苷将不被转化为栎精；结果以高产率和大于80％的纯度得到异槲皮苷。
本发明的方法可用于从各种植物生物质来源产生具有高度浓缩的芸香苷、异槲皮苷、栎精或它们的混合物的产物，这些生物质来源包括，但不限于荞麦属(Fargopyrum)成员，金丝桃的叶、银杏(ginkgo)、biloba紫花苜蓿、桑树、藻类、苹果皮、梨子皮、洋葱皮、芦笋尖头、蔷薇果果皮。
通过本发明的方法产生的富含异槲皮苷的产物具有生物活性性质，该生物活性性质包括血管紧张肽-转化酶抑制、消炎、抗肿瘤、抗病毒、抗氧化、自由基清除、癌症预防、心脏保护、蛋白酶抑制、蛋白激酶C抑制、酪氨酸蛋白激酶抑制、拓扑异构酶II抑制和蛋白切割酶抑制性质。
通过本发明的方法产生的富含异槲皮苷的产物的生物活性性质将用作健康食品、药品、营养药和化妆品中的添加剂。当加到产品中时，这些生物活性性质将可用于预防和治疗疾病和健康问题，其包括，但不限于心血管疾病、中风、毛细血管脆性、动脉硬化症、创伤、氧化应激、高血压、升高的胆固醇、升高的甘油三酯、高血糖、II型糖尿病、肥胖和相关失调、阿尔茨海默氏病、帕金森病、哮喘和一些癌症。
本发明还提供了使得能够经济生产和满足市场偏好的工艺和产品灵活性。
在本发明下面的详细描述中，本发明的这些和其他目的、特征和优点将变得更加明显，该详述通过实施例阐明了本发明的原理。
附图简述
尽管所要求的发明列于本发明的结论部分，但是在相伴的详细描述中提供了优选实施方案，它们可以参考附图获得最佳的理解，其中这些附图的每一个图中相似部分被相似数字标记，并且其中：
图1A说明芸香苷的化学结构式；
图1B说明异槲皮苷的化学结构式；
图1C说明栎精的化学结构式；
图2A-2C显示了如下各项的HPLC分析结果：(2A)荞麦叶的甲醇提取物(RT：14.862＝芸香苷，RT：20.947＝栎精)；(2B)从已经被浓缩到水相并冷藏的荞麦叶水性醇提取物得到的沉淀(RT：14.785＝芸香苷)。(2C)与柚苷酶温育24小时后芸香苷向异槲皮苷(RT：15.181)和栎精(RT：20.372)的转化。所有样品都在C-18对称柱上层析，用含有0.05％三氟乙酸的水∶乙腈梯度洗脱。在280nm监视柱流出液并通过ELSD定量溶解的固体。
图3A-3C显示了如下芸香苷样品的HPLC分析结果：(3A)商业芸香苷样品(Street Chemicals)(RT：14.875＝芸香苷，RT：15.442＝异槲皮苷)；(3B)用柚苷酶处理芸香苷后回收的沉淀(RT：15.487＝异槲皮苷，RT：20.843＝栎精)；(3C)通过制备HPLC得到的纯化的异槲皮苷(RT：15.436＝异槲皮苷)。所有样品都在C-18对称柱上层析，用含有0.05％三氟乙酸的水∶乙腈梯度洗脱。在280nm监视柱流出液并通过ELSD定量溶解的固体。
图4为实施本发明的两种方法的概述性流程图。使用方法A，从植物生物质回收芸香苷，然后将其转化成芸香苷、异槲皮苷和栎精的混合物。使用方法B，加入β-D-葡糖苷酶的抑制剂以防止异槲皮苷向栎精的转化。使用方法B，增加了本发明方法的异槲皮苷产率和纯度。
具体实施方案的描述
本发明提供了从植物生物质产生高价值的生物可利用的类黄酮化合物的方法。如上述，类黄酮化合物已被证明具有一系列有用的生物活性性质。类黄酮化合物用于治疗性应用中的问题之一是它们在自然中通常以低浓度存在。为了将类黄酮化合物用作药物、营养药或和其他健康产品的添加剂，需要纯化类黄酮化合物的方法。
在本发明中，通过标准生物化学方法回收类黄酮化合物芸香苷。然后通过酶制品柚苷酶将芸香苷转化成异槲皮苷和栎精。本发明的进一步改进表明通过使用食品添加剂d-Δ-葡糖酸内酯选择性抑制柚苷酶制品中存在的β-D-葡糖苷酶活性，可以增加中间产物异槲皮苷的产率。
下面的实施例和附图阐明了本发明的一些实施方案的操作，从而使其可以更容易地被理解。
虽然现在详细地具体参考附图，但是应强调所显示的细节仅作为实例并且仅仅用于本发明的优选实施方案的举例说明性讨论的目的，并且是提供其是因为这被认为是最有用的并且容易理解本发明的原理和概念的描述。在这点上，如果对于本发明的基本理解无必要，则不再更详细地说明本发明的结构细节，说明书以及附图将使得本领域技术人员明白本发明的几种形式可以怎样在实践中实施。应强调的是，所显示的这些细节是实例并且用于举例说明性讨论目的。
从植物生物质提取芸香苷
下面的实施例1和2论证了通过涉及水溶液中提取、浓缩和沉淀的方法可以回收植物生物质中的芸香苷。可以考虑省略浓缩提取液的步骤，然而，该相对简单和经济的步骤可以增加该方法的效率。
如实施例1中所示，所述的热水中提取从叶子回收了36％可利用的芸香苷。
如实施例2中所示，如所述的通过在含有50％(体积)甲醇的水性醇溶液中提取，从叶子回收了65％可利用的芸香苷。
如实施例3中所示，通过简单的湿化学手段而不使用层析就可以将富含芸香苷的组合物中芸香苷的含量增加到约70％。
如实施例4中所示，本发明方法的提取效率随着醇浓度、水性溶液的温度、固体与溶剂的比，和提取时间而变。对于经济的商业方法，可以基于提供这些变量的经济性确定这些变量的适宜组合。
预期可以以序贯分批或者连续补料模式实施提取。通过将提取过的生物质加入新鲜量的溶剂中并进行第二次或额外的提取也可以提高该方法的提取回收比。
本领域的现有技术多数集中在类黄酮化合物的分析方法学、来自生物质的类黄酮化合物的浓度和量。以前还没有将来自沉淀的富含芸香苷的级分描述为终产物。以前从未认识到富含芸香苷的组合物的价值。
实施例1：从荞麦叶材料水性提取、浓缩和沉淀芸香苷
收获并干燥后，将荞麦叶在Wiley磨机上碾磨以通过2mm筛，由此制备用于提取的荞麦叶。将1kg磨过的荞麦叶(芸香苷含量3.74％，基于干重)在10L水中在90℃下连续搅拌1小时，进行提取。过滤所得悬浮物，并将滤饼用300ml热(95℃)水洗涤2次。将洗涤的滤液与提取物混合得到体积为8.6L的合并提取物。该水性提取方法从叶子回收了36％可利用的芸香苷。
将提取物在减压下浓缩到原来体积的约1/5和1/10。浓缩提取物保存在冰箱(4℃)中过夜，此时类黄酮化合物从溶液中沉淀出来。以7,000×g离心并过滤上清液后收集沉淀的物质。将沉淀随后冰冻干燥。通过将干燥产物的等分试样溶于甲醇并通过RP-HPLC分析确定沉淀物中芸香苷含量。从HPLC结果，我们得出结论：在沉淀中可以回收浓缩的水性提取物(减小到其原始体积的1/5和1/10)中60％可得到的芸香苷。
实施例2：从荞麦叶材料水性醇提取、浓缩和沉淀芸香苷
收获并干燥后，将荞麦叶在Wiley磨机上碾磨以通过2mm筛，由此制备用于提取的荞麦叶。将1kg磨过的荞麦叶(芸香苷含量3.74％，基于干重)在10L 50％(v/v)水性甲醇中提取，具体地在40℃下连续搅拌3小时。过滤所得悬浮物，并将滤饼用温(40％)50％(v/v)水性甲醇洗涤。将洗涤的滤液与提取物合并。该提取方法从叶子回收了65％可利用的芸香苷。图2A说明了甲醇提取物中芸香苷的浓度。将提取物在减压下浓缩到原来体积的约1/5。浓缩提取物保存在冰箱(4℃)中过夜，此时类黄酮化合物从溶液中沉淀出来。以7,000×g离心并倾析上清液后收集沉淀的物质。将沉淀随后冰冻干燥。通过将干燥产物的等分试样溶于甲醇并通过RP-HPLC分析确定沉淀物中芸香苷含量。图2B说明了沉淀中类黄酮化合物的浓度。发现富含类黄酮化合物的产物含有64％芸香苷和6.88％蛋白质。在来自浓缩提取物的沉淀中证明了93-100％的芸香苷回收。
实施例3：从分离自荞麦叶的富含类黄酮化合物的中间产物纯化芸香苷
将来自实施例2的富含芸香苷的产物溶于温甲醇中，在磁力搅拌器上剧烈搅拌以促进芸香苷的完全溶解。使用真空过滤，从溶液除去任何不溶的物质。将溶液在40℃减压下蒸发至干。然后将残渣悬浮在热(90℃)水中，持续搅拌直到大多数沉淀已经溶解。让悬浮物在冰箱中沉淀过夜。通过真空过滤取出沉淀，并将其冰冻干燥。纯化的芸香苷沉淀溶于甲醇，通过0.45μm尼龙注射滤器过滤，然后用RP-HPLC分析确定产物纯度。重复溶解/结晶而不使用层析后，芸香苷含量增加到约70％和更高。
实施例4：从荞麦叶材料提取芸香苷的优化
将如实施例2中所述得到的荞麦叶用下面溶剂以固体∶溶剂比为1∶20在60℃提取4小时：水、30％(v/v)甲醇/70％(v/v)水、50％(v/v)甲醇、70％(v/v)甲醇/30％(v/v)水、85％(v/v)甲醇/15％(v/v)水、和100％甲醇。过滤所得提取物并通过RP-HPLC分析。提取溶剂中的甲醇含量对从荞麦叶提取芸香苷的效率有显著影响(表1)。从一系列提取优化研究确定了从荞麦叶回收芸香苷的最佳提取条件。改变提取溶剂的醇含量以及提取温度、提取时间和固体与溶剂的比有显著的影响。表1-3总结了这些结果中的一些。
表1：使用1∶20固体∶溶剂比，并在60℃提取4小时的条件下，提取溶剂中甲醇的浓度对芸香苷提取效率的影响
溶剂中％甲醇(％，v/v) 芸香苷的提取效率(％)
 0  1.0
 30  29.2
 50  86.5
 70  94.1
 85  83.7
 100  85.7
[芸香的提取效率(％)＝(提取物中总芸香苷/起始材料中总芸香苷)×100]
表2：使用1∶10固体∶溶剂比、70％(v/v)甲醇提取溶剂、提取4小时的条件下提取温度对芸香苷提取效率的影响
提取温度(℃) 芸香苷的提取效率(％)
 24  72.2
 30  82.9
 40  87.4
 50  90.9
 60  91.4
[芸香的提取效率(％)＝(提取物中总芸香苷/起始材料中总芸香苷)×100]
表3：使用70％(v/v)甲醇提取溶剂50℃条件下，提取时间和固体∶溶剂比对芸香苷提取效率的影响
固体∶溶剂比例 提取时间(小时) 芸香苷提取效率(％)
1∶10  2  86.4
1∶20  2  91.8
1∶30  2  94.5
1∶10  3  92.7
1∶20  3  92.7
1∶30  3  95.4
1∶10  4  90.0
1∶20  4  99.9
1∶30  4  96.3
[芸香的提取效率(％)＝(提取物中总芸香苷/起始材料中总芸香苷)×100]
芸香苷向异槲皮苷和栎精的转化
图1A说明了芸香苷的分子组成。酶α-L-鼠李糖苷酶的反应通过除去底部右手边的第一个糖导致芸香苷向图1B的异槲皮苷的生物转化。为了说明，α-L-鼠李糖苷酶基本上沿着图1A中线A-A’进行概念上的切割。
酶β-D-葡糖苷酶的反应通过除去图1B中底部右手边上的糖导致图1B的异槲皮苷向图1C的栎精的生物转化。为了说明，β-D-葡糖苷酶基本上沿着图1B中线B-B’进行概念上的切割。
如实施例5中所示，从上面的实施例2的富含芸香苷的组合物制备富含异槲皮苷的组合物。该制备方法包括提供处于适于酶温育的条件下的其中悬浮有芸香苷的溶液。实施例5中的这些条件包括升高溶液的温度到80℃，调节pH到4。向溶液中加入含有酶α-L-鼠李糖苷酶和β-D-葡糖苷酶的酶制品，即食品级柚苷酶粉末。在温育期间，该溶液的条件保持在适于酶温育的条件下，溶液的温度为50℃，并且持续搅拌。
将溶液的条件改变为不适于酶温育的条件，终止温育期。在实施例5中该改变包括持续搅拌下调节pH至2.5，然后加热到80℃保持10分钟。
如表4中所见，调节温育期的持续时间可以控制富含异槲皮苷的组合物中异槲皮苷的比例。异槲皮苷的比例随着温育期的延长而增加，8小时后芸香苷/异槲皮苷/栎精的重量比为1.71∶1∶0.06；16小时后为0.33∶1∶0.07；24小时后为痕量∶1∶0.46。
从而24小时后，基本上所有芸香苷都已经被转化成异槲皮苷和栎精。然而，24小时后，组合物含有的异槲皮苷仅为栎精的约2倍。之前，例如16小时时，组合物中异槲皮苷为栎精的约14倍，异槲皮苷为芸香苷的约3倍。
随着温育期进一步增加，可以看到异槲皮苷被进一步转化成栎精，栎精与异槲皮苷的比例一直增加直到96小时，组合物中芸香苷/异槲皮苷/栎精的重量比为痕量∶1∶3.38，组合物含有的栎精为异槲皮苷的三倍以上。
容易看出，通过调节温育期可以调节芸香苷、异槲皮苷和栎精的比例。以小时测量温育时间，从而可以得到相当大的时间范围以容许大规模地以商业上显著的量实现转化。
如实施例6中所示，一天的酶促转化后，商业来源的芸香苷(按重量计纯度为95％)被转化成富含异槲皮苷的组合物，其芸香苷/异槲皮苷/栎精的重量比为0.1∶1.0∶0.2。
如实施例7中所示，商业芸香苷从图3A的高芸香苷组合物被转化成图3B的高异槲皮苷和栎精组合物。
如实施例8所示，通过Deltaprep C-18层析进一步纯化实施例7中产生的高异槲皮苷和栎精组合物，得到高纯度(95％+)异槲皮苷，产率为起始材料中75％的异槲皮苷。
如实施例10中所示，通过加入D-Δ-葡糖酸内酯，或者其他食品助剂可以抑制柚苷酶中β-葡糖苷酶，而不影响α-鼠李糖苷酶的活性。D-Δ-葡糖酸内酯已经被多年用作食品添加剂，例如作为豆腐生产中的凝结剂。在本发明中D-Δ-葡糖酸内酯增加了灵活性并进一步确保该方法将产生高异槲皮苷产率。为了产生异槲皮苷，选择性抑制β-糖苷酶，或者从柚苷酶选择性分离α-鼠李糖苷酶在本发明的范围内。
如实施例11所示，中等规模的方法能够从荞麦叶产生高度富含异槲皮苷的产物。从而，可以从低价值的植物生物质产生新产品。
这样，一种商业可得到的酶混合物——柚苷酶可用于将芸香苷转化成有用的高价值类黄酮化合物栎精和异槲皮苷。此处公开的酶转化是有效的并且比现有技术更廉价，并且不使用有毒和可能有害的溶剂。在从该研究产生的生物转化产物之一中芸香苷/异槲皮苷/栎精重量比为痕量∶22.8∶7.3。其组成类似于银杏(Ginkgo Biloba)提取物，该提取物典型地含有24.5％黄酮糖苷和6.3％栎精。
连同混合在不同条件下加工的产物，可以定制具有不同化学谱的产物。该技术为制备“设计的营养药”提供了一定弹性。此外，使用层析或其他技术可将所转化的混合物分级分离和纯化成高纯度化合物。
尽管在文献中描述了分离类黄酮化合物的层析方法，但是它们主要为了分析目的而设计。以前还不知道使用Stack Pack柱纯化酶-转化的类黄酮化合物(芸香苷、异槲皮苷和栎精混合物)，该Stack Pack柱将处理5-50升提取物。
如实施例9中所示，本发明公开的生物转化技术还可以将金丝桃中的芸香苷转化成异槲皮苷和栎精。各种其他生物质如银杏、苜蓿、桑树叶等以及其他富含芸香苷的农业生物质如蔷薇果、苹果皮、梨子皮、洋葱皮和芦笋尖也含有芸香苷并且可用于产生富含异槲皮苷的组合物。
栎精和异槲皮苷由于稀有性和生物利用度/生物效能而要求更高价格。心血管疾病和癌症预防中栎精和异槲皮苷增加的生物利用度暗示着转化的类黄酮化合物产品在营养药和药物市场中的光明前景。
实施例5：使用酶水解将芸香苷转化成异槲皮苷和栎精
通过操纵生物转化条件，我们能够将富含类黄酮化合物的中间产物转化成含有不同组成的芸香苷/异槲皮苷/栎精的产物。
实施例2中产生的冷冻干燥的芸香苷产物(约60％芸香苷)被用于酶转化实验。将5g干燥芸香苷产物分散于500ml水中(固体∶液体比＝1∶100)。将分散体加热到80℃并调节pH至4。然后将分散体在50℃平衡，接着加入食品级柚苷酶粉(Amano Pharmaceutical Co.，Ltd；日本)。
如供应商的说明书中描述的，柚苷酶制品含有150单位β-葡糖苷酶或柚苷酶活性。在该试验中使用每克芸香苷66mg Amano柚苷酶的剂量。酶温育保持在50℃，持续搅拌适当的时间长度。一旦温育时间完成，通过调节溶液的pH至2.5然后持续搅拌下将温度加热到80℃10分钟使酶失活。80℃10分钟后，将溶液冷却到室温，并调节pH至7。通过喷雾干燥、冷冻干燥或其他适宜的方法将酶转化的产物干燥。
表4总结了制备含有各种芸香苷/异槲皮苷/栎精组成的产物所需的实验条件。为了方便的原因，此处描述的起始材料先前被冷冻干燥。实施例2中干燥步骤前回收的沉淀(小丸)也适于作为实施例5的起始材料。可在不同阶段，即，在类黄酮化合物提取前，水性提取后，预浓缩后，或者沉淀后，应用酶转化。实施与常规酶处理相同的方法之后，对照(没有酶)中类黄酮化合物组成(芸香苷/异槲皮苷/栎精)保持不变。这表明转化由柚苷酶的作用导致。
表4：使用柚苷酶对类黄酮化合物的酶转化
试验# 酶剂量(mg酶/g芸香苷ppt.) 温育时间(小时) 温育温度(℃) 芸香苷∶异槲皮苷∶栎精的重量比
 1  66  8  50  1.71∶1∶0.06
 2  66  16  50  0.33∶1∶0.07
3 66 24 50 痕量∶1∶0.46
 4  66  48  50 痕量∶1∶0.72
 5  66  72  50 痕量∶1∶1.65
 6  66  96  50 痕量∶1∶3.38
实施例6：高纯度商业芸香苷转化成异槲皮苷
使用从Sigma化学公司购买的商业芸香苷(95％纯度)，实施类似于实施例5中描述的酶温育，以将芸香苷转化成异槲皮苷。将10.90g芸香苷分散于1000ml水中。将该分散体加热到80℃并调节pH到4。然后将分散体在55℃平衡，接着加入2.42g柚苷酶粉。酶温育保持在55℃，持续搅拌24小时。一旦温育时间完成，通过调节溶液的pH至2.5然后持续搅拌下将温度加热到80℃10分钟使酶失活。80℃10分钟后，将溶液冷却到室温，并调节pH至7。取出1.0ml提取物等分试样用于终产物组成的RP-HPLC分析。冷冻干燥剩余的提取物。HPLC结果表明纯芸香苷标准已经被转化成含有0.12∶1∶0.21(重量比)的芸香苷/异槲皮苷/栎精组成的产物。
实施例7：扩大转化
从Street Chemicals购买的商业芸香苷用于类似于实施例6中描述的酶转化。商业芸香苷中芸香苷和异槲皮苷的浓度在图3A中显示。将109克芸香苷分散于4000ml水中。将该分散体加热到80℃并调节pH到4。然后将分散体在55℃平衡，接着加入24.2g柚苷酶粉。酶温育保持在55℃，持续搅拌24小时。一旦温育时间完成，通过调节溶液的pH至2.5然后持续搅拌下将温度加热到80℃10分钟使酶失活。80℃10分钟后，将溶液冷却到室温，并调节pH至7。溶液保存在冰箱(4℃)过夜。将离心回收的固体冷冻干燥。得到61.8g干物质。该产物的层析图在图3B中显示。
实施例8：异槲皮苷和栎精的制备级分离
将从实施例7的方法得到的固体(50gm)溶于70％甲醇中并过滤。所得提取物在Waters反相Bondapak C-18，40×310mm(15-20 125)柱上进行制备级层析，柱子用甲醇：1％乙酸梯度洗脱，流速为50ml/min，其中使用装备有Millennium V 2.15软件控制的486可变波长UV-Vis检测器的Waters Delta-Prep 4000系统。在280nm检测目标化合物。用实施例A中描述的分析型HPLC方法评价所收集的级分的纯度。异槲皮苷的产率为起始材料的75％，纯度为95％(图3C)。还从一个制备性HPLC级分回收了少量纯栎精。可以通过从热甲醇重结晶进一步提高制备性HPLC级分的纯度。
实施例9：从金丝桃提取物转化芸香苷
将几个金丝桃朔果的内容物合并，分散在水中，并实施类似于实施例5中描述的酶温育。已知金丝桃含有芸香苷。该实验的目的在于将金丝桃提取物中的芸香苷转化成异槲皮苷。将5.52g金丝桃提取物分散在500ml水中。加热分散体到80℃并调节pH到4。然后将分散体在55℃平衡，接着加入0.60g柚苷酶粉。酶温育保持在55℃，持续搅拌24小时。一旦温育时间完成，通过调节溶液的pH至2.5然后持续搅拌下将温度加热到80℃10分钟使酶失活。80℃10分钟后，将溶液冷却到室温，并调节pH至7。然后冷冻干燥提取物。将干燥产物溶于甲醇，过滤并通过RP-HPLC分析以确定芸香苷向异槲皮苷转化的程度。初始金丝桃提取物的HPLC结果表明芸香苷/异槲皮苷/栎精组成为0.47∶1∶0.21(重量比)。发现酶转化的产物含有的芸香苷/异槲皮苷/栎精组成为痕量∶1∶0.18(重量比)，这表明初始提取物中存在的所有芸香苷已经被转化成异槲皮苷和栎精。
实施例10：使用柚苷酶和D-Δ-葡糖酸内酯将芸香苷大规模转化成异槲皮苷
将来自ICN的药物级芸香苷(38.15g)分散在3.5L去离子水中。制备柚苷酶(8.47g溶于100ml水)和D-Δ-葡糖酸内酯(6.23g溶于100ml水)溶液。将D-Δ-葡糖酸内酯溶液加到芸香苷∶水混合物中。该混合物的pH为4.0。然后加热混合物到80℃并温育2小时。降温到55℃并加入柚苷酶溶液。搅拌下55℃温育混合物24小时。为了终止反应，降低pH到2.5并加热混合物到80℃10分钟。让混合物冷却到室温然后调节pH至7.0。然后过夜冷藏混合物以诱导沉淀形成，并让沉淀沉降。离心收集沉淀并将其冷冻干燥(PPT1级分)。将上清液浓缩然后再次离心。所得沉淀也被冷冻干燥(PPT2级分)。以该方式制备三批。通过HPLC分析来自每批的不同级分中的芸香苷、异槲皮苷和栎精。数据在表5中给出。
表5中的数据表明芸香苷和栎精表现为次要组分，而异槲皮苷是酶转化后所观察到的主要产物。例如，从通过实施例10的方法处理的三批产生了共77.72g异槲皮苷和0.53g栎精。异槲皮苷的大部分(61.8g)出现在PPT1级分中。该转化方法非常有效，因为通过该方法仅剩下0.2009g芸香苷未被转化。该数据还表明将抑制剂D-Δ-葡糖酸内酯包含在反应混合物中可以选择性地导致主要产生一种类型的类黄酮化合物，即异槲皮苷。
PPT1级分中异槲皮苷浓度的平均值为85.2％(范围为81.1-88.8％)。因此，该实施例还表明使用简单的生化纯化技术可以得到高纯度(＞80％)生物可利用的类黄酮化合物，而不需层析方法。上清液(SUP)级分也是有价值的，因为它们每101.66g干物质含有14.42g异槲皮苷。
表5：使用柚苷酶和作为选择性抑制剂的D-Δ-葡糖酸内酯对类黄酮化合物的酶转化
批# 总冷冻干燥重量(g) 总芸香苷(g) 总异槲皮苷(g) 总栎精(g)
 1PPT1PPT2SUP 23.230.5436.41 0.04950.00540.0844 18.84950.21056.9944 0.5299----
 2PPT1PPT2SUP 26.300.6430.64 0.0604---- 23.37680.28282.3697 ------
 3PPT1PPT2SUP 22.921.3434.61 --0.0012-- 19.61540.97275.0559 --0.0008--
实施例11：从荞麦叶材料提取、转化和纯化芸香苷
将1kg ManCan叶材料在10L 70％甲醇中50℃下提取3小时。3小时后，过滤混合物并用约4L热70％甲醇洗涤植物材料。合并滤液并用旋转蒸发器减小体积直到体积为原来体积的1/5。冷藏浓缩的提取物并让其过夜沉淀。搅拌混合物，然后将其离心以收集芸香苷。
基于前面的分析，估计1kg起始叶材料中芸香苷含量为33.66g。所用的酶和抑制剂的量基于这些估计，并且类似于前面的转化(7.36g柚苷酶；6.23g D-Δ-葡糖酸内酯；3.5L水)。
将芸香苷沉淀加入3.5L水，并加入D-Δ-葡糖酸内酯溶液。混合物的pH为4.0。然后将混合物加热到80℃并温育2小时。将混合物冷却到55℃并加入柚苷酶溶液。然后在55℃温育混合物24小时。降低pH到2.5并之后80℃温育10分钟以终止反应。让混合物冷却到室温然后调节pH至7.0。然后将混合物置于4℃过夜以容许沉淀形成。通过如实施例10中的离心收集沉淀。
搅拌下将沉淀溶于55℃甲醇。过滤溶液除去不溶物质。然后尽可能地浓缩滤液，但不让混合物在浓缩容器中产生气泡。此时，将1.5L热水加入混合物，通过在4℃温育2天重新沉淀物质，通过离心收集沉淀。然后将重新沉淀的物质用热水洗涤并第三次沉淀。将最终的沉淀物冷冻干燥形成终产物。
方法和实施例的注释
在Waters对称C-18柱(3.0.×.150mm，5微米)上通过反相高效液相层析(RP-HPLC)，用水性0.05％v/v三氟乙酸(TFA)∶乙腈(T＝0min，％乙腈＝10；T＝20min，％乙腈＝40；T＝30min，％乙腈＝10)的线性梯度洗脱，流速0.4mL/min，使用光电二极管阵列(PDA)检测器在350nm确定荞麦类黄酮化合物含量。通过使用商业途径购买的芸香苷、异槲皮苷和栎精标准制作外标准曲线以定量类黄酮化合物。
通过Minami等人(1998)描述的方法，通过溶剂提取出生物质中的芸香苷并以HPLC方法测定芸香苷。将1g生物质(通过100目筛)用40ml甲醇在70℃下在Soxhelt提取装置中提取60分钟。离心后的上清液用于测定。
如图4中概述，本发明提供了从含有芸香苷的植物生物质提取、浓缩和沉淀富含芸香苷的组合物，和使用方法A将芸香苷酶转化成富含异槲皮苷/栎精的组合物，或者备选地，产生富含异槲皮苷的产物。本发明的方法A和B的两种产物都可以用作健康食品、营养药、药物、化妆品和其他市场的添加剂。
前面的描述被考虑为仅用于举例阐明本发明的原理。此外，由于本领域技术人员将容易实施许多改变和修改，故不打算将本发明限制在所显示和描述的精确结构和实施方法中，因此，结构或实施方法中可以采取的所有这些适宜的改变和修改都将落在所要求的本发明的范围内。

Claims (120)

1.富含异槲皮苷的组合物，其通过包括如下步骤的方法制备：
提供处于适于酶温育的条件下的其中悬浮有芸香苷的溶液；
将含有柚苷酶的酶制品加入溶液；
在温育期保持适于酶温育的溶液条件；
通过将溶液的条件改变为不适于所述酶温育的条件而终止温育期；
其中通过调节温育期的持续时间控制组合物中的异槲皮苷的比例。
2.权利要求1的富含异槲皮苷的组合物，其中作为酶温育的结果，该组合物还富含栎精。
3.权利要求2的富含异槲皮苷的组合物，其中通过调节温育期的持续时间控制栎精和异槲皮苷的相对比例。
4.权利要求2的富含异槲皮苷的组合物，其中温育期的持续时间取决于酶制品的活性。
5.权利要求2的富含异槲皮苷的组合物，其中温育期的持续时间为1到48小时。
6.权利要求1的富含异槲皮苷的组合物，其中酶温育过程中溶液的条件包括温度和pH水平。
7.权利要求6的富含异槲皮苷的组合物，其中温度为50-55℃。
8.权利要求6的富含异槲皮苷的组合物，其中pH为4-8。
9.权利要求1的富含异槲皮苷的组合物，其中溶液的条件为酸性pH和基本上80℃的温度。
10.权利要求1的富含异槲皮苷的组合物，其中芸香苷与异槲皮苷的比例按重量计小于20∶1。
11.权利要求2的富含异槲皮苷的组合物，其中栎精与异槲皮苷的比例按重量计大于0.003∶1。
12.权利要求1的富含异槲皮苷的组合物，其中所述方法还包括在所述温育期终止后纯化所述溶液。
13.权利要求12的富含异槲皮苷的组合物，其中所述温育期终止后所述溶液的纯化使用常规生物化学纯化法实施。
14.利用常规生物化学纯化方法处理权利要求1的富含异槲皮苷的组合物制备的含有按重量计至少90％异槲皮苷的纯化的异槲皮苷组合物。
15.权利要求1的富含异槲皮苷的组合物，其中从商业来源得到富集或纯化形式的芸香苷。
16.权利要求1的富含异槲皮苷的组合物，其中通过权利要求53的方法得到芸香苷。
17.含有根据权利要求1的方法制备的异槲皮苷的富含异槲皮苷的组合物，所述组合物具有包括血管紧张肽-转化酶抑制性质、消炎性质、抗肿瘤性质、抗病毒性质、抗氧化性质、自由基清除性质、癌症预防性质、心脏保护性质、蛋白酶抑制性质、蛋白激酶C抑制性质、酪氨酸蛋白激酶抑制性质、拓扑异构酶II抑制性质和蛋白切割酶抑制性质的生物活性性质。
18.权利要求17的富含异槲皮苷的组合物，其中所述组合物的生物活性性质用于预防和治疗疾病和健康问题，所述疾病和健康问题包括，但不限于心血管疾病、中风、毛细血管脆性、动脉硬化症、创伤、氧化应激、高血压、升高的胆固醇、升高的甘油三酯、高血糖、II型糖尿病、肥胖和相关失调、阿尔茨海默氏病、帕金森病、哮喘和一些癌症。
19.权利要求17的富含异槲皮苷的组合物，其中所述组合物用于功能食品。
20.权利要求17的富含异槲皮苷的组合物，其中所述组合物用于天然健康产品。
21.权利要求17的富含异槲皮苷的组合物，其中所述组合物用于营养药产品。
22.权利要求17的富含异槲皮苷的组合物，其中所述组合物用于药品。
23.权利要求17的富含异槲皮苷的组合物，其中所述组合物用于化妆品。
24.富含异槲皮苷的组合物，其通过包括如下步骤的方法制备：
提供处于适于酶温育的条件下的其中悬浮有芸香苷的溶液；
将含有柚苷酶的酶制品加入溶液；
在温育期保持适于酶温育的溶液条件；
通过将溶液的条件改变为不适于酶温育的条件终止温育期；
其中通过调节温育期的持续时间控制组合物中的异槲皮苷的比例。
24.权利要求24的富含异槲皮苷的组合物，其中通过调节温育期的持续时间控制异槲皮苷的产率。
25.权利要求24的方法，其中温育期的持续时间为1-48小时。
26.权利要求24的富含异槲皮苷的组合物，其中通过向溶液中加入β-D-葡糖苷酶抑制剂控制芸香苷、栎精和异槲皮苷的相对比例。
27.权利要求26的富含异槲皮苷的组合物，其中在将所述酶制品加入溶液之前将所述β-D-葡糖苷酶抑制剂加入溶液。
28.权利要求26的富含异槲皮苷的组合物，其中β-D-葡糖苷酶抑制剂具有D-Δ-葡糖酸内酯的性质。
29.权利要求28的富含异槲皮苷的组合物，其中β-D-葡糖苷酶抑制剂为D-Δ-葡糖酸内酯。
30.权利要求24的富含异槲皮苷的组合物，其中酶制品含有α-L-鼠李糖苷酶。
31.权利要求24的富含异槲皮苷的组合物，其中酶温育过程中溶液的条件包括温度和pH水平。
32.权利要求31的富含异槲皮苷的组合物，其中温度为50-55℃。
33.权利要求31的富含异槲皮苷的组合物，其中pH为4-8。
34.权利要求24的富含异槲皮苷的组合物，其中酶温育过程中溶液的条件包括加入β-D-葡糖苷酶抑制剂。
35.权利要求34的富含异槲皮苷的组合物，其中β-D-葡糖苷酶抑制剂具有D-Δ-葡糖酸内酯的性质。
36.权利要求25的富含异槲皮苷的组合物，其中β-D-葡糖苷酶抑制剂为D-Δ-葡糖酸内酯。
37.权利要求35的方法，其中D-Δ-葡糖酸内酯的浓度大于1mM。
38.权利要求24的富含异槲皮苷的组合物，其还包括通过变性酶α-L-鼠李糖苷酶终止温育期。
39.权利要求24的富含异槲皮苷的组合物，其中从商业来源得到富集的或纯化形式的芸香苷。
40.权利要求24的富含异槲皮苷的组合物，其中通过权利要求53的方法得到芸香苷。
41.权利要求24的富含异槲皮苷的组合物，其中芸香苷与异槲皮苷的比例按重量计小于20∶1。
42.权利要求24的富含异槲皮苷的组合物，其中栎精与异槲皮苷的比例按重量计大于0.003∶1。
43.权利要求24的富含异槲皮苷的组合物，其中所述方法还包括所述温育期终止后纯化所述溶液。
44.权利要求43的富含异槲皮苷的组合物，其中所述温育期终止后所述溶液的纯化使用常规生物化学纯化法实施。
45.利用常规生物化学纯化方法处理权利要求24的富含异槲皮苷的组合物制备的含有按重量计至少90％异槲皮苷的纯化的异槲皮苷组合物。
47.含有根据权利要求1的方法制备的异槲皮苷的富含异槲皮苷的组合物，所述组合物具有包括血管紧张肽-转化酶抑制性质、消炎性质、抗肿瘤性质、抗病毒性质、抗氧化性质、自由基清除性质、癌症预防性质、心脏保护性质、蛋白酶抑制性质、蛋白激酶C抑制性质、酪氨酸蛋白激酶抑制性质、拓扑异构酶II抑制性质和蛋白切割酶抑制性质的生物活性性质。
47.权利要求46的富含异槲皮苷的组合物，其中所述组合物的生物活性性质用于预防和治疗疾病和健康问题，所述疾病和健康问题包括，但不限于心血管疾病、中风、毛细血管脆性、动脉硬化、创伤、氧化应激、高血压、升高的胆固醇、升高的甘油三酯、高血糖、II型糖尿病、肥胖和相关失调、阿尔茨海默氏病、帕金森病、哮喘和一些癌症。
48.权利要求46的富含异槲皮苷的组合物，其中所述组合物用于功能食品。
49.权利要求46的富含异槲皮苷的组合物，其中所述组合物用于天然健康产品。
50.权利要求46的富含异槲皮苷的组合物，其中所述组合物用于营养药产品。
51.权利要求46的富含异槲皮苷的组合物，其中所述组合物用于药品。
52.权利要求46的富含异槲皮苷的组合物，其中所述组合物用于化妆品。
53.从含有芸香苷的生物质制备富含芸香苷的组合物的方法，该方法包括：
使用含有水或醇的水性溶液对生物质实施类黄酮化合物提取步骤；
过滤该溶液以产生提取溶液；
容许提取溶液静置从而形成沉淀；
收集并干燥沉淀以形成富含芸香苷的组合物。
54.权利要求53的方法，其中类黄酮化合物提取步骤包括打碎生物质并在水性溶液中搅拌。
55.权利要求53的方法，其还包括在静置提取溶液之前浓缩提取溶液以形成体积小于其原始体积的1/5的浓缩提取溶液。
56.权利要求55的方法，其中使浓缩的提取溶液在低于10℃的温度下静置。
57.权利要求53的方法，其中水性溶液含有水并且保持在高于30℃的温度。
58.权利要求53的方法，其中水性溶液含有醇。
59.权利要求58的方法，其中水性溶液具有按体积计浓度大于20％的醇，并且溶液的其余部分为水。
60.权利要求59的方法，其中水性溶液具有按体积计浓度50％到100％的醇，并且溶液的其余部分为水。
61.权利要求59的方法，其中提取过程中水性溶液的温度保持在30℃到99℃。
62.权利要求53的方法，其中植物生物质含有来自荞麦属成员的生物质。
63.权利要求53的方法，其中生物质含有金丝桃叶、银杏、bilola、苜蓿、桑树、藻类、苹果皮、梨子皮、洋葱皮、芦笋尖及蔷薇果果皮中的至少一种。
64.含有根据权利要求53的方法制备的芸香苷的富含类黄酮化合物的组合物，所述组合物具有包括血管紧张肽-转化酶抑制性质、消炎性质、抗肿瘤性质、抗病毒性质、抗氧化性质、自由基清除性质、癌症预防性质、心脏保护性质、蛋白酶抑制性质、蛋白激酶C抑制性质、酪氨酸蛋白激酶抑制性质、拓扑异构酶II抑制性质和蛋白切割酶抑制性质的生物活性性质。
65.权利要求64的富含类黄酮化合物的组合物，其中所述组合物的生物活性性质用于预防和治疗疾病和健康问题，所述疾病和健康问题包括，但不限于心血管疾病、中风、毛细血管脆性、动脉硬化、创伤、氧化应激、高血压、升高的胆固醇、升高的甘油三酯、高血糖、II型糖尿病、肥胖和相关失调、阿尔茨海默氏病、帕金森病、哮喘和一些癌症。
66.权利要求64的富含类黄酮化合物的组合物，其中所述组合物用于功能食品。
67.权利要求64的富含类黄酮化合物的组合物，其中所述组合物用于天然健康产品。
68.权利要求64的富含类黄酮化合物的组合物，其中所述组合物用于营养药产品。
69.权利要求64的富含类黄酮化合物的组合物，其中所述组合物用于药品。
70.权利要求64的富含类黄酮化合物的组合物，其中所述组合物用于化妆品。
71.产生富含异槲皮苷的组合物的方法，所述方法包括：
提供处于适于酶温育的条件下的其中悬浮有芸香苷的溶液；
将含有柚苷酶的酶制品加入溶液；
在温育期保持适于酶温育的溶液条件；
通过将溶液的条件改变为不适于所述酶温育的条件终止温育期，所述溶液在此时为富含异槲皮苷的组合物；
其中通过调节温育期的持续时间控制组合物中异槲皮苷的比例。
72.权利要求71的方法，其中作为所述酶温育的结果，所述组合物还含有栎精。
73.权利要求72的方法，其中通过调节温育期的持续时间控制栎精和异槲皮苷的相对比例。
74.权利要求71的方法，其中温育期的持续时间取决于酶制品的活性。
75.权利要求71的方法，其中温育期的持续时间为1-48小时。
76.权利要求71的方法，其中酶温育过程中溶液的条件包括温度和pH水平。
77.权利要求76的方法，其中温度为50-55℃。
78.权利要求76的方法，其中pH为4-8。
79.权利要求71的方法，其中溶液的条件为酸性pH和基本上80℃的温度。
80.权利要求71的方法，其中芸香苷与异槲皮苷的比例按重量计小于20∶1。
81.权利要求80的方法，其中栎精与异槲皮苷的比例按重量计大于0.003∶1。
82.权利要求71的方法，其还包括终止所述温育期后纯化所述溶液。
83.权利要求82的方法，其中终止所述温育期后所述溶液的纯化使用常规生物化学纯化法实施。
84.通过权利要求83的方法生产的产品，其为纯化的异槲皮苷。
85.含有根据权利要求71的方法产生的异槲皮苷的富含异槲皮苷的组合物，所述组合物具有包括血管紧张肽-转化酶抑制性质、消炎性质、抗肿瘤性质、抗病毒性质、抗氧化性质、自由基清除性质、癌症预防性质、心脏保护性质、蛋白酶抑制性质、蛋白激酶C抑制性质、酪氨酸蛋白激酶抑制性质、拓扑异构酶II抑制性质和蛋白切割酶抑制性质的生物活性性质。
86.权利要求85的富含异槲皮苷的组合物，其中所述组合物的生物活性性质用于预防和治疗疾病和健康问题，所述疾病和健康问题包括，但不限于心血管疾病、中风、毛细血管脆性、动脉硬化症、创伤、氧化应激、高血压、升高的胆固醇、升高的甘油三酯、高血糖、II型糖尿病、肥胖和相关失调、阿尔茨海默氏病、帕金森病、哮喘和一些癌症。
87.权利要求85的富含异槲皮苷的组合物，其中所述组合物用于功能食品。
88.权利要求85的富含异槲皮苷的组合物，其中所述组合物用于天然健康产品。
89.权利要求85的富含异槲皮苷的组合物，其中所述组合物用于营养药产品。
90.权利要求85的富含异槲皮苷的组合物，其中所述组合物用于药品。
91.权利要求85的富含异槲皮苷的组合物，其中所述组合物用于化妆品。
92.产生富含异槲皮苷的组合物的方法，所述方法包括：
提供处于适于酶温育的条件下的其中悬浮有芸香苷的溶液；
将含有柚苷酶的酶制品加入溶液；
在温育期保持适于酶温育的溶液条件；
通过将溶液的条件改变为不适于酶温育的条件终止温育期；
其中通过调节温育期的持续时间控制组合物中的异槲皮苷的比例。
93.权利要求92的方法，其中通过调节温育期的持续时间控制异槲皮苷的产率。
94.权利要求92的方法，其中温育期的持续时间为1到48小时。
95.权利要求92的方法，其还包括向溶液中加入β-D-葡糖苷酶抑制剂以控制溶液中芸香苷、栎精和异槲皮苷的相对比例。
96.权利要求95的方法，其中在将所述酶制品加入溶液之前将所述β-D-葡糖苷酶抑制剂加入溶液。
97.权利要求95的方法，其中β-D-葡糖苷酶抑制剂具有D-Δ-葡糖酸内酯的性质。
98.权利要求97的方法，其中β-D-葡糖苷酶抑制剂为D-Δ-葡糖酸内酯。
99.权利要求92的方法，其中酶制品含有α-L-鼠李糖苷酶。
100.权利要求92的方法，其中酶温育过程中溶液的条件包括温度和pH水平。
101.权利要求100的方法，其中温度为50-55℃。
102.权利要求100的方法，其中pH为4-8。
103.权利要求92的方法，其中酶温育过程中溶液的条件包括加入β-D-葡糖苷酶抑制剂。
104.权利要求103的方法，其中β-D-葡糖苷酶抑制剂具有D-Δ-葡糖酸内酯的性质。
105.权利要求104的方法，其中β-D-葡糖苷酶抑制剂为D-Δ-葡糖酸内酯。
106.权利要求105的方法，其中D-Δ-葡糖酸内酯的浓度大于1mM。
107.权利要求92的方法，其还包括通过变性酶α-L-鼠李糖苷酶终止温育期。
108.权利要求92的方法，其中芸香苷与异槲皮苷的比例按重量计小于20∶1。
109.权利要求92的方法，其中栎精与异槲皮苷的比例按重量计大于0.003∶1。
110.权利要求92的方法，其还包括终止所述温育期后纯化所述溶液。
111.权利要求110的方法，其中终止所述温育期后所述溶液的纯化使用常规生物化学纯化法实施。
112.按照权利要求111的方法生产的产品，其为纯化的异槲皮苷。
113.含有按照权利要求92的方法产生的异槲皮苷的富含异槲皮苷的组合物，所述组合物具有包括血管紧张肽-转化酶抑制性质、消炎性质、抗肿瘤性质、抗病毒性质、抗氧化性质、自由基清除性质、癌症预防性质、心脏保护性质、蛋白酶抑制性质、蛋白激酶C抑制性质、酪氨酸蛋白激酶抑制性质、拓扑异构酶II抑制性质和蛋白切割酶抑制性质的生物活性性质。
114.权利要求113的富含异槲皮苷的组合物，其中所述组合物的生物活性性质用于预防和治疗疾病和健康问题，这些疾病和健康问题包括，但不限于心血管疾病、中风、毛细血管脆性、动脉硬化、创伤、氧化应激、高血压、升高的胆固醇、升高的甘油三酯、高血糖、II型糖尿病、肥胖和相关失调、阿尔茨海默氏病、帕金森病、哮喘和一些癌症。
115.权利要求113的富含异槲皮苷的组合物，其中所述组合物用于功能食品。
116.权利要求113的富含异槲皮苷的组合物，其中所述组合物用于天然健康产品。
117.权利要求113的富含异槲皮苷的组合物，其中所述组合物用于营养药产品。
118.权利要求113的富含异槲皮苷的组合物，其中所述组合物用于药品。
119.权利要求113的富含异槲皮苷的组合物，其中所述组合物用于化妆品。
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