KR100832231B1

KR100832231B1 - 바실러스 서브틸리스 균주 및 이로부터 불쾌취가 적고기능성이 강화된 청국장의 제조방법

Info

Publication number: KR100832231B1
Application number: KR1020070081547A
Authority: KR
Inventors: 박용수; 고명석; 이봉수; 권이성; 이슬이; 최은오; 윤영미; 정봉우; 이은미
Original assignee: 무주군약초영농조합법인
Priority date: 2007-08-14
Filing date: 2007-08-14
Publication date: 2008-05-23

Abstract

본 발명은 바실러스 서브틸리스 MJ101 (Bacillus subtilis MJ101)균주(기탁번호 KFCC11391P) 및 이로부터 불쾌취가 적고 기능성이 높은 청국장의 제조방법에 관한 것으로 보다 상세하게는 청국장에서 분리한 바실러스 서브틸리스MJ101(Bacillus subtilis MJ101)균주(기탁번호 KFCC11391P)를 이용하여 어글리콘 상태의 이소플라본 함량을 향상시키며, 발효조건을 조절하여 불쾌취를 저감시키고자 하는 것이 목적이다.

Bacillus subtilis MJ101 (기탁번호 KFCC11391P),청국장, 이소플라본, 불쾌취 제거

Description

바실러스 서브틸리스 균주 및 이로부터 불쾌취가 적고 기능성이 강화된 청국장의 제조방법{Bacillus subtilis MJ101 and Processing method for Chunggukjang which was enriched funtion by aglycone isoflavones and has lower smell}

도 1은 본 발명에서 사용된 균주로서 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis MJ101)(기탁번호 KFCC11391P)의 현미경 사진이다.

도 2는 이소플라본의 액체크로마토그래피 크로마토그램

도 3은 본 발명의 청국장과 일반 청국장의 이소플라본을 분석한 그래프로서 본 발명의 청국장이 어글리콘 형태의 이소플라본을 더 많이 생산하며, 특히 온도조건을 달리 했을때 어글리콘 형태의 이소플라본이 많이 생산되는 것을 볼 수 있다.

도 4는 본 발명에서 사용된 보통배지의 액체배지를 제조하는 공정도이다.

본 발명은 바실러스 서브틸리스 MJ101(Bacillus subtilis)균주(기탁번호 KFCC11391P) 및 이로부터 불쾌취가 적고 기능성이 강화된 청국장의 제조방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게는 청국장에서 분리한 바실러스 서브틸리스MJ101 (Bacillus subtilis MJ101)균주 (기탁번호 KFCC11391P)를 이용하여 어글리콘 상태 의 이소플라본 함량을 향상시키며, 발효조건을 조절하여 불쾌취를 저감시키고자 하는 것이 목적이다.

전통식품 중의 하나로서 최근 건강식품으로 각광을 받고 있는 청국장을 제조함에 있어 대두의 기능성분인 이소플라본 중 기능성이 높고 활성이 큰 어글리콘 형태의 이소플라본 생산량을 증가시키고, 이와 더불어 청국장의 큰 특징 중의 하나인 불쾌취를 감소시키는 발효방법을 개발함으로써, 좀 더 쉽게 고 기능성의 청국장을 활용할 수 있도록 한다. 또한 여러 가지 가공 식품 형태로 활용할 수 있는 폭이 넓어져 대두의 소비를 증가시켜 대두 재배농가의 수익증가와 식품업체의 매출향상에 도움이 되고자 한다.

청국장은 삶은 콩에 고초균을 번식시켜 콩 단백질을 분해시키고 파, 마늘, 고춧가루, 소금 등을 가미하여 저장성을 부여한 식품으로, 제조기간이 짧고, 독특한 맛과 향을 가지고 있으며 각종 유기산 및 비타민 함량이 높아 영양학적 가치가 높은 식품으로 알려져 있다. 또한 전통 대두발효 식품류 중 가장 짧은 기일(2~3일)에 완성할 수 있으면서도 그 풍미가 독특하고, 곡류를 주식으로 하여 온 우리 민족에게 부족하기 쉬운 단백질 급원식품으로써 영양적, 경제적으로 가장 효과적인 콩의 섭취방법이다.

청국장은 청국장균의 정장효과, 섬유질의 변비예방효과, 발암물질과 콜레스 테롤의 체외 배출효과, 점질물의 알콜 흡수에 의한 해장효과, 사포닌의 혈관강화, 혈액순환 촉진 및 젖산분해효과, 레시틴의 뇌 노화, 치매, 고혈압 및 동맥경화 예방 등의 효과가 있는 것으로 알려져 있으며, 혈전용해, 골다공증 예방에 있어서도 우수한 것으로 알려져 있다.

일본에서는 우리나라 청국장과 유사한 대두발효식품인 나토에 나토키나제(nattokinase)라는 혈전용해 효소가 존재함이 알려져 현재 나토가 건강식품으로 판매가 급증하고 있다. 혈전에 의한 뇌혈관 질환은 몸에 상처가 발생했을 때 혈액을 응고시키기 위해 생긴 피브린(fibrin)이 뇌혈관 등에 분해되지 않고 축적되어 혈액순환을 차단함으로써 발생한다. 최근 이들 질환의 예방 및 치료에 대한 연구가 활발히 진행되고 있으며 그의 일환으로 혈전의 생성을 억제하는 항혈전제의 개발과 생성된 혈전을 용해시키는 혈전용해제 개발이 이루어지고 있다. 청국장 발효균주는 발효과정에서 프로테아제(protease), 유로키나제(urokinase), 스트렙토키나제(streptokinase), 나토키나제(nattokinase) 등의 효소를 생성하는데 이런 효소들은 혈전용해능이 있어 심근경색, 뇌혈전 등을 예방하는 것으로 알려져 있다.

콩에 들어 있는 여러 기능성 성분 중 이소플라본(isoflavone)은 포유 동물에서 약한 에스트로겐 활성을 보이므로 식물성에스트로겐(phytoestrogen)으로 분류하며, 폐경기 증후군, 골다공증, 심혈관계질환, 유방암, 전립선암, 대장암 등과 같이 호르몬과 관련된 질환의 예방에 효과가 있는 것으로 알려지고 있다. 이소플라본은 제니스테인(genistein)과 다이드제인(daidzein), 이들의 배당체인 제니스틴(genistin), 다이드진(daidzin)과 그 밖에 여러 유도체 등으로 구성되어 있다. 이 중 제니스테인은 뛰어난 항암효과를 가진 것으로 알려져 있으며, 특히 유방암과 전립선암에 예방 효과가 높다고 알려지고 있다. 또한 여성 호르몬인 에스트로겐(estrogen)과 유사한 작용을 하기 때문에 폐경기 여성의 에스트로겐 결핍으로 인해 유발되는 골다공증의 예방과 진행 억제에 효과가 있는 것으로 알려져 있다. 콩의 이소플라본은 포도당 잔기가 베타-1,4-글리코시드(β-1,4 glycoside) 결합을 한 배당체 형태로 대부분 존재하지만, 발효식품에는 당이 분해된 어글리콘(aglycone) 형태가 많이 존재한다. 어글리콘인 제니스테인을 섭취한 경우와 배당체인 제니스틴을 섭취한 경우에 이들의 체내 대사는 약간 차이가 있는데, 실험동물을 이용한 실험과 인체 실험에서 어글리콘인 제니스테인이 더 빨리 흡수되는 것으로 알려져 있다. 어글리콘 형태는 발효과정에서 배당체의 당류부분이 분해되어 생성되는 것으로 알려져 있다. 따라서 발효 균주와 발효정도가 이소플라본의 생체이용률을 높일 수 있는 요인으로 작용할 수 있다.

최근 노화와 성인병 질환의 원인이 생체 내에서 발생하는 하이드록시라디칼, 슈퍼옥사이드라디칼, 과산화수소 등과 같은 활성산소종에 의한 산화적 대사 부산물이 중요한 원인이 된다는 학설이 있으며, 또한 활성산소종이 단백질, 생체막, 디엔에이(DNA)등에 유해한 작용을 하게 됨에 따라 활성산소종을 조절할 수 있는 물질로 알려진 항산화제에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다. 항산화물질은 과일과 채소 에 많이 존재하며 많은 경우에 항암효과와 관련되어 있다. 대두와 청국장에는 이소플라본과 대부분의 아미노산 및 갈변물질 등이 항산화에 관여하는 것으로 알려져 있다.

본 발명은 전통적인 방법으로 제조한 청국장으로부터 바실러스 서브틸리스 MJ101 (Bacillus subtilis MJ101, 기탁번호 KFCC11391P)를 분리, 대두에 접종하여 항암활성과 신체흡수율이 높은 이소플라본의 어글리콘을 많이 생성한 청국장을 제조하며, 동시에 항산화활성이 높은 청국장을 생산하는 균주를 분리동정하여 기능성이 우수한 청국장을 제조하고자 한다.

상기 청국장은 불쾌취가 적고 기능성이 높은 청국장으로서 환이나 알약 등의 제형으로 제조하여 기능식품으로서 응용이 가능하고, 분말 등으로 가공하여 일반식품에도 응용이 가능한 제품이다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명은 전통적인 방법으로 제조한 청국장으로부터 분리한 바실러스 서브틸리스 MJ101(Bacillus subtilis MJ101, 기탁번호 KFCC11391P)를 진탕배양한 후 이 배양액을 삶은 대두에 접종하여 청국장을 만드는 과정과 발효조건을 조절하여 어글리콘 형태의 이소플라본을 보다 많이 생성하게 하 는 단계로 나눌 수 있다.

한편, 상기 바실러스 서브틸리스 MJ101 (기탁번호 KFCC11391P)를 영양배지에 접종하여 30℃에서 24시간 배양한 것을 실온에서 보관, -20℃ 이하에서 냉동 보관 또는 동결 건조시킨 종균 제제임을 특징으로 한다.

이하 본 발명을 준비예, 시험예, 실시예를 통하여 구체적으로 설명하고자 한다. 그러나, 이들은 본 발명을 보다 상세하게 설명하기 위한 것으로 본 발명의 권리범위가 이들에 의해 한정되는 것은 아니다. 본 발명에 사용된 바실러스 서브틸리스 MJ101 (기탁번호 KFCC11391P)는 일반적인 바실러스 서브틸리스의 형태학적 특성 및 생화학적 특성이 유사하나 어글리콘 상태의 이소플라본 생성능력이 우수하고 발효 후 불쾌취가 적은 것이 특징이다.

<준비예1> 바실러스 서브틸리스 MJ101 (Bacillus subtilis MJ101) 배양액 제조

바실러스 서브틸리스 MJ101 (기탁번호 KFCC11391P)을 배양하기 위하여 보통배지를 제조한다. 보통배지의 액체배지는 펩톤 0.5%, 쇠고기엑스0.5%를 증류수 1000ml에 용해시켜 도4와 같은 순서로 제조하여 사용한다. 보통배지의 고체배지는 액체배지에 한천을 1.5%~2.0% 가량 첨가하여 멸균한 후 40℃로 식혀 페트리디쉬에 깔아서 사용한다.

액체배지에 화염 멸균한 백금이로 동결건조 된 바실러스 서브틸리스 MJ101 (기탁번호 KFCC11391P)를 일정부분 취하여 접종한 후 30℃에서 24시간 배양하였다.

24시간 배양한 배양액을 백금이로 일정 부분 취한 후 보통배지의 고체배지에 획선 도말한 후 다시 30℃에서 24시간 배양하였다.

배양 후에 고체 배지에 나타난 바실러스 서브틸리스 MJ101(기탁번호 KFCC11391P)의 특징은 표1과 같으며, 이중 다른 콜로니와 겹치지 않으며, 흰 빛을 띠고 둥글게 형성된 콜로니를 백금이로 취하고 다시 보통배지의 고체배지에 획선 도말하여 충분히 활성화 시킨 후 청국장 제조에 사용한다.

상기에서 분리한 바실러스 서브틸리스 MJ101(기탁번호 KFCC11391P)를 광학현미경을 사용하여 적절한 배율을 맞춘 후 검사하여 도1와 같이 바실러스 균임을 확인하였다.

바실러스 서브틸리스 MJ101 (기탁번호 KFCC11391P)의 특징

균주 특성	Bacillus subtilis MJ101
세포직경>1.0㎛	-^z
원형포자	-
내생포자	+
그람염색	+
형태	간균
팽창된포자낭	-
부포자 결정	-
콜로니 모양	둥근모양, 광택없음, 흰색, 넓게 퍼짐, 균사

-^z: 90% 이상이 음성, +: 90% 이상이 양성, -: 음성

<준비예2> 바실러스 서브틸리스 MJ101 (기탁번호 KFCC11391P) 배양

상기 준비예 1에서 사용한 보통액체배지(Nutrient broth)에 충분히 활성화 시킨 바실러스 서브틸리스 MJ101 (기탁번호 KFCC11391P)를 백금이로 한 콜로니를 취하여 접종하고 30℃에서 24시간 배양하여 배양액을 얻는다.

<준비예3> 대두의 증숙

국내에서 수확한 대두를 구입하여 정선한 후, 이를 12시간 동안 정수된 물에 침지하고, 121℃에서 60분간 증자하여 사용하였다. 그러나 이것은 예시적인 것으로서 콩이 손으로 쉽게 으깨어질 정도로 호화시키면 충분하다.

<실험예1> 대두 및 청국장으로부터 이소플라본의 추출

이소플라본 함량을 측정하기 위하여 대두 또는 청국장으로부터 이소플라본을 추출하여 분석한다. 이 때 대두 또는 청국장으로부터 이소플라본을 가장 많이 그리고 신속하게 추출하는 전처리 방법을 반복실험하여 구한다.

본 실험에서는 대두 또는 청국장을 일정부분 취하여 중량을 재고 고속분쇄기 또는 막자사발 등을 이용하여 200메시(mesh) 크기로 분쇄하여 사용하였다. 분쇄된 대두 또는 청국장 시료에 부피를 잰 65% 에탄올(물 35%;부피분율)을 첨가한 후 잘 흔들어 섞이도록 한다. 에탄올의 농도는 상기 준비예 3에서 사용된 대두를 기준으로 반복실험을 통하여 이소플라본의 추출량을 최대로 하는 농도를 기준으로 설정되었으며, 이는 대두의 상태나 종류에 따라 달라질 수 있으며, 이는 실시자에 판단에 따라 동일한 조건으로 실시하거나 수정하여 사용해도 무방하다. 65% 에탄올을 첨가한 시료를 40℃ 가온 조건에서 진탕하면서 약 2시간 추출한 후 분석에 사용하였다. 이는 반복실험결과 2시간 추출시 이소플라본 함량곡선이 거의 수평을 이루어 더 이상의 추출이 필요 없으리라는 판단하에 결정되어 진 것이며, 분석시 추출시간의 증가는 무방하다. 추출된 시료는 원심분리 등을 이용하여 1차적으로 잔류물질을 제거하고, 0.45㎛ 시린지필터(Syringe filter)로 여과한 후 분석에 사용하였다.

<실험예2> 이소플라본의 분석

대두의 유용성분인 이소플라본의 분석을 위하여 고속액체크로마토그래피(HPLC;High Performance Liquid Chromatography) 장치를 활용하여 측정하였다. 본 실험예에 사용된 기기는 워터스(Waters) 사의 얼라이언스(Alliance) 2695 시스템이며, 동 사의 2996 피디에이 디텍터(PDA detector)를 사용하여 분석하였다. 이는 이소플라본 분석을 위한 장치이며, 본 실험예와 동일한 조건을 맞출 수 있는 기기이면 어떤 기기라도 무방하다.

분석을 위한 컬럼은 워터스 사의 엑스테라(XTerra RP18, 4.6×250㎜) 컬럼을 사용하였으며, 컬럼의 온도는 30℃를 유지하였다. 이동상은 아세토나이트릴과 물에 0.1%부피 아세트산을 첨가하여 사용하였다. 전개 시작부터 50분까지는 아세토나이트릴과 물의 비율을 15:85에서 35:65로 일정하게 변화시키면서 전개하였으며, 50분에서 51분 사이에는 다시 35:65에서 15:85의 비율로 돌아가도록 하였다. 또한 다음 시료분석을 위하여 분석 간에 9분간의 지연시간을 두었다. 크로마토그램은 254㎚에서 추출하여 분석하였으며, 이동상의 전개속도는 1㎖/min, 시료의 양은 10㎕를 주입하여 시행하였다. 정량분석은 농도별로 표준물질을 제조하여 정량곡선을 그린 후 정량에 활용하였다. 표준물질을 50% 아세토나이트릴에 녹여서 각각 1000 mg/l가 되도록 하여 스탁솔루션(Stock solution)으로 활용하였다. 각 표준물질의 스탁솔루션으로부터 20mg/l, 40mg/l, 80mg/l, 100mg/l 표준물질 용액을 제조하였다. 제조된 표준물질 용액을 차례대로 액체크로마토그래피에 주입하여 크로마토그램을 얻은 후 피크 면적으로부터 정량곡선을 작성하였다. 이 때 분석에 나타난 크로마토그램은 도2와 같이 다이드진(daidzin), 제니스틴(genistin), 다이드제인(daidzein), 제니스테인(genistein)의 순서로 나타났다. 분석에 사용된 시약은 모두 특급시약을 사용하였으며, 정량분석을 위한 표준물질은 시그마(Sigma)사로부터 구입하여 사용하였다.

<실시예1> 청국장의 제조

준비예2에서 제조한 배양액을 준비예3에서 증숙한 대두에 접종함으로써 청국장을 제조한다. 이 때 바실러스 서브틸리스 MJ101 (기탁번호 KFCC11391P) 배양액은 증숙한 대두에 접종할 시 대두의 중량 기준으로 3~5 중량%를 첨가하여 배양되도록 한다. 배양은 전용 배양기에서 이루어졌으며, 전용 배양기는 습도가 90% 이상 유지되었으며, 온도는 35~45℃를 유지하도록 하였다. 상기의 전용배양기는 온도와 습도가 유지되며, 외부로부터 오염을 방지할 수 있는 배양장치면 어떤 것이라도 무방하다. 총 배양시간은 48시간 동안 실시하였으며, 이는 본 실시예에서 사용한 바실러스 서브틸리스 MJ101 (기탁번호 KFCC11391P)의 배양주기에 따른 작업요건으로 배양곡선이 정치기로 들어서서 사멸기로 들어가기 직전까지를 배양시간으로 설정한 것이다.

제조한 청국장을 분쇄하여 실험예1에서 실시한 방법으로 전처리한 후 실험예2에서 실시한 분석방법을 통하여 분석하였다. 이를 일반 대두와 일반 청국장과 비교하여 표2에 나타내었다.

이소플라본의 비교 (단위 : mg/kg)

	다이드진 (daidzin)	제니스틴 (genistin)	다이드제인 (daidzein)	제니스테인 (genistein)
일반대두	100.186	96.732	21.3	33.12
일반 청국장	79.595	76.124	41.475	53.381
본 실시예 청국장	59.640	52.381	60.362	68.619

표2에서와 같이 바실러스 서브틸리스 MJ101 (기탁번호 KFCC11391P)로 제조한 청국장의 경우 일반 청국장에 비해 배당체 형태의 이소플라본을 어글리콘 형태로 변화시키는 능력이 탁월함을 볼 수 있다.

<실시예2> 어글리콘 형태의 이소플라본 함량을 증가시키는 배양조건

실시예1에서와 같이 준비예2에서 제조한 배양액을 준비예3에서 준비한 증숙대두에 접종한다. 이 때 바실러스 서브틸리스 MJ101 (기탁번호 KFCC11391P) 배양액은 대두의 중량 기준으로 3~5 중량%를 접종하여 배양한다. 배양기는 전용 배양기에서 이루어졌다. 이때 조건은 같으나 상기 실시예1에서와 다른 점은 쿨링시스템을 갖춰 온도를 낮추어 배양할 수 있는 장치를 갖추었다는 점이다. 초기 24시간 동안 실시예1에서와 같은 습도 90%를 유지하고 온도를 40℃로 유지하여 배양하였다. 24시간이 되는 시점부터 48시간이 되는 시점까지 40℃에서 10℃로 선형적으로 변화시켰으며, 습도 유지장치도 가동을 중단하였다. 이 때 결과는 도3과 같으며, 본 실시예와 같은 조건으로 배양할 시 어글리콘 상태의 이소플라본의 생성이 더 많이 이루어진다.

<실시예3> 청국장 불쾌취의 측정

청국장의 대표적인 특징 중의 하나인 불쾌한 냄새의 측정을 위하여 지원자를 대상으로 30명을 선별하여 냄새의 관능 검사를 실시하였다. 전통적인 방법으로 지푸라기를 꽂은 후 아랫목에서 발효한 청국장과 두 개 회사를 선별하여 청국장을 구입한 후 본 발명에서 제조한 청국장과 비교하였다. 검사방법은 각 청국장을 작은 병에 따로 담고, 겉에는 번호로 라벨링하여 시료가 어디에서 제조한 것인지 모르게 하였다. 뚜껑을 덮고 냄새가 충분히 평형상태를 이루게 한 후 검사를 시작하였으며, 한 가지 샘플의 냄새를 맡고 난 후에는 약 20분간 바람이 잘 통하는 곳에서 후각능력을 회복한 후 다른 샘플의 냄새를 맡도록 하였다. 그 결과는 아래 표3과 같다.

청국장의 관능평가

	전통적 방법으로 제조한 청국장	A사 청국장	B사 청국장	실시예1의 청국장	실시예 2의 청국장
+++	21	15	13	9	·
++	8	8	9	2	2
+	1	5	5	15	9
-	·	2	2	3	17
--	·	·	1	1	2

* +++: 냄새가 매우 역하다, ++: 냄새가 보통 정도로 역하다, +: 냄새가 조금 역하다, - : 냄새가 약하다. --: 냄새가 거의 나지 않는다. ---: 냄새가 없다.

위의 결과를 요약해 봤을 때 실시예2 방법에 의하여 제조된 청국장이 불쾌취가 가장 적은 것으로 나타났다.

생체이용률이 떨어지는 배당체 형태의 이소플라본을 발효과정을 통해 어글리콘 형태의 이소플라본으로 전환시켜 생체이용률을 높이고자 한다. 특히 항암활성 및 기타 생리활성이 높은 형태의 어글리콘 상태로 바꾸는 것은 청국장의 기능성을 높이는 과정이라고 볼 수 있다. 특히 본 발명에서 제시한 바실러스 서브틸리스MJ101 (기탁번호 KFCC11391P)의 경우 배당체 형태의 이소플라본을 어글리콘으로 전환시키는 능력이 뛰어나며, 실시예2에서 제시한 발효방법으로 청국장을 제조할 경우 청국장 이소플라본의 어글리콘 형태를 더 많이 얻을 수 있으며, 청국장 고유의 불쾌취를 확실히 감소시킬 수 있음이 확인되었다.

본 발명을 통해 고기능성 청국장을 개발함으로써, 대두의 소비증가와 관련산업의 매출증대에 도움을 줄 것으로 기대한다.

Claims

바실러스 서브틸리스 MJ101 (기탁번호 KFCC11391P)를 접종하여 배양한 청국장.
제 1항에 있어서,

불쾌취 감소 및 어글리콘 형태의 이소플라본이 증가된 기능성 청국장.
제 1항에 있어서

청국장 특유의 불쾌취를 감소시키기 위하여 발효시작 24시간 이후부터 48시간이 되는 시점까지 40℃에서 10℃로 선형적으로 온도를 변화시켜 제조한 청국장.