KR101965059B1 - 다이드제인 및 제니스테인을 고함량으로 포함하는 파바톤 콩잎 조성물의 제조방법 및 이를 이용하여 제조된 갱년기 증후군 개선 유효성분 강화 콩잎 조성물 - Google Patents
다이드제인 및 제니스테인을 고함량으로 포함하는 파바톤 콩잎 조성물의 제조방법 및 이를 이용하여 제조된 갱년기 증후군 개선 유효성분 강화 콩잎 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명에서는 이소플라본 유도체 고함량 콩잎인 파바톤 콩잎을 특정 유산균으로 발효하여 이소플라본 유도체 중 다이드제인 및 제니스테인과 같은 비배당체 이소플라본을 70% 이상 포함하는 콩잎 조성물의 제조방법 및 이로부터 제조된 갱년기 증후군 개선 유효성분이 강화된 콩잎 조성물과 이를 포함한 식품, 화장품 등이 제공된다.
본 발명에 따른 콩잎 조성물은 비배당체 이소플라본(다이드제인과 제니스테인)의 함량이 현저히 강화되어 있고 더불어 생리활성인 항산화 활성, 소화효소 저해활성이 증진되어 있어서, 여성호르몬 불균형에 따른 갱년기 증후군 예방 및 개선에 유효하여 식품, 약제 및 화장료 소재로 유용하다.
본 발명에 따른 콩잎 조성물은 비배당체 이소플라본(다이드제인과 제니스테인)의 함량이 현저히 강화되어 있고 더불어 생리활성인 항산화 활성, 소화효소 저해활성이 증진되어 있어서, 여성호르몬 불균형에 따른 갱년기 증후군 예방 및 개선에 유효하여 식품, 약제 및 화장료 소재로 유용하다.
Description
본 발명은 이소플라본 유도체 고함량 콩잎인 파바톤 콩잎의 이소플라본 유도체를 비배당체 이소플라본으로 고효율로 전환하는 방법 및 이로부터 제조된 갱년기 증후군 개선에 유효성분이 강화된 조성물에 관한 것으로, 더 상세하게는 이소플라본 유도체 고함량 콩잎을 특정 유산균으로 발효하여 이소플라본 유도체 중 다이드제인 및 제니스테인과 같은 비배당체 이소플라본이 70% 이상 포함되는 콩잎 조성물의 제조방법 및 이로부터 제조된 갱년기 증후군 개선 유효성분이 강화된 콩잎 조성물에 관한 것이다.
콩잎은 3개 또는 5개의 작은 잎으로 되어 있고 어긋나며 짧은 털로 덮여 있다. 콩잎은 콩잎장아찌와 콩잎김치의 형태로 경상도 지역에서 주로 애용되는 향토음식으로 섭취된다. 이는 여름철에 부드러운 어린 콩잎을 따서 물김치로 담거나 가을철에 노랗게 낙엽진 콩잎을 삭힌 뒤 젓갈 등으로 양념하여 먹기도 한다. 이때 푸른색의 콩잎과 낙엽진 노란 콩잎의 생리 활성은 차이가 있을 것으로 여겨진다. 콩잎에는 콩의 대표적인 기능성 성분인 이소플라본이 함유되어 있고, 콩잎의 생육단계에 따라 당가수분해효소 저해활성이 차이가 나며, 비만, 당뇨 등의 기능성식품 개발에 우수한 소재로 활용이 가능할 것으로 제시되고 있다 (Yuk et al., 2011, Food Chem.).
이소플라본 유도체는 약리학적 효능이 뛰어난 플라보노이드로서 세계적으로 이들이 고 함유된 기능성 식물개발에 많은 자본이 투자되고 있는 실정이다. 이소플라본은 비스테로이드 에스트로겐(non-steroid estrogen)으로 화학 구조적으로 또한 생리학적 특성이 에스트로겐과 유사한 특성을 가지고 있어 식물성 에스트로겐이라 불린다. 이들은 여성호르몬인 에스트로겐과 유사구조로서 에스트로겐에서 기대되는 유용한 생리활성을 보여준다. 특히 폐경기 이후에 발생되는 골다공증의 위험을 감소시키고, 플라즈마 콜레스테롤을 낮추는 것으로 보고되고 있다. 또한 관상동맥심장질환(coronary heart disease)의 위험을 낮추는 효과와 항산화 활성도 보고되고 있다.
이소플라본은 베타-글리코시드가 연결된 배당체 형태 또는 당이 떨어져 나간 비배당체 형태로 존재한다. 비배당체 이소플라본(aglycon isoflavone)으로는 제니스테인(genistein), 다이드제인(daidzein) 및 글리시테인(glycitein) 등이 있으며, 배당체 이소플라본으로는 제니스틴(genistin), 다이드진(daidzin) 및 글리시틴(glycitin) 등이 있다. 특히 다양한 생리활성은 아글리콘 형태의 비배당체 이소플라본에 기인한다고 보고되고 있다. 비배당체 이소플라본 중에서 제니스테인(genistein)은 항산화활성 뿐만 아니라 유방암 및 전립선암 등에 효과적이며 다이드제인(daidzein)은 폐경기 여성의 골다공증에 효과적인 것으로 알려져 있다. 식품의약품안전처는 이소플라본을 건강기능식품 고시형 원료로서 폐경기 이후 뼈 건강에 도움을 줄 수 있으며 일일 섭취권장량으로 비배당체 이소플라본 유도체 총합으로 약 24 ~ 27 mg을 제시하고 있다.
최근 분자농법 기술을 이용하여 이소플라본 유도체 고함량 콩잎(파바톤 콩잎) 재배기술이 개발되었으나 (특허등록 10-1451298호), 이 콩잎의 이소플라본은 배당체 이소플라본인 β-글리코사이드와 말로닐-β-글리코사이드가 약 98%를 차지하고 생리활성이 우수한 비배당체 이소플라본은 약 2% 이하 정도만 존재하여 기능성식품으로 활용면에서 충분하지 않은 실정이었다 (Yuk et al. 2016, J. Agric. Food Chem.).
이에 파바톤 콩잎에 함유된 고함량의 이소플라본 유도체를 비배당체 이소플라본으로의 전환기술 개발과 이를 통한 유효성분이 증진된 파바톤 콩잎의 가공식품의 개발이 요구되고 있다.
본 발명의 목적은 이소플라본 유도체 고함량 콩잎을 특정 유산균으로 발효하여 이소플라본 유도체 중 다이드제인 및 제니스테인과 같은 비배당체 이소플라본을 70% 이상 포함하는 콩잎 조성물의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 상기 방법으로 제조된, 비배당체 이소플라본 강화 콩잎 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 상기 비배당체 이소플라본 강화 콩잎 조성물을 포함하는 갱년기 증후군 개선용 건강기능성 식품 및 화장품을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 이소플라본 유도체 고함량 콩잎을 락토바실러스 파라카세이(Lactobacillus paracasei) 및/또는 락토바실러스 아밀로보루스(Lactobacillus amylovorus)의 종균으로 발효하여 이소플라본 유도체 중 비배당체 이소플라본을 70% 이상 포함하는 콩잎 조성물의 제조방법을 제공한다.
ⅰ) 이소플라본 유도체
고함량
콩잎
본 발명에서 이소플라본 유도체 고함량 콩잎은 재배 전·후에 콩잎에 식물생장호르몬인 에틸렌(ethylene), 에틸렌 공여체(에세폰) 또는 에틸렌 발생제를 처리하여 이소플라본 유도체를 고함량으로 함유하는 콩잎 (이하, ‘파바톤 콩잎’이라고 함)을 사용하는 것이 바람직하다.
파바톤 콩잎은 상업적으로 입수할 수 있다.
파바톤 콩잎에 이소플라본 함량은 약 5,000 ∼ 15,000 ㎍/g 정도의 고농도이다.
파바톤 콩잎은 수확하여 세척한 후 바로 착즙하여 사용하거나 또는 건조하여 분말화한 것을 사용할 수 있다.
ⅱ) 종균
본 발명에서 '종균'은 락토바실러스 파라카세이(Lactobacillus paracasei) 및 락토바실러스 아밀로보루스(Lactobacillus amylovorus)로 구성되는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 균주를 포함하는 종균을 사용한다.
상기 균주들을 종균으로 사용하여 파바톤 콩잎을 발효시, 놀랍게도 고함량의 이소플라본 유도체가 고효율로 비배당체 이소플라본으로 전환되었다 (70% 이상, 표 2). 게다가 항산화 활성, 항당뇨 활성 및 항비만 활성도 또한 증진되었다 (도 3a ~ 도 4b).
ⅲ) 발효
파바톤 콩잎에 종균을 접종하여 발효하여 파바톤 콩잎에 함유된 이소플라본 유도체를 비배당체 이소플라본으로 전환한다.
원활한 발효를 위하여 파바톤 콩잎에 당원과 물을 첨가하여 발효할 수 있다. 당원과 물은 파바톤 콩잎 100 중량부에 각각 1 ~ 5 중량부 및 500 ~ 1,000 중량부로 첨가하는 것이 바람직하다. 필요에 따라서, 파바톤 콩잎, 당원 및 물의 혼합물은 접종 전에 살균할 수 있다. 살균은 통상의 방법에 따라 수행할 수 있다.
접종은 종균 배양액을 1∼10%(v/v)으로 접종하며, 발효는 20∼40℃에서 12시간 이상 수행한다.
접종이 1%(v/v) 미만으로 수행되면 발효속도가 지연될 수 있고 10%(v/v) 초과로 수행되면 경제적 효용성이 떨어진다. 발효온도가 20℃ 미만이면 발효속도가 지연되며 40℃ 초과이면 균 생육이 저지되어 발효속도가 지연되고 이상 발효가 발생할 수 있다. 발효시간이 12시간 미만일 경우는 전환률이 50% 미만으로 미흡하다.
본 발명의 전환 방법에 따르면 함유된 이소플라본 유도체 중 비배당체 이소플라본 특히, 다이드제인과 제니스테인으로 70% 이상 포함하는 콩잎 조성물을 얻을 수 있다.
본 발명의 또 다른 목적에 따라서, 상기 방법으로 제조되고 비배당체 이소플라본 강화 콩잎 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 비배당체 이소플라본 강화 콩잎 조성물은 고함량의 이소플라본 유도체 중의 70% 이상이 비배당체 이소플라본으로 전환되어 있고, 특히 다이드제인과 제니스테인 함량이 현저히 증진되어 있다 (표 2).
또한 본 발명에 따른 콩잎 조성물은 우수한 라디칼 소거능 및 환원력을 가져서 증진된 항산화 활성, 우수한 알파-글루코시다아제(α-glucosidase) 저해능을 가져서 증진된 항당뇨 활성 및 우수한 췌장-리파아제(lipase) 저해능을 가져서 증진된 항비만 활성 등의 증진된 생리활성도 구비하고 있다 (도 3a ~ 도 4b).
따라서 본 발명에 따른 콩잎 조성물은 고함량으로 포함된 비배당체 이소플라본으로 인하여 여성호르몬인 에스트로겐 대용물로서 식품, 약제 및/또는 화장품의 소재로 사용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 목적에 따라서, 상기 비배당체 이소플라본 강화 콩잎 조성물을 포함하는 갱년기 증후군 개선용 식품을 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적에 따라서, 상기 비배당체 이소플라본 강화 콩잎 조성물을 포함하는 화장품을 제공한다.
본 발명의 식품 또는 화장품은 본 발명의 콩잎 조성물을 또는 이의 추출물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 성분과 혼합되어 제조될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 제조될 수 있다.
본 발명에서 상기 식품의 종류는 특별히 제한되지 않으며, 콩잎제품 (환제, 정제제, 캡슐제 등), 발효차, 발효식품 (김치류, 피클류 등), 발효음료 (파우치제, 드링크제 등) 등 일 수 있다. 화장품의 종류는 마스크팩, 스킨, 로션, 크림 등 일 수 있다.
본 발명에 따른 식품(고함량의 비배당체 이소플라본 및 증진된 생리활성에 기인하여)에 의해 예방 또는 개선될 수 있는 갱년기 증후군으로는, 안면홍조, 비만, 불면증, 골다공증, 당뇨 및 피부노화 등을 포함한다.
본 발명에 따른 콩잎 조성물은 비배당체 이소플라본(다이드제인과 제니스테인)의 함량이 현저히 강화되어 있고 더불어 생리활성인 항산화 활성, 소화효소(탄수화물 및 지방 가수분해효소) 저해활성이 증진되어 있어서, 여성호르몬 불균형에 따른 갱년기 증후군 개선 즉, 체중 조절, 콜레스테롤 저하, 고지혈증 개선, 동맥경화 완화, 당뇨병 완화, 내장비만 개선, 면역력 개선, 안면홍조 개선, 피부노화 방지 및 골다공증 개선에 유효하다. 따라서 본 발명에 따른 콩잎 조성물은 갱년기 증후군의 예방 및 개선용 약제 및 화장품 소재로 유용하다.
본 발명의 제조방법은 파바톤 콩잎의 고함량 이소플라본 유도체를 비배당체 이소플라본으로 70% 이상 전환시켜 비배당체 이소플라본 강화 (고함량으로 함유) 콩잎 조성물을 제조케 한다. 또한 본 발명에 따른 방법은 유효성분 증진에 대한 기술 역시 전무하였던 파바톤 콩잎을 가공식품으로의 활용성을 크게 향상시킬 수 있다.
본 발명에 따른 식품은 고함량의 비배당체 이소플라본 및 증진된 생리활성을 가져서 안면홍조, 비만, 불면증, 골다공증, 당뇨 및 피부노화 등의 갱년기 증후군을 예방 또는 개선할 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 방법으로 제조된 파바톤 콩잎(이소플라본 유도체 고함량 콩잎)의 발효 조성물을 보여주는 사진이다.
도 2는 파바톤 콩잎 발효 조성물의 HPLC 크로마토그램을 나타낸 것이다. 도 2a는 본 발명에 따른 파바톤 콩잎 조성물(실시예 1 및 2)과 참조예의 HPLC 크로마토그램을 나타내고, 도 2b, 도 2c는 비교예 1~6의 HPLC 크로마토그램을 나타낸다.
도 3는 파바톤 콩잎 발효 조성물 (실시예 1, 2; 비교예 1~6, 참조예)의 항산화 활성을 나타낸 것이다. 도 3a는 파바톤 콩잎 발효 조성물의 DPPH 라디칼 소거활성을 나타낸 것이며, 도 3b는 파바톤 콩잎 발효 조성물의 ABTS 라디칼 소거활성을 나타낸 것이며, 도 3c는 파바톤 콩잎 발효 조성물의 하이드록실 라디칼 소거활성을 나타낸 것이며, 도 3d는 파바톤 콩잎 발효 조성물의 FRAP 환원력을 나타낸 것이다.
도 4는 파바톤 콩잎 발효 조성물 (실시예 1, 2; 비교예 1~6, 참조예)의 소화효소 저해활성을 나타낸 것이다. 도 4a는 파바톤 콩잎 발효 조성물의 알파-글루코시다아제 저해활성을 나타낸 것이며, 도 4b는 파바톤 콩잎 발효 조성물의 췌장-리파아제 저해활성을 나타낸 것이다.
도 2는 파바톤 콩잎 발효 조성물의 HPLC 크로마토그램을 나타낸 것이다. 도 2a는 본 발명에 따른 파바톤 콩잎 조성물(실시예 1 및 2)과 참조예의 HPLC 크로마토그램을 나타내고, 도 2b, 도 2c는 비교예 1~6의 HPLC 크로마토그램을 나타낸다.
도 3는 파바톤 콩잎 발효 조성물 (실시예 1, 2; 비교예 1~6, 참조예)의 항산화 활성을 나타낸 것이다. 도 3a는 파바톤 콩잎 발효 조성물의 DPPH 라디칼 소거활성을 나타낸 것이며, 도 3b는 파바톤 콩잎 발효 조성물의 ABTS 라디칼 소거활성을 나타낸 것이며, 도 3c는 파바톤 콩잎 발효 조성물의 하이드록실 라디칼 소거활성을 나타낸 것이며, 도 3d는 파바톤 콩잎 발효 조성물의 FRAP 환원력을 나타낸 것이다.
도 4는 파바톤 콩잎 발효 조성물 (실시예 1, 2; 비교예 1~6, 참조예)의 소화효소 저해활성을 나타낸 것이다. 도 4a는 파바톤 콩잎 발효 조성물의 알파-글루코시다아제 저해활성을 나타낸 것이며, 도 4b는 파바톤 콩잎 발효 조성물의 췌장-리파아제 저해활성을 나타낸 것이다.
다음의 실시예들에 의해 본 발명이 더 상세히 설명된다. 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것이며, 본 발명의 범위가 이들에 의해 제한되어서는 안 된다.
제조예
:
파바톤
콩잎 발효 조성물 제조
발효를 위한 종균 균주는 한국유전자은행(KCTC)에서 분양받아 본 발명에 종균으로 적합한 2종의 유산균주를 선별하였고 (표 1의 실시예 1, 2), 비교를 위하여 통상의 6종 유산균주 (비교예 1~6)를 함께 사용하였다.
| 균주 | |
| 실시예 1 | 락토바실러스 파라카세이(Lactobacillus paracasei KCTC 3166) |
| 실시예 2 | 락토바실러스 아밀로보루스(Lactobacillus amylovorus KCTC 3597) |
| 비교예 1 | 락토바실러스 카세이(Lactobacillus casei KCTC 3109) |
| 비교예 2 | 락토바실러스 퍼멘트윰(Lactobaillus fermentum KCTC 3112) |
| 비교예 3 | 락토바실러스 데블렉키이(Lactobacillus delbrueckii KCTC 3635) |
| 비교예 4 | 락토바실러스 팔시미니스(Lactobaillus farciminis KCTC 3681) |
| 비교예 5 | 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis KCTC 3320) |
| 비교예 6 | 락토바실러스 플란타륨(Lactobacillus plantarum KCTC 13093) |
각각의 유산균주를 MRS 액체배지(Difco사, USA)에서 24시간 배양한 후, 발아맥아 100 g에 5배의 정제수를 가하여 100℃에서 6시간 추출하여 거즈로 여과하여 제조한 맥아배지에 접종하여 48시간 혼합 배양하여 접종을 위한 종균 배양액으로 준비하였다.
파바톤 콩잎은 경상대학교 천연물화학연구실에서 2015년 8월경에 에세폰 처리하여 재배하여 수확한 후 열풍 건조하여 분말화한 것을 공급받아 사용하였다.
파바톤 콩잎(분말) 100 g과 설탕 10 g을 500 ml의 증류수에 혼합시킨 뒤 121℃에서 15분 살균처리를 한 발효 베이스 9개를 준비한 후, 8개에는 상기와 같이 준비한 표 1의 종균 배양액을 각각 5%(v/v)로 접종하여 약 37℃에서 72시간 정치 발효시켜 콩잎 발효 조성물을 완성하였다 (도 1). 나머지 1개는 종균 접종없이 동일 조건에서 72시간 유지하였다 (무접종구; 참조예).
참고예
: 생리활성 분석 시료 준비
제조예에서 제조된 각각의 파바톤 콩잎 발효 조성물을 -70℃에서 동결건조시킨 후 분말화하였다. 동결건조된 분말 시료 5 g에 80% 발효주정 200 ml을 첨가한 후 20℃, 300 rpm에서 12시간 추출한 후 여과지로 1차 여과한 후 0.45 ㎛ 여과필터로 2차 여과하여 얻은 여과액 시료를 하기 시험예에서 이소플라본 함량의 측정에 사용하였다.
동결건조된 분말 시료 20 g에 50% 메탄올을 200 ml 첨가하여 상온에서 12시간 동안 교반하여 추출하였다. 이후 원심분리하여 상등액을 모은 후 여과지(No. 2, Whatman, Tokyo Roshi사)로 여과하여 모은 후 여과액을 감압농축기(EYELA, Tokyo, Rikakikai사)를 이용하여 60℃에서 감압농축하였다. 농축된 시료는 추출용매로 녹여 각각 0.1, 0.25, 0.50 및 1.0 mg/ml 농도별 분석 시료를 제조하여 하시 시험예에서 항산화 활성 및 소화효소 저해활성을 평가하였다.
시험예
1: 이소플라본 함량 분석
이소플라본 함량 분석은 HPLC 크로마토그램을 이용하여 분석하였다. 구체적으로는 참고예에서 준비한 0.45 ㎛ 여과필터로 2차 여과하여 얻은 각각의 여과액 시료를 사용하였고, 분석 컬럼은 Lichrophore 100 RP C18 column(4.6×250 mm, 5 ㎛, Merck, Germany)을 사용하였다. 이동상 용매는 0.1% 수중 글라시알 아세트산(glacial acetic acid in water; solution A)와 100% 아세토니트릴 중의 글라시알 아세트산 (glacial acetic acid in acetonitrile; solution B)로 분석하였고, 이동상 조건은 solution B 기준으로 각각 20, 10, 10 및 10 min 동안 10%, 20%, 25% 및 35%로 유지시켰다. 시료는 20 ㎕를 주입하였고 이동상의 속도는 30℃에서 1 mL/min로 유지하였다. 이소플라본은 diode array UV detector(Agilent1200 series, Agilent사, USA)의 흡광도 254 nm에서 정량하여 표준품의 검량곡선과 비교하여 함량을 계산하였다. 각각의 결과를 도 2a ~ 도 2c 및 표 2에 나타냈다.
도 2a ~ 도 2c의 크로마토그램에서 확인되는 바와 같이, 각각의 파바톤 콩잎 발효 조성물에서는 공통적으로 6종류의 이소플라본 유도체(다이드진(daidzin), 제니스틴(genistin), 말로닐다이드진(malonyldaidzin), 말로닐제니스틴 (malonylgenistin), 다이드제인(daidzein) 및 제니스테인(genistein))가 검출되었다. 참조예(무접종구)에서 검출된 주요 유도체로는 배당체 이소플라본인 다이드진(daidzin) 및 제니스틴(genistin) (피크 1 및 2)이 높은 함량으로 측정되었으나, 실시예 1, 2의 발효 조성물에서는 비배당체 이소플라본인 다이드제인(daidzein) 및 제니스테인(genistein) (피크 5 및 6)이 크게 증가하였음을 알 수 있다. 비교예 1~6의 발효 조성물에서는 비배당체 이소플라본의 증가가 거의 이루어지지 않거나 미흡하였다.
| 이소플라본 | 함량 (μg/g) | ||||||||
| NIM 참조예 |
3320 비교예5 |
3109 비교예1 |
3112 비교예2 |
3166 실시예1 |
3597 실시예2 |
3635 비교예3 |
3681 비교예4 |
13093 비교예6 |
|
| β-Glycosides (배당체 이소플라본) | |||||||||
| Daidzin | 4024.56 | 1468.66 | 3146.01 | 4424.15 | 585.69 | 473.46 | 4684.74 | 3762.25 | 1316.57 |
| Genistin | 2256.53 | 540.23 | 779.70 | 2231.14 | 297.89 | 231.35 | 2547.31 | 1263.16 | 1315.72 |
| 합 계 | 6281.09 | 2008.90 | 3925.71 | 6655.29 | 883.58 | 704.81 | 7232.05 | 5025.40 | 2632.29 |
| 비율(%) | 73.8 | 30.9 | 52.8 | 76.4 | 13.9 | 11.4 | 78.0 | 63.1 | 36.5 |
| Malonyl-β-glycosides (배당체 이소플라본) | |||||||||
| Daidzin | 507.31 | 505.67 | 607.20 | 583.68 | 517.16 | 486.13 | 556.83 | 600.23 | 354.76 |
| Genistin | 394.15 | 403.27 | 364.74 | 466.59 | 454.30 | 214.05 | 587.04 | 191.62 | 147.69 |
| 합 계 | 901.46 | 908.94 | 971.94 | 1050.27 | 971.46 | 700.18 | 1143.86 | 791.85 | 502.45 |
| 비율(%) | 10.6 | 13.9 | 13.1 | 12.1 | 15.3 | 11.3 | 12.3 | 9.9 | 7.0 |
| Aglycones (비배당체 이소플라본) | |||||||||
| Daidzein | 1055.18 | 2510.55 | 1563.21 | 743.57 | 3252.06 | 3464.46 | 656.48 | 1357.95 | 3255.67 |
| Genistein | 273.03 | 1078.28 | 970.44 | 264.73 | 1229.50 | 1307.62 | 240.03 | 783.62 | 829.15 |
| 합 계 | 1328.21 | 3588.83 | 2533.65 | 1008.30 | 4481.55 | 4772.08 | 896.51 | 2141.57 | 4084.81 |
| 비율(%) | 15.6 | 55.2 | 34.1 | 11.5 | 70.8 | 77.3 | 9.7 | 27.0 | 56.5 |
| 총합계 | 8510.75 | 6506.66 | 7431.30 | 8713.86 | 6336.59 | 6177.07 | 9272.42 | 7958.83 | 7219.55 |
| NIM (비접종구); 3320, Lac . brevis KCTC 3320; 3019, Lac . casei KCTC 3109; 3112, Lac . fermentum KCTC 3112; 3166, Lac . paracasei KCTC 3166; 3597, Lac . amylovorus KCTC 3597; 3635, Lac. delbrueckii KCTC 3635; 3681, Lac . farciminis KCTC 3681; 13093, Lac . plantarum KCTC 13093 | |||||||||
상기 표 2에 나타낸 바와 같이, 실시예 1, 2의 파바톤 콩잎 발효 조성물 (각각 락토바실러스 파라카세이, 락토바실러스 아밀로보루스 균주로 발효)은 이소플라본 유도체 중 비배당체 이소플라본(다이드제인과 제니스테인)이 70% 이상(점유율) 함유되어 있었다. 따라서 본 발명의 발효 조성물은 각각 70.8% 및 77.3%로 배당체 이소플라본이 비배당체 이소플라본으로의 전환이 매우 높게 이루어졌고, 참조예(무접종구)의 발효 조성물에 비하여 약 5배의 비배당체 이소플라본이 증진된 것을 확인된다.
반면에 비교예 1~4의 파바톤 콩잎 발효 조성물은 이소플라본 유도체 중 비배당체 이소플라본(다이드제인과 제니스테인)의 점유율이 참조예에 비하여 오히려 감소하거나 약간 증가하였고, 비교예 5 및 6은 증가율이 미흡한 정도였다.
따라서 락토바실러스 파라카세이 및 락토바실러스 아밀로보루스로 이루어지는 1종 이상의 균주로 발효된 본 발명에 따른 파바톤 콩잎 조성물은 비배당체 이소플라본(다이드제인과 제니스테인)의 함량이 현저히 강화됨을 알 수 있다.
시험예
2 : 항산화 활성 검정
본 발명에 따른 파바톤 콩잎 발효 조성물의 항산화 활성은 DPPH 라디칼 소거활성, ABTS 라디칼 소거활성 및 하이드록실 라디칼 소거활성, 및 환원력(FRAP) 분석의 4가지 분석방법으로 측정하였다.
<DPPH 라디칼 소거활성>
DPPH(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl, Sigma D9132, FW 393.4, C18H12N5O6)는 매우 안정한 라디칼로서 525 nm에서 특정 흡광도를 나타내는 보라색 화합물이다. DPPH 라디칼 소거활성을 측정하여 항산화 활성을 확인하였다.
구체적으로는 DPPH 용액 0.8 ml와 참고예에서 준비된 각각의 분석 시료 0.2 ml를 첨가하고 이를 혼합하여 암실에서 30분간 방치시켰으며 반응 후 분광광도계를 사용하여 525 nm에서 흡광도를 측정하였다. 음성 대조구 실험은 시료 대신에 PBS 완충액(NaCl 8.76 g, NaH2PO4 0.11 g, Na2HPO4 0.596 g)을 사용하였고 라디칼 소거활성은 분석 시료 첨가구와 무첨가구 사이의 흡광도 값을 구하여 아래와 같은 식에 대입하여 백분율(%)로 표시하였으며 그 결과를 도 3a에 나타냈다:
DPPH 라디칼 소거활성(%) =
[1-(음성 대조구 흡광도 ÷ 실험구 흡광도)] × 100
도 3a에 도시된 바와 같이, 실시예 1, 2의 발효 조성물(각각 락토바실러스 파라카세이, 락토바실러스 아밀로보루스 균주로 발효)의 DPPH 라디칼 소거활성은 참조예(무접종구)에 비하여 크게 증진되었고, 비교예들에 비하여도 더 높은 활성을 보였다.
특히 실시예 2의 발효 조성물이 74.21%로 가장 높은 활성을 보였다.
<ABTS 라디칼 소거활성>
ABTS 라디칼 소거활성은 2-azino-bis의 색을 띤 라디칼의 감소정도에 따라 항산화 활성을 검사하는 방법이다. 이 방법은 시료와 표준물질(Trolox, 6-hydroxy -2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid)의 값과 비교하여 항산화 활성을 측정하는 방법으로서, 시료의 항산화력에 의해 ABTS 양이온(ABTS＋)이 소거되어 청록색으로 탈색되는데, 이때 ABTS 양이온(ABTS＋)의 제거 정도를 흡광도를 측정함으로서 알 수 있고, 탈색반응이 1분 내에 종료되므로 짧은 시간에 측정이 가능하다.
구체적으로는 7 mM ABTS+ 5 ml과 2.45 mM K2S2O8 5 ml를 섞어 암실에서 12∼16시간 방치시켜 ABTS+ 라디칼을 형성시켰다. 이후 732 nm에서 대조구의 흡광도 값이 0.7±0.02가 되도록 조절한 ABTS+ 0.9 ml와 참고예에서 준비된 각각의 분석 시료 1.0 ml를 첨가하여 3분간 반응시켜 732 nm에서 흡광도를 측정하였다. 음성대조구 실험은 시료 대신에 PBS 완충액(NaCl 8.76 g, NaH2PO4 0.11 g, Na2HPO4 0.596 g)을 사용하였고 라디칼 소거활성은 시료용액의 첨가구와 무첨가구 사이의 흡광도 값을 구하여 아래와 같은 식에 대입하여 백분율(%)로 표시하였으며, 그 결과를 도 3b에 나타냈다.
ABTS 라디칼 소거활성(%) =
[1-(음성대조구 흡광도 ÷ 실험구 흡광도)] × 100
도 3b에 도시된 바와 같이, 실시예 1, 2의 발효 조성물(각각 락토바실러스 파라카세이, 락토바실러스 아밀로보루스 균주로 발효)의 ABTS 라디칼 소거활성은 참조예(무접종구)에 비하여 크게 증진되었고, 비교예들에 비하여도 더 높은 활성을 보였다.
특히 실시예 2의 발효 조성물이 77.56%로 가장 높은 활성을 보였다.
<하이드록실 라디칼 소거활성>
하이드록실 라디칼 소거활성 측정은 10 mM FeSO4·7H20-EDTA 0.2 ml, 10 mM 2-데옥시리보스 0.2 ml, 10 mM H2O2 0.2 ml와 참고예에서 준비된 각각의 분석 시료 1.4 ml를 혼합하여 37℃에서 4시간 반응시켰다. 이 혼합액에 1% 티오바르비투르산(thiobarbituric acid)/증류수와 2.8% 트리클로로아세트산(trichloroaceric acid)/증류수를 각각 1 ml 첨가하여 100 ℃에서 20분간 가열하여 발색시키고 적당히 냉각시킨 후 520 nm에서 흡광도를 측정하였다. 음성대조구 실험은 시료 대신에 PBS 완충액(NaCl 8.76 g, NaH2PO4 0.11 g, Na2HPO4 0.596 g)을 사용하였고 하이드록실 라디칼 소거활성은 분석 시료 첨가구와 무첨가구 사이의 흡광도 차이를 구하여 아래와 같은 식에 대입하여 백분율(%)로 나타냈으며 그 결과를 도 3c에 도시했다.
하이드록실 라디칼 소거활성(%) =
1-(음성대조구 흡광도 ÷ 실험구 흡광도)] × 100
도 3c에 도시된 바와 같이, 실시예 1, 2의 발효 조성물(각각 락토바실러스 파라카세이, 락토바실러스 아밀로보루스 균주로 발효)의 하이드록실 라디칼 소거활성은 참조예(무접종구)에 비하여 크게 증진되었고, 비교예들에 비하여도 더 높은 활성을 보였다.
특히 실시예 2의 발효 조성물이 56.2%로 가장 높은 활성을 보였다.
<FRAP 환원력>
FRAP (Ferric reducing antioxidant power) 환원력 분석은 화합물의 환원력을 측정하는 방법으로 Fe3+를 Fe2+로 환원시키는 힘을 측정하는 방법으로, FeⅢ-TPTZ(ferric tripyridyl triazine)가 시료의 환원력에 의하여 푸른색의 FeⅡ-TPTZ(ferrous tripyridyl triazine)으로 환원될 때 흡광도를 측정하여 항산화 활성을 알아보는 것이다.
구체적으로는 FRAP 환원력 분석에서 반응액으로는 30 mM 아세테이트 완충액(pH 3.6), 40 mM 염산에 녹인 10 mM 2,4,6-트리피리딜-s-트리아진(TPTZ, T1253, C18H12N6, MW312.33) 및 20mM FeCl3(F7134, MW 162.20, in DW)를 준비하였으며, 아세테이트 완충액, TPTZ 용액 및 FeCl3 용액을 10:1:1 (v/v/v)로 혼합하여 37 ℃에서 15분간 예비반응을 시켜두었다. 참고예에서 준비된 각각의 분석 시료 50 ㎕와 FRAP 시약 950 ㎕를 시험관에 분주한 후 약 15분간 반응시키고 마이크로플레이트 리더 (Biorad 3055, Sweden)를 사용하여 593 nm에서 흡광도를 측정하여 그 결과를 도 3d에 나타냈다.
도 3d에 도시된 바와 같이, 실시예 1, 2의 발효 조성물(각각 락토바실러스 파라카세이, 락토바실러스 아밀로보루스 균주로 발효)의 하이드록실 라디칼 소거활성은 참조예(무접종구)에 비하여 크게 증진되었고, 비교예들에 비하여도 더 높은 활성을 보였다.
특히 실시예 2의 발효 조성물이 2,270으로 가장 높은 활성을 보였다.
상기 결과들로부터 본 발명에 따른 파바톤 콩잎 발효 조성물은 항산화 활성이 크게 증진된다는 것을 알 수 있다.
시험예 3 : 소화효소 저해활성 검정
본 발명에 따른 파바톤 콩잎 발효 조성물에 대해 항당뇨(당뇨 개선) 효과의 지표인 알파-글루코시다아제 저해활성을 검정하였고, 항비만(비만 개선) 지표인 췌장 리파아제 저해활성을 검정하였다. 알파-글루코시다아제 저해활성과 췌장 리파아제 저해활성은 파라-니트로페놀법(para-nitrophenol method)으로 검정하였다.
<알파-글루코시다아제 저해활성>
참고예에서 준비된 각각의 분석 시료 50 ㎕, 알파-글루코시다아제 (0.5 U/ml) 효소용액 50 ㎕, 200 mM 인산나트륨 완충용액(pH 6.8) 50 ㎕를 혼합하여 37℃에서 10분간 예비반응 하였다. 이후 인산나트륨 완충용액(pH 6.8)에 녹인 p-NPG (5 mM) 100 ㎕를 가하여 다시 37℃에서 10분 반응시켰으며 반응액에 Na2CO3 (100 mM) 0.75 ml를 가해 최종반응을 정지시킨 후 420 nm에서 분광광도계를 이용하여 흡광도를 측정하였다. 음성대조구는 시료 대신에 추출용매를 취하였으며 분석 시료 첨가구와 무첨가구 사이의 흡광도 차이를 백분율(%)로 나타내어 그 결과를 도 4a에 나타냈다.
도 4a에 도시된 바와 같이, 실시예 1, 2의 발효 조성물(각각 락토바실러스 파라카세이, 락토바실러스 아밀로보루스 균주로 발효)의 알파-글루코시다아제 저해활성은 참조예(무접종구)에 비하여 2배 이상 현저히 증진되었고, 비교예 1~4, 6에 비하여도 더 높은 활성을 보였다.
특히 실시예 2의 발효 조성물이 39.15%로 가장 높은 활성을 보였다.
따라서 본 발명에 따른 발효 조성물은 알파-글루코시다아제 저해활성이 현저히 증진되어 혈당저하 활성이 우수하여 당뇨 개선효과가 증진됨을 알 수 있다.
<췌장-리파아제 저해활성>
참고예에서 준비된 각각의 분석 시료 50 ㎕, 췌장 리파아제 (1.0 U/ml) 효소용액 50 ㎕, 및 200 mM 인산나트륨 완충용액(pH 6.8) 50 ㎕를 혼합하여 37 ℃에서 10분간 예비반응시켰다. 반응 후 인산나트륨 완충용액에 녹인 p-NPB(5 mM) 100 ㎕를 가하여 동일하게 10분간 반응시킨 후 100 mM Na2CO3 0.75 ml를 가해 반응을 종결시켜 420 nm에서 흡광도를 측정하였다. 음성대조구는 시료 대신에 추출용매를 취하였으며 시료용액의 첨가구와 무첨가구 사이의 흡광도 차이를 백분율(%)로 나타내어 그 결과를 도 4b에 나타냈다.
도 4b에 도시된 바와 같이, 실시예 1, 2의 발효 조성물(각각 락토바실러스 파라카세이, 락토바실러스 아밀로보루스 균주로 발효)의 췌장 리파아제 저해활성은 참조예(무접종구)에 비하여 현저히(약 3배) 증진되었고, 비교예들에 비하여도 더 높은 활성을 보였다.
특히 실시예 2의 발효 조성물이 28.54%로 가장 높은 활성을 보였다.
따라서 본 발명에 따른 발효 조성물은 췌장 리파아제 저해활성이 현저히 증진되어 비만 개선효과가 강화됨을 알 수 있다.
시험예 4: 이화학적 특성 및 생균수
제조예에서 제조된 본 발명에 따른 파바톤 콩잎 발효 조성물의 이화학적 특성(pH, 산도 및 생균수)을 분석하여 표 3에 나타냈다.
pH는 pH 측정기를 사용하여 측정하였고, 산도 측정은 발효 조성물 1 ml를 0.1N-NaOH 용액으로 pH 8.4±2까지 중화시키는데 소요된 0.1N-NaOH의 소비 ml수를 구하고 젖산(lactic acid)양으로 환산하여 %로 총산을 나타내었다. 생균수 측정은 발효 조성물 1 ml를 멸균생리식염수에 단계별로 희석하여 MRSA 배지에 도말하고 30 ℃에서 48시간 배양 후 나타난 젖산균 특유의 콜로니를 측정하여 생균수(log cfu/g)로 나타내었다.
| pH | 산도 | 생균수 | |
| 참조예(무접종구) | 6.30 | 0.36 | - |
| 실시예1(L. paracasei KCTC 3166) | 4.62 | 1.37 | 9.82 |
| 실시예2(L. amylovorus KCTC 3597) | 4.31 | 1.75 | 10.32 |
| 비교예1(L. casei KCTC 3109) | 4.81 | 1.28 | 9.80 |
| 비교예2(L. fermentum KCTC 3112) | 4.55 | 1.53 | 10.11 |
| 비교예3(L. delbrueckii KCTC 3635) | 4.28 | 1.71 | 10.69 |
| 비교예4(L. farciminis KCTC 3681) | 4.51 | 1.64 | 10.34 |
| 비교예5(L. brevis KCTC 3320) | 5.06 | 1.06 | 9.80 |
| 비교예6(L. plantarum KCTC 13093) | 4.07 | 2.21 | 9.99 |
표 3에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 발효 조성물은 pH는 감소하였고 산도와 총 유산균 수가 증가하여, 식품의 저장성을 향상시킬 수 있을뿐만 아니라 유산균 제품(유산균수가 9.0 log cfu/mL 이상으로 규정)으로도 사용할 수 있는 장점이 있다.
Claims (7)
- 이소플라본 유도체 고함량 콩잎을 락토바실러스 파라카세이(Lactobacillus paracasei) 및 락토바실러스 아밀로보루스(Lactobacillus amylovorus)로 구성되는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 종균으로 발효하여 이소플라본 유도체 중 비배당체 이소플라본을 70% 이상 포함하는 콩잎 조성물의 제조방법으로,
상기 이소플라본 유도체 고함량 콩잎은 재배 전·후에 콩잎에 에틸렌 또는 에세폰를 처리하여 이소플라본 유도체를 5,000 ∼ 15,000 ㎍/g의 고함량으로 함유하도록 한 콩잎이고,
상기 비배당체 이소플라본은 다이드제인 및 제니스테인인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1항에 따른 방법으로 제조되고, 이소플라본 유도체 중 비배당체 이소플라본을 70% 이상 포함하고, 상기 비배당체 이소플라본은 다이드제인 및 제니스테인인 것을 특징으로 하는 비배당체 이소플라본이 강화된 콩잎 조성물.
- 삭제
- 제 2항에 있어서, 상기 콩잎 조성물은 식품 또는 화장품의 소재로 포함되는 것을 특징으로 하는 비배당체 이소플라본이 강화된 콩잎 조성물.
- 제 2항에 따른 비배당체 이소플라본 강화 콩잎 조성물을 포함하는 식품.
- 제 2항에 따른 비배당체 이소플라본 강화 콩잎 조성물을 포함하는 화장품.
- 제 5항에 있어서, 상기 식품은 당뇨 또는 비만의 예방 및 개선용인 것인 식품.
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