KR101963978B1 - 진세노사이드 컴파운드 케이 및 Rh2와 생리활성성분이 증진된 새싹삼 발효조성물 및 그 제조방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명에서는 새싹삼 전초를 락토바실러스 브레비스 BMK184 균주로 발효하여 제조되어, 진세노사이드 컴파운드 케이 및 Rh2와 생리활성성분인 가바, 에피카테킨, 갈산 및 클로르제닉산이 증진된 새싹삼 발효조성물 및 그 제조방법에이 개시된다. 본 발명에 따른 새싹삼 발효조성물은 진세노사이드 컴파운드 케이 및 Rh2와 생리활성성분인 가바, 에피카테킨, 갈산 및 클로르제닉산의 함량이 현저히 증진되어 있고, 더불어 우수한 알파-글루코시다제 저해활성과 췌장 리파제 저해활성도 가져서 우수한 항산화 활성, 항당뇨 활성 및 항비만 활성을 갖는 기능성 식품의약품의 소재로 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 진세노사이드 컴파운드 케이 및 Rh2와 생리활성성분이 증진된 새싹삼 발효조성물 및 그 제조방법에 관한 것으로, 더 상세하게는 새싹삼 전초를 락토바실러스 브레비스 BMK184 균주로 발효하여 제조되어, 진세노사이드 컴파운드 케이 및 Rh2와 생리활성성분인 가바, 에피카테킨, 갈산 및 클로르제닉산이 증진된 새싹삼 발효조성물 및 그 제조방법에 관한 것이다.
고려인삼의 속명인 Panax는 그리스어의 Pan(모든)과 Akok(치료하다)의 복합어로서 '모든 병을 치료한다'라는 의미로 예로부터 식약용으로 가장 널리 이용되고 있는 약용작물이다. 인삼은 약 60％의 탄수화물, 8~15％의 조단백질, 1~3％의 조지방, 4~6％의 회분, 3~7％의 조사포닌, 그 외 미량성분들로 구성되어 있다. 인삼의 기능성으로는 면역력 개선, 피로회복, 기억력 개선, 혈행 개선, 항산화 효과 및 갱년기 여성 건강 등이 있으며, 그 외 중추신경 억제 및 흥분 작용, 단백질 및 핵산 생합성 촉진 작용, 조혈 작용, 동맥경화 예방, 혈당강하 작용, 항피로 및 항스트레스 작용 등의 약리작용도 보고되어 있으며, 이와 같은 작용은 사포닌으로부터 당이 분리되면서 생성된 진세노사이드의 작용에 기인하는 것으로 알려져 있다.
현재까지 30여 종이 넘는 진세노사이드가 인삼 사포닌으로부터 분리동정되었으며, 프로토파낙사디올계 사포닌에 속하는 진세노사이드 Rb1, Rb2, Rc, Rd와 프로토파낙사트리올계 사포닌에 속하는 진세노사이드 Re와 Rg1이 대부분을 차지하고 있다.
진세노사이드 컴파운드 케이 (20-O-beta-D-glucopyranosyl-20(S)- protopanaxadiol)는 진세노사이드 대사체로서 특히 체내 흡수율이 탁월하고 약리학적 활성도 우수한 것으로 알려져 있으며, 최근에는 황반변성질환 치료, 신경변증성 통증 치료도 보고되고 있고 (등록특허 10-1539573호, 등록특허10-1300775호), 진세노사이드 Rh2는 항암 효과, 암세포 증식억제, 인슐린 분비 촉진, 세포내 활성산소 제거 및 민감성 개선 효과 등이 우수하다고 알려져 있다.
그러나 진세노사이드 컴파운드 케이 및 Rh2는 수삼, 홍삼에서도 그 함량이 매우 미량으로 존재하고 있어, 이를 해결하고자 효소나 방사선 조사를 이용하여 삼에 포함된 진세노사이드를 진세노사이드 컴파운드 케이 및 Rh2로 전환하는 기술들이 몇몇 개발되어 있으나 (등록특허 10-1751305호, 등록특허 10-1117072호), 이들 기술은 비용이 높거나 안전성 문제를 내포하고 있어서, 여전히 진세노사이드 컴파운드 케이 및 Rh2를 증진시키는 방법의 개발이 요구되고 있는 실정이다.
가바(GABA; γ-aminobutyric acid)는 비-단백질 아미노산의 일종으로, 포유류의 중추신경계에서 주된 억제성 신경전달물질이다. 분자량이 103.12, 녹는점이 203℃로서 물에 잘 녹으며, 생물계에서는 효소에 의해서 글루탐산에서 이산화탄소가 빠져나가는 과정으로부터 생성된다. 가바는 식물 병원성 방어기작에 중요한 역할을 하며, 일반적으로 숙취해소, 불안감 해소, 고혈압강하, 인슐린 효과의 증대, 식욕감퇴 및 우울증 등에 효과가 있다. 또한, 뇌세포 대사 기능을 활발하게 함으로서 중풍 및 치매의 예방, 정신집중력 강화, 기억력 증진, 불면증 등에 효과를 인정받고 있다. 미국이나 유럽에서는 의약품으로 판매되고 있다. 그러나 가바(GABA)는 배아미, 녹차 및 뽕잎 등에 함유되어 있다는 보고는 많지만, 약리작용을 발휘하기에는 함량이 낮아 자연적인 섭취로 가바의 생리작용을 기대하기는 어려운 실정이다. 따라서 가바 함량을 증대시키고 이를 다양한 제품에 적용하여 이용하고자 하는 시도가 계속되고 있다.
갈산(gallic acid) 및 클로르제닉산(Chlorgenic acid)은 페놀산의 일종이고 에피카테킨(epicatechin)은 플라보놀의 일종으로 이들 생리활성성분은 강력한 항산화 성분으로 활성산소를 제거하고 항비만, 고혈압조절, 항균, 항염, 혈당조절, 간기능 보호 등 많은 효능이 알려져 있다. 그러나 가공삼과 관련하여서는 진세노사이드 이외에 폴리페놀 화합물이나 페놀산과 같은 생리활성물질의 증진에 관한 기술이 개발된 바가 드물며, 특히 가바, 에피카테킨, 갈산 및 클로르제닉산이 증진된 가공삼의 개발은 알려져있지 않다.
이에 본 발명자들은 종래 기술의 요구에 부응하기 위한 연구를 지속한 결과, 새싹삼 전초를 락토바실러스 브레비스 BMK184 균주로 발효하여 제조한 조성물이, 진세노사이드 컴파운드 케이 및 Rh2의 함량과 생리활성성분인 가바, 에피카테킨, 갈산 및 클로르제닉산의 함량이 현저히 증진됨을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서 본 발명의 목적은 진세노사이드 컴파운드 케이 및 Rh2와 생리활성성분인 가바, 에피카테킨, 갈산 및 클로르제닉산이 증진된 새싹삼 발효조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 진세노사이드 컴파운드 케이 및 Rh2와 생리활성성분인 가바, 에피카테킨, 갈산 및 클로르제닉산이 증진된 새싹삼 발효조성물의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 새싹삼 발효조성물을 포함하여 증진된 항산화 활성, 항당뇨 활성 및 항비만 활성을 갖는 기능성식품을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 새싹삼 전초를 락토바실러스 브레비스 BMK184 균주로 발효하여 제조되고, 진세노사이드 컴파운드 케이 및 Rh2와 생리활성성분인 가바, 에피카테킨, 갈산 및 클로르제닉산이 증진된 새싹삼 발효조성물을 제공한다.
본 발명에서 '새싹삼'는 묘삼을 광도, 온도 및 습도를 조절하여 90일내로 생산하는 것을 지칭하며, 새싹삼은 재배 동안에는 농약이 전혀 사용되지 않은 친환경 농산물로 수경재배, 연중생산 가능 및 재배기간의 단축으로 인해 종래에 이용되는 뿌리인삼보다 낮은 가격을 형성하고 있다는 장점이 있다.
본 발명에서는 새싹삼 전초를 사용하는 것이 바람직하며, 더 바람직하게는 30일 배양된 새싹삼 전초를 사용한다.
본 발명에서 '전초'는 삼의 뿌리, 줄기 및 잎을 포함한 전체를 의미한다.
본 발명에서 '락토바실러스 브레비스 BMK184 균주'는 본 발명자가 여주 물김치로부터 분리/동정한 신규한 균주로 우수한 가바 생성능(GABA)을 구비하였고, 국립농업과학원 농업유전자원센터 (KACC)에 2016년 12월 12일에 기탁하여, 수탁번호 KACC92156P를 부여받았다 (특허출원 2017-0068747호).
상기와 같이 락토바실러스 브레비스 BMK184 균주는 공식 수탁기관에 기탁된 균주이므로 당업자는 필요에 따라서 용이하게 입수할 수 있다.
락토바실러스 브레비스 BMK184 균주로 새싹삼 전초를 발효시 가바가 증진될뿐만 아니라, 놀랍게도, 진세노사이드 컴파운드 케이 및 Rh2와 에피카테킨, 갈산 및 클로르제닉산이 현저히 증진된 발효조성물을 얻을 수 있었다 (시험예 3~5).
본 발명에 따른 새싹삼 발효조성물은 진세노사이드 컴파운드 케이를 1.68 mg/g 이상, Rh2를 1.4mg/g 이상 함유하고, 가바를 300 mg/100g 이상, 에피카테킨을 54㎍/g 이상, 갈산을 28㎍/g 이상 및 클로르제닉산을 140㎍/g 이상 함유한다 (표 2~5).
본 발명에 따른 새싹삼 발효조성물은 진세노사이드와, 가바, 페놀산 및 플라보놀 등의 생리활성물의 함량이 강화되어, 증진된 항산화 활성, 항당뇨 활성 및 항비만 활성을 갖는다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
ⅰ) 새싹삼 전초를 분말화하는 단계;
ⅱ) 새싹삼 전초 분말에 정제수를 첨가하여 40~50%(v/w) 수분을 함유하도록 하는 단계; 및
ⅲ) 락토바실러스 브레비스 BMK184 균주의 종균을 접종하여 발효하는 단계를 포함하는 진세노사이드 컴파운드 케이 및 Rh2와 생리활성성분인 가바, 에피카테킨, 갈산 및 클로르제닉산이 증진된 새싹삼 발효조성물의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 제조방법은, 추가로, 단계 ⅲ)으로부터의 새싹삼 발효조성물을 건조시켜 분말화하는 단계를 포함할 수 있다.
단계 ⅰ):
새싹삼
전초
분말화
새싹삼 전초를 분말화한다.
새싹삼 전초를 수세하여 물기를 제거한 후 사용한다.
분말화는 새싹삼 전초를 50~60℃에서 2~3일 건조시켜 100 메쉬 이하의 분말로 제조하는 것으로 수행한다.
발효는 분말화하지 않고 진행할 수 있으나, 유효성분 증진을 위해 분말화하여 진행하는 것이 효율적이다. 분말화 후 발효시 미생물에 의해 생성되는 효소의 반응표면 면적이 확대되어 효율적으로 유효성분을 증가시킬 수 있다.
단계 ⅱ): 수분 조정
새싹삼 분말을 발효용기에 담고 정제수를 첨가하여 수분이 40 ~ 50% (v/w)가 되도록 조정한다.
수분이 함량이 40% 미만일 때는 발효가 제대로 진행되지 않으며, 50% 초과의 경우 수분 함량이 과다하여 이상발효가 진행될 수 있고 추가 단계에서의 분말화 또는 건조에 시간과 비용이 많이 소요된다.
필요에 따라서, 수분 조정 후에, 새싹삼 분말에 살균 단계를 수행한다. 살균은 통상의 방법으로 수행할 수 있으나, 살균온도는 100~120℃에서 살균시간은 15~30분간 수행하는 것이 바람직하다. 살균온도 100℃ 혹은 살균시간 15분 미만의 경우 제대로 살균이 되지 않아 잡균 등의 오염이 발생할 수 있고, 120℃ 혹은 30분 초과 살균시 새싹삼의 생리활성성분이 파괴될 수 있다.
단계 ⅲ) 발효
락토바실러스 브레비스 BMK184 균주의 종균을 접종하여 발효하여 새싹삼 발효조성물을 제조한다.
발효는 락토바실러스 브레비스 BMK184 균주의 종균 배양액을 수분 조정된 새싹삼에 2∼10%(v/w) 농도로 접종하여 25~40℃에서 2~5일간 발효시키는 것으로 수행될 수 있다.
종균 접종량이 2%(v/w) 미만이면 발효속도가 지연될 수 있고 10%(v/v) 초과로 수행되면 경제적 효용성이 떨어진다. 발효온도가 25℃ 미만이면 발효기간이 길어져 잡균의 오염을 초래하고 40℃를 초과할 경우에는 균주의 생육이 정지될 수 있다. 발효기간이 2일 미만이면 발효가 충분하지 않아 생리활성물질의 생성이 저조하게 될 수 있으며, 5일 초과이면 발효에 의해 생성된 생리활성물질이 분해되기 시작하여 유효성분이 함량이 감소될 수 있다.
본 발명의 제조방법은 락토바실러스 브레비스 BMK184 균주를 종균으로 사용하고 상기와 같은 단계를 포함함에 의하여, 가공 전에 비하여, 진세노사이드 컴파운드 케이와 에피카테킨이 새로이 생성되고, 진세노사이드 Rh2의 함량은 약 9.6배 증진되고, 갈산의 함량은 3.7배 그리고 클로르제닉산의 함량은 1.9배이 증진된 새싹삼 발효조성물을 제조케한다 (표 2 ~ 표 5).
본 발명의 제조방법에 의해 제조된 새싹삼 발효조성물은 컴파운드 케이 및 Rh2를 포함한 진세노사이드, 가바, 페놀산 및 플라보놀의 함량이 강화되어, 증진된 항산화 활성, 항당뇨 활성 및 항비만 활성을 갖는다.
본 발명의 또 다른 목적에 따라서, 본 발명은 상기 제조방법에 의해 제조되고, 진세노사이드 컴파운드 케이 및 Rh2와 생리활성성분인 가바, 에피카테킨, 갈산 및 클로르제닉산이 증진된 새싹삼 발효조성물을 유효성분으로 포함하는 항산화 활성, 항당뇨 활성 및 항비만 활성을 갖는 기능성식품을 제공한다.
본 발명에서 기능성식품은 본 발명의 새싹삼 발효조성물을 분말화한 것을 그대로 이용하거나, 과립, 환, 음료, 젤리 등의 형태의 제품을 제조될 수 있다.
본 발명에 따른 새싹삼 발효조성물은 진세노사이드 컴파운드 케이 및 Rh2와 생리활성성분인 가바, 에피카테킨, 갈산 및 클로르제닉산의 함량이 현저히 증진되어 있고, 더불어 우수한 알파-글루코시다제 저해활성과 췌장 리파제 저해활성도 가져서 우수한 항산화 활성, 항당뇨 활성 및 항비만 활성을 갖는 기능성 식품의약품의 소재로 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 제조방법은, 통상의 방법에 비하여, 진세노사이드 컴파운드 케이 및 Rh2와 가바, 에피카테킨, 갈산 및 클로르제닉산의 함량 현저히 증진된 새싹삼 발효조성물을 생산케 한다.
본 발명에 따른 기능성식품은 우수한 항산화 활성, 항당뇨 활성 및 항비만 활성을 가져서, 지방생성 억제효과, 체중 조절, 콜레스테롤 저하, 고지혈증 개선, 동맥경화 완화, 당뇨병 완화, 혈액순환 개선, 면역력 개선용으로 유용하다.
도 1은 본 발명에 따른 새싹삼 발효조성물의 총 페놀릭스 및 총 플라보노이드스를 나타낸 그래프이다. 도 1a는 총 페놀릭스 함량, 도 1b는 총 플라보노이드스 함량을 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명에 따른 새싹삼 발효조성물의 항산화 활성을 나타낸 그래프이다. 도 2a는 DPPH 라디칼 소거활성을 나타낸 것이며, 도 2b는 ABTS 라디칼 소거활성을 나타낸 것이며, 도 2c는 환원력(FRAP)을 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명에 따른 새싹삼 발효조성물의 소화효소 저해활성을 나타낸 그래프이다. 도 3a는 알파-글루코시다아제 저해활성을 나타낸 것이며, 도 3b는 췌장-리파아제 저해활성을 나타낸 것이다.
도 4는 락토바실러스 브레비스 BMK184 균주의 가바 생산성을 확인할 수 있는 TLC 사진이다.
도 5는 락토바실러스 브레비스 BMK184 균주의 16S rRNA 유전자의 염기서열이다.
도 2는 본 발명에 따른 새싹삼 발효조성물의 항산화 활성을 나타낸 그래프이다. 도 2a는 DPPH 라디칼 소거활성을 나타낸 것이며, 도 2b는 ABTS 라디칼 소거활성을 나타낸 것이며, 도 2c는 환원력(FRAP)을 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명에 따른 새싹삼 발효조성물의 소화효소 저해활성을 나타낸 그래프이다. 도 3a는 알파-글루코시다아제 저해활성을 나타낸 것이며, 도 3b는 췌장-리파아제 저해활성을 나타낸 것이다.
도 4는 락토바실러스 브레비스 BMK184 균주의 가바 생산성을 확인할 수 있는 TLC 사진이다.
도 5는 락토바실러스 브레비스 BMK184 균주의 16S rRNA 유전자의 염기서열이다.
다음의 실시예들에 의해 본 발명이 더 상세히 설명된다. 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것이며, 본 발명의 범위가 이들에 의해 제한되어서는 안된다.
제조예
:
새싹삼
발효조성물의 제조
30일 재배된 새싹삼 전초 10kg을 흐르는 물에 3회 세척하고 완전히 물기를 제거한 후, 50~55℃에서 2~3일 건조시킨 후 분쇄기로 100메쉬 이하로 분쇄하여 분말을 제조하였다.
새싹삼 전초 분말 50 g를 발효용기에 담고 5배 부피의 정제수를 첨가하여 수분이 45% 되도록 조정한 후 120℃에서 20분간 살균하여 발효 베이스를 준비하였다. 여기에 미리 배양해 둔 락토바실러스 브레스 BMK184 균주(수탁번호 KACC92156P) 배양액을 5%(v/w)로 접종하고 30℃에서 3일간 발효시켜 본 발명의 새싹삼 발효조성물을 완성하였다.
새싹쌈 발효조성물은 -70℃에서 2일간 동결건조 후 분말로 제조하여 보관하면서 하기의 시험예들의 분석을 수행하였다.
시험예
1.
새싹삼
발효조성물의 이화학적 특성
상기에서 제조된 새싹삼 발효조성물의 pH, 총산도 및 생균수를 측겅하여 그 결과를 표 1에 나타내었다. pH는 pH 미터기를 사용하여 측정하였고 총산도는 중화적정법을 통해 수행하여 젖산으로 환산하였다.
| pH | 총산도 (젖산 기준) | 생균수(log cfu/g) | |
| 새싹삼 발효조성물 (BMK184) | 4.80 | 1.44 | 10.13 |
본 발명에 따라 제조된 새싹삼 발효조성물은 pH가 5 이하, 총산도가 1.4이상으로 적정한 산도가 생성되었다. pH가 높을 경우에는 식품위해미생물 등의 증식이 가능하고, 너무 낮을 경우에는 과다 산이 생성되면 신맛이 강화하여 기호성에 문제가 발생할 수 있다.
생균수는 10 cfu/㎖ 이상으로 유산균 발효물에 요구되는 유산균 수에 충족하였다.
시험예
2.
새싹삼
발효조성물의
가바
함량 분석
상기 제조예에서 제조된 본 발명의 새싹삼 발효조성물(실시예)의 가바 함량을 분석하였다.
가바 함량 측정을 위한 유리아미노산 분석은 자동아미노산 분석기(Hitachi, L-8900, Japan)를 이용하여 분석하였다.
새싹삼 발효조성물의 동결건조 분말 0.1 g를 정확히 시험관에 칭량하고 증류수 4 ㎖를 첨가하여 60℃에서 1시간 동안 가수분해를 진행하였다. 그 후 10% 5-술포살리실산(sulfosalicylic acid) 1 ㎖를 첨가하여 4℃에서 2시간 방치하여 단백질을 침전시켰다. 이후에는 글라스 필터로 여과하고 얻은 여액을 60℃에서 감압 농축하여 물을 완전 증발시켰다. 농축된 시료는 리티윰시트레이트 완충액(lithium citrate buffer, pH 2.2) 2 ㎖에 용해한 후 0.45 μm 막필터(Dismic-25CS, Toyoroshikaisha Ltd, Tokyo, Japan)로 여과한 여액을 자동아미노산 분석기로 분석하여 표 2에 나타내었다.
| 가바 함량 (mg/100g) | 실시예 (BMK184) |
| GABA | 303.36 |
표 2에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 새싹삼 발효조성물에서는 303.36 mg/100g으로 높은 가바 함량이 확인되었다.
시험예
3.
새싹삼
발효조성물의 진세노사이드 함량 분석
상기에서 제조된 새싹삼 발효조성물(실시예; BMK184)의 분말과, 비교를 위하여, 새싹삼 전초를 가바 생산 공시균주인 락토바실러스 브레스 KCTC3320 균주로 제조예와 동일한 방식으로 발효한 발효조성물 (참조예; KCTC3320)의 분말, 발효하지 않은 새싹삼 전초를 50~55℃에서 2일 건조시킨 후 분쇄기로 100메쉬 이하로 분쇄하여 분말화한 것(비교예; NIM)을 준비하여 이들을 대상으로 진세노사이드 컴파운드 케이 및 Rh2의 함량 분석을 수행하였다.
<분석시료 준비>
상기에서 준비된 3종의 분말은 건강기능식품분석법에 따라 삼 진세노사이드를 추출하였다. 구체적으로는 각 건조분말을 1 g씩 250 ㎖ 삼각플라스크에 정확히 취하고 70% 메탄올 20 ㎖를 가하여 80℃ 항온수조에서 1시간 정치한 후 냉각하였다. 이를 원심분리하여 상등액만 취하고 이를 2회 반복하였다. 이 상등액을 60℃에서 감압 농축하여 그 잔유물을 3차 증류수 2 ㎖에 용해하여 0.45㎛ 멤브레인 필터로 여과한 후 분석시료로 사용하였다.
<진세노사이드 화합물 분석>
진세노사이드 분석은 기능성식품 분석법에 기술된 방법을 변형하여 고압액체크로마토그래피(HPLC, high press liquid chromatograph)로 분석하였다. 분석 컬럼은 TSKgel ODS-100Z을 사용하여 시료주입량 10㎕, 온도는 30℃ 측정파장은 203 nm, 유속은 1.0 ㎖/min으로 하였고 이동상으로는 A용액은 HPLC water, B용액은 아세토니트릴을 사용하였다. HPLC 분석 조건은 이동상 용액은 0분때 A용액 81% : B용액 19%로 흘려주고 15분때에는 A용액 80% : B용액 20%로 흘려주고 40분때 A용액 77% : B용액 23%, 42분때 A용액 70% : B용액 30%, 75분때에 A용액 65% : B용액 35%, 80분때에 A용액 30% : B용액 70%, 90분때에 A용액 10% : B용액 90%로 이동상을 흘려주었다. 분석된 비교예(발효전, NIM), 실시예 (새싹삼 발효조성물, BMK184) 및 참조예(공시균주 발효조성물, KCTC3320)의 진세노사이드 함량을 표 3에 나타내었다.
| 진세노사이드 함량 (mg/g) | 비교예 (발효전, NIM) |
실시예 (BMK184) |
참조예 (KCTC3320) |
| Ginsenoside Rh2 | 0.15 | 1.45 | 0.82 |
| Ginsenoside Compound K | nd1) | 1.68 | 1.15 |
| 1)nd: 검출되지 않음. | |||
표 3에 나타낸 바와 같이, 발효되지 않은 새싹삼 전초(비교예)와 비교하여, 실시예의 새싹삼 발효조성물은 진세노사이드 Rh2 함량이 9.7배 증진되었고 특히 진세노사이드 컴파운드 케이는 새로이 생성되었다 (1.68 mg/g).
또한 참조예의 공시균주 발효조성물과 비교시에도 본 발명에 따른 새싹삼 발효조성물은 약 1.5배 높은 진세노사이드 컴파운드 케이 함량을 보였고, 진세노사이드 Rh2의 경우도 약 1.7배 높은 함량을 보였다.
시험예
4.
새싹삼
발효조성물의 생리활성성분 함량 분석
발효 전후 및 공시균주 발효시 생리활성성분인 총 페놀릭스, 총 플라보노이드스 함량을 분석하였다.
<분석시료 준비>
상기 시험예 3에서와 같이 준비된 실시예(BMK184)의 분말, 참조예(KCTC3320)의 분말, 비교예(NIM)의 분말 각각 10 g에 50% 발효주정 10 ㎖를 첨가하여 상온(20±5℃)에서 24시간 추출하고 3,000 rpm의 속도로 원심분리하여 상등액만을 취하여 추출물을 제조하고 이들 추출물을 시료로 하여 총 페놀릭스, 총 플라보노이드스 함량 분석을 하였다.
<총 페놀릭스 함량>
총 페놀릭스 함량은 Folin Denis법(1912)으로 측정하였다.
구체적으로는 상기에서 준비된 각 분석시료를 시험관에 0.5 ㎖ 분주하고 여기에 25% Na2CO3 용액 0.5 ㎖를 첨가하여 3분간 정치시켰다. 다시 2N-Folin-Ciocalteu 페놀 시약 0.25 ㎖를 첨가하여 혼합한 다음 30℃에서 1시간 동안 정치시킨 후 750 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때 총 페놀릭스 함량은 갈산(Gallic acid)을 이용하여 작성한 표준곡선으로부터 함량을 구하여 갈산에 상당하는 양으로 계산하였고 그 결과를 도 1a에 나타냈다.
도 1a에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 발효조성물(실시예, BMK184)의 총 페놀릭스 함량은 20 mg/g 이상으로 비교예(NIM)에 비하여 훨씬 증진되었고, 참조예(KCTC3320)에 비하여도 증진되었다.
<총 플라보노이드스 함량>
총 플라보노이드스 함량은 Davis 변법으로 측정하였다.
구체적으로는 상기에서 준비된 시료 0.1 ㎖에 1 N NaOH 0.01 ㎖를 첨가한 후 디에틸렌글리콜 1.0 ㎖를 첨가하여 37℃에서 1시간 방치 후 420 nm 흡광도를 측정하였다. 이때 총 플라보노이드스 함량은 루틴(rutin)의 최종 농도를 0, 0.25, 0.5, 1.0 mg/㎖로 제조하여 작성한 표준곡선으로부터 함량을 구하였고 그 결과는 도 1b에 나타내었다.
도 1b에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 발효조성물(실시예, BMK184)의 총 플라보노이드스 함량은 30 mg/g 이상으로 비교예(NIM)에 비하여 훨씬 증진되었고, 참조예(KCTC3320)에 비하여도 증진되었다.
시험예
5.
새싹삼
발효조성물의 페놀산 및
플라보놀
분석
생리활성성분인 페놀산 및 플라보놀을 분석하였다.
페놀산과 플라보놀 함량 분석은 상기 시험예 4에서와 같이 준비된 각각의 시료에 대해 HPLC(high performance liquid chromatography)를 사용하여 분석하였다.
분석 컬럼은 XBridgeTM C18(4.6×250 mm, 5 μm, Waters Corp., Milford, MA, USA) 컬럼을 사용하였고 0.5% 글라시알 아세트산 (glacial acetic acid, 이동상 용매 A)와 100% 메탄올(이동상 용매 B)을 0 ~ 100% 선형 구배(linear gradient)로 30℃에서 60분간 1분당 1 ㎖의 속도로 가동하면서 UV 검출기로 페놀산(280 nm)과 플라보놀(270 nm)을 검출하였고 그 결과를 각각 표 4와 표 5에 나타내었다.
| 페놀산 함량1 ) (μg/g) | 비교예 (NIM) |
참조예 (KCTC3320) |
실시예 (BK184) |
| Gallic acid | 5.86 | 13.44 | 28.68 |
| Protocatechuic acid | 8.76 | 13.53 | 14.03 |
| Chlorgenic acid | 74.39 | 101.88 | 140.22 |
| Ferulic acid | 7.56 | 8.54 | 17.68 |
| Vertaric acid | nd | nd | 15.93 |
| 1)모든 실험은 삼반복 수행하였다. 2)nd, 검출되지 않음 | |||
표 4에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 발효조성물(실시예, BMK184)은 페놀산 화합물이 비교예 및 참조예에 비하여 모두 증가하였고, 특히 갈산(gallic acid), 클로르제닉산(chlorgenic acid)의 함량은 각각 약 3.7배 및 1.9배 이상 증진되었다.
| 플라보놀 함량1 ) (μg/g) | 비교예 (NIM) |
참조예 (KCTC3320) |
실시예 (BK184) |
| Epicatechin | nd2 ) | 23.22 | 54.84 |
| Quercetin | 182.86 | 231.72 | 213.79 |
| 1)모든 실험은 삼반복 수행하였다. 2)nd, 검출되지 않음. | |||
표 5에 나타낸 바와 같이, 비교예에 비교하여, 본 발명에 따른 발효조성물(실시예, BMK184)은 플라보놀 화합물이 증가하였고, 특히 에피카테킨(epicatechin)은 새로이 생성되었음을 알 수 있다.
시험예
6.
새싹삼
발효조성물의 항산화 활성 분석
본 발명에 따른 새싹삼 발효조성물의 항산화 활성은 DPPH 라디칼 및 ABTS 라디칼 소거활성과 FRAP 환원력을 측정하여 분석하였다.
<분석시료>
시험예 4에서 준비된 각각의 추출물 시료를 60℃에서 감압농축 및 동결건조 후, 0.5 mg/㎖와 1.0 mg/㎖ 농도로 제조하여 분석시료로 사용하였다.
<DPPH 라디칼 소거활성>
DPPH 라디칼 소거활성은 상기에서 준비된 각각의 분석시료 (1 mg/㎖) 0.2 ㎖에, DPPH 용액(1.5×10-4M) 0.8 ㎖를 첨가하여 균일하게 혼합하여 30분간 방치한 후 525 nm에서 흡광도를 측정하여 수행하였다. DPPH 라디칼 소거활성의 음성 대조구는 시료 대신 증류수를 사용하여 동일한 방법으로 진행하여 흡광도의 차이를 다음과 같은 식에 의해 백분율(%)로 산출하였으며, 그 결과를 도 2a에 도시하였다.
라디칼 소거활성(%) =
[1-(음성대조구 흡광도 ÷ 실험구 흡광도)] × 100
도 2a에 나타난 바와 같이, 비교예에 비하여, 본 발명에 따른 발효조성물(실시예, BMK184)의 DPPH 라디칼 소거활성이 현저히 증진되었다 (비교예(NIM) 39%, 실시예(BMK184) 53.17%).
<ABTS 라디칼 소거활성>
ABTS 라디칼 소거활성은 7 mM ABTS 시약 5 ㎖과 140 mM K2S2O8 (FW 270.3, Sigma 9392) 5 ㎖을 섞어 어두운 곳에 16시간 방치시켜 양이온 라디칼을 생성시킨 후, 이를 메탄올로 섞어 732 nm에서 대조구의 흡광도 값이 0.7±0.02가 되도록 조절한 ABTS 용액을 사용하였다. 상기에서 준비된 각각의 분석시료 (0.5 mg/㎖) 0.1 ㎖과 ABTS 용액 0.9 ㎖를 혼합하여 3분간 반응시키고 732 nm에서 흡광도를 측정하였다. ABTS 라디칼 저해활성 역시 음성 대조구는 시료 대신 증류수를 사용하여 동일한 방법으로 진행하여 흡광도의 차이를 상기 식에 의해 백분율(%)로 산출하였으며, 그 결과를 도 2b에 도시하였다.
도 2b에 나타난 바와 같이, 비교예에 비하여, 본 발명에 따른 발효조성물(실시예, BMK184)의 ABTS 라디칼 소거활성이 현저히 증진되었다 (비교예(NIM) 43%, 실시예(BMK184) 64.16%).
<FRAP 환원력 분석>
FRAP (Ferric reducing antioxidant power) 환원력 분석은 화합물의 환원력을 측정하는 방법으로 Fe3+를 Fe2+로 환원시키는 힘을 측정하는 방법이다. 구체적으로는 FeⅢ-TPTZ(ferric tripyridyl triazine)가 시료의 환원력에 의하여 푸른색의 FeⅡ-TPTZ(ferrous tripyridyl triazine)으로 환원될 때 흡광도를 측정하여 항산화 활성을 알아보는 것이다.
FRAP 환원력 분석에서 반응액으로는 30 mM 아세테이트 완충액(pH 3.6), 40 mM 염산에 녹인 10 mM 2,4,6-트리피리딜-s-트리아진(TPTZ, T1253, C18H12N6, MW312.33) 및 20 mM FeCl3(F7134, MW 162.20, in DW)를 준비하였으며, 아세테이트 완충액, TPTZ 용액 및 FeCl3 용액을 10:1:1 (v/v/v)로 혼합하여 37℃에서 15분간 예비반응을 시켜두었다. 상기에서 준비된 각각의 분석시료 50 ㎕(1 mg/㎖)와 FRAP 시약 950 ㎕를 시험관에 분주한 후, 약 15분간 반응시키고 마이크로플레이트 리더 (Biorad 3055, Sweden)를 사용하여 593 nm에서 흡광도를 측정하여 그 결과를 도 2c에 나타냈다.
도 2c에 도시된 바와 같이, 비교예에 비하여, 본 발명에 따른 발효조성물(실시예, BMK184)의 환원력이 현저히 증진되었다 (비교예(NIM) 0.67, 실시예(BMK184) 0.853).
이들 결과로부터 본 발명에 따른 새싹삼 발효조성물은 항산화 활성이 현저히 증진됨을 알 수 있다.
시험예
7.
새싹삼
발효조성물의 소화효소 저해활성 검정
본 발명에 따른 새싹삼 발효조성물에 대해 항당뇨(당뇨 개선) 효과의 지표인 알파-글루코시다아제 및 항비만(비만 개선) 효과의 지표인 췌장-리파아제 저해활성을 시험하였다.
<알파-글루코시다아제 저해활성>
알파-글루코시다아제 저해활성은 상기 시험예 6에서 준비된 분석시료 (1 mg/㎖ 농도) 50 ㎕에 0.5 U/㎖ 알파-글루코시다아제 효소액 50 ㎕를 첨가하고 여기에 200 mM 인산나트륨 완충액(pH 6.8) 50 ㎕를 혼합하여 37℃에서 10분간 예비 배양한 후, 인산나트륨 완충액(pH 6.8)을 100 ㎕ 가하여 37℃에서 10분간 반응시켰다. 반응액에 100 mM Na2CO3 0.75 ㎖를 첨가하여 반응을 정지시키고 420 nm에서 흡광도를 측정하였으며 음성 대조구는 시료 대신 증류수를 사용하여 동일한 방법으로 진행하여 흡광도의 차이를 다음 식에 의해 백분율(%)로 산출하였으며, 그 결과를 도 3a에 도시하였다.
저해활성(%) = [1-(음성대조구 흡광도 ÷ 실험구 흡광도)] × 100
도 3a에 도시된 바와 같이, 본 발명에 따른 발효조성물(BMK184)은 비교 예(NIM)에 비하여, 알파-글루코시다아제 저해활성이 현저히 증진되었다 (약 2.4배 증진).
<췌장-리파아제 저해활성>
췌장-리파아제 저해활성은 상기 시험예 6에서 준비된 분석시료(1 mg/㎖ 농도) 50 ㎕, 1.0 U/㎖ 췌장 리파아제 효소액 50 ㎕, 200 mM 인산나트륨 완충액(pH 6.8) 50 ㎕를 혼합하여 37℃에서 10분간 예비 배양한 후, 인산나트륨 완충액(pH 6.8)을 100 ㎕ 가하여 37℃에서 10분간 반응시켰다. 이 반응액에 100 mM Na2CO3 0.75 ㎖를 첨가하여 반응을 정지시키고 420 nm에서 흡광도를 측정하고 음성 대조구는 증류수를 사용하여 동일한 방법으로 진행하여 흡광도의 차이를 상기 식에 의해 백분율(%)로 산출하였으며, 그 결과를 도 3b에 도시하였다.
도 3b에 도시된 바와 같이, 본 발명에 따른 발효조성물(BMK184)은 비교 (NIM)에 비하여, 췌장-리파아제 저해활성도 현저히 증진되었다 (약 1.4배).
이들 결과로부터 본 발명에 따른 새싹삼 발효조성물은 알파-글루코시다아제 및 췌장-리파아제 저해활성이 현저히 증진되어 항당뇨 활성 및 항비만 활성이 탁월함을 알 수 있다.
상기 활성(기능성) 검정 결과들로부터, 본 발명의 제조방법에 따라 제조된 새싹삼 발효조성물은 진세노사이드 컴파운드 케이 및 Rh2, 가바, 갈산, 클로니제닉산, 에피카테킨과 같은 생리활성성분이 증진될 뿐만 아니라, 우수한 항산화 활성, 항당뇨 및 항비만 활성을 가져서 기능성 식품의 소재로 유용하다는 것을 알 수 있다.
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<223> 16S rRNA of Lactobacillus brevis BMK184
<400> 1
cggagagttt gatcctggct caggacgaac gctggcggca tgcctaatac atgcaagtcg 60
aacgagcttc cgttgaatga cgtgcttgca ctgatttcaa caatgaagcg agtggcgaac 120
tggtgagtaa cacgtgggga atctgcccag aagcagggga taacacttgg aaacaggtgc 180
taataccgta taacaacaaa atccgcatgg attttgtttg aaaggtggct tcggctatca 240
cttctggatg atcccgcggc gtattagtta gttggtgagg taaaggccca ccaagacgat 300
gatacgtagc cgacctgaga gggtaatcgg ccacattggg actgagacac ggcccaaact 360
cctacgggag gcagcagtag ggaatcttcc acaatggacg aaagtctgat ggagcaatgc 420
cgcgtgagtg aagaagggtt tcggctcgta aaactctgtt gttaaagaag aacacctttg 480
agagtaactg ttcaagggtt gacggtattt aaccagaaag ccacggctaa ctacgtgcca 540
gcagccgcgg taatacgtag gtggcaagcg ttgtccggat ttattgggcg taaagcgagc 600
gcaggcggtt ttttaagtct gatgtgaaag ccttcggctt aaccggagaa gtgcatcgga 660
aactgggaga cttgagtgca gaagaggaca gtggaactcc atgtgtagcg gtggaatgcg 720
tagatatatg gaagaacacc aggtggcgaa ggcggctgtc tagtctgtaa ctgacgctga 780
ggctcgaaag catgggtagc gaacaggatt agataccctg gtagtccatg ccgtaaacga 840
tgagtgctaa gtgttggagg gtttccgccc ttcagtgctg cagctaacgc attaagcact 900
ccgcctgggg agtacgaccg caaggttgaa actcaaagga attgacgggg gcccgcacaa 960
gcggtggagc atgtggttta attcgaagct acgcgaagaa ccttaccagg ccttgacatc 1020
ttctgccaat cttagagata agacgttccc ttcggggaca gaatgacagg tggtgcatgg 1080
ttgtcgtcag ctcgtgtcgt gagatgttgg gttaagtccc gcaacgagcg caacccttat 1140
tatcagttgc cagcattcag ttgggcactc tggtgagact gccggtgaca aaccggagga 1200
aggtggggat gacgtcaaat catcatgccc cttatgacct gggctacaca cgtgctacaa 1260
tggacggtac aacgagtcgc aaagtcgtga ggctaagcta atctcttaaa gccgttctca 1320
gttcggattg taggctgcaa ctcgcctaca tgaagttgga atcgctagta atcgcggatc 1380
agcatgccgc ggtgaatacg ttcccgggcc ttgtacacac cgcccgtcac accatgagag 1440
tttgtaacac ccaaagccgg tgagataacc ttcgggagtc agccgtctaa tggtgggaca 1500
gatgattagg gtgaagtcgt aaccaaggta gccgta 1536
Claims (8)
- 새싹삼 전초 분말을 수탁번호 KACC92156P로 기탁된 락토바실러스 브레비스 BMK184 균주로 발효하여 제조되고, 진세노사이드 컴파운드 케이 및 Rh2와 생리활성성분이 증진된 새싹삼 발효조성물로,
상기 생리활성성분은 가바(GABA), 에피카테킨, 갈산 및 클로르제닉산이고,
상기 새싹삼 발효조성물은 진세노사이드 컴파운드 케이를 1.68 mg/g 이상, Rh2를 1.4 mg/g 이상, 가바를 300 mg/100g 이상, 에피카테킨을 54 ㎍/g 이상, 갈산을 28 ㎍/g 이상 및 클로르제닉산을 140 ㎍/g 이상 함유하는 것인 새싹삼 발효조성물.
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 제 1항에 있어서, 상기 새싹삼 발효조성물은 항당뇨 활성 및 항비만 활성을 갖는 것인 진세노사이드 컴파운드 케이 및 Rh2와 생리활성성분이 증진된 새싹삼 발효조성물.
- 제 1항 또는 제 5항에 따른 새싹삼 발효조성물을 포함하는 식품.
- 제 6항에 있어서, 상기 식품은 분말, 과립, 환, 음료 및 젤리로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나의 형태인 것인 식품.
- 제 1항에 따른 진세노사이드 컴파운드 케이 및 Rh2와 생리활성성분이 증진된 새싹삼 발효조성물의 제조방법으로, 상기 방법은
ⅰ) 새싹삼 전초를 분말화하는 단계;
ⅱ) 새싹삼 전초 분말에 정제수를 첨가하여 40~50%(v/w) 수분을 함유하도록 하는 단계; 및
ⅲ) 수탁번호 KACC92156P로 기탁된 락토바실러스 브레비스 BMK184 균주의 종균을 2∼10%(v/w) 농도로 접종하여 25~40℃에서 2~ 5일간 발효시키는 단계를 포함하고,
상기 생리활성성분은 가바, 에피카테킨, 갈산 및 클로르제닉산이고,
상기 새싹삼 발효조성물은 진세노사이드 컴파운드 케이를 1.68 mg/g 이상, Rh2를 1.4 mg/g 이상, 가바를 300 mg/100g 이상, 에피카테킨을 54 ㎍/g 이상, 갈산을 28 ㎍/g 이상 및 클로르제닉산을 140 ㎍/g 이상 함유하는 것인 제조방법.
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