KR102464052B1 - 진세노사이드 F2, Rg3, Rd2 및 컴파운드 케이, 클로로제닉산, 쿠마린산, 카테킨 및 쿼르세틴이 증진된 새싹삼 복합발효 조성물 및 그 제조방법 - Google Patents
진세노사이드 F2, Rg3, Rd2 및 컴파운드 케이, 클로로제닉산, 쿠마린산, 카테킨 및 쿼르세틴이 증진된 새싹삼 복합발효 조성물 및 그 제조방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명에서는 진세노사이드 F2, Rg3, Rd2 및 컴파운드 케이, 클로로제닉산, 쿠마린산, 카테킨 및 쿼르세틴이 증진된 새싹삼 복합발효 조성물 및 그 제조방법이 개시된다. 본 발명에 따른 새싹삼 복합발효 조성물은 진세노사이드 F2, Rg3, Rd2 및 컴파운드 케이, 클로로제닉산, 쿠마린산, 카테킨 및 쿼르세틴의 함량이 현저히 증진되어 있고, 더불어 우수한 항산화 활성을 가져서 기능성식품의 소재로 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 기능성식품은 우수한 항산화 활성을 가져서, 지방생성 억제효과, 체중 조절, 콜레스테롤 저하, 고지혈증 개선, 동맥경화 완화, 당뇨병 완화, 혈액순환 개선, 면역력 개선용으로 유용하다.
Description
본 발명은 진세노사이드 F2, Rg3, Rd2 및 컴파운드 케이, 클로로제닉산, 쿠마린산, 카테킨 및 쿼르세틴이 증진된 새싹삼 복합발효 조성물 및 그 제조방법에 관한 것으로, 더 상세하게는 새싹삼 전초를 특정 조건에서 3증3포하여 숙성한 후 락토바실러스 브레비스 BMK184 균주와 락토바실러스 플란타륨 P1201 균주의 복합발효를 통하여 제조된, 진세노사이드 F2, Rg3, Rd2 및 컴파운드 케이, 클로로제닉산, 쿠마린산, 카테킨 및 쿼르세틴이 증진된 새싹삼 복합발효 조성물 및 그 제조방법에 관한 것이다.
새싹삼은 묘삼을 광도, 온도 및 습도를 조절하여 90일내로 생산하는 것을 지칭하며, 21종의 진세노사이드 함량이 인삼 대비 2배 이상이며, 산양삼 전초와 유사하다고 알려져 있다. 새싹삼은 재배 동안에는 농약이 전혀 사용되지 않은 친환경 농산물로 수경재배, 연중생산 가능 및 재배기간의 단축으로 인해 종래에 이용되는 뿌리인삼보다 낮은 가격을 형성하고 있고, 산양삼 전초 대비 16배 이상 저렴하다는 장점이 있다. 따라서 새싹삼을 이용하여 진세노사이드 및 생리활성성분을 증진시키기 위한 가공방법의 개발이 활발히 연구되고 있다.
활성형 진세노사이드는 인체 장내에서 흡수가 용이한 진세노사이드로서 진세노사이드 Rg1, Rg3, Rd2, Rf, Rh, F2, 컴파운드 케이(compound K) 등이 있다. 진세노사이드 Rg1은 학습기능 개선, 항피로 작용, 진세노사이드 Rf는 뇌신경세포 진통작용, 지질과산화 억제작용, 진세노사이드 Rg3는 암세포 전이억제, 간보호 작용, 항암제 내성억제 작용, 진세노사이드 Rd2는 부신피질 호르몬 분비 촉진 작용, 진세노사이드 F2는 간질환, 치매 및 미백작용, 및 진세노사이드 컴파운드 케이는 항암작용, 간보호 작용, 피부보호 작용, 종양증식억제 작용, 항산화 작용, 항알레르기 작용이 밝혀져 있다. 특히, 진세노사이드 컴파운드 케이는 진세노사이드 대사체로서 특히 체내 흡수율이 탁월하고 약리학적 활성도 우수한 것으로 알려져 있으며, 최근에는 황반변성질환 치료, 신경변증성 통증 치료도 보고되고 있다 (등록특허10-1300775).
클로로제닉산(Chlorgenic acid)은 페놀산의 일종으로, 활성산소를 제거하고 혈당을 저하하여 항당뇨 활성을 나타내는 것으로 보고되어 있고, 쿠마린산(Coumaric acid)도 페놀성 화합물로 항암 효과, 멜라닌 생산의 억제제, 세균 증식의 억제효과가 알려져 있다. 카테킨(Catechin)은 플라보놀의 일종으로 간질환 및 고지혈증에 효과가 있고 항산화 활성이 높은 것으로 알려져 있고 쿼르세틴(quercetin)도 플라보놀 화합물의 일종으로 항염증작용, 뇌세포 보호활성, 항암작용, 항당뇨, 항비만, 항고혈압 등 각종 생리활성을 나타내는 것으로 보고되어 있다.
그러나 진세노사이드 F2, Rg3, Rd2 및 컴파운드 케이, 클로로제닉산, 쿠마린산, 카테킨 및 쿼르세틴이 현저히 증진된 새싹삼 가공품은 개발된바 없다.
이에 본 발명자들은 종래 기술의 요구에 부응하기 위한 연구를 지속한 결과, 새싹삼 전초를 특정 조건에서 3증3포하여 숙성한 후 락토바실러스 브레비스 BMK184 균주와 락토바실러스 플란타륨 P1201 균주의 복합발효한 경우, 활성형 진세노사이드인 진세노사이드 F2, Rg3, Rd2 및 컴파운드 케이, 생리활성성분인 클로로제닉산, 쿠마린산, 카테킨 및 쿼르세틴의 함량이 현저히 증진됨을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서 본 발명의 목적은 진세노사이드 F2, Rg3, Rd2 및 컴파운드 케이, 클로로제닉산, 쿠마린산, 카테킨 및 쿼르세틴이 증진된 새싹삼 복합발효 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 진세노사이드 F2, Rg3, Rd2 및 컴파운드 케이, 클로로제닉산, 쿠마린산, 카테킨 및 쿼르세틴이 증진된 새싹삼 복합발효 조성물의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 새싹삼 복합발효 조성물을 포함하는 기능성식품을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 새싹삼 전초를 특정 조건에서 3증3포하여 숙성한 후 락토바실러스 브레비스 BMK184 균주와 락토바실러스 플란타륨 P1201 균주의 복합발효를 통하여 제조된, 진세노사이드 F2, Rg3, Rd2 및 컴파운드 케이, 클로로제닉산, 쿠마린산, 카테킨 및 쿼르세틴이 증진된 새싹삼 복합발효 조성물을 제공한다.
본 발명에서는 새싹삼 전초를 사용하는 것이 바람직하며, 더 바람직하게는 30일 배양된 새싹삼 전초를 사용한다.
본 발명에서 '전초'는 삼의 뿌리, 줄기 및 잎을 포함한 전체를 의미한다.
숙성
새싹삼
전초
새싹삼 전초를 3증3포하여 숙성된 새싹삼 전초를 제조한다.
본 발명에서 '3증3포'는 100℃에서 60~120분 증숙하고 70~80℃에서 2~5일간 숙성하는 과정을 3회 반복하는 것을 의미한다.
숙성은 개방용기를 사용하여 수분이 증발되게 하면서 수행하는 것이 바람직하다.
증숙시간이 60분 미만인 경우 충분한 증숙이 진행되지 않아 숙성과 같은 후속 단계가 원활하지 않을 수 있고 잡균의 오염이 발생될 수 있으며, 120분 초과하여 증숙될 경우는 오랜 열처리로 삼 전초의 생리활성성분이 파괴될 수 있으며 특히 잎과 줄기의 생리활성성분이 과다하게 파괴될 수 있다. 숙성온도가 70℃ 미만이거나 숙성기간이 2일 미만인 경우 숙성이 원활히 이루어지지 않으며, 숙성온도가 80℃ 초과하거나 숙성기간이 5일 초과의 경우 생산된 생리활성물질이 분해되어 함량이 감소될 수 있다.
복합 발효
3증3포 숙성된 새싹삼 전초를 복합종균으로 발효한다.
본 발명의 제조방법에서 복합종균으로는 락토바실러스 브레비스 BMK184 균주와 락토바실러스 플란타륨 P1201 균주의 복합 종균을 사용한다.
본 발명에서 복합종균을 구성하는 하나의 균주인 락토바실러스 브레비스 BMK184 균주는 본 발명자들이 여주 물김치로부터 분리/동정한 신규한 균주로, 우수한 가바(GABA)의 생산성을 구비하였고, 국립농업과학원 농업유전자원센터(KACC)에 2016년 12월 12일에 기탁하여, 수탁번호 KACC 92156P를 부여받았다 (특허출원 10-2017-0068747호).
본 발명에서 복합종균을 구성하는 또 다른 하나의 균주인 락토바실러스 플란타륨 P1201 균주는 본 발명자들이 발효식품으로부터 분리/동정하여 국립농업과학원 농업유전자원센터(KACC)에 2013년 7월 19일에 기탁한 균주(수탁번호 KACC91848P)로서, 생균제제능이 우수하고 생리활성물질 생산성이 우수한 특성을 갖는다 (등록특허 10-154418호).
본 발명의 복합종균을 구성하는 락토바실러스 브레비스 BMK184 균주와 락토바실러스 플란타륨 P1201 균주는 발효 특성이 상호 보완되어 상승작용을 나타낸다. 락토바실러스 브레비스 BMK184 균주는 이형유산발효(hetero-lactic acid fermentation) 유산균으로 단독 발효시 유산 생성이 충분하지 않고, 락토바실러스 플란타륨 P1201 균주는 동형유산발효(homo-lactic acid fermentation) 유산균으로 단독 발효시 유산이 과다하게 생성되는데, 놀랍게도 새싹삼 전초를 이들 두 가지 종균을 함께 사용하여 복합발효시 양 균주의 발효 특성이 상호 보완되고 활성 진세노사이드 및 생리활성성분의 생성이 현저히 증진되었다 (표 2, 표 3).
본 발명에서 복합종균은 락토바실러스 브레비스 BMK184 균주와 락토바실러스 플란타륨 P1201 균주 각각 별도의 배양액으로서 첨가될 수도 있으며, 혼합 배양된 혼합 배양액으로서 첨가될 수도 있다.
복합종균에서 상기 2종의 균주의 혼합 비율은 3 : 1~ 1 : 3(v/v)으로 혼합될 수 있다.
발효는 상기 복합종균의 배양액을 3증3포 숙성된 새싹삼 전초에 3~10%(v/w) 농도로 접종하여 25~40℃에서 2~5일간 발효시키는 것으로 수행될 수 있다.
복합종균 접종량이 3%(v/w) 미만일 경우에는 발효 속도가 지연될 수 있고 10%(v/w) 초과시에는 균체 증식 속도가 빨라 활성 진세노사이드의 전환율이 낮으며 신맛이 등이 과다할 수 있으며, 발효 온도가 25℃ 미만일 경우 발효기간이 길어져 잡균의 오염을 초래하고 40℃를 초과할 경우에는 균주의 생육이 정지될 수 있고, 발효 기간이 2일 미만일 경우 발효가 충분하지 않아 생리활성물질 등의 생성이 저조하게 될 수 있으며, 5일을 초과한 경우는 과발효에 의해 생리활성물질이 분해될 수 있다.
본 발명에 따른 새싹삼 복합발효 조성물은 진세노사이드 F2를 8.5 mg/g 이상, 진세노사이드 Rg3를 1.6 mg/g 이상, 진세노사이드 Rd2를 4.1 mg/g 이상 및 진세노사이드 컴파운드 케이를 4.5 mg/g 이상, 클로로제닉산을 546 ㎍/g 이상, 쿠마린산을 14 ㎍/g 이상, 카테킨을 549 ㎍/g 이상 및 쿼르세틴을 678 ㎍/g 이상 함유한다 (표 2, 표 3).
본 발명에 따른 새싹삼 복합발효 조성물은 락토바실러스 브레비스 BMK184 균주 단독 발효시 (진세노사이드 컴파운드 케이를 1.68 mg/g, 클로로제닉산 140 ㎍/g)에 비하여 진세노사이드 컴파은드 케이는 약 2.4배 이상, 클로로제닉산은 약 3.9배 이상 증진된다 (도시되지는 않음).
또한 본 발명에 따른 새싹삼 복합 발효조성물은 진세노사이드, 페놀산 및 플라보놀 등의 생리활성물의 함량이 강화되어, 증진된 항산화 활성을 갖는다 (도 4 ~ 도 7).
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기와 같은 단계들을 포함하는 진세노사이드 F2, Rg3, Rd2 및 컴파운드 케이, 클로로제닉산, 쿠마린산, 카테킨 및 쿼르세틴이 증진된 새싹삼 복합발효 조성물의 제조방법을 제공한다:
ⅰ) 새싹삼 전초를 3증3포하여 숙성하는 단계;
ⅱ) 숙성된 새싹삼 전초를 락토바실러스 브레비스 BMK184 균주와 락토바실러스 플란타륨 P1201 균주의 복합 종균으로 발효하는 단계.
본 발명의 제조방법은, 추가로, 단계 ⅱ)으로부터의 새싹삼 복합발효 조성물을 건조시켜 분말화하는 단계를 포함할 수 있다.
단계 ⅰ):
새싹삼
전초
숙성
새싹삼 전초를 3증3포하여 숙성한다.
새싹삼, 전초, 3증3포 및 숙성은 상기에서 정의된바와 같다.
단계 ⅱ) 복합발효
숙성된 새싹삼 전초를 복합종균으로 발효한다.
복합종균은 상기에서 정의된 바와 같다.
본 발명의 상기와 같은 단계를 거쳐 제조된 새싹삼 복합발효 조성물은, 발효 전에 비하여, 진세노사이드 F2를 약 3.9배 이상, 진세노사이드 Rg3를 약 5.2배 이상, 진세노사이드 Rd2를 약 2.81배 이상 및 진세노사이드 컴파운드 케이를 약 6배 이상, 클로로제닉산을 약 2.9배 이상, 쿠마린산을 약 14배 이상, 카테킨을 약 1.8배 이상 및 쿼르세틴을 약 1.1배 이상 증진되었다 (표 3, 표 4).
본 발명의 또 다른 목적에 따라서, 본 발명은 상기 제조방법에 의해 제조된 진세노사이드 F2, Rg3, Rd2 및 컴파운드 케이, 클로로제닉산, 쿠마린산, 카테킨 및 쿼르세틴이 증진된 새싹삼 복합발효 조성물을 포함하는 기능성식품을 제공한다.
본 발명에 따른 기능성 식품은 우수한 항산화 활성을 갖는다 (도 4~도 7).
본 발명에서 기능성식품은 본 발명의 새싹삼 복합발효 조성물을 건조하여 분말화한 것을 그대로 이용하거나, 과립, 환, 음료, 젤리 등의 형태의 제품으로 제조될 수 있다.
본 발명에 따른 새싹삼 복합발효 조성물은 진세노사이드 F2, Rg3, Rd2 및 컴파운드 케이, 클로로제닉산, 쿠마린산, 카테킨 및 쿼르세틴의 함량이 현저히 증진되어 있고, 더불어 우수한 항산화 활성을 가져서 기능성식품의 소재로 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 제조방법은, 종래의 가공방법에 비하여, 진세노사이드 F2, Rg3, Rd2 및 컴파운드 케이, 클로로제닉산, 쿠마린산, 카테킨 및 쿼르세틴의 함량이 현저히 증진된 새싹삼 복합발효 조성물을 생산케 한다.
본 발명에 따른 기능성식품은 우수한 항산화 활성을 가져서, 지방생성 억제효과, 체중 조절, 콜레스테롤 저하, 고지혈증 개선, 동맥경화 완화, 당뇨병 완화, 혈액순환 개선, 면역력 개선용으로 유용하다.
도 1은 본 발명에 따른 새싹삼 복합발효 조성물의 제조 공정의 일례를 나타낸 사진이다.
도 2는 본 발명에 따른 새싹삼 복합발효 조성물의 진세노사이드 HPLC 크로마토그램을 나타낸 것이다. (A)는 진세노사이드 21종 표준 크로마토그램이고, (B)는 비교예 1의 크로마토그램이고, (C)는 비교예 2의 크로마토그램이고, (D)는 실시예 1의 크로마토그램이다.
도 3은 발명에 따른 새싹삼 복합발효 조성물의 총 페놀릭스 및 총 플라보노이드를 나타낸 그래프이다. 도 3a는 총 페놀릭스 함량, 도 3b는 총 플라보노이드 함량을 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명에 따른 새싹삼 복합발효 조성물의 DPPH 라디칼 소거활성을 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명에 따른 새싹삼 복합발효 조성물의 ABTS 라디칼 소거활성을 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명에 따른 새싹삼 복합발효 조성물의 하이드록실 라디칼 소거활성을 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명에 따른 새싹삼 복합발효 조성물의 환원력(FRAP)을 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명에 따른 새싹삼 복합발효 조성물의 진세노사이드 HPLC 크로마토그램을 나타낸 것이다. (A)는 진세노사이드 21종 표준 크로마토그램이고, (B)는 비교예 1의 크로마토그램이고, (C)는 비교예 2의 크로마토그램이고, (D)는 실시예 1의 크로마토그램이다.
도 3은 발명에 따른 새싹삼 복합발효 조성물의 총 페놀릭스 및 총 플라보노이드를 나타낸 그래프이다. 도 3a는 총 페놀릭스 함량, 도 3b는 총 플라보노이드 함량을 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명에 따른 새싹삼 복합발효 조성물의 DPPH 라디칼 소거활성을 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명에 따른 새싹삼 복합발효 조성물의 ABTS 라디칼 소거활성을 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명에 따른 새싹삼 복합발효 조성물의 하이드록실 라디칼 소거활성을 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명에 따른 새싹삼 복합발효 조성물의 환원력(FRAP)을 나타낸 것이다.
다음의 실시예들에 의해 본 발명이 더 상세히 설명된다. 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것이며, 본 발명의 범위가 이들에 의해 제한되어서는 안된다.
제조예 : 새싹삼 복합발효 조성물의 제조
새싹삼 전초 3 kg을 흐르는 물에 3회 세척하고 완전히 물기를 제거하여 준비하였다.
새싹삼 전초 2 kg을 증자기에 적당량의 물과 함께 100℃에서 1시간 증숙한 후 건조 채반에 담고 수분이 증발되게 하면서 75℃에서 3일간 숙성시키는 과정(증숙과 숙성)을 3회 진행하여(3증3포) 숙성 새싹삼 전초를 제조하였다.
제조된 숙성 새싹삼 전초 1 kg을 발효용기에 2배의 정세수(2 L)를 가하고 1시간동안 수화시켜 수분 함량을 약 50% 정도 되게 조정한 후, 120℃에서 20분간 살균하고, 락토바실러스 플란타륨 P1201 균주 및 락토바실러스 브레비스 BMK184 균주를 맥아엑기스 액체배지에서 종균으로 배양하며 1:1 비율로 혼합한 복합종균을 5%(v/w)로 접종하고 30℃에서 3일간 발효시켜 새싹삼 복합발효 조성물 (실시예 1; FASG)을 제조하였다 (도 1).
비교를 위하여, 물에 3회 세척하고 물기가 제거된 새싹삼 전초 1 kg을 55 ℃에서 3일간 건조한 새싹삼 건조 조성물 (비교예 1; DSG)과 3증3포 숙성 새싹삼 조성물 (비교예 2; ASG)를 함께 준비하였다.
<이화학적 특성>
상기에서 제조된 실시예 1, 비교예 1 및 비교예 2의 조성물의 pH는 pH 미터기를 사용하여 측정하였고, 총산도는 중화적정법을 통해 수행하여 젖산으로 환산하여 표기하였고, 환원당은 DNS법(Mille, 1953)을 통해 수행하여 포도당으로 환산하여 표기하였다.
| 분석항목1) | 시료 | ||
| 비교예 1 | 비교예 2 | 실시예 1 | |
| pH | 5.86±0.29 | 5.10±0.26 | 4.87±0.24 |
| 총산도 (%, 젖산) | 2.82±0.14 | 3.79±0.19 | 4.50±0.23 |
| 환원당 (mg/ml) | 3.51±0.18 | 21.09±1.05 | 30.89±1.54 |
| 1)모든 실험은 삼 반복 수행하였음. | |||
본 발명에 따라 제조된 새싹삼 복합발효 조성물은 건조 또는 숙성 새싹삼 전초에 비하여 pH는 감소하였고, 총산도와 환원당은 증가하였다. pH가 높을 경우에는 식품위해미생물 등의 증식이 가능하고, 너무 낮을 경우에는 과다 산이 생성되면 신맛이 강화하여 기호성에 문제가 발생할 수 있는데, 본 발명의 새싹삼 복합발효 조성물은 적당한 산과 당이 생성되어 신맛과 단맛이 적절히 이루어져 있다.
시험예 1. 진세노사이드 함량 분석
상기에서 제조된 실시예 1, 비교예 1 및 비교예 2의 조성물을 55℃에서 2일 건조시킨 후 분쇄기로 100메쉬 이하로 분쇄하여 분말을 제조하였다.
<분석시료 준비>
상기에서 제조된 분말은 건강기능식품분석법에 따라 삼 진세노사이드를 추출하였다. 구체적으로는 상기에서 준비된 각 건조분말을 1 g씩 250 ml 삼각플라스크에 정확히 취하고 70% 메탄올 20 ml를 가하여 70℃ 항온수조에서 1시간 정치한 후 냉각하였다. 이를 원심분리하여 상등액만 취하고 이를 2회 반복하였다. 이 상등액을 60℃에서 감압 농축하여 그 잔유물을 3차 증류수 2 ml에 용해하여 0.45㎛ 멤브레인 필터로 여과한 후 분석시료로 사용하였다.
<진세노사이드 화합물 분석>
진세노사이드 분석은 기능성식품 분석법에 기술된 방법을 변형하여 고압액체크로마토그래피(HPLC, high press liquid chromatograph)로 분석하였다. 분석 컬럼은 TSKgel ODS-100Z(4.6 ×250 nm, 5 μm, Tosoh Corp.,)을 사용하여 시료주입량 10 ㎕, 온도는 30℃ 측정파장은 203 nm, 유속은 1.0 ml/min으로 하였고 이동상으로는 A용액은 HPLC water, B용액은 아세토니트릴을 사용하였다. HPLC 분석 조건은 이동상 용액은 0분때 A용액 81% : B용액 19%로 흘려주고 15분때에는 A용액 80% : B용액 20%로 흘려주고 40분때 A용액 77% : B용액 23%, 42분때 A용액 70% : B용액 30%, 75분때에 A용액 65% : B용액 35%, 80분때에 A용액 30% : B용액 70%, 90분때에 A용액 10% : B용액 90%로 이동상을 흘려주었다. 각 HPLC 크로마토그램을 도 2에 나타내고, 활성형 진세노사이드 화합물의 함량을 표 2에 나타내었다.
| 함량(mg/g d.w.) | 비교예 1 | 비교예 2 | 실시예 1 |
| Ginsenoside Rd2 (15) | 1.48±0.07 | 3.79±0.19 | 4.16±0.21 |
| Ginsenoside F2 (16) | 2.15±0.11 | 3.56±0.18 | 8.59±0.43 |
| Ginsenoside Rg3 (17) | 0.31±0.02 | 1.17±0.06 | 1.64±0.08 |
| Compound K (19) | 0.75±0.04 | 2.98±0.15 | 4.54±0.23 |
도 2의 HPLC 크로마토그램를 비교해 보면, 본 발명의 새싹삼 복합발효 조성물(실시예 1)은 건조 또는 숙성 조성물 (비교예 1 및 비교예 2)에 비하여 활성형 진세노사이드들이 증진되었음이 확인된다.
또한 표 2에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 새싹삼 복합발효 조성물은 진세노사이드 Rd2는 비교예 1에서 1.48 mg/g의 함량을 보였으며 실시예 1에서 4.16 mg/g으로 약 3배 증가하였고, 진세노사이드 F2의 경우는 비교예 1의 경우 2.15 mg/g이고 비교예 2의 경우 3.56 mg/g이었으나, 실시예 1의 경우는 8.59 mg/g으로 증가되었다. 진세노사이드 Rg3의 경우는 비교예 1의 경우 0.31 mg/g이고 비교예 2의 경우 1.17 mg/g이었으나, 실시예 1의 경우는 1.64 mg/g으로 증가되었다. 또한 진세노사이드 compound K는 비교예 1의 경우 0.75 mg/g, 비교예 2의 경우 2.98 mg/g이었으나, 실시예 1의 경우 4.54 mg/g으로 현저히 증진되었다.
시험예 2. 생리활성성분 함량 분석
항산화 활성 등을 나타내는 생리활성성분인 총 페놀릭스, 총 플라보노이드스, 갈변물질 함량을 분석하였다.
<분석시료 준비>
시험예 1에서와 같이 분말화한 각 분말 1 g에 50% 발효주정 20 ml를 첨가하여 상온(20±5℃)에서 12시간 추출하고 3,000 rpm의 속도로 원심분리하여 상등액만을 취하여 0.45 μm membrane filter (Dismic-25CS, Toyoroshikaisha, Ltd, Tokyo, Japan)로 여과하여 농축하여 시료를 제조하고 이 시료로 하여 총 페놀릭스, 총 플라보노이드스 함량 분석을 하였다.
<총 페놀릭스 함량>
총 페놀릭스 함량은 Folin Denis법(1912)으로 측정하였다.
구체적으로는 상기에서 준비된 각 분석시료를 시험관에 0.5 ml 분주하고 여기에 25% Na2CO3 용액 0.5 ml를 첨가하여 3분간 정치시켰다. 다시 2N Folin-Ciocalteu 페놀 시약 0.25 ml를 첨가하여 혼합한 다음 30℃에서 1시간 동안 정치시킨 후 750 nm에서 분광광도계(Spectronic 2D, Thermo Co., Califonia, CL, USA)를 사용하여 흡광도를 측정하였다. 이때 총 페놀릭스 함량은 갈산(Gallic acid)을 이용하여 작성한 표준곡선으로부터 함량을 구하여 갈산에 상당하는 양으로 계산하였고 그 결과를 도 3a에 나타냈다.
도 3a에 나타낸 바와 같이, 총 페놀릭스 함량은 비교예 1에서 2.39 GAE/g의 함량을 보였으며 비교예 2에서 4.94 GAE/g으로 함량을 보였고, 실시예 1에서는 5.52 GAE/g의 증진된 함량을 나타냈다.
<총 플라보노이드스 함량>
총 플라보노이드스 함량은 Davis 변법으로 측정하였다.
구체적으로는 상기에서 준비된 시료 0.5 ml에 디에틸렌글리콜 1.0 ml를 분주한 후 1 N NaOH 0.01 ml를 첨가한 후 37℃ 항온수조에서 1시간 방치 후 420 nm에서 분광광도계로 흡광도를 측정하였다. 이때 총 플라보노이드스 함량은 루틴(rutin)의 최종 농도를 0, 0.25, 0.5, 1.0 mg/ml로 제조하여 작성한 표준곡선으로부터 함량을 구하였고 그 결과는 도 3b에 나타내었다.
도 3b에 나타낸 바와 같이, 총 플라보노이드스 함량도, 비교예 1의 경우 5.42 RE/g의 함량을 보였으며 비교예 2에서 9.44 RE/g의 함량을 보였으나 실시예 1에서는 비교예 1 보다 약 2.5배 높은 13.30 RE/g으로 함량이 크게 증가하는 것을 확인할 수 있다.
시험예 3. 페놀산 및 플라보놀 분석
생리활성성분인 페놀산 및 플라보놀을 분석하였다.
페놀산과 플라보놀 함량 분석은 Hwang 등(2017)의 방법을 약간 변형하여 상기 시험예 2에서와 같이 준비된 각각의 시료에 대해 HPLC(high performance liquid chromatography)를 사용하여 분석하였다.
분석 칼럼은 XbridgeTM C18(4.6 ×250 nm, 5 μm, Ireland)를 사용하였고 칼럼 온도는 30℃로 하였다. 유속은 1 ml/min을 유지하였고, 시료의 주입량은 10 ㎕로 하였다. 분석 용매는 A 용매(0.2% acetic acid in HPLC water)와 B 용매(0.2% acetic acid in acetonitrile)를 사용하였다. 이동상 조건은 B 용매 기준으로 0 min-0%, 5 min-5%, 10 min-15%, 19 min-10%, 20 min-15%, 28 min-30%, 32 min-40%, 37 min-30%, 40 min-50%, 45 min-60%, 55 min-80%, 60 min-90% 및 65 min-100%로 유지하였으며 UV 검출기로 페놀산(280 nm)과 플라보놀(270 nm)을 검출하였고 그 결과를 표 3에 나타내었다.
| 함량(㎍/g d.w.) | 비교예 1 | 비교예 2 | 실시예 1 |
| 페놀산 | |||
| Gallic acid | 23.65±1.18 | 90.59±4.53 | 90.65±4.53 |
| Protocatechuic acid | 45.33±2.27 | 118.38±5.92 | 136.59±6.83 |
| Chlorogenic acid | 183.56±9.18 | 436.72±21.84 | 546.85±27.34 |
| Vanillic acid | 2.99±0.15 | 24.97±2.75 | 10.62±0.53 |
| p-Coumaric acid | nd | nd | 14.61±0.73 |
| Vertaric acid | 18.37±0.92 | 21.46±1.07 | 34.30±1.72 |
| 플라보놀 | |||
| Epigallocatechin | 213.94±10.70 | 451.03±22.55 | 822.18±41.11 |
| Catechin | 299.54±14.98 | 389.61±14.48 | 549.51±27.48 |
| Epicatechin | 191.14±9.56 | 237.87±21.89 | 274.14±13.71 |
| Epigallocatechin gallate | 17.79±0.89 | 20.11±0.99 | 29.44±1.47 |
| Vanillin | 0.15±0.01 | nd | 11.72±0.59 |
| Rutin | 12.25±0.61 | 13.11±0.64 | 15.47±0.71 |
| Catechin gallate | 18.99±0.95 | 22.11±1.00 | 53.81±2.69 |
| Quercetin | 587.85±29.39 | 655.34±32.77 | 678.70±30.44 |
| Naringin | nd | 20.36±5.52 | 46.56±2.33 |
| Naringenin | nd | 13.12±1.66 | 24.55±1.02 |
| Formonoetin | 6.74±0.34 | 10.72±0.54 | 14.33±0.51 |
표 3에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 새싹삼 복합발효 조성물은 페놀산 화합물과 플라보놀 화합물이 모두 증가하였고, 특히 클로로제닉산은 비교예 1에서 183.56 ㎍/g의 함량, 비교예 2에서는 436.72 ㎍/g 함량을 나타냈으나, 실시예 1에서는 546.85 ㎍/g의 함량으로 비교예 1에 비하여 약 3배 증진되었다. 쿠미린산은 비교예 1 및 비교예 2에서는 검출되지 않았으나(nd) 실시예 1에서는 14.61 ㎍/g의 함량으로 증진되었다. 카테킨은 비교예 1에서 299.54 ㎍/g의 함량, 비교예 2에서는 389.61 ㎍/g 함량을 나타냈으나, 실시예 1에서는 549.51 ㎍/g의 함량으로 비교예 1에 비하여 약 1.8배 증진되었다. 퀘르세틴 함량은 실시예 1에서 678.70 ㎍/g으로 비교예 1 및 비교예 2에 비하여 증진되었다.
시험예 4. 항산화 활성 분석
본 발명에 따른 활성산양삼 조성물의 항산화 활성은 DPPH 라디칼 소거활성, ABTS 라디칼 소거활성, 하이드록실 라디칼 소거활성 및 FRAP 환원력을 측정하여 분석하였다.
<분석시료>
시험예 2에서 준비된 각각의 추출물 시료를 60℃에서 감압농축 및 동결건조 후, 0.25, 0.5, 1 mg/ml 농도로 제조하여 분석시료로 사용하였다.
<DPPH 라디칼 소거활성>
DPPH 라디칼 소거활성은 Hwang 등(2014)의 방법을 변형하여 측정하였다. 상기에서 준비된 시료 (0.25, 0.5, 1 mg/ml 농도) 각각 0.2 ml에, DPPH 메탄올 용액(1.5×10- 4 M) 0.8 ml를 첨가하여 10초간 교반후 암실에서 30분간 방치한 후 525 nm에서 흡광도를 측정하여 수행하였다. DPPH 라디칼 소거활성의 음성 대조구는 시료 대신 추출용매를 사용하여 동일한 방법으로 진행하여 흡광도의 차이를 다음과 같은 식에 의해 백분율(%)로 산출하였으며, 그 결과를 도 4에 도시하였다.
라디칼 소거활성(%) = [1-(음성대조구 흡광도 ÷실험구 흡광도)] × 100
도 4에 나타난 바와 같이, DPPH 라디칼 소거활성은 0.5 mg/ml의 농도에서 각각 비교예 1의 경우 30.42%, 비교예 2의 경우 57.97% 및 실시예 1의 경우 68.74%의 활성을 보여 실시예 1의 새싹삼 복합발효 조성물이 가장 높은 활성을 보였다.
<ABTS 라디칼 소거활성>
ABTS 라디칼 소거 활성도 Hwang 등(2014)의 방법에 준하여 측정하였다. 7 mM ABTS+와 2.45 mM K2S2O8를 1:1 비율로 섞어 암실에서 12∼16시간 반응시킨 후 메탄올과 1:88 비율로 섞어 732 nm에서 대조구의 흡광도 값이 0.7±0.02가 되도록 조절한 ABTS+ 용액을 사용하였다. 적당히 희석된 여과액 0.1 mL와 ABTS+ 용액 0.9 ml를 첨가하여 혼합한 후 3분간 정치 후 즉시 732 nm에서 분광광도계를 사용하여 흡광도를 측정하였다. 음성대조구 실험은 시료 대신에 추출용매를 취하여 진행하였으며 실험구와 음성 대조구의 흡광도를 구하여 상기 식에 의해 백분율(%)로 산출하여 그 결과를 도 5에 나타냈다.
도 5에 나타난 바와 같이, ABTS 라디칼 소거활성은 0.25 mg/mL의 농도에서 비교예 1의 경우 9.94%의 활성을 보였고, 비교예 2의 경우 46.06%의 활성을 보였으며, 실시예 1의 경우는 60.17%으로 가장 높은 활성을 보였다.
<하이드록실 라디칼 소거활성>
하이드록실 라디칼 소거 활성은 Kim 등 (2019)의 방법에 준하여 측정하였다. 10 mM FeSO4 7H2O-EDTA, 10 mM 2-데옥시리보스 및 10 mM H2O2 0.2 ml를 시험관에 분주하고 시료를 1.4 ml를 가하여 37℃에서 4시간 반응시켰다. 1% TBA와 2.8% TCA 1 ml을 첨가하고 100℃에서 20분간 발색한 후 520 nm 파장에서 흡과도를 측정하였다. 음성대조구는 시료대신 PBS 완충용액을 사용하여 실험하였으며 실험구와 음성대조구의 흡광도를 구하여 상기 식에 의해 백분율(%)로 산출하여 그 결과를 도 6에 나타냈다.
도 6에 나타난 바와 같이, 하이드록실 라디칼 소거활성은 1 mg/ml의 농도에서 비교예 1은 40.39%, 비교예 2는 48.23%, 실시예 1은 55.67%로 나타나, 본 발명에 따른 새싹삼 복합발효 조성물에서 가장 높은 소거활성을 보였다.
<FRAP 환원력 분석>
FRAP (Ferric reducing antioxidant power) 환원력 분석은 화합물의 환원력을 측정하는 방법으로 Fe3 +를 Fe2 +로 환원시키는 힘을 측정하는 방법이다. 구체적으로는 FeⅢ-TPTZ(ferric tripyridyl triazine)가 시료의 환원력에 의하여 푸른색의 FeⅡ-TPTZ(ferrous tripyridyl triazine)으로 환원될 때 흡광도를 측정하여 항산화 활성을 알아보는 것이다.
FRAP 환원력 분석에서 반응액으로는 30 mM 아세테이트 완충액(pH 3.6), 40 mM 염산에 녹인 10 mM 2,4,6-트리피리딜-s-트리아진(TPTZ, T1253, C18H12N6, MW312.33) 및 20 mM FeCl3(F7134, MW 162.20, in DW)를 준비하였으며, 아세테이트 완충액, TPTZ 용액 및 FeCl3 용액을 10:1:1 (v/v/v)로 혼합하여 37 ℃에서 15분간 예비반응을 시켜두었다. 상기에서 준비된 각각의 분석시료(0.25, 0.5, 1 mg/ml 농도) 50 ㎕와 FRAP 시약 950 ㎕를 시험관에 분주한 후, 약 15분간 반응시키고 593 nm에서 흡광도를 측정하여 그 결과를 도 7에 나타냈다.
도 7에 나타난 바와 같이, FRAP 환원력은 1 mg/ml의 농도에서 비교예 1은 0.716, 비교예 2는 1.551, 실시예 1은 2.046으로 나타나, 역시 실시예 1에서 가장 높은 환원력을 보였다.
이들 결과로부터 본 발명에 따른 새싹삼 복합발효 조성물은 항산화 활성이 현저히 증진됨을 알 수 있다.
상기 활성(기능성) 검정 결과들로부터, 본 발명에 따른 새싹삼 복합발효 조성물은 진세노사이드 F2, Rg3, Rd2 및 컴파운드 케이, 클로로제닉산, 쿠마린산, 카테킨 및 쿼르세틴이 증진될 뿐만 아니라, 우수한 항산화 활성을 가져서 기능성 식품의 소재로 유용하다는 것을 알 수 있다.
Claims (7)
- 진세노사이드 F2 및 Rd2, 클로로제닉산, 쿠마린산, 카테킨 및 쿼르세틴이 증진된 새싹삼 복합발효 조성물로,
상기 조성물은 새싹삼 전초를 100℃에서 60~120분 증숙하고 70~80℃에서 2~5일간 숙성하는 과정을 3회 반복한 후, 수탁번호 KACC92156P로 기탁된 락토바실러스 브레비스 BMK184 균주와 수탁번호 KACC91848P로 기탁된 락토바실러스 플란타륨 P1201 균주의 복합 종균으로 발효하여 제조되고,
상기 조성물은 진세노사이드 F2를 8.5 mg/g 이상, 진세노사이드 Rd2를 4.1 mg/g 이상, 클로로제닉산을 546 ㎍/g 이상, 쿠마린산을 14 ㎍/g 이상, 카테킨을 549 ㎍/g 이상 및 쿼르세틴을 678 ㎍/g 이상 함유하는 것을 특징으로 하는 조성물.
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 제 1항에 따른 새싹삼 복합발효 조성물을 포함하는 기능성식품.
- 제 6항에 있어서, 상기 기능성식품은 항산화 활성을 갖는 특징으로 하는 기능성식품.
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