KR102564529B1 - 파바톤 콩잎 및 현미의 송이버섯균사체 발효조성물 및 그 제조방법 - Google Patents

파바톤 콩잎 및 현미의 송이버섯균사체 발효조성물 및 그 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명에서는 파바톤 콩잎과 현미를 특정 비율로 혼합한 혼합물을 송이버섯균사체로 발효하여 제조한 비배당체 이소플라본인 다이드제인과 제니스테인, 리보플라빈, 루틴 및 퀘르세틴이 현저히 증진된 발효조성물 및 그 제조방법이 개시된다.
본 발명에 따른 발효조성물은 다이드제인, 제니스테인, 리보플라빈, 루틴, 퀘르세틴의 함량이 고함량으로 함유되어 기능성식품 및 화장품의 소재로 사용될 수 있다.

Description

파바톤 콩잎 및 현미의 송이버섯균사체 발효조성물 및 그 제조방법{Fermentation composition of complex-fermented of Fabaton soybean leaves by using Tricholoma matsutake mycelium and preparation method thereof}
본 발명은 파바톤 콩잎 및 현미의 송이버섯균사체 발효 조성물 및 그 제조방법에 관한 것으로, 더 상세하게는 파바톤 콩잎과 현미를 특정 비율로 혼합한 혼합물을 송이버섯균사체로 발효하여 제조한 비배당체 이소플라본인 다이드제인과 제니스테인, 리보플라빈, 루틴 및 퀘르세틴이 현저히 증진된 발효조성물 및 그 제조방법에 관한 것이다.
콩잎에는 콩의 대표적인 기능성 성분인 이소플라본이 함유되어 있고, 콩잎의 생육단계에 따라 당가수분해효소 저해활성이 차이가 나며, 비만, 당뇨 등의 기능성식품 개발에 우수한 소재로 활용이 가능할 것으로 제시되고 있다 (Yuk et al., 2011, Food Chem.).
최근 분자농법 기술을 이용하여 이소플라본 유도체 고함량 콩잎(파바톤 콩잎) 재배기술이 개발되었으나 (특허등록 10-1451298호), 이 콩잎의 이소플라본은 배당체 이소플라본인 β-글리코사이드와 말로닐-β-글리코사이드가 약 98%를 차지하고 생리활성이 우수한 비배당체 이소플라본은 약 2% 이하 정도만 존재하여 기능성식품으로 활용면에서 충분하지 않은 실정이다.
이소플라본은 베타-글리코시드가 연결된 배당체 형태 또는 당이 떨어져 나간 비배당체 형태로 존재한다. 비배당체 이소플라본(aglycon isoflavone)으로는 제니스테인(genistein), 다이드제인(daidzein) 및 글리시테인(glycitein) 등이 있으며, 배당체 이소플라본으로는 제니스틴(genistin), 다이드진(daidzin) 및 글리시틴(glycitin) 등이 있다. 특히 다양한 생리활성은 아글리콘 형태의 비배당체 이소플라본에 기인한다고 보고되고 있다. 비배당체 이소플라본 중에서 제니스테인(genistein)은 항산화활성 뿐만 아니라 유방암 및 전립선암 등에 효과적이며 다이드제인(daidzein)은 폐경기 여성의 골다공증에 효과적인 것으로 알려져 있다. 식품의약품안전처는 이소플라본을 건강기능식품 고시형 원료로서 폐경기 이후 뼈 건강에 도움을 줄 수 있으며 일일 섭취권장량으로 비배당체 이소플라본 유도체 총합으로 약 24 ~ 27 mg을 제시하고 있다.
리보플라빈(riboflavin)은 각종 대사에 관여하는 중요한 비타민 중의 하나이다. 리보플라빈은 모든 유기 세포체의 산화-환원반응에 필요한 조효소인 플라빈 아데닌 디뉴클레오티드(flavin adenine dinucleotide, FAD)와 플라민 모노뉴클레오티드(flavin mononucleotide, FMN)의 전구물질로서 인간을 포함한 동물에게 필수영양소이다. 리보플라빈이 결핍되면 구강 및 인두점막의 염증, 피부 염증 및 다른 피부손상, 결막염, 시력감퇴, 성장저해 및 체중감소 등을 유발할 수 있다 (등록특허 10-1335853호).
루틴은 채소 특히 메밀, 적포도주, 아스파라거스, 페퍼민트, 유칼립투스, 많은 베리류 예컨대, 크랜베리 및 멀베리에 함유되어 있다. 루틴은 모세혈관벽 강화 효과 및 미소순환에 대한 유익한 작용으로 치질 및 혈종의 치료에 이용된다. 최근 연구는 루틴의 약물학적 특성 특히, 혈소판에 대한 항응집 활성, 항염증 활성 및 항산화제 활성을 개시한다 (공개특허 10-2016-0049013).
퀘르세틴(Quercetin)은 플라보놀 화합물의 일종으로 항염증작용, 뇌세포 보호활성, 항암작용, 항당뇨, 항비만, 항고혈압 등 각종 생리활성을 나타내는 것으로 보고되어 있다.
그러나 다이드제인과 제니스테인과 더불어 리보플라빈, 루틴 및 퀘르세틴이 현저히 증진된 송이버섯균사체 발효조성물은 개발된 바 없다.
이에 본 발명자들은 종래 기술의 요구에 부응하기 위한 연구를 지속한 결과, 파바톤 콩잎과 현미를 특정 비율로 혼합한 혼합물을 송이버섯균사체로 발효한 경우, 다이드제인, 제니스테인, 리보플라빈, 루틴 및 퀘르세틴이 현저히 증진됨을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서 본 발명의 목적은 다이드제인, 제니스테인, 리보플라빈, 루틴 및 퀘르세틴이 증진된 송이버섯균사체 발효조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 다이드제인, 제니스테인, 리보플라빈, 루틴 및 퀘르세틴이 증진된 송이버섯균사체 발효조성물의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 발효조성물을 포함하는 기능성식품을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 발효조성물을 포함하는 화장품을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 파바톤 콩잎과 현미의 혼합물을 송이버섯균사체로 발효하여 제조된, 다이드제인, 제니스테인, 리보플라빈, 루틴 및 퀘르세틴이 증진된 발효조성물을 제공한다.
본 발명에서 '파바톤 콩잎'은 재배 전·후에 콩잎에 식물생장호르몬인 에틸렌(ethylene), 에틸렌 공여체(에세폰) 또는 에틸렌 발생제를 처리하여 이소플라본 유도체를 고함량으로 함유하는 콩잎을 의미한다. 파바톤 콩잎은 통상적으로 약 5,000 ㎍/g 이상의 이소플라본 유도체를 함유하며, 상업적으로 입수할 수 있다.
본 발명의 파바톤 콩잎과 현미의 혼합물에서 파바톤 콩잎 : 현미의 중량비는 9 : 1 내지 7 : 3이 바람직하며, 가장 바람직하게는 8 : 2이다.
파바톤 콩잎 : 현미의 중량비가 상기 범위를 벗어나면, 다이드제인 및 제니스테인의 함량이 떨어지거나 송이버섯균사체의 균사 성장이 충분하지 않을 수 있다. 송이버섯균사체의 성장 정도와 다이드제인 및 제니스테인의 함량을 모두 고려할 때 파바톤 콩잎 : 현미의 중량비는 8 : 2인 것이 가장 바람직하다.
본 발명에서 파바톤 콩잎은 건조하고 분쇄하여 분말화하여 사용하는 것이 바람직하며, 현미도 분말화하여 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명에서 '송이버섯균사체'는 송이버섯의 균사체를 의미한다. 송이버섯균사체는 수확시기와 상관없이 언제든지 이용가능하고 자실체와 유사한 항암, 체지방 감소, 혈중 콜레스테롤 저하 및 면역증가 효과 등의 효능을 가지며, 특히 균사체 성장 중에 β-글루코시다아제를 포함한 섬유소 분해효소, 단백질 분해효소, 지방질 분해효소 등의 다양한 가수분해효소를 생성한다.
본 발명에서 '발효'는 송이버섯균사체를 종균으로 사용하여 발효하는 것을 의미한다. 파바톤 콩잎과 현미의 혼합물을 송이버섯균사체로 발효시, 놀랍게도 다이드제인, 제니스테인, 리보플라빈, 루틴 및 퀘르세틴이 현저히 증진되었다 (표 1 ~ 표 3).
본 발명에서 송이버섯균사체는 파바톤 콩잎과 현미의 혼합물에 3~10%(v/w) 농도로 접종하여 25~30℃에서 8~12일간 발효시키는 것으로 수행될 수 있다. 가장 바람직하게는 10일간 발효한다.
송이버섯균사체 접종량이 3%(v/w) 미만일 경우에는 발효 속도가 지연될 수 있고 10%(v/w) 초과시에는 균사체 증식 속도가 빨라 전환율이 낮을 수 있으며, 발효 온도가 25℃ 미만일 경우 발효기간이 길어져 잡균의 오염을 초래하고 30℃를 초과할 경우에는 균사체의의 생육이 저하될 수 있고, 발효 기간이 8일 미만일 경우 발효가 충분하지 않아 생리활성물질 등의 생성이 저조하게 될 수 있으며, 12일을 초과한 경우는 과발효에 의해 생리활성물질이 분해될 수 있다.
본 발명에서 파바톤 콩잎과 현미의 혼합물은 발효 전에 증자 처리될 수 있다. 증자는 100℃ 이상에서 30 ~ 90분 증자하는 것이 바람직하고, 가장 바람직하게는 121℃에서 60분 증자한다.
본 발명에서 증자 처리를 하는 이유는 파바톤 콩잎이나 현미에 존재하는 세균 등의 필요 없는 미생물을 살균하기 위함이며 100℃ 이하 혹은 30분 이하의 경우 필요없는 미생물(잡균)이 완전히 살균되지 않아 발효에 영향을 미칠 수 있었으며, 121℃ 이상 혹은 90분 이상 처리시 과도한 열처리에 의하여 영양성분과 유효성분 등의 파괴가 많이 될 수 있다.
본 발명에 따른 발효조성물은 다이드제인 2,472 ㎍/g 이상, 제니스테인 933 ㎍/g 이상, 리보플라빈 10 mg/100g, 루틴 351 ㎍/g 이상 및 퀘르세틴 346 ㎍/g 이상 함유한다 (표 1~표 3).
본 발명에 따른 발효조성물은 다이드제인 및 제니스테인의 함량이 가공전 혼합물(비교예 1)에 비하여 각각 약 6.2배 이상, 발효 전(비교예 2)에 비하여도 각각 약 3.1배 및 약 3,7배 이상 증진된다 (표 1).
또한 본 발명에 따른 발효조성물은 리보플라빈, 루틴 및 퀘르세틴의 함량이 가공전 혼합물(비교예 1)에 비하여 각각 약 27배 이상, 약 2배 이상 및 약 1.7배 이상, 발효 전(비교예 2)에 비하여도 각각 약 8.3배 이상, 약 1.16배 이상 및 약 1.4배 이상 증진된다 (표 1~표 3).
또한 본 발명에 따른 발효조성물은 다이드제인, 제니스테인, 리보플라빈, 루틴, 퀘르세틴, 총 페놀릭스 및 총 플라보노이드스 등의 생리활성물의 함량이 강화되어, 증진된 항산화 활성을 갖는다 (표 1~표 3, 도 5a ~도 7d).
또한 본 발명에 따른 발효조성물은 알파-글루코시다아제 저해활성과 췌장-리파아제 저해활성이 증진되어 우수한 당뇨 개선 및 비만 개선 효과를 갖는다 (도 8 및 도 9).
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 파바톤 콩잎과 현미의 혼합물을 송이버섯균사체로 발효하여 다이드제인, 제니스테인, 리보플라빈, 루틴 및 퀘르세틴이 증진된 발효조성물의 제조방법을 제공한다.
구체적으로 상기 방법은
ⅰ) 파바톤 콩잎 분말과 현미 분말을 9:1 내지 7:3 중량비로 혼합한 후 물을 3~5배(v/w)으로 혼합하는 단계;
ⅱ) 100℃ 이상에서 60 ~ 120분 증자하는 단계; 및
ⅱ) 송이버섯균사체를 3~10%(v/w) 농도로 접종하여 25~30℃에서 8~12일간 발효하는 단계를 포함한다.
본 발명의 제조방법에서, 파바톤 콩잎, 혼합물의 중량비, 송이버섯균사체 및 발효는 상기에서 정의된 바와 같다.
원활한 발효를 위하여 파바톤 콩잎과 현미의 혼합물에 물을 첨가하여 발효할 수 있다. 물은 파바톤 콩잎과 현미의 혼합물의 3~5배(v/w)으로 첨가하는 것이 바람직하다.
발효 전에, 파바톤 콩잎, 현미 및 물의 혼합물은 살균하기 위하여 증자 처리될 수 있다. 증자는 100℃ 이상에서 30 ~ 90분 증자하는 것이 바람직하고, 가장 바람직하게는 121℃에서 60분 증자한다.
본 발명의 또 다른 목적에 따라서, 본 발명은 상기 제조방법에 의해 제조된 다이드제인, 제니스테인, 리보플라빈, 루틴 및 퀘르세틴이 증진된 발효조성물을 포함하는 기능성식품을 제공한다.
본 발명에 따른 기능성 식품은 우수한 항산화 활성, 당뇨 개선 및 비만 개선 효과를 갖는다 (도 7a~도 9).
본 발명의 또 다른 목적에 따라서, 다이드제인, 제니스테인, 리보플라빈, 루틴, 퀘르세틴이 증진된 발효조성물을 포함하는 화장품을 제공한다.
본 발명의 식품 또는 화장품은 본 발명의 발효조성물 또는 이의 추출물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 성분과 혼합되어 제조될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 제조될 수 있다.
본 발명에서 상기 식품의 종류는 특별히 제한되지 않으며, 환제, 정제, 캡슐제, 발효차, 발효식품 (김치류, 피클류 등), 발효음료 (파우치제, 드링크제 등) 등일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 화장품의 종류는 마스크팩, 스킨, 로션, 크림 등일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명에 따른 발효조성물은 다이드제인, 제니스테인, 리보플라빈, 루틴, 퀘르세틴의 함량이 고함량으로 함유되어 기능성식품 및 화장품의 소재로 사용될 수 있다.
또한 본 발명에 따른 기능성식품 또는 화장품은 다이드제인, 제니스테인, 리보플라빈, 루틴, 퀘르세틴의 함량이 높으며, 더불어 우수한 항산화 활성, 알파-글루코시다아제 저해활성 및 췌장-리파아제 저해활성을 가져서, 지방생성 억제효과, 체중 조절, 콜레스테롤 저하, 고지혈증 개선, 동맥경화 완화, 당뇨병 개선, 비만 개선, 혈액순환 개선, 면역력 개선, 여성 갱년기 증후군 개선용으로 유용하다.
도 1a는 본 발명의 발효조성물의 제조 공정도의 일례이다.
도 1b는 파바톤 콩잎과 현미의 혼합비에 따른 발효조성물을 보여주는 사진이다.
도 2는 파바톤 콩잎과 현미의 혼합비에 따른 발효조성물의 이소플라본 HPLC 크로마토그램을 나타낸다.
도 3a는 발효 기간별(0, 4, 8 및 12일) 발효조성물을 보여주슨 사진이다.
도 3b는 발효 기간별(0, 4, 8 및 12일) 발효조성물의 이소플라본 HPLC 크로마토그램를 나타낸다.
도 4는 본 발명에 따른 발효조성물(실시예 1)의 사진이다.
도 5는 본 발명에 따른 발효조성물(실시예 1)의 이소플라본 HPLC 크로마토그램를 나타낸다.
도 6a는 본 발명에 따른 발효조성물의 총 페놀릭스 함량을 나타낸 것이다.
도 6b는 본 발명에 따른 발효조성물의 총 플라보노이드 함량을 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명에 따른 발효조성물의 항산화 활성을 나타내 것이다. 도 7a는 DPPH 라디칼 소거활성, 도 7b는 ABTS 라디칼 소거활성, 도 7c는 하이드록실 라디칼 소거활성, 및 도 7d는 환원력(FRAP)을 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명에 따른 발효조성물의 알파-글루코시다아제 저해활성을 나타낸 것이다.
도 9는 본 발명에 따른 발효조성물의 췌장-리파아제 저해활성을 나타낸 것이다.
다음의 실시예들에 의해 본 발명이 더 상세히 설명된다. 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것이며, 본 발명의 범위가 이들에 의해 제한되어서는 안된다.
재료 및 방법
<재료>
파바톤 콩잎은 2018년도 남해군 일대에서 재배된 것을 농업회사법인 주식회사 제이씨엔팜으로부터 건조된 상태로 공급받아 사용하였다. 구체적으로는 대원콩 종자를 파종 후 약 60일(R3 생육단계: 까투리가 맺히기 전 최대 성장 시기) 동안 재배된 콩잎에 에테폰을 200 ㎍/ml 농도로 약액이 흐를 정도로 충분히 24시간 간격으로 2회 살포하였다. 첫 살포 후 96시간 후에 콩잎을 수확하여 물로 세척 후 식품건조기(35℃)에서 건조하였다. 현미는 진주시 소재 대형마트에서 구입하여 사용하였다.
송이버섯 균사체는 경상대학교 임산공학과 목질화학연구실에 보관되어 있던 것을 분양받아 사용하였다. 송이버섯 균사체 계대 배양은 Potato Dextrose broth/agar(PDB/PDA, BD-Difco사, Sparks, MD, USA)를 사용하였다.
<분석시료 제조>
분말 시료 1 g에 50% 주정을 50배 첨가하여 12시간 동안 추출한 뒤 감압여과기를 이용해 여과하고 감압농축기를 이용하여 완전 농축시킨 후 동결건조기(FD-1000, TOKYO RIKAKIKAI, Japan)를 이용하여 동결건조하였다. 최종 동결건조된 시료 1 g에 50% 주정을 100배 첨가하여 추출물을 제조하여 분석시료로 사용하였다.
<이소플라본 함량 분석>
이소플라본 함량 분석은 Cho 등(2011)의 방법에 준하여 HPLC 크로마토그램을 이용하여 분석하였다. 분석에 이용된 고정상 컬럼은 Lichrophore 100 RP C18(ichroCART 125-4, 5μm, 125mm×4mm, Merck KGaA, Darmstadt, Grmany)을 사용하였고, 이동상 용매는 0.2% 수중 글라시알 아세트산(glacial acetic acid in water; solution A)와 0.2% 아세토니트릴 중의 아세트산 (acetic acid in acetonitrile; solution B)로 분석하였고, 이때 이동상의 조건은 A 용매 기준으로 0분-100%, 15분-90%, 25분-80%, 30분-75%, 45분-65% 및 50분-65%로 분석하였다. 시료는 20 ㎕를 주입하였고 이동상의 속도는 30℃에서 1 ml/min로 유지하였다. 이소플라본은 diode array UV detector(Agilent1200 series, Agilent사, USA)의 흡광도 254 nm에서 정량하여 표준품의 검량곡선과 비교하여 함량을 계산하였다.
시험예 1: 발효 최적조건 분석
건조된 분쇄한 파바톤 콩잎 분말과 현미 분말을 각각 10:0, 9:1, 8:2, 7:3의 중량비로 혼합한 분말 (4개의 그룹)에 정제수를 5배(w/w) 첨가하고 수화시킨 후 121℃에서 1시간 동안 증자 처리하고 송이버섯균사체 액체 배양액을 5% 접종하여 25℃에서 12일간 발효를 진행한 후 55℃에서 3일간 건조하였고 (도 1a), 그 결과 사진을 도 1b에 나타냈다.
도 1b에 나타낸 바와 같이, 파바톤 콩잎만 발효시킬 경우(파바톤 콩잎과 현미의 혼합비가 10:0) 송이버섯 균사체가 완전히 생성되지 않을 것을 확인하였고, 송이버섯 균사체의 성장 정도는 파바톤 콩잎과 현미의 혼합비가 8:2 비율일 때 가장 양호하였다.
각 그룹의 발효 후의 이소플라본의 함량을 분석하여 그 결과의 HPLC 크로마토그램를 도 2에 나타냈다.
도 2에 나타낸 바와 같이, 파바톤 콩잎만 발효시킨 경우(파바톤 콩잎과 현미의 혼합비가 10:0)는 비배당체 이소플라본으로의 전환이 완전히 이루어지지 않아 배당체인 다이드진(daidzin; 1)과 제니스틴(genistin; 2), 말로일다이드지(malonyl-β-daidzin; 3), 말로일제니스틴(malonyl-β-genistin; 4) 및 비배당체인 다이드제인(daidzein; 5)과 제니스테인(genistein; 6) 6종이 모두 검출되었으나, 파바톤 콩잎과 현미를 9:1, 8:2 및 7:3으로 혼합하여 발효시틴 경우는 비대당체인 다이드제인과 제니스테인만이 검출되었다. 다이드제인과 제니스테인의 함량은 각각 562.29과 130.0 ㎍/g(10:0 혼합비), 1,636.6과 365.43 ㎍/g(9:1 혼합비), 1,591.96과 281.61 ㎍/g(8:2 혼합비) 및 123.02과 407.17 ㎍/g(7:3 혼합비)이었다.
도 1b와 도 2에 따른 균사체 성장 정도와 이소플라본 생성량을 고려하여 파바톤 콩잎과 현미의 혼합 중량비는 9:1 ~ 7:3이 바람직하고, 8:2가 가장 바람직함을 확인할 수 있었다.
최적 발효 기간을 분석하기 위하여, 파바톤 콩잎과 현미를 8:2의 중량비로 혼합한 그룹의 발효 진행중 0, 4, 8 및 12일에 송이버섯균사체의 성장 정도를 육안으로 확인하였고 그 결과 사진을 도 3a에 나타냈고, 또한 상기 각각의 일자에 발효물의 이소플라본 함량을 분석하여 그 결과 HPLC 크로마토그램를 도 3b에 나타냈다.
도 3a에 나타낸 바와 같이, 발효 4일째부터 송이버섯 균사체가 생성되어 8일째 대부분 균사체가 성장하였고 12일째는 균사체 성장이 완료되었음을 확인할 수 있다.
도 3b에 나타낸 바와 같이, 발효 0일째에는 주요 이소플라본은 배당체인 다이드진과 제니스틴이었고, 비배당체인 다이드제인과 제니스테인은 함량이 낮았으며, 발효 4일째부터는 비배당체인 다이드제인과 제니스테인의 피크가 높아지기 시작하였으며, 발효 8일 ~ 12일은 다이드제인과 제니스테인의 함량이 현저히 증진되었다. 발효가 진행됨에 따라 새로운 피크도 생성되었다
도 3a와 도 3b에 따른 균사체 성장 정도와 이소플라본 생성량을 고려하여 발효 기간은 8 ~ 12일이 바람직하고, 약 10일이 가장 바람직함을 확인할 수 있었다.
제조예 : 발효조성물의 제조
건조된 분쇄한 파바톤 콩잎 분말과 현미 분말을 8:2의 중량비로 혼합하여 정제수를 5배(w/w) 첨가하고 수화시킨 후 121℃에서 1시간 동안 증자 처리하고 송이버섯균사체 액체 배양액을 5% 접종하여 25℃에서 10일간 발효하여 본 발명에 따른 발효조성물을 제조하였고 (실시예 1), 그 결과 사진을 도 4에 나타냈다.
비교를 위하여, 건조후 분쇄한 파바톤 콩잎 분말과 현미 분말을 8:2의 중량비로 혼합한 조성물 (비교예 1). 건조된 분쇄한 파바톤 콩잎 분말과 현미 분말을 8:2의 중량비로 혼합하여 정제수를 5배(w/w) 첨가하고 수화시킨 후 121℃에서 1시간 동안 증자 처리한 조성물 (비교예 2)을 준비하였다.
시험예 2: 다이드제인 및 제니스테인 함량 분석
상기 제조예에서 제조된 실시예 1의 발효조성물, 비교예 1 및 비교예 2의 조성물의 다이드제인과 제니스테인의 함량을 분석하여, 그 결과의 HPLC 크로마토그램를 도 5에 나타냈고, 각각의 다이드제인과 제니스테인의 함량을 표 1에 나타냈다.
함량(㎍/g) 비교예 1 비교예 2 실시예 1
다이드제인[5] 394.64±19.73 790.51±39.53 2,472.77±123.64
제니스테인[6] 151.97±7.60 248.05±12.40 933.66±46.68
합계 546.61 1038.57 3406.43
도 5의 크로마토그램에서 확인되는 바와 같이, 비교예 1의 조성물(가공전 원료)에서는 배당체인 다이드진(daidzin; 1), 제니스틴(genistin; 2), 말로닐다이드진(malonyldaidzin; 3) 및 말로닐제니스틴(malonylgenistin; 4)의 피크가 높게 나타났고, 다이드제인(daidzein; 5) 및 제니스테인(genistein; 6)의 피크는 거의 나타나지 않았다. 비교예 2의 조성물(증자된 조성물)에서는 여전히 배당체인 다이드진(daidzin; 1)과 제니스틴(genistin; 2)의 피크가 높게 나타났으며 다이드제인(daidzein; 5) 및 제니스테인(genistein; 6)의 피크는 약간 상승했을뿐이며, 이에 비하여 실시예 1의 발효조성물에서는 다이드제인(daidzein) 및 제니스테인(genistein)의 피크(피크 5 및 6)가 현저히 높아졌음을 확인할 수 있다.
상기 표 1에 나타낸 바와 같이, 실시예 1의 발효조성물은 다이드제인이 2,472.77 ㎍/g, 제니스테인이 933.66 ㎍/g으로 나타나, 가공되지 않은 원료인 비교예 1(394.64±19.73 ㎍/g, 151.97±7.60 ㎍/g)에 비하여 각각 약 6.2배 이상 증진되었고, 비교예 2 (790.51±39.53 ㎍/g, 248.05±12.40 ㎍/g)에 비하여도 각각 약 3.1배 및 약 3.7배 이상 증진되었다.
따라서 송이버섯균사체로 발효된 본 발명에 따른 파바톤 콩잎 및 현미의 혼합물의 발효조성물은 다이드제인과 제니스테인의 함량이 현저히 강화됨을 알 수 있다.
시험예 3: 불포화지방산 함량 분석
불포화지방산 (올레산, 리놀레산, 알파-리놀레산) 분석은 Hwang 등이 보고한 지방산 분석방법에 따라 수행하였다. 제조예에서 준비된 실시예 1, 비교예 1 및 비교예 2의 조성물 각각 1 g을 시험관에 정확히 칭량하고 여기에 0.5 N 메탄올성 NaOH 3 ml를 첨가하여 100℃에서 10분간 열처리하여 지방산과 글리세롤 가수분해 과정을 수행하였다. 이후 삼불화붕소(BF3) 2 ml을 추가적으로 첨가하고 교반한 후 30분간 다시 열처리하여 지방산의 메틸에스테르화를 진행하였다. 메틸에스테르화 반응 종료 후 이소옥탄 1 ml을 첨가하고 격렬히 흔든 후 방치시켜 이소옥탄층만을 회수하여 무수황산나트륨과 함께 탈수한 뒤 0.45 ㎛-막 필터로 여과하여 GC(질소 및 수소 가스와 SP-2560 capillary column (100 m×0.25 mm i.d., 0.25-μm film thickness, Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA)로 분석하였다. 분석결과를 표 2에 나타냈다.
함량(mg/100 g) 비교예 1 비교예 2 실시예 1
Oleic acid (C18:1c) 29.1±1.46 32.0±1.60 77.7±3.89
Linoleic acid (C18:2c) 56.2±2.81 56.7±2.84 274.9±13.75
α-Linolenic acid (C18:3n3) 46.9±2.35 47.2±2.36 87.8±4.39
불포화지방산인 올레산, 리놀레산, 알파-리놀레산의 함량은 비교예 1의 조성물이 각각 29.1±1.46 mg/100g, 56.2±2.81 mg/100g, 및 46.9±2.35 mg/100g이었으며, 비교예 2의 조성물은 32.0±1.60 mg/100g, 56.7±2.84 mg/100g 및 47.2±2.36 mg/100g로, 증자 처리에 의해서는 불포화지방산의 함량이 증진되지 않는다는 것을 확인할 수 있다.
이에 비하여, 실시예 1의 발효조성물의 올레산, 리놀레산, 알파-리놀레산의 함량은 각각 77.7±3.89 mg/100g, 274.9±13.75 mg/100g 및 87.8±4.39 mg/100g으로 나타나, 비교예 1 및 비교예 2에 비하여 각각 약 2.6배, 약 4.8배 및 약 1.8배 이상 증진되었음을 확인할 수 있다.
시험예 4: 리보플라빈 함량 분석
리보플라빈 분석은 Joo 등(2018)의 비타민 분석 방법에 준하여 시료전처리 후 HPLC로 분석하였다. 분석 칼럼은 capcell-pak C18(4.6×150 mm, 5 ㎛) 및 capcell-pak C18 MG(4.6×250 mm, 5 ㎛)을 사용하였고 이동상 용매 A는 10 mM NaH2PO4 in H2O(pH 5.5)를 사용하였고, 이동상 B는 메탄올을 사용하였다. 시료는 5-10 ㎕를 주입하였으며 이동상 속도는 35-40℃에서 0.5-1.0 ml/min로 유지하였다. 검출기는 fluorescence 및 photodiode array(Agilent Co.)를 사용하였다. 검출 파장은 530 nm에서 정량하였고 그 결과를 표 3에 나타냈다.
함량(mg/100 g) 비교예 1 비교예 2 실시예 1
B2 (Riboflavin) 0.4 1.3 10.8
표 3에 나타낸 바와 같이, 리보플라빈의 함량은, 비교예 1은 0.4 mg/100 g, 비교예 2는 1.3 mg/100 g 및 실시예 1은 10.8 mg/100 g으로 나타나, 실시예 1의 리보플라빈 함량은 비교예 1 및 비교예 2에 비하여 각각 약 27배 및 약 8.3배 증진되었음을 확인할 수 있다.
시험예 5. 루틴 및 퀘르세틴 함량 분석
루틴과 퀘르세틴의 함량은 상기와 같이 준비된 각각의 시료에 대해 HPLC(high performance liquid chromatography)를 사용하여 분석하였다. 분석 컬럼은 XBridge C18(4.6×250 mm, 5 μm, Waters Corp., Milford, MA, USA) 컬럼을 사용하였고 0.5% 글라시알 아세트산 (glacial acetic acid, 이동상 용매 A)와 100% 메탄올(이동상 용매 B)을 0 ~ 100% 선형 구배(linear gradient)로 30℃에서 60분간 1분당 1 ml의 속도로 가동하면서 UV 검출기로 270 nm에서을 검출하였고 그 결과를 표 4에 나타냈다.
함량(㎍/g) 비교예 1 비교예 2 실시예 1
Rutin 169.59±8.48 301.15±15.06 351.84±17.59
Quercetin 194.78±9.74 250.32±12.52 346.59±17.33
표 4에 나타낸 바와 같이, 루틴과 퀘르세틴의 함량은, 비교예 1은 169.59±8.48 ㎍/g 및 194.78±9.74 ㎍/g, 비교예 2는 301.15±15.06 ㎍/g 및 250.32±12.52 ㎍/g, 실시예 1은 351.84±17.59 ㎍/g 및 346.59±17.33 ㎍/g으로 나타나, 실시예 1의 루틴과 퀘르세틴의 함량은 비교예 1 및 비교예 2에 비하여 각각 약 2배와 약 1.8배, 약 1.2배와 약 1.4배 증진되었음을 확인할 수 있다.
시험예 6. 생리활성성분 함량 분석
항산화 활성 등을 나타내는 생리활성성분인 총 페놀릭스, 총 플라보노이드스 함량을 분석하였다.
<총 페놀릭스 함량>
분석시료를 시험관에 0.5 ml 분주하고 여기에 25% Na2CO3 용액 0.5 ml를 첨가하여 3분간 정치시킨 후, 2N Folin-Ciocalteu 페놀 시약 0.25 ml를 첨가하여 혼합한 다음 30℃에서 1시간 동안 정치시킨 후 750 nm에서 분광광도계를 사용하여 750nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때 총 페놀릭스 함량은 갈산(Gallic acid)을 이용하여 작성한 표준곡선으로부터 함량을 구하여 갈산에 상당하는 양으로 계산하였고 그 결과를 도 6a에 나타냈다.
도 6a에 나타낸 바와 같이, 총 페놀릭스 함량은 비교예 1 및 비교예 2에서는 각각 0.37 및 0.43 mg/g이었으며, 실시예 1에서는 0.49 mg/g으로 나타나, 본 발명에 따른 발효조성물은 총 페놀릭스 함량이 증진됨을 확인할 수 있다.
<총 플라보노이드스 함량>
분석시료 0.5 ml에 디에틸렌글리콜 1.0 ml를 분주한 후 1 N NaOH 0.01 ml를 첨가한 후 하여 37℃ 항온수조에서 1시간 방치 후 420 nm에서 분광광도계로 흡광도를 측정하였다. 이때 총 플라보노이드스 함량은 루틴(rutin)의 최종 농도를 0, 0.25, 0.5, 1.0 mg/ml로 제조하여 작성한 표준곡선으로부터 함량을 구하였고 그 결과는 도 6b에 나타내었다.
도 6b에 나타낸 바와 같이, 총 플라보노이드스 함량도, 비교예 1, 비교예 2 및 실시예 1에서 각각 0.39, 0.43 및 0.49 mg/g으로 나타나, 본 발명에 따른 발효조성물은 총 플라보노이드스의 함량도 크게 증가하는 것을 확인할 수 있다.
시험예 7. 항산화 활성 분석
항산화 활성은 DPPH 라디칼 소거활성, ABTS 라디칼 소거활성, 하이드록실 라디칼 소거활성 및 FRAP 환원력을 측정하여 분석하였다.
실시예 1, 비교예 1 및 비교예 2의 분석시료를 0.25, 0.5, 1 mg/ml 농도로 제조하여 사용하였다.
<DPPH 라디칼 소거활성>
각각의 시료 0.2 ml에 DPPH 메탄올 용액(1.5×10-4 M) 0.8 ml를 첨가하여 10초간 교반후 암실에서 30분간 방치한 후 525 nm에서 흡광도를 측정하여 수행하였다. DPPH 라디칼 소거활성의 음성 대조구는 시료 대신 추출용매를 사용하여 동일한 방법으로 진행하여 흡광도의 차이를 다음과 같은 식에 의해 백분율(%)로 산출하였으며, 그 결과를 도 7a에 도시하였다.
라디칼 소거활성(%) = [1-(음성대조구 흡광도 ÷실험구 흡광도)] ×100
도 7a에 나타난 바와 같이, DPPH 라디칼 소거활성은 1 mg/ml의 농도에서 비교예 1, 비교예 2 및 실시예 2는 각각 55.74%, 60.20% 및 70.05%의 활성을 나타내 실시예 1의 발효조성물이 가장 높은 활성을 보였다.
<ABTS 라디칼 소거활성>
7 mM ABTS+와 2.45 mM K2S2O8를 1:1 비율로 섞어 암실에서 12∼16시간 반응시킨 후 메탄올과 1:88 비율로 섞어 732 nm에서 대조구의 흡광도 값이 0.7±0.02가 되도록 조절한 ABTS+ 용액을 사용하였다. 각각의 시료 0.1 ml와 ABTS+ 용액 0.9 ml를 첨가하여 혼합한 후 3분간 정치 후 즉시 732 nm에서 분광광도계를 사용하여 흡광도를 측정하였다. 음성대조구 실험은 시료 대신에 추출용매를 취하여 진행하였으며 실험구와 음성 대조구의 흡광도를 구하여 상기 식에 의해 백분율(%)로 산출하여 그 결과를 도 7b에 나타냈다.
도 7b에 나타난 바와 같이, ABTS 라디칼 소거활성은 0.5 mg/ml의 농도에서 비교예 1, 비교예 2 및 실시예 2는 각각 58.84%, 65.98% 및 73.34%의 활성을 나타내 실시예 1의 발효조성물이 가장 높은 활성을 보였다.
<하이드록실 라디칼 소거활성>
각각의 시료를 1.4 ml에 10 mM FeSO4·7H2O-EDTA 0.2 ml, 10 mM 2-데옥시리보스 0.2 ml 및 10 mM H2O2 0.2 ml를 시험관에 분주하고 37℃에서 4시간 반응시켰다. 1% TBA와 2.8% TCA 1 ml을 첨가하고 100℃에서 20분간 발색한 후 520 nm 파장에서 흡과도를 측정하였다. 음성대조구는 시료대신 PBS 완충용액을 사용하여 실험하였으며 실험구와 음성대조구의 흡광도를 구하여 상기 식에 의해 백분율(%)로 산출하여 그 결과를 도 7c에 나타냈다.
도 7c에 나타난 바와 같이, 하이드록실 라디칼 소거활성은 1 mg/ml의 농도에서 비교예 1, 비교예 2 및 실시예 2는 각각 52.10, 60.80 및 73.98%의 활성을 나타내 실시예 1의 발효조성물이 가장 높은 활성을 보였다.
<FRAP 환원력 분석>
FRAP 환원력 분석에서 반응액으로는 30 mM 아세테이트 완충액(pH 3.6), 40 mM 염산에 녹인 10 mM 2,4,6-트리피리딜-s-트리아진(TPTZ, T1253, C18H12N6, MW312.33) 및 20 mM FeCl3(F7134, MW 162.20, in DW)를 준비하였으며, 아세테이트 완충액, TPTZ 용액 및 FeCl3 용액을 10:1:1 (v/v/v)로 혼합하여 37 ℃에서 15분간 예비반응을 시켜두었다. 각각의 시료 0.05 ml에 FRAP 시약 0.95ml를 첨가하여 37 ℃에서 약 15분간 반응시키고 590 nm에서 흡광도를 측정하여 그 결과를 도 7d에 나타냈다.
도 7d에 나타난 바와 같이, FRAP 환원력은 1 mg/ml의 농도에서 농도에서 비교예 1, 비교예 2 및 실시예 2는 각각 0.507, 0.627 및 0.737의 활성을 나타내 실시예 1의 발효조성물이 가장 높은 활성을 보였다.
이들 결과로부터 본 발명에 따른 발효조성물은 항산화 활성이 현저히 증진됨을 알 수 있다.
시험예 8: 소화효소 저해활성 검정
본 발명에 따른 발효조성물에 대해 항당뇨(당뇨 개선) 효과의 지표인 알파-글루코시다아제 저해활성을 검정하였고, 항비만(비만 개선) 지표인 췌장 리파아제 저해활성을 검정하였다.
<알파-글루코시다아제 저해활성>
분석시료 30 ㎕에 알파-글루코시다아제 (0.5 U/ml) 효소용액 70 ㎕, 200 mM 인산나트륨 완충용액(pH 6.8) 50 ㎕를 혼합하여 37℃에서 10분간 예비반응하였다. 이후 인산나트륨 완충용액(pH 6.8)에 녹인 p-NPG (10 mM) 100 ㎕를 첨가하여 다시 37℃에서 10분 반응시켰으며 반응액에 Na2CO3 (100 mM) 750 ㎕를 첨가해 반응을 정지시킨 후 420 nm에서 분광광도계를 이용하여 흡광도를 측정하였다. 음성대조구는 시료 대신에 추출용매를 취하였으며 분석시료 첨가구와 무첨가구 사이의 흡광도 차이를 백분율(%)로 나타내어 그 결과를 도 8에 나타냈다.
도 8에 도시된 바와 같이, 알파-글루코시다아제 저해활성은 1.0 mg/ml 처리 시 비교예 1에서 24.12%, 비교예 2에서 47.46%로 나타났으나, 실시예 1에서는 73.25%로 현저히 증진되었다.
따라서 본 발명에 따른 발효조성물은 알파-글루코시다아제 저해활성이 현저히 증진되어 혈당저하 활성이 우수하여 당뇨 개선효과가 증진됨을 알 수 있다.
<췌장-리파아제 저해활성>
분석시료 30 ㎕에 췌장 리파아제 (0.5 U/ml) 효소용액 70 ㎕ 및 200 mM 인산나트륨 완충용액(pH 6.8) 50 ㎕를 혼합하여 37 ℃에서 10분간 예비반응시켰다. 반응 후 인산나트륨 완충용액에 녹인 p-NPB(10 mM) 100 ㎕를 첨가하여 동일하게 10분간 반응시킨 후 100 mM Na2CO3 750 ㎕를 첨가해 반응을 종결시켜 420 nm에서 흡광도를 측정하였다. 음성대조구는 시료 대신에 추출용매를 취하였으며 시료용액의 첨가구와 무첨가구 사이의 흡광도 차이를 백분율(%)로 나타내어 그 결과를 도 9에 나타냈다.
도 9에 도시된 바와 같이, 췌장 리파아제 저해활성은 1.0 mg/ml 처리 시 비교예 1에서 33.75%, 비교예 2에서 45.06%로 나타났으나, 실시예 1에서는 58.26%로 더 높은 활성을 보였다.
따라서 본 발명에 따른 발효조성물은 췌장 리파아제 저해활성이 증진되어 비만 개선효과가 강화됨을 알 수 있다.
상기 활성(기능성) 검정 결과들로부터, 본 발명에 따른 발효조성물은 다이드제인, 제니스테인, 리보플라빈, 루틴 및 퀘르세틴이 증진될 뿐만 아니라, 우수한 항산화 활성, 항당뇨 및 항비만 활성을 가져서 기능성 식품의 소재로 유용하다는 것을 알 수 있다.

Claims (8)

  1. 파바톤 콩잎과 현미를 8:2의 중량비로 혼합한 혼합물을 100℃ 이상에서 30~90분 증자한 후, 송이버섯균사체를 3~10%(v/w) 농도로 접종하여 25~30℃에서 10~12일간 발효하여 제조된, 다이드제인, 제니스테인, 리보플라빈 및 루틴이 증진된 발효조성물로,
    상기 발효조성물은 다이드제인 2472 ㎍/g 이상, 제니스테인 933 ㎍/g 이상, 리보플라빈 10 mg/100g 이상 및 루틴 351 ㎍/g 이상 함유하는 것인 발효조성물.
  2. 삭제
  3. 삭제
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  7. 제 1항에 따른 발효조성물을 포함하는 당뇨 개선 및 비만 개선용 기능성식품.
  8. 삭제
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