KR101561588B1 - 홍화 새싹의 페놀성 화합물의 함량을 증가시키는 방법 및 이 홍화 새싹을 함유하는 화장료 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 홍화식물의 종자의 새싹을 포함하는 화장료 조성물에 관한 것으로, 특히 홍화종자의 새싹 재배시 LED광원 특히 적색 광원을 이용하여 식물공장에서 홍화 새싹을 재배함으로써 안정적인 광합성을 유도하여 페놀계 화합물의 양을 증가시켰을 뿐만 아니라 생물공학적인 기술을 이용하여 배당체 형태의 페놀계 화합물에서 당을 유리 시킴으로써 아글리콘 형태의 페놀계 화합물을 얻어 활성이 좋은 주름개선 기능성을 갖는 화장품 소재 및 그 제조방법을 제공하는 것이다.

Description

홍화 새싹의 페놀성 화합물의 함량을 증가시키는 방법 및 이 홍화 새싹을 함유하는 화장료 조성물{Method of producing increasing phenolic compounds in safflower buds and a cosmetic composition containing the safflower buds obtained from the methods}

본 발명은 LED 광원을 사용한 식물공장에서 재배되어 페놀성 화합물 함량 및 콜라겐 합성능이 증가되고 개선된 홍화 새싹의 생산방법 및 이 홍화 새싹을 포함하는 주름 개선용 화장료 조성물에 관한 것이다.

화장품시장은 경기 방어적 성격이 매우 강하고, 화장품 시장의 평균성장율(CAGR)은 10%이다. 2008년 화장품 시장 성장률은 10.8%였고, 경기 침체에도 불구하고 2009년도에는 약 전년대비 6.2%의 성장률을 예상하고 있다. 이는 전년 대비 성장률 둔화를 보이고 있지만 다른 소비재와 비교하면 높은 성장률을 유지하는 것으로 볼 수 있다.

국내 화장품 시장 규모는 2007년 5조 9천억원, 2008년 6조 6천억원, 2009년도 6조 9천억원으로 예상된다. 2006년도를 기준으로 제품 유형별 화장품 점유율을 살펴보면 기초 화장품 45%로 가장 높으며 18.9%의 점유율을 보이는 기능성 화장품이 그 다음을 차지하고 있다.

기능성 화장품은 미백, 주름개선, 자외선차단 제품이 있으며, 2001년에서 2006년도까지 22.7%의 높은 연평균 성장률을 보이고 있다. 기능성 화장품 유형별 시장 점유율은 자외선 차단(7.4%), 주름 개선(5.8%), 미백(4.6%)를 차지하고 있지만 성장률에서는 미백이 가장 높은 29.1%를 보이고 있다. 또한 식약청 자료에 따르면 2006년도에 기능성 화장품으로 승인받은 품목은 총 2,219개 품목으로 2005년도에 비해 262개 품목이 증가하고 있다. 품목별로는 미백, 자외선, 주름개선, 복합유형 순으로 품목수가 많다. 현재 삶의 질의 향상과 젊음을 유지하기 위하여 화장품의 고유한 역할을 넘어서는 치료의 역할을 요구하고 있으며 화장품의 발달도 이에 부합하는 방향으로 발전하고 있다.

기능성 화장품의 원료는 화학 합성을 기반으로 하는 것과 천연물 유래 유용성분을 이용한 것으로 구별할 수 있으며, 최근 소비자에게는 자연에서 유래된 천연물 유용성분이 더 좋은 반응을 얻고 있다. 천연물 유래의 기능성 화장품 원료는 그 이미지가 매우 친환경적이고 친근한 느낌을 주며, 그 효능과 효과 역시 많은 시간 사람들이 직접 사용하여 어느 정도 검증된 상태이다. 또한 다양한 원료가 존재함으로써 그 선택의 폭이 매우 넓다.

그러나 천연물 유래의 기능성 화장품 원료의 경우, 시료의 채취시기, 채취장소, 채취방법, 시료의 형태에 따라 그 유용성분의 함량이 일정하지 않다. 천연물 유래의 기능성 화장품 원료에 대한 효능효과에 대한 과학적 접근보다는 경험적 검증이 더 많이 이루어진 측면이 많으므로 이들의 효능 및 효과 있는 유용성분에 대한 많은 연구가 요구되고 있다.

천연물 유래 기능성 화장품 소재는 대부분 성체를 이용함으로써, 재배 시간이 매우 길고, 그 채취시기가 지나면 더 이상 구할 수 없으며, 한 번에 많은 양을 채취하고 보관하여야 하기 때문에 넓은 보관 장소가 필요하고, 보관조건이 까다로워 보관의 용이성을 위하여 대부분 건조하여 사용하게 되는데 이때 유용성분의 변화가 일어날 수 있으며 뜻하지 않은 독성 성분을 생성할 수 있는 문제점이 발생한다.

대부분의 천연유래 화장품 소재의 경우 씨앗, 줄기,잎, 뿌리, 꽃 등 다양한 부위를 이용할 수 있으나 상기와 같이 보관 및 채취시기에 따른 문제점으로 인하여 식물의 유용성분 활용 측면에서도 어느 한 부분만 이용해야 하는 단점을 가지고 있다. 이와 같은 단점을 보완하기 위하여 최근 새싹을 이용한 기능성 화장품 원료 개발이 연구되고 있으나 현재까지는 단순히 씨앗에서 새싹을 발아시켜 사용하고 있는 실정이다. 또한, 새싹의 성장과정에서 유용성분의 변화에 따른 가장 적절한 이용 시기 및 유용성분의 변화에 대한 연구는 아직 미미하다.

특히 우리나라의 경우 한약의 발달로 인한 한방약재의 다양성 및 민간에서의 경험을 통한 안정성과 효능이 검증된 자연유래 소재의 개발이 활발히 이루어지고 있다. 국내의 많은 화장품 회사에서는 한방 원료를 기본으로 하는 고급 브랜드를 만들어 판매하고 있으며, 외국의 유명 화장품 브랜드와 경쟁을 하고 있다.

화학합성 원료의 경우 중국의 성장과 국내 경쟁력 저하에 따라 대부분 수입에 의존하고 있는 실정이다. 천연물 유래 기능성 화장품 소재 역시 같은 한방 약재를 사용하고 있는 중국산이 많은 비중을 차지하고 있지만 최근 중국산에 대한 국내외적 거부감 때문에 국내산 원료로 대체하기 위해 많은 노력을 하고 있다.

최근 새롭게 주목받고 있는 식물 공장은 통제된 시설 내에서 식물의 생육환경 (빛, 공기, 열, 양분)을 인공적으로 제어하여 공산품처럼 일정한 품질의 생산이 가능한 시스템적인 농업 형태일 뿐만 아니라 최신 기술인 LED, 환경제어시스템, 로봇 자동화 공정 등을 도입한 첨단 IT 기술이 융화된 농업이다.

식물공장은 1950년대 유럽에서 시작되어 현재 미국과 일본에서 활발하게 진행되고 있다. 현재 지구의 온난화 현상으로 인한 기후 변화, 공기 및 토양의 오염은 심각하게 진행되고 있으며, 이러한 오염은 광범위하게 진행되어 화학비료를 사용하지 않고 재배한 유기농 농작물조차 중금속이 검출되는 등의 결과를 초래하고 있는 실정이다.

그러므로 식물 공장을 이용한 천연물의 재배는 보다 질 좋고 안전한 천연 소재의 안정적인 공급을 가능하게 할 수 있다.

홍화(Carthamus tinctorius L.)식물은 국화과에 속하는 여러해살이풀로, 7∼8월에 적황색의 꽃이 피며, 9∼10월에 결실한다. 홍화식물의 꽃과 씨는 모두 약용으로 쓰이는데, 꽃은 천연색소로서 오래전부터 사용되어 왔으며, 선황색(safflower yellow), 카르타민(carthamin:C21H22O11) 등의 색소물질과 여러 가지 지방산의 글리세리드가 주성분으로 함유되어 있다. 특히, 카르타민은 약성이 따뜻하고 피를 다스린다하여 어혈, 통경약으로 한방에서 널리 사용해 왔다. 홍화씨에는 다가 불포화지방산인 리놀렌산이 75%나 함유되어 있어, 혈중 콜레스테롤 농도를 저하시켜 동맥경화, 고지혈증, 고혈압 등의 순환기질환의 치료에 탁월한 효과를 보이며, 골다공증, 관절염 등의 원료로 사용되기도 하였다. 지금까지 이 식물에 대한 연구로는, 홍화꽃 적색소 카르타민(carthamin)의 효과적인 분리 및 화학구조 분석, 홍화순의 이화학적 특성, 홍화씨에서 N-feruloylserotonin의 분리 및 항산화 활성 측정 등이 보고되어 있다.

홍화식물과 관련하여, 대한민국 특허출원 제10-2003-0047056호 ‘홍화씨 발아 방법과 동 새싹을 이용한 건강식품 제조방법’에서는 홍화씨를 발아시켜 이를 건강식품에 이용하는 발명에 대하여 기재하고 있고, 대한민국 등록특허 제10-0670237호 ‘홍화씨 추출물을 함유하는 화장료 조성물 및 홍화씨 내 화장료 유효성분의 추출방법’에서는 열탕 추출 등에 의해 홍화씨에서 화장료 유효 성분을 추출하여 화장료 조성물에 이용하는 발명에 대하여 기재하고 있다.

그러나, 선행 기술중 어떠한 것에서도 홍화식물의 종자 유래의 새싹(이하, 홍화 새싹이라한다) 자체를 화장료 조성물에 사용하는 것에 대하여는 기재한 바가 없고, 더욱이 홍화 새싹 재배시 LED 광원을 사용하여 폐놀계 화합물 함량을 증가시키는 것에 대하여는 더욱 기재한 바가 없다. 또한, 주름 개선 활성 증가를 위한 방안으로 발효/bio-conversion 방법을 사용한 선행 기술의 예도 찾을 수 없다.

본 발명은 상기와 같은 점들을 감안하여 연구를 진행한 결과, 성체에 비해 재배시간이 짧으며 재배 및 채취가 용이한 홍화 새싹을 LED 광원을 이용한 식물공장에서 생산하고 이 홍화 새싹을 이용하여 기능성 화장품 소재를 개발함으로써 많은 중국산 원료를 대체하는 경제적인 효과를 가져 올 수 있을 뿐만 아니라 원료 공급의 안정성을 확보함으로 산업적으로 대량생산이 가능하도록 하였다. 또한 본 발명은 LED 광을 사용한 식물공장 재배로 인해 페놀성 화합물 함량 및 콜라겐 합성능이 증진되고 개선되어 주름개선 효과를 나타내는 홍화 새싹을 함유한 주름개선용 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명에서는 LED 광원을 이용한 식물공장에서 생산한 홍화 새싹의 클로로필 함량, 색도, 비타민 C 함량 등을 측정하여 이화학적 특성 변화를 확인하고, 페놀성 화합물 함량 측정, SOD 유사활성 측정, 전자공여능(DPPH) 실험, 히드록시 라디칼 소거능 측정, 콜라겐 합성능 측정 및 항알러지 시험을 통해 홍화 새싹의 효능, 효과를 평가하고 최적의 효능을 나타내는 조건을 확립하였다.

본 발명은 LED 광원을 사용한 식물공장을 구축하여 홍화 새싹을 생산함으로써 대량생산을 가능하게 하고 재배기간을 단축시켜 뛰어난 경제적 효과를 나타낼 뿐만 아니라 LED 광원으로 인해 홍화 새싹의 효능이 개선되는 효과가 있다.

도 1은 본 발명의 식물공장의 일례를 나타낸 것이다.
도 2는 건조방법에 따른 홍화 새싹 추출물의 폴리페놀 함량을 나타낸 그래프이다.
도 3은 건조방법에 따른 홍화 새싹 추출물의 SOD 유사활성을 나타낸 그래프이다.
도 4는 건조방법에 따른 홍화 새싹 추출물의 전자공여능을 나타낸 그래프이다.
도 5는 건조방법에 따른 홍화 새싹 추출물의 히드록시 라디칼 소거능을 나타낸 그래프이다.
도 6은 건조방법에 따른 홍화 새싹 추출물의 TLC 패턴을 나타낸 것이다.
도 7은 건조방법에 따른 홍화 새싹 추출물의 HPLC 패턴을 나타낸 것이다.
도 8은 홍화 재배 조건에 따른 콜라겐 합성능을 나타낸 그래프이다.
도 9는 홍화 재배 조건에 따른 β-hexosaminidase 분비 억제능을 나타낸 그래프이다.
도 10은 본 발명의 홍화 새싹 함유 화장료 조성물의 제조공정을 간략하게 나타낸 공정도이다.

본 발명에서 ‘홍화 새싹’이라 함은 홍화식물의 종자를 3일 동안 발아 후 식물공장에 파종하고 7일째 수확한 새싹을 의미한다.

본 발명에서 ‘식물공장’이라 함은 작물 생육에 적당한 환경을 제공하여 더 많은 수량과 좋은 품질의 농산물을 얻을 수 있도록 인공적으로 재배환경을 제어하는 폐쇄작물 재배시스템을 말하는 것으로, 온실형태의 식물공장과 폐쇄된 완전제어 식물생장공장의 2종류가 있다[한국농업기계학회지 제26권 제3호 2001년 6월호 참고].

현재, 식물이 재배되는 재배면적이 동일한 구조를 갖는 다수의 트레이(tray)를 동축상에 적층하여 한정된 공간에서 수경재배 면적을 최대한 확보하여 생산성을 향상시킬 수 있도록 한 식물 공장 시스템(대한민국 등록특허 제10-0512378호)이나, LED 광원을 이용함으로써 식물에 필요한 파장의 광을 집중적으로 균형있게 조사하도록 한 식물공장(대한민국 공개특허 제10-2004-0010426호)이 알려져 있다.

본 발명에서는 홍화 새싹이 안정적으로 광합성할 수 있도록 하는 식물공장이라면 그 구조 및 제어시스템에 있어 특별히 제한되지 않는다.

본 발명에서 사용되는 광원은 LED 광원이다. 보다 구체적으로, 본 발명에서는 650nm 내지 680nm 범위의 LED 광원을 사용한다. 상기 파장 범위는 엥겔만의 실험(Engelmann's experiment)에 의해 광합성에 적합한 것으로 밝혀진 것이다. 본 발명에서 LED 광원은 당업계에서 통상적인 방법으로 식물공장에 설치된다. 본 발명에서는 식물공장에서 적색광 LED 광원을 하루에 10시간씩 조사하였다.

발효/bioconversion은 미생물내(바실러스, 아스퍼질러스, 버섯균등) 다양한 효소 활성 특히 당가수분해활성 대표적으로 글루코시다아제 등의 활성이 높은 균을 선정하여 플라보노이드 배당체에서 당이 유리화된 형태인 아글리콘으로 만들어 즉, 고분자를 저분자화 함으로써 피부 침투 활성이 높게 만드는 과정이다. 이러한 발효를 통해 미생물 및 미생물이 분비하는 효소에 의해 물질이 자연 분해됨으로서 평균 80nm 이하로 작아져 피부 흡수가 용이해지며, 발효에 따른 기존 성분의 강화와 더불어 새로운 유기물이 생성되어 영양 성분이 증가되는 장점을 갖게 된다. 또한, 미생물에 의해 인체에 유해한 중금속, 잔류농약 등과 같은 독성물질이 완전히 분해되어 인체에 무해하며, 발효 산물은 열과 이산화탄소에 강하고 잘 변질되지 않아 유효성분의 보존성이 증가된다.

배당체를 가수분해하는 효소를 글리코시다아제라고 총칭하지만, 특히 당 부분이 글루코스일 때 글루코시다아제라고 부른다. 글루코시드결합이 α인가 β인가에 따라서 α-D-글루코시다아제와 β-D-글루코시다아제로 나눈다. 전자는 동식물 및 미생물계에 널리 분포한다. 좁은 의미로서 말타아제가 이에 속하는데, 이는 α-1, 4-글루코시다아제로서 말토스, 아밀로오스 등에 작용한다. 그러나 설탕이나 메틸-α-글루코시드에는 작용하지 않는다. 사람의 장점막(腸粘膜)에서는 5종류의 α-글루코시다아제가 분리되었는데, 이 장점막의 효소는 장관에서 이당류의 소화흡수에 관여한다. 한편, 후자인 β-글루코시다아제는 미생물, 고등동식물, 동물의 간, 신장, 소장점막, 달팽이의 소화액 등에 널리 분포한다.

본 발명의 발효/bioconversion는 본 분야에서 통상적으로 사용되는 글루코시다아제 및 글루코시다아제를 발현하는 미생물 또는 산업용으로 판매되는 효소를 사용하여 실시할 수 있다.

본 발명의 홍화새싹은 화장료 조성물 전체 중량을 기준으로 0.01 내지 5 중량%, 바람직하게는 1~3 중량%의 함량으로 포함될 수 있다.

본 발명의 홍화새싹을 포함하는 화장료 조성물은 통상적으로 화장료 조성물에 이용되는 성분, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함할 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 유연 화장수, 수렴 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 포움, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.

본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오즈 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 스프레이인 경우에는 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 다이메틸 에테르와 같은 추진제를 추가로 함유할 수 있다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용된다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상 희석제, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정질 셀룰로오즈 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 계면활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 홍화 새싹 함유 조성물은 식용가능한 천연 물질로 제조되었으므로, 음료, 정제, 환약 등의 식품 조성물로도 사용할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예를 들어 보다 구체적으로 설명한다. 그러나, 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이므로, 본 발명을 이에 한정하는 것으로 해석해서는 안 된다.

본 발명에 사용된 홍화는 시중에 유통되는 중국산과 의성에서 수확한 홍화를 3일 동안 발아시킨 후 식물공장에 파종하고 7일째에 수확하여 실험에 사용하였다. 홍화 새싹은 2가지 방법으로 건조하여 이화학적 특성을 분석비교 하였는데, 60℃ 건조기에서 24시간 동안 말리는 방법으로 건조하였고, 진공 동결건조는 시료(RM)는 -20℃에서 냉동 후 진공 동결건조기(FD5508, Ilshin Lab Co., Ltd., Korea)를 이용하여 -70℃에서 12시간 건조하였다. 전 처리된 홍화새싹은 분쇄하여 분석시료로 사용하였다. 분석용매등은 99.8% 이상의 순도를 갖는 HPLC Grade 용매(J.T.baker)를 사용하였고, 그외 사용시약은 1급 이상의 시약을 사용하였다.

실시예 1. 홍화 새싹의 일반성분 분석

시료의 일반성분은 AOAC의 방법에 준하여 측정하였다. 즉, 수분은 상압가열건조법, 조단백질은 micro-Kjeldahl법, 조지방은 Soxhlet법, 회분은 직접회화법으로 측정하였다.

이하, 본 명세서에서 WRM(white lighting raw materials)은 백색광을 조사한 시료를, BRM(blue lighting raw materials)은 청색광을 조사한 시료를, RRM(red lighting raw materials)은 적색광을 조사한 시료를, CRM(control raw materials)은 대조군 시료를 의미한다. 또한, WHD(white lighting hot air drying)은 백색광 조사후 고온 공기에서 건조시킨 홍화새싹을, BHD(blue lighting hot air drying)은 청색광 조사후 고온 공기에서 건조시킨 홍화새싹을, RHD(red lighting hot air drying)은 적색광 조사후 고온 공기에서 건조시킨 홍화새싹을, CHD(control hot air drying)은 대조군으로서 고온 공기 건조시킨 홍화새싹을 의미한다. 또한, WFD(white lighting freeze drying)은 백색광 조사후 동결건조시킨 홍화새싹을, BFD(blue lighting freeze drying)은 청색광 조사후 동결건조시킨 홍화새싹을, RFD(red lighting freeze drying)은 적색광 조사후 동결건조시킨 홍화새싹을, CFD(control freeze drying)은 대조군 동결건조시킨 홍화새싹을 의미한다.

홍화새싹의 일반성분(수분, 조 회분, 조 지방, 조 단백)을 분석한 결과는 표3과 같다. 수분함량은 적색광을 쬐인 홍화새싹에서의 수분함량이 건조조건에 따라서도 다소 높게 측정되었으며, 조회분 함량은 raw materials의 홍화 새싹에서 회분 함량이 낮게 측정된 반면, 청색광을 쬐인 홍화에서 회분함량이 다소 높게 나타났다. 조지방 함량은 진공 동결 건조한 적색광을 쬐인 홍화 새싹에서의 지방함량이 다소 높게 나타났다. 조단백질 함량은 흡광에 따른 홍화 새싹의 60℃건조조건에서는 유의적인 차이를 나타내지 않았으나, 진공동결 건조한 홍화 새싹에서는 적색광을 쬐인 홍화 새싹에서 조단백질 함량이 높게 측정되었다.

실시예 2. 홍화 새싹의 클로로필 함량 분석

홍화 새싹 3g에 85% 아세톤 100㎖를 가하여 분쇄 후 3,000rpm에서 5분간 원심 분리하여 얻은 잔사에 다시 85% 아세테이트를 넣어 추출하는 과정을 3회 반복 실시 후 상등액만 모아 500㎖로 정용하였다. 이 중 25㎖를 취하여 에테르 50㎖와 증류수 25㎖를 가하여 1분간 진탕한 후 에테르층을 취하는 조작을 3회 실시하고 황산나트륨을 소량 가하여 수분을 제거한 다음 에테르로 100㎖ 정용하여 660nm, 642nm에서 흡광도를 측정하여 총 클로로필, 클로로필 a, 클로로필 b 함량을 측정하였다.

클로로필 a는 청록색, 클로로필 b는 황록색을 나타내며 그 비율은 3:1로 존재한다. 클로로필의 핵 중심은 Mg, 혈색소의 핵 중심은 Fe이란 점 외에 이 둘은 같은 포스피린(phorphyrin) 구조이며, 이는 동물이 엽록소를 섭취하여 소화될 때 소장 융모에 존재하는 Fe과 Mg이 치환되어 혈색소를 생성하는 조혈작용에 관여하는 것으로 보고되고 있다. 건조한 홍화새싹의 클로로필 함량을 분석한 결과는 표 2와 같다.

본 실험결과 대조군인 control과 비교해 볼 때, 청록색을 나타내는 클로로필 a 의 함량이 클로로필 b에 비해 높은 경향을 보였으며, 흡광을 쬐인 청색광이나 적색광의 홍화 새싹에서 클로로필 함량이 높게 나타났다.

실시예 3. 홍화 새싹의 색도 분석

홍화새싹의 색도는 색차계(Model CR-200, Minolita Co., Japan)를 사용하여 측정하였으며, Hunter scale에 의해 L(Lightness), a(redness), b(yellowness) 값으로 표시하였고, 각각 3회 측정하여 평균값으로 나타내었다. 표준색판으로 백판(Y=94.2, x=-0.3131, y=0.3201)을 사용하였다.

색도는 외관상 품질을 판정하는데 중요한 요인 중의 하나이며, 홍화새싹의 색도를 측정한 결과 표 3a 내지 표 3c와 같다.

밝기정도를 나타내는 L값은 적색광을 쬐인 홍화에서 높게 측정되었다. 이는 온도의 영향을 크게 받지 않는 진공 동결건조 한 홍화새싹에서 다른 건조방법으로 건조된 홍화새싹보다 갈변현상이 적게 일어났기 때문으로 사료된다.

적색 도를 나타내는 a값은 조물질 홍화에서 가장 높게 측정되었고, 60℃에서 건조한 홍화에서 가장 낮게 나타났다. 황색 도를 나타내는 b값은 진공동결 건조한 홍화에서 높게 측정되었으며, 흡광에 따른 유의적인 차이는 나타나지 않았다.

실시예 4. 홍화 새싹의 비타민 C 함량

각 추출물을 0.2 ㎛ membrane filter로 여과하여 HPLC로 분석하였으며, 분석조건은 표 4와 같다. 표준곡선은 L(+)-아스코르브산을 표준시약으로 사용하여 표준곡선을 작성하여 계산하였다.

홍화새싹의 비타민씨 분석을 위한 HPLC 분석 조건

Items	Conditions
Instrument	Young-Rin Associates
Column	ODS-5 Develosil
Mobile phase	Acetonitrile:0.5% Phospholic acid in Water=60:40(v:v)
Detecter	UV 245 nm
Flow rate	0.8 ㎖/min

비타민 C함량을 측정한 결과는 표 5과 같다. CRM(Control raw materials)과 비교하여 청색광을 쬐인 홍화에서 비타민 함량이 높게 측정되었으며, 건조 방법을 달리한 홍화에서는 비타민C가 검출되지 않았다.

건조방법을 달리한 홍화 잎 추출물의 비타민 C 함량

	Vitamin C (mg%)
WRM	2,515.15±0.01
BRM	2,869.68±0.00
RRM	1,738.86±0.00
CRM	1,613.74±0.00
WHD	1,178.81±0.01

WRM : white lighting raw materials

BRM : blue lighting raw materials

RRM : red lighting raw materials

CRM : control raw materials

실시예 5. 홍화 새싹 추출물의 제조

건조한 홍화새싹을 sonificator(JAC 4020, Jinwoo, Korea) 기기를 사용하여 추출하였다. 건조한 홍화새싹 2-3g을 25% EtOH 40-60 ㎖를 가하고, sonificator 의 온도를 40℃로 고정 후 추출하였다. 모든 과정은 1시간씩 3회 반복에 걸쳐 수행하였다. 추출된 시료를 Waterf를 사용하여 mg/㎖로 조제 후 0.45 ㎛ membrane filter로 재여과한 다음 각종 분석에 사용하였다.

실시예 6. 페놀성 화합물 정량

홍화 새싹 추출물 0.1 ㎖에 2% Na₂CO₃를 2.0 ㎖ 가하고 혼합하여 실온에서 30분 정치한 후 750 nm에서 흡광도를 측정하였다. 0-1.0 mg/㎖의 농도의 카테킨을 이용하여 시료의 페놀성 화합물 정량을 위한 검량선을 작성하였으며, 모든 과정은 3회 반복하였다.

건조방법을 달리한 홍화 새싹을 25% 에탄올로 추출 후 1 mg/mL의 농도로 제조하여 총 페놀함량을 측정한 값은 도 2와 같다. 총 페놀함량은 적색광을 쬐인 진공 동결 건조한 홍화 새싹에서 총 페놀함량이 유의적으로 높게 측정되었다. 일반적으로 엽채류는 가열처리 중에 원형질막의 파괴로 단백질 변성, 비타민과 같은 특수 분자의 산화, 고형물질의 손실, 유기산의 휘발 및 색의 변화 등이 발생하고 특히 수용성 영양소들이 열에 많은 영향을 받아 함량이 감소한다는 보고와 다른 경향을 나타내었다.

실시예 7. TLC 분리

TLC 전개용매 및 기타시약은 특급 및 분석용 시약을 사용하였고, TLC plate는 Merck사의 precoated kieselgel 60 F₂₅₄ (layer thickness 0.25mm, 20×20 cm, Merck Art. No. 5715)를 사용하였다. 첫 번째 전개용매 조건은 BuOH : EtOH : H₂O = 10 : 2.5 : 10 (v:v:v) 조건에서 전개하여 확인하였고, 두 번째 전개용매 조건은 BuOH : EtOH : H₂O : Formic acid = 5 : 12.5 : 5 : 0.5 (v/v/v/v)에서 전개하였다. 물질은 UV 254 nm, 334 nm에서 확인하였고, 5%황산 용액을 도포 후 발색하여 확인하였다.

건조방법을 달리한 홍화새싹 추출물의 TLC 패턴은 도 6과 같다. TLC 결과 모든 추출물에서 공통적으로 Rf치가 같은 동일선상의 물질을 확인할 수 있었다. 확인된 물질이 항산화 활성이 있는 페놀성 화합물로 추정되며, 그 외에도 많은 기능성 물질들이 존재하는 것으로 사료된다.

실시예 8. HPLC 분석

HPLC(High Performance Liquid Chromatography)는 다음의 조건으로 정성 분석하였다. 즉, mobile phase는 물 : 메탄올 : 아세트산 (12：15 : 1, v/v/v）에서 (μ-Bondapak C₁₈ 3.9×300 mm) 컬럼을 사용하였으며, 275 nm에서 20분간 측정하였다.

HPLC 분석조건

Items	Conditions
Instrument	Young-Rin Associates
Column	μBondapak C18 (3.9×300 mm)
Mobile phase	Water : MeOH : Acetic acid (12 : 15 : 1, v/v/v)
Detecter	UV 275 nm
Flow rate	0.8 ㎖/min

HPLC 분석 결과는 도 7과 같았다. 건조방법을 달리한 홍화 추출물의 HPLC 패턴을 분석한 결과 retation time이 같은 피크가 모든 추출물에 존재하는 것을 확인할 수 있었다. 본 실험결과 표준품인 Syringic acid, Ferulic acid, p-Coumaric acid, Quercetin과 같은 물질과 retation time 같은 것으로 보아 페놀성 화합물로 추정된다.

실시예 9. SOD 유사활성

SOD 유사활성 측정은 각 추출물 시료 0.2 ㎖에 tris-HCl buffer(pH8.5) 3 ㎖와 0.2 mM 피로갈롤(pyrogallol)을 가하여 25℃에서 10분간 방치한 후 1N-HCl로 반응을 정지 시킨 후 420 nm에서 UV-visible spectrophotometer를 이용하여 측정하였다.

SOD-liked Activity (%) = 100-(A/B x 100)

A : 시료 첨가군의 흡광도

B : 시료 무 첨가군의 흡광도

건조방법을 달리한 홍화 새싹의 SOD 유사활성능은 도 3과 같다. 호기성 생물체는 호흡대사 중 산소를 이용하는 과정에서 슈퍼옥사이드 라디칼(superoxide radical)이 생성되며, 이는 생물체의 유기물과 결합하여 산화되고 산화물은 생명체에서 산화적 손상(oxidative damage)으로 작용하여 생 체내 여러 가지 질병을 야기하므로 체내는 SOD (superoxide dismutase)에 의한 효소적 기작 및 비효소적 기작에 의한 복합적 항산화 체제를 갖고 있다. 식물체 잎의 엽록소에서 일어나는 광합성 대사 시 카테킨 등의 폴리페놀 성분이 생성되고, 이 물질들은 항산화 능과 밀접한 상관관계가 있다고 보고되고 있고, 페놀성 화합물이 SOD 유사활성을 갖는다고 보고된 바 있다. 홍화 새싹은 이와 상반된 연구 결과를 보였으며, 이는 추출방법과 추출용매에 의한 차이라 사료된다. 본 실험 결과, 60℃로 건조한 홍화 새싹보다는 진공 동결 건조한 홍화 새싹에서 SOD 유사활성이 높게 측정되었다.

실시예 10. 전자 공여능 측정( Electron donating ability : EDA )

각 시료의 항산화 활성은 DPPH 자유 라디칼 소거법에 의한 전자공여능(EDA)으로 측정하였다. 각 추출방법에 의하여 추출된 시료는 0.5 mL DPPH(1,1-diphenyl-2-picryl hydazyl) 시약 3 mL를 가하고, 실온에서 30분간 방치 후 UV-visible spectrophotometer(Phanrmaca biotech Ultraspec 3000 Engalnad)를 이용하여 517 nm에서 측정하였다.

EDA(Electron donating ability) (%) = 100 - (A/B) x 100

A: 시료 첨가군의 흡광도

B: 시료 무첨가군의 흡광도

건조방법에 따른 홍화 새싹의 전자 공여능을 측정한 결과는 도 4와 같다. 한국 약용 및 식물자원의 항산화성 식물탐색에 대한 결과에 의하면 포도씨와 음양곽을 제외한 식물자원이 20%미만의 활성을 보고한 바와 유사한 결과를 보여주고 있다. 이 결과 적색광을 쬐인 진공 동결건조한 홍화 새싹에서 유의적으로 높은 전자 공여능을 보였다.

실시예 11. 히드록시 라디칼 ( Hydroxyl radical ) 저해활성 측정

FeSO₄/EDTA 용액, 2-deoxyribose, 각 추출물, 인산염 완충용액 및 H₂O₂를 혼합하고 2시간 동안 반응시킨 후 TCA(trichloro acetic acid)용액과 TBA(thiobarbituric acid)용액을 넣고 15분 가열한 후 급속히 냉각시켜 532 nm에서 흡광도를 측정하여 항산화 활성을 비교하였다.

Hydroxyl radical scavenging activity (%) = (A-B)/A x 100

A : 시료 첨가군의 흡광도

B : 시료 무 첨가군의 흡광도

건조방법에 따른 홍화 새싹의 히드록시 라디칼 소거 능을 측정한 결과는 도 5와 같다. 이 실험결과 또한 흡광에 의한 영향은 없는 것으로 사료되며, 건조방법에 따라서도 큰 차이를 나타내지 않았다.

실시예 12. 세포기반 효능 평가를 위한 식물공장 변화 조건 확립

식물공장에서 홍화재배시 사용하는 물/물흡수제/빛조건등을 변화시켰을때, 콜라겐 합성능/항염/미백/항산화/항알러지 효능효과의 변화를 연구하였다. 사용시료는 1차~4차로 나눠 재배하였으며 변화 조건은 다음과 같다(표 7).

홍화 재배 조건

	빛 조건	물 조건
1차	1. Control(국내산) 2. China(중국산) - 원형 삼파장 전구 3. China White - 삼파장 전구 + LED(주광색) 4. China Yellow - 삼파장 전구 + 백열등	1. 황토볼 배지 2. 일반적인 물 사용
2차	1. White - 삼파장 전구 2. Red - 삼파장 전구 + LED(적색) 3. Blue - 삼파장 전구 + LED(청색) 4. Red + Blue - 삼파장 전구 + LED(적색 + 청색)	1. 물흡수볼 배지(하이드로젤) 2. 이온수 사용 3. 모두 국산 홍화씨 사용
3차	1. White - 삼파장 전구 2. Red - 삼파장 전구 + LED(적색) 3. Blue - 삼파장 전구 + LED(청색)	1. 물흡수볼 배지(하이드로젤) 2. 일반적인 물 사용 3. 모두 국산 홍화씨 사용
4차	1. White - 삼파장 전구	1. 국산 홍화씨 사용 2. 물위에 바구니를 띄움 (뿌리가 잘리지 않고 길게 자람) 3. 일반적인 물 사용

효능효과 평가 시험 방법

시험항목	시험방법
콜라겐합성능	proCollagen type1 peptide
항알러지	β-hexosaminidase release

실시예 13. 콜라겐 합성능 시험

피부 섬유아세포(HDFn)를 48 웰 플레이트에 5X10⁴cells/well의 농도로 배양 배지 0.3 ml로 접종하여 37℃, 5% CO₂에서 배양하였다. 24시간 지난 이후 추출물을 농도별로 포함한 새로운 배지로 24시간 동안 배양하였다. 24시간 배양 이후 배양액을 모아서 enzymes-linked immunoassay kit (Takara사)를 이용하여 콜라겐 전구체의 C-말단의 양을 측정하였다. 또한, 콜라겐 용액 (640 ng/ml)을 이용하여 콜라겐 농도 0 ng-640 ng 사이의 standard curve를 얻어 배지에 있는 콜라겐 양을 계산하였다.

피부주름의 발생원인 중 하나로 피부교원질(콜라겐)의 결핍을 들고 있다. 콜라겐은 피부 진피를 구성하는 주요 단백질로서 피부구조와 탄력을 유지하는 역할을 하고 있다. 콜라겐은 나이가 들면서 생성의 감소를 보이며 분해도 증가되어 피부 진피층의 함몰을 유도하여 피부의 주름을 생성하는 것으로 알려져 있다. 진피층에 존재하는 섬유아세포는 피부 구성 주요 단백질인 콜라겐의 합성을 담당하고 있다. 따라서 섬유아세포를 이용하여 콜라겐의 생성 증가 정도를 측정함으로써 추출물의 콜라겐 합성능 향상 및 주름개선 효력을 평가할 수 있는데, 도 8과 같이 청색 빛을 함께 준 시료에서 콜라겐 합성능이 약 20% 정도 증가하였다. 적색광을 쬐인 시료에서도 전반적으로 증가된 콜라겐 합성능을 나타냄을 확인할 수 있다.

실시예 14. 비만세포의 탈과립 억제 시험( 항알러지 시험)

아토피성 피부염에서 혈중 호산구수와 혈청 IgE양의 증가가 나타나며, 이는 아토피성 피부염의 대표적인 지표로써 아토피성 피부염의 초기반응은 항원의 자극에 의해 항체 IgE가 생산된 후 항체가 비만세포 표면의 high affinity receptor에 결합하였을 때 항원이 재침입하면 수용체와 결합하고 있는 항체와 결합하여 비만세포 내로 신호를 빠르게 전달하여 알레르기를 일으키는 화학적 매개물질 (사이토카인, 히스타민, 류코트리엔(leukotrienes))을 분비한다. 히스타민 등의 매개물질에 의해서 혈관 투과성을 증가시키고, 혈관을 확장시키고, 평활근을 수축시키며, 분비선의 기능을 항진시키는 특징적인 반응을 일으키게 되며, 동반되는 염증반응에는 비만세포, 호산구, T세포에서 분비되는 인터루킨 등 여러 가지 사이토카인에 의해 호산구가 염증 부위로 이동하는 것이 중요하다. 히스타민과 함께 중요한 매개체로 작용하는 것으로 ß-hexosaminidase가 있으며, 세포로부터 ß-hexosaminidase의 방출 또한 면역세포 탈과립의 지표로 사용된다.

RBL-2H3 세포를 10% FBS를 함유한 DMEM(Dulbecco’s modified Eagle’s medium)에 현탁시킨 후 24 웰 플레이트에 각 웰 당 2 x 10⁵cell이 들어가도록 처리한 다음 각 웰 당 100ng/ml의 마우스 모노클로날 IgE로 감작시킨 후 5% CO2 인큐베이터에서 24 시간동안 배양하였다. 세포를 웰 당 Tyrode buffer 500ul를 사용하여 헹구어내고, 농도별로 혼합 추출물을 처리한 후 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 15분간 배양하고, 한 시간 동안 DNP-BSA 100ng/ml을 처리하였다. 상층액에 기질(1mM p-nitrophenyl-N-acetyl-ß-D-glucosaminide) 50ul 처리 후 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 한 시간 동안 배양한 후 ELISA reader를 사용하여 405nm에서 흡광도를 측정하였다.

그 결과는 도 9에 나타냈으며, 도시된 바와 같이 항알러지 효능도 실험 최고 농도인 100㎍/ml의 농도에서 40~50%의 저해 활성을 나타내었다.

실시예 15. β- 글루코시다아제를 이용한 발효/생물전환( bioconversion )

실시예 5에서와 같이 제조한 홍화 새싹 추출물 2500 ml을 녹인 후, 아세테이트 버퍼(acetate buffer, pH 4.0) 500 ml와, 0.1mg/100ml 농도의 β-글루코시다아제(β-glucosidase, 60U/g, Fluka) 25ml을 넣어 55℃에서 100rpm으로 4시간 동안 반응시켰다. 다음으로, 90℃로 5분간 가온하여 효소반응을 완료한 후, 반응물을 진공 농축하였다. 진공 농축된 농축물은 진공 감압건조기를 사용하여 60℃에서 30시간 건조하였다.

홍화새싹에 적색광을 조사한 경우, 백색광 또는 청색광을 사용한 경우에 비해 페놀계 화합물의 함량, 전자공여능 및 항알러지 시험에서 우수한 효과를 갖는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 콜라겐 합성능에서도 청색광과 유사하게 증가된 활성을 갖는 것으로 나타났다. 이러한 결과를 종합하였을 때, 적색광 LED 광원을 조사한 홍화 새싹에서 페놀계 화합물의 함량 및 콜라겐 합성능이 증가하여 주름개선 효과를 나타냄을 알 수 있다.

Claims (7)

1. LED를 광원으로 이용하여 식물공장에서 홍화식물(Carthamus tinctorius L.)의 종자 새싹을 재배하여 페놀계화합물의 함량을 증대시키는 단계; 상기 단계에서 얻은 홍화 새싹을 수확하여 건조시키는 단계; 상기 단계에서 얻은 건조된 홍화의 새싹을 에탄올 추출하는 단계; 및 상기단계에서 얻은 홍화의 새싹추출물을 배당체로 가수분해하는 글루코시다아제를 사용하여 가수분해시키는 단계를 포함하는 홍화식물의 종자 새싹 추출물의 가수분해물의 제조방법.
2. 제 1항에 있어서, 상기 LED 광원은 적색광 650nm-680nm LED 광원임을 특징으로 하는 홍화식물의 종자 새싹 추출물의 가수분해물의 제조방법.
3. 제1항 또는 제2항의 방법에 따라 제조된 홍화식물의 종자 새싹 추출물의 가수분해물.
4. 제 3항의 새싹 추출물의 가수분해물을 유효성분으로 함유하고 콜라겐 합성능을 갖는 것이 특징인 피부주름 개선용 화장료 조성물.
5. 삭제
6. 삭제
7. 제 4항의 화장료 조성물이 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 클렌징, 오일, 분말파운데이션, 유탁액파운데이션, 왁스파운데이션 및 스프레이 중에서 선택되는 어느 하나의 제형을 갖는 것이 특징인 피부주름 개선 기능성 화장료 조성물.

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