KR101326271B1 - 항비만 효과를 가지는 진피 발효 추출물의 제조방법과 그 진피 발효 추출물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 진피의 항비만 발효 추출물 제조방법과 그 항비만 발효 추출물에 관한 것으로 더욱 상세하게는, 진피에 풍부하게 존재하는 천연 glycoside 바이오플라보노이드를 미생물을 이용하여 생물전환시켜 인체에 흡수가 쉬운 형태인 aglycone 플라보노이드로 전환함으로써 항비만 효과를 극대화하는 방법 및 그 추출물과 체지방감소, 혈중지질개선 또는 비만 예방의 용도에 관한 것이다.
본 발명에 따른 항비만 효과를 가지는 진피 발효 추출물의 제조방법은,
(1) 진피를 분말화하는 단계;
(2) 상기 진피 분말을 Aureobasidium pullulans를 이용하여 발효시켜 진피의 플라보노이드 성분이 비배당체(aglycon)로 생물적 전환이 이루어지도록 하는 단계;
(3) 상기 (2)단계에서 얻은 발효물에서 발효된 진피 분말만 분리해내는 단계; 및
(4) 상기 단계의 발효된 진피 분말을 주정으로 추출하는 단계;로 이루어지는 것을 특징으로 한다.

Description

항비만 효과를 가지는 진피 발효 추출물의 제조방법과 그 진피 발효 추출물 {The manufacturing method of fermented citrus peel extract with anti-obesity nature and the product}

본 발명은 진피의 항비만 발효 추출물 제조방법과 그 항비만 발효 추출물에 관한 것으로 더욱 상세하게는, 진피에 풍부하게 존재하는 천연 glycoside 바이오플라보노이드를 미생물을 이용하여 생물전환시켜 인체에 흡수가 쉬운 형태인 aglycone 플라보노이드로 전환함으로써 항비만 효과를 극대화하는 방법 및 그 추출물과 체지방감소, 혈중지질개선 또는 비만 예방의 용도에 관한 것이다.

이를 위해 발명자는 생물전환 활성 미생물을 분리, 동정하였으며, 분리균을 이용하여 생물전환을 위한 최적 발효 조건 규명 및 고농도의 바이오플라보노이드를 함유한 건강 기능성 소재를 개발하고, 발효 전후의 효능 비교를 위해 in vitro에서 지방전구세포와 췌장세포를 이용하여 비만 및 비만과 밀접한 연관이 있는 당뇨에 대한 효능을 확인하였으며, 최종적으로 생물전환을 통해 향상된 항비만 효능을 in vivo에서 확인함으로서 비만 예방에 도움을 줄 수 있는 건강기능성 소재를 개발하였다.

비만은 에너지의 섭취와 소비의 불균형에 의해서 야기되는 현상으로 체내에 지방이 과잉 축적되어 있는 상태를 의미한다. 다양한 원인에 의해 야기되기 때문에 명확한 원인은 아직 밝혀지지 않았지만 일반적으로 지나친 열량 섭취, 내분비 장애, 운동부족, 유전적 요인 등에 기인하는 것으로 인식되고 있다. 그리고 생활 습관과 밀접한 관계가 있기 때문에 일반적으로 생활습관병이라고도 한다(Grundy 1998; Heo et al. 2009). 전 세계적으로 비만 인구는 지속적으로 증가되고 있는 추세이며 우리나라도 소득수준의 향상과 식생활 습관이 서구화되면서 비만 인구가 급증하고 있다. 국민건강통계 자료에 따르면 만 19세 이상의 비만 유병률은 1998년 26.0%에서 지속적으로 증가되어 2008년에는 31.0%로, 이는 미국(만 20세 이상, 체질량지수 30 kg/m² 이상)의 비만유병률 32.2%와 비슷한 수준으로 나타났다(보건복지가족부 2009, 48; Flegal et al. 2010). 비만이 심각한 사회적 문제로 대두되면서 국내에서도 성인병의 주요원인으로 자리 잡고 있는 비만을 예방하기 위해 다양한 대책과 활발한 연구가 진행되고 있다.

비만 치유를 위한 방법으로는 식사 등 생활 습관의 개선과 약물투여, 수술 등이 있으며, 최근에는 건강기능식품 시장이 커지면서 식이조절과 병행한 기능성 식품으로 개선하려는 시도가 많이 이루어지고 있다(Reddy and Chow 1998; Kim 2004). 우리나라에서도 건강기능성 식품에 관한 법률이 제정되어 다양한 건강기능성 소재 및 식품이 식품의약품안전청의 허가를 받아 유통되고 있고, 그 중 체중 조절과 연관된 개별인정형 원료 성분으로는 conjugated linoleic acid (CLA), hydroxy-citric acid (HCA), CJ-hibiscus 복합추출물 등이 허가를 받아 시판되고 있다. 천연물을 이용한 항비만 소재에 관한 연구를 살펴보면 식욕 억제에 관여하는 물질로 hydroxy-citric acid, palm oil, olibra, 식이섬유 등이 있으며, 지방의 소화 및 흡수를 저해하는 물질로는 chitin, 플라보노이드 등, 그리고 열 발생을 유도하여 지방의 축적을 억제하는 물질로는 고추의 capsaicin, CLA, 우유 칼슘과 관련된 단백질 등이 보고되고 있다(Zacour et al. 1992; Kamphuis et al. 2003; Ahn, Park, Do 2007; Hong et al. 2009). 뿐만 아니라 한의학에서도 지실, 녹차, 천궁, 진피, 솔잎 등이 체중조절에 효과가 있는 것으로 보고되고 있다(Kang et al. 2003; Jeon et al. 2005). 비만의 개선을 위해 가장 좋은 방법은 스스로 식이 조절을 통해 섭취 열량을 조절하여 자신의 생활 패턴과 활동량에 적합한 열량을 섭취하도록 하는 것이며, 이와 병행하여 다양한 천연물 유래의 항비만 성분을 꾸준히 섭취하면 개선 효과를 배가 시킬 수 있을 것이다. 현재 건강기능소재 시장에서 가장 큰 비중을 차지하는 것이 체지방 감소와 체중 감량 소재이며 현재는 CLA, HCA 등이 시장을 주도하고 있으나, 많은 연구자들에 의해 국내 농산물과 한약재 유래의 항비만 소재 개발에 대한 연구가 활발히 진행되어 순수 국내 소재로 개발된 우수한 항비만 건강기능성 식품의 개발이 많이 이루어질 것으로 기대된다.

본 발명의 소재인 진피는 성숙한 감귤 과실의 껍질로 예로부터 한약재로 사용되어 왔으며, 대한약전에는 '귤나무 (Citrus unshju Markovich) 또는 기타 동속 근연식물 (운향과, Rutaceae)의 성숙한 과피'로 규정되어 있고, 주요 플라보노이드 성분인 hesperidin의 함유량이 4% 이상으로 기재되어 있다(Korea Food & Drug Administration 2005, 1455-1456). 진피에는 천연 바이오플라보노이드와 베타카로틴 등 유용한 생리활성 물질이 풍부하게 함유되어 있어 감귤산업이 발달된 제주도를 중심으로 감귤 과피의 활용에 대한 연구가 활발하게 진행되고 있다. 진피에는 polyphenol류, vitamin류, essential oil 등과 함께 hesperidin, naringin, narirutin 등의 citrus 속 과일 특유의 플라보노이드류와 tangeretin, nobiletin 등 감귤류 고유의 플라보노이드를 함유하고 있다(Son et al. 1992; Laura 1998; Hyon et al. 2010). 진피 플라보노이드의 기능성에 대한 연구는 항산화작용, 고지혈증 억제작용, 충치예방효과, 항균작용 등과 고혈압 예방, 혈중 LDL-콜레스테롤 함량 감소작용 및 HDL-콜레스테롤 증가 그리고 순환계 질환의 예방 및 개선 효과 등 다양한 생리기능성에 대한 보고가 되고 있다(Han and You 1988; Monforte et al. 1995; Kurowska et al. 2000). 특히 hesperidin과 naringin에 대한 연구가 활발하게 이루어져왔으며(Kawaguchi et al. 1997; Bok et al. 1999; Cha et al. 1999), 감귤 고유의 플라보노이드인 tangeretin이 암세포침윤 및 전이 방지 효과, 암세포의 apoptosis 유도효과 및 백혈병 세포의 분화 촉진 작용이 있다고 보고되고 있다(Kunizane, Ueda, Yamazaki 1995). Kang 등(2005)은 젖산균으로 발효시킨 진귤 과피 추출물이 대식세포인 Raw 264.7 세포에서 염증유발 단백질(iNOS, COX-2)의 수준을 억제하고, 세포의 생존률을 향상 시킨다고 하였다. 뿐만 아니라 hesperidin과 naringin은 흰쥐를 이용한 독성 실험에서 급성, 아급성, 만성독성, 생식독성, 돌연변이원성 등이 거의 없는 안전한 화합물로 미국 FDA가 보고하여 다양한 식품과 의약품에 첨가물로 이용되고 있다. 진피에 함유돼 있는 다양한 물질의 효능을 정리해 보면 Table 1과 같다.

Table 1. 진피의 함유 성분과 효능(Biological compounds and pharmacological effects of citrus species)

플라보노이드란 그리스어로 황색을 의미하는 flavus에서 유래된 것으로 과일 껍질, 채소의 잎, 줄기, 뿌리, 씨앗 등 식물에 광범위하게 존재하는 천연물질이다(Kuhnan 1976). 플라보노이드류는 현재까지 약 4,000여종 이상이 알려져 있으며, 감귤류에도 약 60여종 이상이 알려져 있다. 플라보노이드는 담황색 또는 노란색의 색소화합물로 식물체에서 대부분 당과 결합된 배당체(glycoside)형태로 존재하며, 최초의 임상적 사용은 1939년 헝가리 Albert Szent-Gyorgyi에 의한 것으로 플라보노이드가 혈관투과성 조절 및 vitamin C 보조 활성을 보이기 때문에 vitamin P라고 불리기도 하였고, 인체에 대한 1일 섭취량이 약 23∼1,000 mg 정도로 특이한 부작용이 없는 것으로 알려져 있다(Hertog et al. 1993; Garg et al. 2001).

플라보노이드는 polyphenolic substance로 Fig. 1에서처럼 분자 구조에 따라 flavones, flavanones, flavonols, isoflavones, anthocyanidins 그리고 flavanols (또는 catechins) 등으로 분류되며, 자연상태에서는 비배당체(aglycone)로 존재하기도 하지만 대부분 rutinose, glucose, rhamnose 등의 당과 결합된 배당체(glycoside) 형태로 존재한다(Fig. 2). 그리고 이러한 구조의 차이에 의해 생체 내에서의 흡수 및 대사 그리고 생화학적 활성이 달라진다고 보고되고 있다(Garcia et al. 1997; Erlund 2004; Elisa et al. 2007). Ameer 등(1995)의 보고에 따르면 naringin과 hesperidin의 체내 흡수형태를 조사하기 위해 25세의 건강한 남성을 대상으로 naringin과 hesperidin을 각각 체중 kg당 11 mg씩 2일간 단독 경구투여한 후 체내 흡수형태를 살피고, 또한 이들 플라보노이드를 함유한 오렌지와 자몽 주스를 1개월간 섭취시킨 후 혈액, 요(尿), 혈구에서 어떤 형태로 검출되는지를 조사한 결과, naringin 및 hesperidin의 단독투여 실험에서는 각각 요(尿) 중에 이들의 aglycone 형태인 naringenin과 hesperetin이 각각 5%, 3% 씩 검출되었고, 주스로 음용한 후 측정한 결과에서도 역시 aglycone 형태인 naringenin과 hesperetin이 각각 7%, 24%가 검출되었으며, 혈액과 혈구에서는 aglycone 형태인 naringenin과 hesperetin만이 검출되었다고 보고하였다. 이러한 결과를 통해 Fig. 3에서처럼 당이 결합된 형태의 플라보노이드가 소화과정에서 장내세균이 분비하는 효소의 작용을 받아 당이 유리된 후 aglycone 형태로 전환되어 흡수되고 그 후 혈액, 요(尿), 혈구 등으로 이동되어 검출된다는 것을 알 수 있다(Ross and Kasum 2002; Kanaze et al. 2007).

Fig. 1. 플라보노이드의 분자 구조(Molecular structures of flavonoids. The basic structure consists of the fused A and C ring, with the phenyl ring B attached to through its 10 position to the 2-position of the C ring, numbered from the pyran oxygen).

Fig. 2. Flavane 핵의 화학적 구조(Chemical structures of the flavane nucleus). [Quercetin (MW = 302 g/mol), hesperetin (MW = 302 g/mol), and naringenin (MW = 272 g/mol), and some of their most common glycosides.]

Fig. 3. 진피 플라보노이드의 소화와 흡수(The digestion and absorption of dietary citrus flavonoids)

감귤류는 과실이 성숙되는 정도에 따라 플라보노이드 함량과 조성이 변하는 것으로 알려져 있는데, 미성숙 과실에서는 플라보노이드의 함량과 종류가 다양하게 존재한다. 즉 미성숙 과실에서는 glycoside와 aglycone 플라보노이드가 모두 존재하지만 과실이 성숙되면서 aglycone의 함량은 급격하게 감소되어 완숙된 감귤의 과피에서는 aglycone 플라보노이드 화합물이 거의 존재하지 않고, glycoside인 narirutin과 heaperidin이 주요 플라보노이드로 존재하게 된다. 따라서 시중에 한약재로 유통되는 진피의 경우에는 체내에 바로 흡수될 수 있는 형태인 aglycone 플라보노이드의 함량이 극히 낮기 때문에 플라보노이드의 흡수는 개개인의 장내 미생물 균총의 차이에 따라 나타나는 효소활성의 차이에 의해 달라지게 된다는 것을 알 수 있다(Song et al. 1998; Rhyu et al. 2002).

유효 성분의 흡수에 있어서 개인적인 차이를 줄이기 위해서는 섭취 전 가수분해 등의 과정을 통해 흡수 가능한 형태로 전환시키는 방법이 있을 수 있다. 이는 최근 관심이 높아지고 있는 발효 한약 분야와 기본적으로 같은 개념이며, 우리 민족이 오래전부터 사용해 왔던 다양한 발효 기술 또한 이러한 개념을 바탕으로 하고 있다고 할 수 있다.

우리나라는 전통적으로 발효 문화가 잘 발달되어 장류, 누룩, 젓갈 등 풍부한 발효 미생물을 보유하고 있다. 일반적으로 미생물의 안전성을 입증받은 generally recognized as safe (GRAS) 균주인 유산균, 효모 그리고 누룩 곰팡이류가 산업적으로 많이 이용되고 있다.

Aureobasidium pullulans는 Aspergillus niger 등과 함께 세포외 다당류를 생산하는 미생물로 무성포자(conidia)가 자낭에 싸여있고, yeast-like, typhae, chlamydospore와 같이 다양한 형태로 존재하기 때문에 불완전 균류로 불린다(Suh et al. 2006). A. pullulans는 일반적으로 'black yeast'로 알려져 있기도 하며, α-glucan의 일종으로 다당류인 pullulan을 생산하여 식품첨가물, 가식성 필름 등의 분야에서 산업적으로 이용되고 있는 균주이다(Kwon et al. 1994). A. pullulans에 대한 연구는 초기에 pullulan 생산을 위한 연구를 시작으로 하여 최근에는 수용성 β-glucan을 생산하는 것으로 알려지면서 발효 조건과 특성 그리고 생리적 효능에 대한 다양한 보고가 이루어지고 있다(Lee et al. 2008; Lee et al. 2009). 이러한 연구들은 A. pullulans가 가지고 있는 세포외 다당류 생산능력을 이용한 것이다. 그러나 A. pullulans의 효소 생산성에 대해서는 학술적 연구로 효소의 특성과 생산 조건 등에 국한되어 있고 다당류 생산 이외에 효소를 이용한 소재 개발 연구는 거의 진행되지 않았다(Hayashi et al. 1993; Dake, Jadhav, Patil 2004).

따라서 본 발명의 목적은, 풍부한 플라보노이드와 다양한 기능성을 가지고 있어 한약재, 식품 등으로 사용되는 진피에 A. pullulans의 효소 생산 능력을 적용시켜 진피에 존재하는 플라보노이드의 생물전환을 유도하여 체내 흡수가 쉽게 될 수 있는 aglycone 플라보노이드를 생성시킴으로서 소화, 흡수의 개인적인 차이를 감소시킨 새로운 기능성 소재를 개발하여 진피의 부가가치를 높이고 최근 심각한 사회적 문제가 되고 있는 비만에 대한 예방 효과가 우수한 소재를 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 갖는 본 발명의 항비만 효과를 가지는 진피 발효 추출물의 제조방법은,

(1) 진피를 분말화하는 단계;

(2) 상기 진피 분말을 Aureobasidium pullulans를 이용하여 발효시켜 진피의 플라보노이드 성분이 비배당체(aglycon)로 생물적 전환이 이루어지도록 하는 단계;

(3) 상기 (2)단계에서 얻은 발효물에서 발효된 진피 분말만 분리해내는 단계; 및

(4) 상기 단계의 발효된 진피 분말을 주정으로 추출하는 단계;로 이루어지는 것을 특징으로 한다.

또한 이때, 단계 (4)의 주정 추출 후에, (5) 그 추출물에 물을 첨가하여 물에 용해되지 않고 침전된 부분만을 회수하는 단계가 더 포함되는 것을 특징으로 한다.

본 발명은 또한 상기 제조방법에 있어서, 단계 (2)에서 Aureobasidium pullulans를 이용하여 진피를 발효시키는 조건은 물 100중량부, 진피 분말 3~10중량부, casitone 0.6~1.0중량부의 조성으로 하여, 발효 온도 20~28℃, 교반 속도 50~200 rpm으로 1~4일 발효시키는 것을 특징으로 한다.

본 발명은 또한 상기 각 방법에 의하여 제조되는, 항비만 효과를 가지는 진피 발효 추출물인 것을 특징으로 한다.

본 발명은 또한 상기 항비만 효과를 가지는 진피 발효 추출물을 유효 성분으로 하는 체지방감소, 혈중지질개선 또는 비만 예방 및 개선용 식품이나 약품인 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따르면 다양한 기능성을 가진 진피의 효능을 극대화하고 우수한 항비만 효과를 갖는 소재로 이용할 수 있게 된다.

<제1장 서론>

본 발명자는 진피에 풍부하게 존재하는 천연 glycoside 바이오플라보노이드를 미생물을 이용하여 생물전환시켜 인체에 흡수가 쉬운 형태인 aglycone 플라보노이드로 전환시키기 위해 생물전환 활성 미생물을 분리, 동정하였으며, 분리균을 이용하여 생물전환을 위한 최적 발효 조건 규명 및 고농도의 바이오플라보노이드를 함유한 건강 기능성 소재를 개발하고, 발효 전후의 효능 비교를 위해 in vitro에서 지방전구세포와 췌장세포를 이용하여 비만 및 비만과 밀접한 연관이 있는 당뇨에 대한 효능을 확인하였으며, 최종적으로 생물전환을 통해 향상된 항비만 효능을 in vivo에서 확인하였다.

이하 본 발명을 실시예와 함께 상세히 설명한다.

<제2장 재료 및 방법>

2.1 사용 시약

생물전환을 위해 사용된 진피는 2008년도 제주도산으로 품종은 온주밀감(Citrus unshiu Markovich)이며, (주)옴니허브로부터 시중에 유통되는 한약재를 구입하여 실험에 사용하였다. 생물전환 균주 분리를 위해 사용한 potato dextrose agar (PDA), triptic soy agar (TSA), nutrient agar는 Difco Co. (USA)제품을 사용하였으며, β-glucosidase활성 screening을 위해 사용한 esculin과 4-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside (pNPG), sodium acetate, p-nitrophenol 등의 시약은 Sigma Co. (USA) 제품을 사용하였다. 그리고 arabinose, fructose, galactose, glucose, glycerol, lactose, maltose, soluble starch, sucrose, xylose, casitone, soytone, tryptone, yeast extract, malt extract, peptone, NaNO₃, (NH₄)₂SO₄, NH₄Cl 등은 시판 특급 제품을 사용하였다.

플라보노이드 추출에 사용된 주정은 식용 가능한 발효 주정(Duksan Co. Korea)을 사용하였고, 성분 분석에 사용한 dimethyl formide (DMF), methanol 등 유기용매는 J. T. Baker (USA), acetic acid는 Junsei Co. (Japan) 제품을 사용하였다. 플라보노이드 표준물질로 사용한 naringin, naringenin, hesperetin은 Sigma Co. (USA) 제품을, narirutin과 hesperidin은 Chromadex Co. (USA)의 특급 제품을 사용하였다. 그리고 세포배양을 위해 사용된 Dulbecco's modified Eagle medium-high glucose (DMEM) 배지는 Welgene Co. (Korea)를 사용하였으며, 그 밖에 모든 시약들은 시중에 판매되는 특급 제품들을 사용하였다.

2.2 진피 플라보노이드 생물전환 균주 선별

2.2.1 균주 분리 및 배양

진피 플라보노이드의 생물전환 균주 분리는 플라보노이드와 폴리페놀이 풍부하여 항산화능이 우수한 것으로 알려져 있는 식물인 진피(국산), 감잎(국산) 그리고 비파엽(중국산)을 (주)옴니허브로부터 구입하여 분리원으로 이용하였다. 균 분리의 효율을 높이기 위해 먼저 각각의 소재를 적당히 조분쇄한 후, 분쇄물 1 g을 멸균 증류수 9 mL에 현탁하고 10배씩 단계 희석하여 각각의 배지에 100 μL씩 접종하여 30℃에서 2∼3일간 배양하면서 생성되는 colony를 육안으로 관찰하면서 1차 분리하였다. 균 분리에 사용된 배지는 세균 분리를 위해 TSA, nutrient agar 배지, 효모와 곰팡이 분리를 위해 potato dextrose yeast extract (PDY) agar를 기본배지로 사용하였고, 각 배지의 조성은 Table 2와 같다.

1차로 분리된 균주는 다시 각 배지에 계대 배양을 실시하였으며, 플라보노이드 생물전환 균주를 screening하기 위해 분쇄한 진피분말에 증류수를 20 배 첨가하여 70℃에서 3시간 추출한 추출액을 시험관에 5 mL씩 분주하고 121℃에서 15분간 멸균한 후, 분리균을 한 백금이씩 접종하여 30℃, 150 rpm에서 2일간 배양한 배양액을 12,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 균체를 제거하고 배양 전·후의 총 플라보노이드 함량 변화를 비교하여 유의적인 변화가 있는 균주를 2차 선별하였다. 그리고 선별된 균주는 glycoside 플라보노이드를 aglycone로 전환시키는 데 필요한 효소인 β-glucosidase 활성 유무를 조사하기 위해 esculin 가수분해 실험과 β-glucosidase 효소활성을 측정하여 효소활성이 가장 우수한 균주를 최종생물전환 균주로 분리하였다. 그리고 분리된 균주는 PDY agar 배지에 사면배양하여 4℃에서 보관하였고, 별도로 20% glycerol을 함유하는 보존액에 현탁하여 -70℃에서 동결 보존하면서 실험에 사용하였다.

Table 2. 배지 조성(Composition of culture medium)

2.2.2 총 플라보노이드 함량 측정

총 플라보노이드 함량 측정은 분리균을 진피 추출액에 배양한 후 배양액을 12,000 rpm에서 10분간 원심분리(Avanti J-25, Beckman Coulter, USA)하여 상등액을 시료로 측정하였다. 먼저 각 시료 1 mL에 5% sodium nitrite (NaNO₂) 용액 150 μL를 첨가하고 상온에서 5분 동안 반응시킨 후, 10% aluminium(Ⅲ) chloride (AlCl₃) 300 μL를 첨가하여 상온에서 다시 5분간 반응시켰다. 그 후 1 M NaOH 용액을 1 mL 첨가하고 잘 혼합한 후, 분광광도계(Uvikon XS, Secomam, France)를 사용하여 510 nm에서 흡광도를 측정하였다. 총 플라보노이드 함량은 표준물질로 rutin을 사용하여 작성한 표준검량선에 대입하여 계산하였다(Jia, Tang, Wu 1999).

2.2.3 Esculin 가수분해능 측정

진피에 존재하는 플라보노이드는 주로 glycoside 형태로 존재하여 이를 aglycone로 전환시키기 위해서는 β-glucosidase의 작용이 필요하다. 따라서 1차 분리된 균주를 대상으로 β-glucosidase 활성 유무를 신속하게 screening 하기 위해 esculin 평판배지법을 이용하였다(Kwon et al. 1994). Esculin은 Fig. 4에서 보는 것처럼 β결합을 하고 있는 glycoside 화합물로 Esculetin 6-β-D-glucoside라고도 하며 β-glucosidase의 작용을 받아 aglycone인 esculetin으로 전환되면 철이온과 결합하여 검게 발색되게 되는데 이러한 성질을 이용하여 β-glucosidase활성 균주를 screening하였다. Esculin 평판배지는 각 분리균의 기본배지에 0.1% esculin과 0.05% ferric ammonium citrate를 첨가하여 제조하였다. Esculin 평판배지에 각 분리균을 획선 배양하여 30℃에서 배양하면서 colony 주위가 검게 발색되는 정도를 육안으로 관찰하여 β-glucosidase활성 균주를 선별하였다.

Fig. 4. 에스큘린의 화학 구조(Chemical structure of esculin)

2.2.4 β-glucosidase 활성 측정

Esculin 가수분해능이 확인된 균주를 대상으로 β-glucosidase 활성을 측정하였다(Leite, Gomes, Silva 2007). 분리 균주의 배양 상등액을 조효소액으로 사용하였고, glucoside bond를 가지는 4-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside (pNPG)를 기질로 사용하였다. 4 mM의 pNPG를 포함한 50 mM sodium acetate buffer (pH 5.0) 2 mL에 조효소액 200 μL를 가하고 40℃ 항온수조에서 30분간 반응시킨 후, 0.5 M의 차가운 Na₂CO₃ 용액 2 mL을 첨가하여 반응을 정지시키고, 유리된 p-nitrophenol의 양을 405 nm에서 흡광도를 측정하였다. 유리된 p-nitrophenol의 양은 p-nitrophenol을 이용하여 미리 작성해둔 표준 검량선으로부터 산출하였고, β-glucosidase 효소활성 1 unit은 반응시간 분당 1 μM의 p-nitrophenol을 생성하는데 필요한 효소의 양으로 정의하였다.

2.3 선발 균주의 생물전환능 확인 및 균주 동정

2.3.1 생물전환 발효 조건

Esculin 가수분해능 실험을 통해 β-glucosidase 활성을 가지는 것으로 선별된 균주가 실제로 진피 플라보노이드의 생물전환능을 가지는지 확인하기 위해 분리균을 진피 발효 배지에 직접 배양하였다. 발효 기질로 사용한 진피는 60℃에서 12시간 건조시켜 수분함량을 5% 이하로 조정한 다음 가정용 분쇄기를 이용하여 분쇄한 후, 30 mesh 체로 거른 분말을 사용하였다. 진피 플라보노이드의 생물전환을 위한 발효는 진피 분말 1.5 g에 증류수 30 mL를 첨가하여 제조한 진피 발효 배지를 이용하였으며, PDY broth에서 36시간 미리 전배양한 배양액을 5% 되게 접종한 후, 28℃에서 150 rpm으로 3 일간 발효한 다음 플라보노이드 성분을 분석하여 aglycone 플라보노이드인 naringenin과 hesperetin의 생성 유무를 조사하였다.

2.3.2 플라보노이드 추출

진피 플라보노이드 추출은 진피발효 배지에서 3일간 발효한 후, 발효액을 12,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 상등액을 제거하고 남은 진피 분말 pallet에 발효 주정을 30 mL 첨가하여 잘 혼합한 후, 70℃에서 3시간 환류추출 하였다. 추출액은 여과지(Watman paper No. 2)를 이용하여 여과하고 주정을 이용하여 다시 30 mL로 정용한 후 플라보노이드 분석에 이용하였다. 그리고 필요에 따라 감압농축기(N-1000, EYELA, Japan)를 이용하여 45℃에서 농축하여 주정을 완전히 제거한 후 동결건조하여 분말시료를 제조하였다(Fig. 5).

Fig. 5. 진피로부터의 플라보노이드 추출 과정(Scheme for flavonoid extraction of citrus peel)

2.3.3 플라보노이드 성분 분석 조건

발효 후 플라보노이드의 생물전환 확인을 위해 HPLC (Waters, USA)를 이용하여 각각의 플라보노이드 함량을 분석하였다. 표준물질로는 진피에 일반적으로 풍부하게 존재하는 glycoside 플라보노이드인 hesperidin, narirutin, naringin과 생물전환 결과 생성되는 aglycone 플라보노이드인 hesperetin과 naringenin을 사용하였다. 발효 진피 추출액은 여과한 후 그 자체를 분석 시료로 사용하였으며, 동결건조 분말은 20% DMF를 포함하는 메탄올 용액에 적당량 용해하여 분석시료로 사용하였다. 모든 분석 시료는 0.2 μm syringe filter로 여과한 후 사용하였으며, HPLC 분석 조건은 Table 3, 4와 같다.

Table 3. 플라보노이드의 HPLC 분석 조건(Operating conditions of HPLC for flavonoid analysis)

Table 4. 플라보노이드 분석을 위한 이동상의 기울기 조건(Gradient condition of mobile phase for flavonoid analysis)

2.3.4 선발 균주의 동정

생물전환능이 가장 우수한 균주를 선별하기 위해 진피 배지를 이용하여 발효를 실시한 후, 발효를 통해 glycoside 플라보노이드가 aglycone로 전환되는 것을 HPLC 분석을 통해 확인하고 전환능이 가장 우수한 균주를 선별하였다. 전환능이 가장 우수한 균주의 동정은 현미경(Axio imager, Carl Zeiss, German)을 이용한 형태학적인 특징 관찰과 함께, (주)솔젠트사에 의뢰하여 분리균의 18S rDNA를 universal primer인 ITS1 (forward), ITS4 (reverse)를 이용하여 sequencing하고, NCBI 홈페이지(.nlm.nih.gov)의 blast search program을 통해 염기서열의 상동성을 조사하여 동정하였다.

2.4 진피 플라보노이드의 생물전환을 위한 최적 발효조건 검토

2.4.1 탄소원에 의한 영향

진피 플라보노이드의 생물전환에 미치는 탄소원의 영향을 조사하기 위해 생물전환 기본배지인 진피발효 배지에 탄소원으로 arabinose, fructose, galactose, glucose, glycerol, lactose, maltose, soluble starch, sucrose, xylose를 각 각 2% 되게 첨가하여 28℃, 150 rpm에서 72시간 발효한 후, 생성된 aglycone 플라보노이드인 naringenin과 hesperetin의 양을 분석하여 최적 탄소원을 선정하였다.

2.4.2 질소원 및 질소원 농도의 영향

진피 플라보노이드의 생물전환에 미치는 질소원의 영향을 조사하기 위해 생물전환 기본배지인 진피 배지에 질소원으로 casitone, malt extract, peptone, soytone, tryptone, yeast extract와 같은 유기질소원과 NaNO₃, (NH₄)₂SO₄, NH₄Cl과 같은 무기질소원을 발효 배지에 0.2% 되게 첨가하여 전환된 aglycone 플라보노이드 함량을 분석하여 최적의 질소원을 선정하였다.

질소원 농도에 대한 영향은 최적 질소원으로 선정된 casitone을 0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0% 되게 첨가하여 발효시킨 후 생성된 aglycone 플라보노이드인 naringenin과 hesperetin의 함량을 분석하여 최적 농도를 선정하였다.

2.4.3 발효 온도 및 교반 속도의 영향

진피 플라보노이드의 생물전환에 미치는 발효 온도의 영향을 조사하기 위해 진피 배지에 질소원으로 0.8%의 casitone을 첨가한 발효 배지에 선발균을 접종한 후, 진탕속도 150 rpm으로 각 각 15, 20, 25, 28, 30, 35, 40℃의 온도에서 72시간 발효한 후 생성된 aglycone 플라보노이드 화합물의 함량을 분석하여 최적 발효 온도를 선정하였다.

그리고 진탕속도에 따른 생물전환의 영향을 검토하기 위해 발효시 진탕 속도를 0, 50, 100, 150, 200 rpm 으로 달리 조정하여 생성된 aglycone 플라보노이드 화합물의 함량을 분석하여 최적의 진탕속도를 결정하였다.

2.4.4 발효 시간에 의한 영향

진피 플라보노이드의 생물전환에 미치는 발효 시간의 영향을 조사하기 위해 0.8% casitone을 첨가한 진피발효 배지에 PDY배지에서 36시간 전배양한 종균을 5%되게 접종한 후, 25℃에서 150 rpm으로 1, 3, 5, 7, 9일간 발효시켜 생성된 aglycone 플라보노이드 화합물의 함량을 비교하여 최적 발효 시간을 결정하였다.

2.4.5 생물전환 선발균주의 생육곡선

최적 발효 조건에서 선발균의 생육 상태를 조사하기 위해 PDY 배지에서 전배양한 선발균을 5% 되게 접종한 후, 발효 기간 3일 동안 매 12시간 마다 균수를 측정하였다. 균수 측정은 발효액 1 mL에 멸균수 9 mL를 첨가하여 강하게 혼합한 후 10배씩 단계희석하여 희석한 현탁액 100 μL를 PDY agar 배지에 접종하고, 28℃에서 48시간 배양한 후 생성된 colony를 개수하여 측정하였고, 이를 바탕으로 선발균의 발효 생육곡선을 작성하였다.

2.5 발효 진피 추출물이 3T3-L1 지방세포의 분화에 미치는 영향

2.5.1 발효진피 시료 제조

생물전환된 발효 진피의 항비만 효과를 세포수준에서 확인하기 위해 지방전구세포인 3T3-L1 cell을 대상으로 발효 진피와 생진피 추출물을 처리하여 세포의 분화에 미치는 영향을 조사하였다. 먼저 발효 진피 추출물은 선발균을 최적 발효 조건에서 진피 분말 50 g을 사용하여 제조하였다. 즉 3 L 삼각플라스크에 진피 50 g과 0.8% casitone을 포함한 증류수 1 L를 가하여 25℃, 150 rpm에서 3일간 발효하였다. 시료 제조는 Fig. 5에 나타낸 것처럼 발효 후 원심분리(Avanti J-25, Beckman Coulter, USA)하여 상등액을 별도로 회수하고 발효된 진피 분말에 식용 가능한 발효 주정(95% ethanol)을 진피 분말의 20배량 즉, 1 L를 첨가하여 70℃에서 3시간 환류추출기(YWS 6H, Yeunwoo, Korea)를 이용하여 추출하였다. 추출액을 여과지(Watman No. 2)를 이용하여 여과한 후, 감압농축기(N-1000, Eyela, Japan)를 사용하여 45℃에서 주정이 완전히 제거될 때까지 농축하고 소량의 증류수에 현탁하여 동결건조기(VFDR05-3060, Biocryos, Korea)로 건조하여 발효 진피 추출 분말을 제조하였고, 이를 fermented citrus peel extract powder (FCP)로 표시하였다. 별도로 배양 상등액은 다시 0.2 μm 제균 필터를 이용하여 균체를 완전히 제거한 후 spray dryer (KL-8, Seo gang engineering, Korea)를 이용하여 분말을 제조 하였고, 이는 fermented citrus peel culture broth powder (FCB)로 표시하였다(Fig. 6). 그리고 대조구로 발효하지 않은 생진피 분말을 발효 진피 분말과 동일하게 20배(w/v)량의 주정으로 추출, 농축하여 동결건조 한 후, 시료로 사용하였고, 이는 citrus peel extract powder (CP)로 표시하였다. 각각의 시료는 HPLC를 이용하여 플라보노이드 함량을 측정한 후, 시료로 사용하였다.

Fig. 6. 발효 진피 추출 과정(Procedure for the extraction of fermented citrus peel)

2.5.2 3T3-L1 세포배양

발효 진피 추출물이 지방세포의 분화에 미치는 영향을 조사하기 위해 사용된 3T3-L1 세포주는 한국세포주은행(Korean Cell Line Bank, Seoul, Korea)에서 분양받아 사용하였다. 실험에 사용된 3T3-L1 세포는 10% bovine serum (BS)과 100 U/mL penicillin G와 100 μg/mL streptomycin을 포함하는 Dulbecco's modified Eagle medium-high glucose (DMEM) 배지(Welgene, Daegu, Korea)를 사용하여 37℃에서 5% CO₂ 조건으로 계대배양 하여 preadipocyte 상태가 유지된 세포를 본 실험에 사용하였다(Huang et al. 2006; Ka et al. 2009).

Preadipocyte 상태인 3T3-L1 세포를 seeding하여 DMEM배지로 37℃, 5% CO₂ 조건에서 배양하였다. Cell이 confluent 상태에 도달 한 후, post- cofluent를 위해 2일간 추가 배양을 실시한 후, 분화 유도물질인 0.25 μM dexmethasone, 0.5 mM methylisobutylxanthine 그리고 5 μg/mL 인슐린이 첨가된 DMEM　배지로　교환하여 3일간 분화시켰다. 그 후 2일 간격으로 10 μg/mL 인슐린만 첨가된 DMEM 배지로 교환하면서 adipocyte maintenance를 통해 지방을 축적시켰다.

발효 진피 추출물의 anti-adipogenesis 효과를 조사하기 위해 각 시료를 적당한 농도로 DMSO에 녹여 분화유도배지에 첨가하였으며, 지방축적 처리기간 동안 2일 간격으로 새 배지와 함께 첨가 되었다.

2.5.3 세포독성 시험

3T3-L1 preadipocyte cell에 대한 발효 진피 추출물의 세포 독성 확인은 MTT 법을 통해 측정하였다. 1×10⁶ cell/well로 seeding 되어진 preadipocyte cell에 FCP, FCB, CP 시료를 각 각 5, 25, 50, 250, 500 μg/mL 농도로 처리하여 48시간 동안 배양한 후, MTT assay를 수행하였다. MTT reagent (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide)를 최종 0.5 mg/mL 농도로 처리하여 37℃에서 4시간 추가 배양한 후, 상등액을 제거하고 DMSO(Junsei, Japan)를 첨가하여 생성된 formazan의 양을 microplate reader (Asys UVM340, Biochrom, UK)를 이용하여 540 nm에서 측정하였다. Cell viability는 대조군의 평균 흡광도 값에 대한 백분율로 나타내었다.

2.5.4 세포분화 및 oil red O staining

발효 진피 추출물 첨가에 따른 지방 축적율 변화를 9일간의 분화 및 지방축적 기간 동안 1.0×10⁶ cell/well로 seeding 되어진 3T3-L1 cell에 FCP, FCB, CP 시료를 25 μg/mL, 50 μg/mL 농도로 처리하여 관찰하였다. 분화유도가 완료된 후 배지를 제거하고 PBS로 세척하여 배지 성분을 제거하였다. 그리고 10% formalin으로 cell을 고정시켰으며, oil-red O를 처리하여 염색하였고, 염색 후 isopropyl alcohol로 용해하여 microplate reader(Asys UVM340, Biochrom, UK)로 500 nm에서 흡광도를 측정하였다. 지방함량은 시료를 처리하지 않은 대조군의 평균 흡광도 값에 대한 백분율로 나타내었다.

2.5.5 Triglyceride 함량 측정

발효 진피 추출물 첨가에 따른 중성지방(TG; Triglyceride) 함량 변화는 9일간의 분화 및 지방축적 기간 동안 1.0×10⁶ cell/well로 seeding 되어진 3T3-L1 cell에 FCP, FCB, CP 시료를 25 μg/mL 농도로 처리하여 조사하였다. 세포는 PBS로 세척한 후, TG quantification kit(Biovision, USA)를 사용하여 중성지방 함량을 570 nm에서 측정하였다. 세포내 단백질 함량은 BCA법(Thermo, USA)으로 562 nm에서 흡광도 측정 및 정량하였으며, 각 세포들의 단백질 함량 대비 중성지방 함량으로 나타내었다.

2.5.6 Glycerol 3-phosphate dehydrogenase (GPDH) 측정

Adipocyte로 분화되는 세포 내에서 증가되는 효소인 glycerol 3-phosphate dehydrogenase (GPDH) 활성에 대해 알아보고자, 9일간의 분화 및 지방축적 기간 동안 1.0×10⁶ cell/well로 seeding 되어진 3T3-L1 cell에 FCP, FCB, CP 시료를 25 μg/mL 농도로 처리하였다. 세포는 PBS로 세척한 후 GPDH activity assay kit(Takara, Japan)를 사용하여 GPDH activity를 340 nm에서 측정하였고, 효소활성은 unit/mL로 나타내었다.

2.6 HIT - T15 (β- Cell )에서 산화적 손상에 의한 세포 생존률 및 인슐린 분비 개선 효과

2.6.1 세포배양 및 독성 시험

고혈당증(Hyperglycemia)에 의한 β-cell의 손상을 예방하는 효과를 조사하기 위해 hamster pancreatic β-cell인 HIT-T15 cell line을 사용하였다. HIT-T15 cell은 한국세포주은행(Korean Cell Line Bank, Seoul, Korea)에서 구입하여 10% FBS 및 100 unit/mL penicillin, 100 ng/mL의 streptomycin을 첨가한 RPMI-1640 (glucose 11.1 mM 포함)배지로 37℃, 5% CO₂ 조건에서 배양하였다(Miyake et al. 1998). 그리고 본 실험에 사용된 RPMI-1640, FBS, penicillin, streptomycin은 (주)웰진(Daegu, Korea)에서 구입하여 사용하였다.

동결건조된 발효 진피 추출물의 세포 처리 농도를 결정하기 위해 MTT (3-(4,5- dimethylthiazol -2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide)법을 이용하여 세포 독성을 확인하였다. 즉, 24 well plate에 well 당 10⁴개의 세포를 분주한 다음 24시간 배양하고 동결건조된 발효 진피 추출물을 DMSO에 농도별로 용해시켜 배지에 첨가한 다음 24시간 추가 배양하였다. 그 후 각각의 well에 MTT (5 mg/mL)를 첨가하고 4시간 반응 후, 상등액을 제거하고 DMSO를 300 μL 첨가하여 formazan을 충분히 용해시켜 microplate reader (Asys UVM340, Biochrom, UK)를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.

2.6.2 세포 생존률 및 인슐린 분비능 측정

고농도의 당에 의한 세포 손상을 유도하기 위해 deoxyribose를 HIT-T15 cell에 10∼60 mM의 농도로 처리한 후, MTT 법을 통해 세포 생존률을 조사하여 생존률 50%를 나타내는 IC₅₀ 농도를 결정하였다. 그리고 시료 처리에 따른 세포 생존률의 변화는 먼저 배양된 세포에 DMSO에 농도별로 용해한 각 시료를 첨가하여 30분간 반응시키고 deoxyribose를 IC₅₀ 농도로 첨가하여 추가 배양한 후, MTT 법을 통해 시료를 첨가하지 않은 대조군과 비교하여 세포의 생존률을 비교하였다. 이 때 상등액에 분비된 인슐린의 양은 Mercordia high range rate insulin ELISA (Mercodia, Sweden)를 사용하여 측정하였으며, 단백질량은 Bradford reagent (Thermo, USA)를 이용하여 분석한 후, 최종적으로 단백질 mg당 인슐린 분비량으로 나타내었다.

2.7 in vivo 항비만 효과

2.7.1 실험동물

생물전환된 발효 진피의 항비만 효과를 확인하기 위해 생후 4주령 수컷 흰쥐(Sprague Dawley)를 효창사이언스(Daegu, Korea)로부터 구입하여 고형사료와 물을 공급하면서 일주일간 적응시킨 후 사용하였다. 음수는 자외선으로 멸균된 물을 사용하였고, 사료는 자유롭게 섭취케 하였다. 실험기간동안 사육환경은 온도 20∼22℃, 상대습도 50±1%, 환기횟수 10∼15 회/hr, 명암주기는 12시간 간격으로 조도 150∼300 lux로 유지하였다.

2.7.2 시료제조

실험동물에 투여할 시료는 70 L 발효기(KF-70L, KBT. Co., Korea)를 이용하여 진피를 발효시키고 시료를 제조하였다. 먼저 A. pullulans Y-12 균주를 28℃, 150 rpm으로 36시간 동안 전배양하여 본 발효를 위한 종균으로 사용하였다. 본 발효는 70 L 발효기에 진피 분말 2 kg과 물 40 L를 첨가하여 121℃에서 20분간 멸균한 후, 발효 온도인 25℃로 냉각하고 미리 배양해둔 전배양액을 2 L 접종하여 교반속도 100 rpm에 공기 투입량 0.5 L/min으로 3일간 발효하여 제조하였다. 그리고 대조구로 사용될 생진피 추출물은 진피 분말 150 g에 발효 주정 3 L를 가하여 70℃에서 3시간 환류추출하여 제조하였다. 각각의 시료는 실험동물 사료 제조시 0.1, 0.5%씩 첨가하여 실험동물에 투여하였다.

2.7.3 실험식이

실험동물의 식이성 비만(diet-induced obesity)을 유도하기 위하여 고지방 식이와 함께 발효 진피 추출물(FCP)과 진피 추출물(CP)을 총 10주 동안 먹이면서 실험동물의 변화를 관찰하였다. 실험식이의 조성은 Table 5와 같으며, 표준식이(AIN-76)(Dytes Inc., Bethleham, PA, USA)를 기준으로 비만 및 고지혈을 유도하기 위하여 17% lard, 1% 콜레스테롤을 첨가하여 실험용 사료를 제조하여 사용하였다.

실험군은 표준 식이를 기준으로 한 정상군(normal)과 실험쥐에 고지방, 고콜레스테롤 식이만을 공급한 대조군(control) 그리고 고지방, 고콜레스테롤 식이를 기준으로 시험물질인 진피 추출분말을 0.1, 0.5% 첨가한 CP 0.1군, CP 0.5군 및 발효진피 추출 분말을 0.1, 0.5% 첨가한 FCP 0.1군, FCP 0.5군으로 총 6개의 군으로 나누었으며, 군당 8 마리(n=8)로 시험물질을 10주간 투여하면서 사육하였다.

Table 5. 실험 식이의 조성(Diet composition of experimental diet, unit : % of diet)

2.7.4 식이효율 측정

실험동물의 체중 증가량 및 식이 섭취량의 확인은 실험 개시일 부터 충분한 양의 사료와 물을 공급하면서 일주일 간격으로 측정하였다. 식이 섭취량은 급여량에서 잔량을 감하여 계산하였으며, 식이효율(FER; Food efficiency ratio)은 실험 기간 동안의 체중 증가량을 같은 기간의 식이 섭취량으로 나누어 환산하여 계산하였다.

2.7.5 실험동물 처치 및 장기 적출

총 10주간 사육한 랫드를 처치 전 16시간 동안 절식 시킨 후, ether를 이용하여 마취시키고 복부대동맥에서 혈액을 채취하여 실온에 30분간 방치시키고 3000 rpm에서 30분간 원심 분리하여 혈청을 분리하였다. 장기는 채혈 후 즉시 간장, 비장, 신장, 폐 그리고 심장을 적출하였으며, 지방함량 측정을 위해 후복강 지방조직(retroperitonea)과 부고환 지방조직(epididymal)을 적출하여 4℃ 생리식염수로 씻어내고 여과지로 수분을 제거한 후 즉시 무게를 칭량하였다.

2.7.6 혈청성분 분석

실험동물로부터 채취한 혈액을 이용하여 진피 추출물 시료의 투여로 인한 항비만 효과를 조사하기 위해 혈중지질 성분의 주요 지표가 되는 총콜레스테롤(total cholesterol), 중성지방(triglyceride), LDL-콜레스테롤(low density lipoprotein cholesterol) 그리고 HDL-콜레스테롤(high density lipoprotein cholesterol)과 혈중 glucose 함량을 생화학 자동분석기(Konelab 20XT, Vantaa, Finland)를 이용하여 분석하였다.

2.7.7 통계처리

모든 실험결과에 대한 통계처리는 실험으로부터 얻어진 결과를 SPSS 12.0K 프로그램을 이용하여 one-way ANOVA에 의한 평균치와 표준편차(mean±SD)로 표시하고, 각 실험 군간의 유의성은 p〈0.05 수준에서 Dun can's multiple range test로 검정하였다.

<제3장 결과 및 고찰>

3.1 진피 플라보노이드 생물전환 균주 선별

3.1.1 1차 균주 선발

3.1.1.1 균주분리

진피 플라보노이드의 생물전환 균주를 분리하기 위하여 분리원으로 진피, 감잎, 비파엽을 사용하였으며, 총 29 종의 미생물을 분리하였다. 현미경 검경을 통해 세균과 효모로 구분하였으며, 이들 균주를 조분쇄한 진피에 증류수를 20배 첨가하여 70℃에서 3시간 추출한 진피 추출액 5 mL에 각각 접종하여 세균으로 추정되는 균(B)은 37℃, 효모로 추정된 균주(Y)는 28℃에서 2일간 발효하였다. 발효액의 총 플라보노이드 함량을 측정하여 발효하지 않은 대조구와 비교하여 함량 변화가 일어나는 균주를 선별한 결과, Table 6에 나타낸 것처럼 Y-1, 3, 11, 12 균주에서 플라보노이드 함량이 대조구에 비해 20% 이상 감소되는 현상이 나타났으며, 나머지 균주는 대조구에 비해 ±3% 범위로 거의 변화가 없는 것으로 확인되었다. 플라보노이드의 분자량은 glycoside인 narirutin과 hesperidin이 각 각 580, 610이며, aglycone인 naringenin과 hesperetin은 272, 302로 당 부분이 제거되어 분자량이 감소되게 된다. 총 플라보노이드 함량이 감소되는 것은 glycoside 플라보노이드가 aglycone으로 전환되면서 분자량이 50% 정도 감소되어, 플라보노이드 함량 측정 시 시약에 대한 반응 정도가 약해지기 때문인 것으로 생각되어 이들 균주를 1차로 선별하여 다음 실험을 진행하였다.

Table 6. 분리 균주에 의한 발효 후 플라보노이드의 함량 변화(Change in flavonoid contents after fermentation by isolated microorganisms)

3.1.1.2 Esculin 가수분해능 측정

분리된 균주를 대상으로 glycoside 플라보노이드를 aglycone으로 생물전환 시키는데 필요한 β-glucosidase 활성을 가지는 균주를 screening하기 위해 esculin 가수분해능을 측정하였다. 그 결과 Fig. 7에서 보는 바와 같이 Y-1, 3, 11, 12 균주에서 esculin이 esculetin으로 가수분해되어 colony 주위가 검게 발색되는 것을 확인할 수 있었다. 이는 Table 5의 결과에서 Y-1, 3, 11, 12 균주가 총 플라보노이드 함량의 변화가 가장 크게 나타난 것과 일치하였다. 따라서 이상 4종의 균주를 생물전환 균주로 2차 선발하였다.

Fig. 7. 분리 균주의 에스큘린 가수분해능(Esculin hydrolysis of isolated microorganisms on esculin agar. Y-1, 3, 11, 12 were isolated from persimmon leaves and incubated at 28℃ for 3 days on esculin agar medium.)

3.1.2 선발균의 β-glucosidase 활성

Fig. 7의 결과에서 esculin 가수분해능을 가진 4종의 균주를 대상으로 β-glucosidase 생산능을 검토하였다. 효소생산은 PDY broth 배지에서 28℃, 150 rpm 으로 2일간 배양한 상등액을 조효소액으로 하여 β-glucosidase 활성을 측정하였다. 효소활성은 반응 산물인 p-nitrophenol을 이용한 표준 검량선을 이용하여 산출하였다(Fig. 8).

분리 미생물 4종의 β-glucosidase활성은 Fig. 9에 나타낸 바와 같이 Y-12 균주가 556 mU/mL으로 가장 높은 활성을 나타내었고, Y-1, Y-3 균주에서도 각 각 385, 254 mU/mL 그리고 Y-11 균주는 87 mU/mL으로 가장 낮은 활성을 나타내었다. Saha와 Bothast (1996)는 Candida peltata 배양액으로부터 배양액 mL당 117 mU의 β-glucosidase 활성을 확인하였고, Leite, Gomes, Silva (2007)는 불완전 균류인 Aureobasidium pullulans를 이용하여 다양한 탄소원에서 β-glucosidase을 측정한 결과, wheat bran에서 1.0, soy bran 0.15, soy peel 0.2, corncob 0.35, corn straw 0.1 U/mL의 활성을 나타낸다고 보고한 것과 비교할 때, 본 분리균의 효소 활성이 비교적 우수함을 확인하였다. 효소 활성이 확인된 분리 균주는 PDY agar에 사면배양하여 4℃에서 보관하고, 별도로 20% glycerol을 함유하는 보존액에 현탁하여 -70℃에서 동결 보존한 후 진피 발효 실험에 이용하였다.

Fig. 8. p-nitrophenol의 표준 검량선을 이용한 효소활성 산출(Standard curve for the determination of p-nitrophenol)

Fig. 9. 분리 균주의 β-glucosidase 활성(β-glucosidase activity of isolated microorganisms. Data values were expressed as mean±SD of triplicate experiments.)

3.2 선발균주 생물전환능 확인

3.2.1 생물전환 플라보노이드 확인

β-glucosidase 활성이 확인된 선별균의 진피 플라보노이드 생물전환능 확인은 진피발효 배지(진피 분말 1.5 g, 증류수 30 mL)를 이용하여 검토하였다. 발효 종료 후 발효액을 12,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 상등액을 제거하고 남은 발효 진피 pellet에 주정(95% EtOH) 30 mL를 첨가하여 70℃에서 3시간 환류추출 한 후, 여과하고 총량을 30 mL로 정용한 추출액을 HPLC를 이용하여 플라보노이드 함량을 분석하였다. 그 결과 대조구인 비발효 생진피 추출물에서는 검출되지 않은 aglycone 플라보노이드 화합물인 naringenin과 hesperetin이 검출되는 것을 확인하였고, 가장 활성이 우수한 Y-12균의 발효 추출물을 분석한 크로마토그램은 Fig. 10과 같다.

Fig. 10. Y-12균의 진피 발효 추출물을 분석한 크로마토그램[Bioconversion of citrus peel flavonoids by fermentation. Isolated microorganism Y-12 was fermented at 28℃, 150 rpm for 3 days. Mobile phase: methanol/0.5% acetic acid(15:85∼65:35, v/v), column: Sunfire C18 5 μm, flow rate: 1.0 mL/min, detection: UV at 280 nm.]

분리균 4종 모두에서 생물전환 활성이 나타났으며, Table 7에 나타낸 바와 같이 특히 Y-12 균주가 naringenin 47.5 μg/mL, hesperetin 51.3 μg/mL로 총 98.8 μg/mL의 aglycone 플라보노이드를 생성하여 가장 높은 전환율을 보였다. 그리고 Y-1과 Y-3 균주도 각각 43.9, 42.2 μg/mL 그리고 38.3, 45.6 μg/ mL으로 유사한 생물전환 활성을 보였으나, Y-11균주는 naringenin이 28.8 μg/mL, hesperetin이 42.9 μg/mL로 다른 균주와는 달리 hesperetin에 비해 naringenin의 함량이 특이적으로 낮게 나타났다. 분리균의 생물전환 활성은 Fig. 9의 결과인 분리균의 β-glucosidase활성과 동일한 경향으로 나타나 Y-12 균주가 가장 전환능이 우수하였고, Y-11 균주가 전환능이 가장 약한 것으로 보아 β-glucosidase에 의해 glycoside 플라보노이드가 전환되어 aglycone로 전환된 것으로 판단된다. 이 결과를 바탕으로 생물전환능이 가장 우수한 Y-12 균주를 최종적으로 생물전환 균주로 선택하였다.

Table 7. 분리 균주로부터 생물전환된 플라보이드 함량(Contents of the bioconverted flavonoid from isolated microorganisms)

Shimoda 등(2010)은 식물세포인 Eucalyptus perriniana를 이용하여 생물전환을 수행한 결과 naringin으로부터 naringenin 7-O-β-D-glucopyranoside, naringenin 그리고 naringenin 5,7-O-β-D-diglucopyranoside 등 7종류의 naringin 유도체와 naringenin 으로부터 naringenin 4-O-β-D-glucopyranoside, naringenin 5-O-β-D-glucopyranoside 등 7종류의 생물전환 유도체를 확인하였는데, 이는 플라보노이드에 결합된 당의 결합위치와 종류를 변화시켜 일어난 결과로 당쇄 부분을 제거한 본 연구에 비해 더욱 다양한 종류의 플라보노이드 화합물이 만들어짐을 알 수 있었다. 그리고 Chebil 등(2006)은 lipase, carboxyl-esterase 등의 효소를 이용한 acylation을 통해 quercitrin, rutin 등 다양한 플라보노이드 화합물의 생물전환 결과를 보고한 바 있다. 이러한 플라보노이드의 생물전환에 대한 연구는 결합된 당의 종류와 위치에 변화를 줌으로서 일어나는 물성변화(수용성 증진)와 약리적 기능성을 향상시키고자 하는 데 그 목적이 있다. 따라서 본 연구에서도 발효 과정에서 전환된 aglycone의 당쇄에 변화를 줄 수 있는 새로운 효소의 이용 등 발효 공정에 대한 연구가 수행되어야 한다고 사료된다.

3.2.2 생물전환 플라보노이드의 UV spectrum 조사

생물전환 결과 검출된 naringenin과 hesperetin이 실제 표준물질과 동일한지 확인하기 위해 HPLC를 이용하여 UV spectrum을 조사하였다. Photo diode array (PDA) 검출기로 표준물질과 생물전환물의 UV spectrum을 비교해 본 결과, Fig. 11에 나타낸 바와 같이 표준물질에서 naringenin이 290 nm, hesperetin이 287.6 nm에서 최대 흡수파장을 나타내었고, 생물전환 결과 생성된 naringenin과 hesperetin에서도 최대 흡수파장이 290 nm, 287.6 nm로 표준물질과 동일하게 나타나 분리균의 발효에 의해 생물전환된 물질이 naringenin과 hesperetin 임을 다시 한 번 확인하였다.

생물전환된 플라보노이드뿐만 아니라 glycoside 화합물인 narirutin과 hesperidin 또한 표준물질과 동일한 UV spectrum을 나타내어 HPLC 분석에서 나타난 모든 플라보노이드가 표준물질과 일치하는 것을 확인하였다.

Fig. 11. 진피에서 생물전환된 플라보노이드의 UV spectrum 조사(UV spectrum of bioconverted flavonoid from citrus peel, UV scanning was performed on the 200∼800 nm.)

(A): 기준 플라보노이드(Standard flavonoid)

(B): 생물전환 플라보노이드(Bioconversion flavonoid)

3.3 선발균주 동정

진피 발효에서 가장 우수한 생물전환 활성을 보인 Y-12 균주를 최종 생물전환용 공시 균주로 선정하였으며, 균주의 동정은 현미경을 통한 형태학적인 특징과 18S rDNA분석을 통해 수행하였다. 분리균의 염기서열 분석은 (주)솔젠트사에 의뢰하여 rDNA를 universal primer인 ITS1 (forward), ITS4 (reverse)를 이용하여 염기서열을 분석하고, NCBI의 blast search를 통해 상동성을 조사하여 동정하였다. 그 결과 Fig. 12에 보인 바와 같이 Aureobasidium pullulans의 염기서열과 상동성 100%로 일치하여 최종적으로 Aureobasidium pullulans Y-12로 명명하였다.

Fig. 12. Y-12와 Aureobasidium pullulans의 18S rDNA 서열(Alignment of partial 18S rDNA sequence of the strain Y-12 and Aureobasidium pullulans.)

A. pullulans는 균체 외로 pullulan과 같은 중성 세포외 다당류(nutral exopolysaccharide)를 생산하는 것으로 알려져 산업적으로 이용되고 있으며 일본에서는 이 균주의 배양액을 정제하여 기능성 식품 소재로도 제품화되고 있다. A. pullulans는 불완전곰팡이의 일종으로 효모와 비슷한 생육 형태를 보여 흑효모라고도 하며 일부 균에서는 멜라닌 색소를 생성하기도 한다(Youssef, Roukas, Biliaderis 1999; Lee et al. 2009). 본 발명에서 분리된 균주 역시 Fig. 13에서처럼 Aureobasidium sp. 균주의 전형적인 생육 특징인 budding과 mycelium이 관찰되었으며, PDA 배지에서 7일간 배양한 후, 검게 변색되지 않는 것으로 보아 멜라닌 색소는 생성하지 않는 것으로 확인되었다. 뿐만 아니라 Leite, Gomes, Silva (2007)는 A. pullulans로부터 β-glucosidase를 정제하여 열 안정성을 보고한 바 있고, Li 등(1993)은 A. pullulans Y-2311-1로부터 xylanase를 정제하고 효소학적 특성을 보고하였을 뿐 아니라 tannase 생산에 대한 보고(Debdulal and Pati 2007)도 있는 등 다양한 효소 생산성이 보고되어 있다. 하지만 세포외 다당류 생산과 효소학적인 특성에 대한 연구만 수행되었을 뿐 이를 이용한 생물전환 또는 산업적 적용에 대한 연구는 수행된 바가 없다. 따라서 본 발명에서는 다양한 효소 생산능을 가지는 본 균주의 특성을 이용하여 세포외 다당류 생산과 차별화되는 새로운 산업적 적용에 대한 연구를 수행하고자 하였다.

Fig. 13. A. pullulans Y-12의 사진[Photographs of A. pullulans Y-12. A: A. pullulans Y-12 was incubated at 28℃ for 7 days on PDY medium, B: Microscope image (×400)].

3.4 생물전환을 위한 A. pullulans Y-12의 최적 발효 조건

3.4.1 탄소원에 의한 영향

공시균주의 진피 플라보노이드 생물전환에 미치는 탄소원의 영향은 기본배지인 진피발효 배지에 탄소원으로 arabinose, fructose, galactose, glucose, glycerol, lactose, maltose, soluble starch, sucrose, xylose를 각각 2%되게 첨가하여 28℃, 150 rpm에서 72시간 발효한 후, 생성된 aglycone 플라보노이드인 naringenin과 hesperetin의 함량을 분석하였다. Table 8에 나타낸 것처럼 arabinose를 첨가했을 때 naringenin이 53.3 μg/mL, hesperetin이 51.7 μg/mL로 가장 높게 나타났으나, 탄소원을 첨가하지 않은 무첨가구에서도 naringenin이 52.0 μg/mL, hesperetin이 51.3 μg/mL로 거의 유사한 수준의 전환율을 나타내었다. 그 외의 모든 탄소원에서는 탄소원을 첨가하지 않았을 때 보다 오히려 전환율이 낮았으며 특히 galactose를 첨가하였을 경우에는 naringenin과 hesperetin 생성량이 탄소원을 첨가하지 않았을 때 보다 약 40% 정도 감소되는 것으로 확인되었다.

이는 진피 자체에 sucrose와 fructose 등의 당류가 풍부하게 존재하여 A. pullulans Y-12의 생육에 필요한 탄소원이 원료 그 자체에 충분하게 있을 뿐 아니라 첨가된 당류를 먼저 이용하기 때문에 상대적으로 효소 활성이 낮아졌기 때문인 것으로 사료되며, 또 탄소원을 추가로 첨가하지 않을 경우 생육을 위해 진피로부터 탄소원을 확보하고자 β-glucosidase를 포함한 각종 당 분해 효소의 활성이 높아지기 때문일 것으로 생각된다. 따라서 탄소원은 추가로 첨가하지 않는 것이 유리하다 판단되었으며 탄소원의 농도에 대한 영향은 생략하였다.

Table 8. A. pullulans Y-12에 의한 진피의 생물전환에 대한 탄소원의 영향(Effect of carbon sources on bioconversion of citrus peel by A. pullulans Y-12)

3.4.2 질소원 및 질소원 농도의 영향

진피에는 미생물 생육에 필요한 탄소원은 충분한 양이 있으나 단백질 함량은 1% 미만으로 미생물의 생육 및 효소 단백질 합성에 필요한 질소원 함량은 아주 낮다. 질소원의 첨가에 따른 생물전환의 영향을 비교하기 위해 casitone, soytone 등 유기질소원과 (NH₄)₂SO₄등 무기질소원을 발효 배지에 0.2% 되게 첨가하여 전환된 aglycone 플라보노이드 함량을 조사하였다.

Table 9에서처럼 무기질소원보다는 유기질소원을 첨가하였을 때 전환된 물질의 함량이 높게 나타났으며, 특히 casitone 첨가군에서 naringenin이 66.6 μg/mL, hesperetin이 59.4 μg/mL로 무첨가군에 비해 약 27% 정도 증가되어 가장 우수하였다.

최적 질소원으로 선정된 casitone의 첨가 농도를 설정하기 위해 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1% 되게 casitone을 첨가하여 비교해 본 결과, Table 10에서처럼 0.8% 까지 casitone 함량이 증가할수록 전환물의 함량 또한 증가하는 경향을 나타내었고, 그 이상에서는 비슷한 수준을 유지하였다. 그리고 특이적인 것은 질소원의 함량이 증가됨에 따라 naringenin 보다는 hesperetin의 함량이 증가하였다. 따라서 최적 질소원 첨가 농도는 naringenin 67.6 μg/mL, hesperetin 75.7 μg/mL를 생성한 casitone 0.8%로 확인되었다.

Table 9. A. pullulans Y-12에 의한 진피의 생물전환에 대한 질소원의 영향(Effect of nitrogen sources on bioconversion of citrus peel by A. pullulans Y-12)

Table 10. A. pullulans Y-12에 의한 진피의 생물전환에 대한 casitone 질소 농도의 영향(Effect of nitrogen concentration on bioconversion of citrus peel by A. pullulans Y-12)

3.4.3 발효 온도 및 교반 속도에 의한 영향

진피 플라보노이드의 생물전환에 미치는 물리적 조건인 배양온도, 진탕속도, 그리고 배양시간에 따른 영향을 조사 하였다. 배양 온도에 따른 영향을 조사하기 위해 진피 발효 기본배지에 0.8% casitone을 첨가하여 선정된 탄소원과 질소원을 첨가한 후 15, 20, 25, 28, 30, 35, 40℃로 온도를 달리하여 3일간 발효한 결과, Table 11에서 보인바와 같이 naringenin의 경우에는 25℃에서 76.4 μg/mL로 가장 높았고, hesperetin의 경우는 20℃와 25℃에서 각 각 88.8, 88.5 μg/mL로 큰 차이가 없었다. 발효 최적 온도는 두 전환물의 합이 164.9 μg/mL로 가장 높게 나타난 25℃로 확인되었고, 20℃ 역시 154.5 μg/mL로 높은 전환율을 나타내었다. 그리고 30℃ 이상에서는 전환율이 급격하게 감소되어 35℃에서는 naringenin이 검출되지 않고 hesperidin만이 11.3 μg/mL로 소량 전환되었으며, 40℃에서는 naringenin과 hesperetin 모두 검출되지 않았다. 이는 A. pullulans를 30℃에서 배양하여 L-fructose를 L-sorbitol로 전환하였다는 보고(Sasahara and Izumori 2005)와, Seo 등(2006)이 A. pullulans HP-2001을 30℃에서 배양하여 세포외 다당류인 pullulan을 연속생산 하였다고 보고한 것과 비교할 때, 본 발명에서 분리된 균주는 일반적인 미생물의 생육 온도보다 다소 낮은 온도에서 생물전환 활성이 높게 나타남을 알 수 있었다.

진탕배양시 회전 속도에 의한 영향은 진탕배양기의 회전 속도를 0, 50, 100, 150, 200 rpm으로 하여 발효를 수행하였으며, 초기 조건으로 설정한 150 rpm에서 naringenin이 123.1 μg/mL, hesperetin이 66.1 μg/mL로 두 전환물의 합이 189.2 μg/mL로 가장 높았으며, 0에서 200 rpm 전 구간에서 비교적 양호한 활성을 유지하는 것으로 나타났다(Table 12).

Table 11. A. pullulans Y-12에 의한 진피의 생물전환에 대한 발효온도의 영향(Effect of fermentation temperature on bioconversion of citrus peel by A. pullulans Y-12)

Table 12. A. pullulans Y-12에 의한 진피의 생물전환에 대한 교반 속도의 영향(Effect of agitation speed on bioconversion of citrus peel by A. pullulans Y-12)

3.4.4 발효 시간에 의한 영향

생물전환에 미치는 발효시간의 영향은 배양 기간을 1, 3, 5, 7, 9일로 조정하여 수행하였다. Table 13에서처럼 3일째 naringenin이 114.8 μg/mL, hesperetin이 65.9 μg/mL로 두 aglycone 플라보노이드의 합이 180.7 μg/mL로 가장 높은 것으로 나타났고, 특히 발효 1일째에서도 146.5 μg/mL이 생성되어 발효 초기에 생물전환 반응이 빠르게 일어나는 것으로 확인되었다. 이는 초기 접종량이 5%로 충분한 양이 접종되어 균의 증식이 발효 초기에 급격하게 일어나기 때문인 것으로 생각된다. 그리고 발효 기간이 길어질수록 전환물의 생성량은 급격하게 감소되어 9일째에는 naringenin이 70.9 μg/ mL, hesperetin이 14.1 μg/mL로 아주 낮게 나타났고, 특히 배양기간이 길어질수록 naringenin 보다는 hesperetin의 함량이 급격하게 감소되는 경향을 나타내었다.

Table 13. A. pullulans Y-12에 의한 진피의 생물전환에 대한 발효기간의 영향(Effect of fermentation period on bioconversion of citrus peel by A. pullulans Y-12)

3.4.5 A. pullulans Y-12의 생육 곡선

최근 발효 한약에 대한 연구가 많이 진행되면서 미생물의 증식에 의해서 일어나는 발효과정과 미생물의 증식 없이 효소처리에 의한 발효(가수분해) 과정을 구분 없이 모두 발효라고 하여 명확한 용어의 사용이 필요하다. 본 발명에서도 A. pullulans Y-12 균주가 발효 과정에서 실제로 증식이 일어나면서 발효가 진행되는지 확인하기 위해 최적의 조건에서 발효하면서 12시간 마다 발효액 중의 생균수를 측정하여 생육곡선을 확인하였다. Fig. 14에 나타난 바와 같이 발효 초기 24시간 내에 균체 증식이 활발하게 일어난 것을 알 수 있었고, 이후 48시간까지는 서서히 증가하다가 48시간 이후부터는 소폭 감소되는 경향을 나타내었다.

발효 시 초기 접종량이 5%로 적지 않은 양이기 때문에 유도기(lag phase) 기간이 아주 짧았고, 곧 바로 대수증식기(log phase)로 진입하는 모습을 나타내었다. 이 결과로 발효 기간이 생물전환에 미치는 영향에서 발효 1일째 상당량의 aglycone 플라보노이드가 생성된 것은 발효 초기에 균체의 증식이 활발하기 때문이라는 것을 확인할 수 있었다.

Fig. 14. A. pullulans Y-12의 생육 곡선(Growth curve of A. pullulans Y-12)

3.5 발효 진피 추출물이 3T3-L1 지방세포의 분화에 미치는 영향

3.5.1 시료 제조 및 플라보노이드 함량

생진피 추출물과 발효 진피 추출물의 항비만 효과에 대한 효능을 비교하기 위해 지방전구세포인 3T3-L1 cell을 이용하였다. 먼저 fermented citrus peel extract powder (FCP)와 fermented citrus peel culture broth powder (FCB) 그리고 citrus peel extract powder (CP)의 추출 수율을 비교해 본 결과, Table 14에 나타낸 바와 같이 CP의 수율은 원료 50 g을 사용하여 17.55 g의 동결건조 분말을 얻어 35.1%의 수율을 나타내었고, 발효 진피의 경우는 상등액을 분무건조 한 FCB가 13.5 g, 발효 진피 pellet으로부터 추출된 FCP가 3.87 g으로 각각 27.0, 7.74%의 수율을 나타내었다.

그리고 FCB와 FCP 수율의 합계가 34.74%로 CP의 수율인 35.1%와 거의 동일하게 나타났는데, 이는 발효되면서 소비된 당분을 감안하면 발효에 의해 플라보노이드와 기타 다른 성분의 추출율이 높아졌기 때문으로 사료된다.

Table 14. 발효 후의 추출 수율 비교(Comparison of extraction yield after fermentation)

분말화 된 시료의 플라보노이드 함량을 분석한 결과는 Table 15에 나타낸 바와 같이 FCP에서 생물전환된 naringenin과 hesperetin은 각 각 32.8, 21.5 mg/g powder를 포함하여 분말 단위 g 당 154.8 mg의 플라보노이드를 함유하여 CP에 비해 약 4.6배 정도 높은 함량을 가진 것으로 확인되었다. 그리고 FCB에는 플라보노이드 총 함량이 1.23 mg/g powder로 극히 소량만이 존재하는 것으로 나타났다. 추출 수율과 각 플라보노이드의 함량을 근거로 생진피 원료 50 g으로부터 얻어진 총 플라보노이드 함량을 계산해 보면, FCP에서 0.6 g, FCB에서 0.02 g, 그리고 CP에서 0.59 g으로 생진피를 추출할 때 보다 오히려 발효했을 때 더 많고 다양한 플라보노이드를 얻을 수 있음을 확인할 수 있었다. 뿐만 아니라 CP에서는 검출되지 않는 naringenin과 hesperetin이 각각 32.8, 21.5 mg/g powder로 총 플라보노이드 함량의 35% 정도를 차지하였다. 그리고 aglycone 플라보노이드 화합물의 분자량이 glycoside 플라보노이드 분자량의 절반 정도인 것을 감안한다면 상당량이 aglycone로 전환이 되었음에도 불구하고 FCP의 총 플라보노이드 함량이 높은 것은 발효과정에서 생성되는 다양한 효소의 작용으로 진피의 조직이 분해되면서 훨씬 더 많은 플라보노이드가 추출되는 효과를 얻었기 때문인 것으로 사료된다.

Table 15. 진피 발효 전후의 주요 플라보노이드 함량(Major flavonoid contents of non-fermentation and after fermentation from citrus peel)

3.5.2 세포독성 조사

발효 진피와 생진피 추출물의 항비만 효과를 확인하기 위해 먼저 각 시료의 세포 처리 농도를 결정하였다. MTT assay를 통해 cell viability를 조사해 본 결과, Fig. 15에 나타낸 바와 같이 FCP군이 50∼500 μg/mL 농도 범위에서 생존률 85% 정도를 유지하여 세포 독성에 큰 영향을 주지 않는 것으로 나타났다. FCB 군에서는 전체 농도 구간에서 생존률이 100% 이상으로 나타나 독성이 전혀 없는 것으로 확인되었고, CP군 역시 모든 구간에서 95% 이상의 생존률을 나타내는 것으로 확인되었다. FCP군에서 약하나마 세포독성이 관찰되는 것은 상대적으로 플라보노이드의 함량이 높기 때문인 것으로 추측되며, 이상의 결과를 바탕으로 최종 처리 농도를 25, 50 μg/mL로 정하였다.

Fig. 15. 3Ts-L1 세포의 생존에 대한 진피 추출물의 영향 [Effect of citrus peel extract on cell viability of 3T3-L1 cells. CP: citrus peel extract powder, FCP: fermented citrus peel extract powder, FCB: fermented citrus peel culture broth powder. Data values were expressed as mean±SD of triplicate experiments.]

3.5.3 세포분화 및 oil red O staining

비만은 preadipocyte가 adipocyte로 분화되는 지방세포의 이상발달이라고도 하는데, 지방세포에 의한 지방의 축적은 지방세포 수의 증가나 지방세포 크기가 증가됨에 따라 증상이 심해지는 것으로 알려져 있다. 인체에 지방을 축적하는 세포는 hepatocyte(단기축적)와 adipocyte(장기축적)로 알려져 있으나 비만과 관련이 있는 것은 주로 adipocyte로 알려져 있다.

Preadipocyte는 적절한 환경이 되면 분화되어 세포내 지방을 축적하는데 이때 adipocyte의 크기와 수의 증가가 비만의 정도를 결정짓는 요인 중 하나로 인식되고 있다. 따라서 preadipocyte의 분화를 억제하는 물질은 비만을 예방하는데 효과적이라고 알려져 있다(Kim et al. 2010).

본 발명에서도 발효 진피 추출물의 지방세포 분화 억제능을 확인하기 위해 preadipocyte 상태인 3T3-L1 세포를 adipocyte로 분화시키면서 FCP, FCB, CP 시료를 각각 25, 50 μg/mL 농도로 세포에 처리한 후, oil-red O staining을 통하여 지방축적을 비교해 본 결과, Fig. 16에서 보는 것처럼 adipocyte에서 선명한 붉은색을 나타내어 세포의 분화가 정상적으로 일어나 충분한 지방이 축적된 것을 확인할 수 있었다. 그리고 모든 시료에서 농도 의존적으로 adipocyte에 비해 지방 축적이 낮아지는 것을 육안으로 확인할 수 있었다. 특히 FCP군의 경우는 50 μg/mL 농도에서 대조구인 pre- adipocyte와 유사하게 보일 정도로 지방 축적이 현저히 감소되었다. CP 첨가군에서도 adipocyte 보다는 지방 축적이 다소 감소된 것을 확인할 수 있었다. 좀 더 자세한 관찰을 위해 현미경을 통해 세포를 관찰해 본 결과, Fig. 17에서처럼 adipocyte는 축적된 지방에 의해 붉게 염색된 부분이 확실하게 나타났으나, FCP 첨가군 에서는 시료 농도 25, 50 μg/mL 모두에서 preadipocyte처럼 붉게 염색된 부분이 거의 관찰되지 않았고 CP첨가군 역시 adipocyte보다는 약하게 나타났다. 대조군인 adipocyte의 평균 흡광도 값을 기준으로 시료의 흡광도 값을 백분율로 나타내어 지방 축적율을 계산해 본 결과, Fig. 18에서처럼 지방 축적율이 FCP〉CP〉FCB 순으로 낮게 나타났다. 특히 FCP군에서 시료 농도를 25, 50 μg/mL로 처리했을 때 지방 축적율이 각각 44, 46%로 동일한 농도에서 지방 축척율 70∼80% 정도를 나타낸 CP군과 FCB군에 비해 월등히 낮은 지방 축적율을 나타내어 비만세포의 지방 축적을 억제시키는 효과가 높은 것으로 확인되었으며, 모든 시료에서 처리 농도에 따른 영향은 거의 나타나지 않아 25 μg/mL 처리로도 충분할 것으로 생각된다. 이상의 결과는 옻나무 추출물로부터 정제한 fisetin을 동일한 세포에 20 μM 농도로 처리하였을 때 지방 축적률이 40% 정도 감소되었다고 보고한 Kim 등(2010)의 결과와 chitosan oligosaccharide를 0.5∼4.0 mg/mL 농도로 처리하였을 때, 1 mg/mL에서 약 50%, 4 mg/mL 농도에서 약 30% 정도의 지방축적률을 나타내었다고 보고(Cho et al. 2008)한 것과 비교해 볼 때 25 μg/mL 이라는 낮은 농도로도 44% 정도의 축적률을 나타내어 발효 진피 추출물의 지방 축적 저해 효과가 높은 것으로 사료된다. 백색지방 조직(white adipose tissue)은 고등동물에 중요한 에너지원이지만 과잉 생성되면 비만이 되어 2형 당뇨병과 고혈압, 동맥경화와 같은 주요 대사성 질환의 원인이 될 수 있으므로 발효 진피 추출물의 이러한 효능을 이용하여 기능성 소재로 개발할 가치가 충분할 것으로 판단된다.

Fig. 16. oil-red O staining을 통하여 지방축적을 비교해 본 결과(Result of oil-red O stain in 3T3-L1 treated with citrus peel extracts. FCP: fermented citrus peel extract powder, CP: citrus peel extract powder, FCB: fermented citrus peel culture broth powder.)

Fig. 17. 발효 진피 추출물로 처리된 preadipocyte 3T3-L1 세포의 사진[Photographs of 3T3-L1 preadipocyte treated by citrus peel extract.

A: preadipocyte, B: adipocyte, C: FCP (25 μg/mL), D: FCP (50 μg/ mL), E: CP (25 μg/mL), F: CP (50 μg/mL), G: FCB (25 μg/mL), H: FCB (50 μg/mL). Magnification ×200.]

Fig. 18. 대조군인 adipocyte의 평균 흡광도 값을 기준으로 시료의 흡광도 값을 백분율로 나타내어 지방 축적율을 계산해 본 결과(Effect of citrus peel extracts on lipid accumulation during 3T3-L1 adipocyte differentiation. CP: citrus peel extract powder, FCP: fermented citrus peel extract powder, FCB: fermented citrus peel culture broth powder. Data values were expressed as mean±SD of triplicate experiments.)

3.5.4 Triglyceride 함량

중성지방(TG; Triglyceride)은 3T3-L1 지방전구세포로부터 지방세포로 분화되는 단계에서 3가지 과정에 의해 생성된다. 첫째로 세포 내로 유입되는 포도당의 대사과정, 둘째로는 lipoprotein lipase에 의해 분해되어 유입된 모노글리세롤과 지방산, 그리고 세포내 de novo 지방산합성 과정 등으로 인해 종합적으로 세포내에 중성지방이 생성되어 분화 마지막 단계까지 계속적으로 지방구를 형성하게 된다(Cha et al. 2010). 발효 진피 추출물 첨가에 따른 중성지방의 함량 변화를 알아보고자, 9일간의 분화 및 지방축적 기간 동안 세포에 FCP, FCB, CP 시료를 25 μg/mL 농도로 처리하였다. 그 결과 CP와 FCB 군의 중성지방 함량은 각각 415, 433 nM/mg으로 control인 adipocyte에 비해 약 5∼10% 정도 낮은 함량을 나타내었으나, FCP군은 동일한 농도에서 control 대비 90%정도 낮은 47 nM/mg의 TG 함량을 나타내어 preadipocyte와 비슷한 수준을 유지하는 것으로 확인되었다(Fig. 19). 이는 Table 15에 나타낸 바와 같이 FCP군이 다른 시료 보다 플라보노이드 함량이 4배 이상 높고 또 다른 시료에는 거의 존재하지 않는 naringenin과 hesperetin이 포함되었기 때문인 것으로 생각된다. Choi 등(2010)은 포도씨 탈지박 추출물을 100 μg/mL 농도로 처리하였을 때, 중성지방 함량이 약 80% 정도 감소하였다고 보고하였고, Cha 등(2010)은 수세미오이 메탄올 추출물을 1,000 μg/mL 처리하였을 때 중성지방 함량이 약 20% 정도 감소한다고 보고하였는데, 본 실험에서는 25 μg/mL의 적은 농도로도 약 90% 정도의 감소 효과를 보여 미량으로도 좋은 효과를 나타내는 것으로 사료된다.

Fig. 19. 3T3-L1이 지방세포로 분화하는 과정에서 중성지방에 대한 진피 추출물의 영향 (Effect of citrus peel extracts on triglyceride contents during 3T3-L1 adipocyte differentiation. CP: citrus peel extract powder, FCP: fermented citrus peel extract powder, FCB: fermented citrus peel culture broth powder. Data values were expressed as mean±SD of triplicate experiments.)

3.5.5 Glycerol-3-phosphate dehydrogenase (GPDH) 활성

Gglycerol 3-phosphate dehydrogenase (GPDH)는 NAD를 보효소로 하여 dihydroxyacetone phosphate에서 glycerol-3-phosphate를 생성하는 효소로 preadipocyte에서 adipocyte로 분화될 때 활성이 급격히 증가한다. 따라서 9일간의 분화 및 지방축적 기간 동안 1.0×10⁶ cell/well로 seeding한 3T3-L1 cell에 CP, FCP, FCB 시료를 25 μg/mL 농도로 처리하여 세포 내에서 증가되는 GPDH 활성에 대해 알아 본 결과, Fig. 20에서처럼 대조군인 시료 무처리 adipocyte에서 GPDH 활성은 0.0428 unit/min/mg protein이었으나, FCP군에서는 0.0012 unit/min/mg protein의 활성을 나타내어 대조구에 비해 95% 이상 감소되어 효과가 가장 우수하였다. 그리고 발효 하지 않은 진피 추출물인 CP군에서도 0.0309 unit/min/mg protein으로 대조구에 비해 28% 정도 낮게 나타났다. 하지만 FCB에서는 0.0596 unit/min/mg protein으로 GPDH 활성이 오히려 증가되는 경향을 보였다. Shin 등(2008)은 초콩 추출물 20 μL를 처리하였을 때 GPDH 효소 활성이 최고 59% 정도 감소되었다고 보고하였고, Jeon 등(2004)은 홍국 추출물을 0.5 mg/mL 농도로 처리 했을 때 GPDH 효소 활성이 50% 정도 감소한다고 보고한 것과 비교하면 발효진피 추출물의 효소 저해 효과는 아주 높은 것을 알 수 있다. GPDH는 dihydroxyacetone phosphate를 glycerol-3- phosphate로 전환을 촉매하여 중성지방의 생합성 과정에 중요한 역할을 하는 효소로 세포 분화의 지표가 되며 GPDH의 활성이 저해된다는 것은 지방세포로의 분화를 억제시킬 수 있다는 것을 의미한다. 따라서 세포의 지방축적과 중성지방 함량의 변화 그리고 GPDH의 활성 변화 등을 종합해 볼 때 발효를 하지 않은 진피 추출물 자체에도 in vitro 상에서 지방 축적을 저해하는 효과를 가지지만, 발효를 통해 플라보노이드의 함량을 높이고 체내 흡수가 쉬운 aglycone 플라보노이드를 생성함으로써 기존의 진피 추출물 보다 더욱 우수한 효능을 나타낼 수 있다는 것을 확인할 수 있었으며, 향후 기능성 소재로 개발 가능성이 충분할 것으로 생각된다. 그러나 플라보노이드 함량이 극히 낮은 FCB 군은 유의적 효과를 가지지 못하여 이후 실험에서 더 이상 사용하지 않았다.

Fig. 20. 3T3-L1이 지방세포로 분화하는 동안 GPDH 활성에 대한 진피 추출물의 영향 (Effect of citrus peel extracts on glycerol-3-phosphate dehydrogenase during 3T3-L1 adipocyte differentiation. CP: citrus peel extract powder, FCP: fermented citrus peel extract powder, FCB: fermented citrus peel culture broth powder. Data values were expressed as mean±SD of triplicate experiments.)

3.6 HIT-15 cell의 회복능 및 인슐린 분비 개선 효과

3.6.1 세포독성

2형 당뇨병의 병인은 말초조직의 인슐린저항성과 췌장의 β-cell 기능저하로 설명되는데, β-cell 기능저하의 정확한 기전은 알려져 있지 않지만 만성적인 고혈당, 혈중 유리 지방산의 증가, 아밀로이드 폴리펩타이드 그리고 유전적 요인 등이 가설로 제기되고 있다. 만성적인 고혈당에 의한 비가역적인 β-cell 기능저하를 당독성(glucose toxicity)이라고 하는데, 고농도 포도당에 의한 산화적 스트레스의 증가가 원인인 것으로 알려져 있다. Deoxy ribose(dRib)는 glucose에 비해 환원력이 크기 때문에 단시간에 β-cell에 산화적 스트레스를 유발할 수 있어 in vitro 연구에서 glucose 대신 당독성 연구에 효과적으로 이용될 수 있다(Koh et al. 2005; Koh et al. 2007).

CP와 FCP가 deoxyribose 노출로 산화적 손상이 유도된 HIT-T15 세포에서 세포 회복능과 인슐린 분비능의 개선에 효과가 있는지를 조사하기 위해 MTT assay를 수행하였다. Fig. 21에 나타낸 바와 같이 시료를 첨가하지 않은 대조구와 비교해 CP의 경우 1 mg/mL 농도에서도 97% cell viability를 나타내어 세포 독성 효과는 관찰 되지 않았다. 그러나 FCP 경우 0.5 mg/mL에서는 대조구 생육의 75%로 약한 세포 독성이 확인되었고, 1 mg/mL에서는 생존률 10%이하로 독성이 있는 것으로 나타나, 생존률 94%로 독성이 나타나지 않는 농도인 0.1 mg/mL 이하를 시료 처리 농도로 설정하였다. 이러한 세포 독성은 FCP가 CP 보다 플라보노이드 함량이 높으며 생물전환된 naringenin과 hesperetin 또한 상당량 포함하고 있기 때문인 것으로 사료된다.

Fig. 21. HIT-T15 세포 회복능에 대한 진피 추출물과 진피 발효 추출물의 영향 (Effect of citrus peel extract and fermented citrus peel extract on cell viability of HIT-T15. CP: citrus peel extract powder, FCP: fermented citrus peel extract powder. Data values were expressed as mean±SD of triplicate experiments.)

3.6.2 고농도 당 노출에 의해 손상된 HIT-T15 cell의 회복능에 미치는 진피 발효 추출물의 영향

3.6.2.1 Deoxyribose 처리 농도 설정

고혈당(Hyperglycemia) 상태가 지속적으로 유지되면 당독성에 의해 비가역적으로 세포 손상이 일어나는데, 이는 고농도의 glucose가 존재하게 되면 glucose 산화과정에서 생기는 ROS에 의해 β-cell의 기능장애가 일어나기 때문이다. 특히 2형 당뇨 질환이 나타나기 전 pre-diabetes 상태에서는 고혈당증이 일어나고 이때 β-cell의 기능은 50% 수준까지 저하되게 된다.

Deoxyribose를 이용하여 고혈당 산화스트레스를 유도하기 위해 HIT-T15 cell의 50%를 사멸시킬 수 있는 농도를 결정하였다. Deoxyribose를 10∼60 mM의 농도로 HIT-T15에 처리하여 무처리구를 대조구로 하여 세포생존율을 MTT 법으로 조사한 결과, Fig. 22에서처럼 처리 농도가 높아짐에 따라 세포 생존율은 감소하여 60 mM에서는 21.89%로 측정되었다. Deoxyribose 처리 농도에 따른 세포 생존율의 상관관계를 조사한 결과 생존률 50%인 IC₅₀ 농도는 38.12 mM로 고혈당 산화적 스트레스 유도를 위하기 deoxyribose의 처리농도를 38 mM로 결정하였다.

Fig. 22. HIT-T15 세포에서의 Deoxyribose 처리 농도별 생존률(Effect of cell viability by various concentrations of deoxyribose in HIT-T15 cells.)

3.6.2.2 진피 발효 추출물에 의한 HIT-T15 세포 회복능 조사

Fig. 22의 결과를 기반으로 하여 IC₅₀ 농도인 38 mM deoxyribose를 처리한 HIT-T15 세포에 FCP와 CP를 처리하여 세포 회복능을 조사하였다. Fig. 23에서 보인 바와 같이 무처리구와 비교시 deoxyribose를 처리한 HIT- T15 cell에서는 세포 생존률이 54%로 감소되었으나, 각 시료 처리(0.01∼0.1 mg/mL)에 의해 산화적으로 손상이 된 세포가 77.76∼82.58%의 생존률을 보여 세포 회복능을 있는 것을 확인할 수 있었다. FCP와 CP간의 차이는 크지 않았으나 CP의 경우 0.025 mg/mL 농도에서 생존률 90%로 회복능이 가장 우수하였고, FCP에서는 보다 낮은 농도인 0.01 mg/mL에서 동일하게 90%의 생존률을 나타내어 CP 보다 우수하였다. 0.025 및 0.1 mg/mL처럼 상대적으로 높은 농도에서는 CP가 회복능이 좋았지만, 0.01 mg/mL의 낮은 농도에서는 FCP가 우수한 회복능을 나타내어 FCP가 소량으로도 좋은 효과를 가지는 것을 알 수 있었다.

Fig. 23. 진피 추출물과 진피 발효 추출물에 의한, deoxyribose로 처리된 HIT-T15 세포의 회복능에 대한 영향 조사 [Effect of cell viability by citrus peel extract and fermented citrus peel extract in HIT-T15 cells treated by deoxyribose. Normal was treated with DMSO, and control was added DMSO and 38 mM deoxy ribose(IC₅₀). Citrus peel extract and fermented citrus peel extract were pre incubated for 1 hr at 37℃ before treatment of deoxyribose in HIT-T15. CP: citrus peel extract powder, FCP: fermented citrus peel extract powder. Data values were expressed as mean±SD of triplicate experiments.]

3.6.3 발효 진피 추출물이 인슐린 분비능에 미치는 영향

β-cell에서 발효 진피 추출물의 인슐린 분비능 개선 효과를 조사하기 위해 deoxyribose으로 손상을 일으킨 HIT-T15의 cell viability와 함께 인슐린 분비량을 조사하였다. Fig. 24에서 보는 바와 같이 deoxyribose만 처리한 control의 인슐린 생산은 452 μg/mg protien으로 정상적인 HIT-T15 세포의 인슐린 생산량에 비해 68%로 수준으로 감소하였다. 그러나 시료의 첨가에 따라 인슐린의 분비능이 농도 의존적으로 회복되어 특히, FCP 0.025 mg/mL 농도에서 인슐린 생산량이 평균 757 μg/mg protien으로 정상군(661 μg/mg protien)과 유사한 수준으로 나타났다. CP의 경우 0.05 mg/mL 이상의 농도에서는 더 이상 증가 되지 않았으나 FCP의 경우 0.1 mg/mL에서 산화적 손상을 받지 않은 normal군보다도 약 2배 정도 높은 인슐린 분비능을 나타내어 FCP가 CP보다 산화적으로 손상된 췌장 세포의 생존률 회복 및 인슐린 분비 개선에 더욱 좋은 효과를 가진다는 것을 알 수 있었다.

Kim, Bae, Cha (2010)는 alloxan 처리로 β-세포 파괴를 유도한 후 돼지감자 추출물을 1.5 μL/mL 처리하였을 때 인슐린 분비량이 유의적으로 증가된다고 보고하였고, alloxan 처리로 산화적 손상을 유도하고 진피 주정 추출물을 0.125 mg/mL 농도로 처리한 결과 인슐린 분비가 약 1.6배 정도 증가한다고 보고한 Jung 등(2010)의 결과와 비교하면 발효진피 추출물이 상대적으로 우수한 효과를 가지는 것으로 사료된다.

Fig. 24. 진피 추출물과 진피 발효 추출물이, deoxyribose 처리된 HIT-T15의 인슐린 분비능에 미치는 영향 [Effect of insulin secretion by citrus peel extract and fermented citrus peel extract in HIT-T15 cells treated by deoxyribose. Normal was treated with DMSO, and control was added DMSO and 38 mM deoxyribose(IC₅₀). Citrus peel extract and fermented citrus peel extract were preincubated for 1 hr at 37℃ before treatment of 38 mM deoxy ribose in HIT-T15. CP: citrus peel extract powder, FCP: fermented citrus peel extract powder. Secreted insulin was measured with super natant from HIT-T15 cell culture. Data values were expressed as mean±SD of triplicate experiments.]

3.7 발효 진피 추출물 제조 공정 확립 및 추출물의 특성

3.7.1 플라보노이드 고함량 추출 조건 확립

감귤류에 존재하는 플라보노이드는 감귤의 과실이 성숙할수록 aglycone 플라보노이드 함량이 감소되어 한약재로 사용되는 진피에는 glycoside 플라보노이드인 narirutin과 hesperidin이 주요한 플라보노이드 성분이며, naringin과 aglycone인 naringenin과 hesperetin은 극히 미량으로 존재한다. 플라보노이드의 생리적 효능을 극대화하기 위해서는 최종 소재에 가능한 고함량의 플라보노이드를 함유하는 것이 유리할 것이다. Table 14에서 언급했듯이 단순 주정 추출물의 경우 동결건조 분말에 주요 플라보노이드의 함량이 33.6 mg/g powder로 약 3.3% 정도 수준이었다. 그리고 생물전환 균주로 분리된 A. pullulans Y-12 균주를 활용하여 발효한 후, 추출하여 제조한 동결건조 분말의 경우에는 154.8 mg/g powder로 약 15% 정도의 함량을 가져 동결건조 분말 단위 g당 약 5배 정도 함량을 증대시킬 수 있었다. 그러나 진피에서 유래된 당 성분들로 인해 동결건조시 분말의 성상이 결정상을 나타내며 외부 공기에 노출이 되면 비교적 단시간에 흡습되어 기능성 분말 소재로 사용하기가 어려운 단점이 있었다.

이러한 단점을 보완하기 위해 발효 진피 추출물의 제조 공정 개선으로 플라보노이드의 함량을 높임과 동시에 분말의 성상을 개선시키고, 건조 후 흡습이 되지 않는 방법을 검토하였다. Fig. 25에서 나타낸 것처럼 추출, 농축 후 농축물에 남아있는 당 성분을 제거하고자 플라보노이드 성분이 물에 쉽게 용해되지 않는 성질과 물에 쉽게 용해되는 당의 성질을 이용하여 주정 추출 후 최종 농축물에 소량의 물을 첨가하여 물에 용해되지 않고 침전된 부분만을 회수하여 동결건조 분말을 제조해 보았다. 진피 분말 50 g을 발효하여 각각의 방법으로 추출해본 결과, Table 16에 나타낸 것처럼 기존의 방법으로 추출하여 제조한 분말은 약 20%의 플라보노이드 함량을 가진 반면 침전 후 분리 방법을 적용했을 경우에는 약 36% 정도의 함량을 가지는 것으로 나타나 최종 분말 소재의 플라보노이드 함량이 약 1.5배 증대됨을 확인할 수 있었다. 최종 추출 수율은 침전 분리를 통해 제조한 시료가 4.5%로 낮았지만 총 플라보노이드 함량은 오히려 높게 분석되어 정제된 효과를 나타내었다. 뿐만 아니라 분말의 성상 또한 Fig. 26에서처럼 발효 하지 않은 진피를 주정으로 단순 추출하여 동결건조한 분말은 마치 설탕과 같이 알갱이 모양을 이루고 있는 반면에, 발효진피를 개선된 방법으로 추출하여 제조한 분말은 입자가 작은 가루의 형태를 가지고 있으며, 공기 중에 노출되어도 흡습이 쉽게 되지 않아 보관성과 가공성이 우수하여 기능성 소재로서 활용 가치가 뛰어나다는 것을 확인할 수 있었다.

Fig. 25. 보통의 추출방법과 개선한 추출방법에 의해 진피 분말로부터 동결건조분말을 제조하는 과정 (Manufacturing process of extract powder from crude citrus peel powder by normal and modified method.)

Table 16. 보통의 추출방법과 개선된 추출방법에 의한 플라보노이드 함량(Comparison of flavonoid contents by modified extraction method)

Fig. 26. 보통의 방법(A)과 개선한 방법(B)에 의해 제조된 진피 추출 분말의 사진 [Photographs of citrus peel extract powder manufactured by normal method (A) and modified method (B).]

3.8 발효 진피 추출물의 항비만 효과( in vivo test)

3.8.1 시료 제조 및 플라보노이드 함량

FCP와 CP를 이용하여 발효 전후의 효능 차이를 비교하기 위해 실험동물에서 비만 관련 효능을 검토하였다. 각각의 시료에 포함된 플라보노이드 함량을 조사하기 위해 동결건조 분말을 2.5 mg/mL 농도로 20% DMF를 함유한 메탄올에 용해하여 HPLC로 분석한 결과 Fig. 27에서처럼 분말의 단위 g 당 함량 차이가 크게 날 뿐만 아니라 FCP 시료에서 생물전환 결과 생성된 naringenin과 hesperetin 또한 확인하였다. 각 시료의 추출 수율과 실험동물 사료에 첨가된 시료 분말의 단위 g당 플라보노이드 조성은 Table 17에 나타낸 바와 같이 FCP가 357.6 mg/g으로 CP에 비해 약 7.8배 정도 높은 함량을 가지는 것으로 확인되었다. 그러나 추출 수율에서는 FCP가 4.5%로 CP 보다 약 1/7 정도로 낮게 나타났다. 추출 수율을 감안하더라도 발효 진피로부터 추출한 총 플라보노이드의 양이 더욱 많기 때문에 발효와 추출 과정을 통해 플라보노이드 성분이 정제된 것과 같은 효과를 얻을 수 있었다.

Fig. 27. 진피 추출 분말의 플라보노이드에 관한 HPLC 크로마토그램 [HPLC chromatogram of flavonoids from citrus peel extract powder. A: fermented citrus peel extract powder (FCP), B: citrus peel extract powder (CP). Mobile phase: methanol/0.5% acetic acid(15:85∼65:35, v/v), Column: Sunfire C18 5 μm, flow rate: 1.0 mL/min, Detection: UV at 280 nm.]

Table 17. 진피 추출물의 플라보노이드 함량과 추출 수율 비교 (Comparison of flavonoid contents and extraction yield on citrus peel extract)

3.8.2 실험동물 체중 변화 및 식이 효율

시료 투여기간 총 10주 동안 일반식이 및 고지방식이를 급여하면서 체중변화, 식이섭취량, 식이효율 측정 결과를 Table 18에 나타내었다. 실험기간 중 1일 평균 사료섭취량은 일반식이를 하는 정상군이 25.4±0.46 g으로 나타났으며, 고지방식이를 하는 대조군과 시료 투여군에서 평균 20.4 g으로 일반식이 보다 낮은 식이 섭취량을 보였다. 대조군과 시험물질 투여군 간의 식이섭취량에 있어서는 유의적인 차이를 보이지 않았으며, CP 및 FCP군 간의 식이섭취량 또한 차이가 없는 것으로 조사되었다.

CP 0.1% (CP 0.1), CP 0.5% (CP 0.5) 및 FCP 0.1% (FCP 0.1), FCP 0.5% (FCP 0.5)첨가군의 투여기간 10주 동안의 체중변화는 일반식이를 한 정상군에서의 평균체중이 505.0±25.4 g으로 대조군이 596.0±33.5 g으로 유의적인 증가를 보이는 것으로 나타났으며, 고지방식이에 의해 비만유발이 된 것으로 확인되었다. CP 및 FCP 투여에 의한 체중변화는 CP 0.1, CP 0.5, FCP 0.1 군에서 대조군과 비교하여 감소되는 경향을 나타내었으며, 특히 FCP 0.5에서는 554.9±30.2 g 으로 대조군에 비해 약 40 g 이상의 체중이 감소되어 유의적인 효과가 있음을 확인하였다.

일당증체량은 고지방식이 투여로 대조군 및 시험물질 투여군이 정상군과 비교하여 유의적인 증가현상을 보였으며, 체중 감량효과가 가장 큰 FCP 0.5 군에서 3.63±0.45 g/day로 가장 작은 증체량을 나타내었다. 또한 식이효율(FER)을 측정해 본 결과 체중증가량과 비례하여 고지방식이 투여군인 대조군 및 시험물질 투여군에서 유의적으로 높게 나타났으며, 실험군 간의 유의적인 차이는 나타나지 않았으나 CP 0.1 군과 FCP 0.5 군이 다소 낮아지는 경향을 보였다. 이상의 결과로 발효에 관계없이 진피 자체로도 체중감소 효과가 나타나지만 발효를 통해 체중 감량 효과가 더욱 뚜렷하게 나타나는 것을 확인할 수 있었다. 따라서 FCP 0.5 수준에서 고지방 식이에 의한 과도한 체중증가를 억제할 수 있을 것으로 생각된다.

Table 18. Sprague dawley rat에서의 식이섭취량, 체중, 식이효율에 대한 진피 추출물과 진피 발효 추출물의 영향 (Effect of citrus peel and fermented citrus peel extract on food intake, body weight and food efficiency ratio in SD rats)

3.8.3 혈중 glucose 함량 변화

시료 투여기간 10주 동안 일반식이 및 고지방식이를 급여하면서 혈중 glucose 함량 변화를 측정해 본 결과, Fig. 28에서처럼 CP 0.1을 제외한 모든 실험군에서 혈중 glucose 함량이 유의적인 감소 효과를 나타내었다. 대조구는 정상군에 비해 증가되어 135.3±15.6 mg/dL로 고지방 식이로 인해 비만이 유도되면서 혈당이 동반 상승한 것으로 생각된다. 실험군에서는 FCP군이 CP군 보다 감소폭이 컸으며, 특히 FCP 0.1군에서 100.6±28.7 mg/ dL로 가장 낮고, FCP 0.5군에서는 108.8±10.1 mg/dL로 FCP 0.1보다 오히려 높았다. 그리고 CP 0.1군을 제외한 모든 실험군이 121.7± 15.8 mg/dL를 나타낸 정상군보다 낮은 경향을 나타내었다. 이는 streptozotocin으로 당뇨를 유발한 rat에 키토산올리고 당을 식이에 10% 수준으로 첨가했을 때 약 16% 정도 혈당이 감소하였다고 보고(Kim and Seong 2008)한 것과 Hua 등(2010)이 rat에 soybean oligosaccharides를 300 mg/kg body weight로 투여하였을 때 대조군에 비해 약 28% 정도의 혈당이 감소되었다고 보고한 것과 비교하면 유사한 수준으로 확인되었다.

이러한 결과로 발효 진피 추출물이 실험동물에서 비만으로 인한 혈당 상승을 예방하는 효과가 있음을 확인하였다.

Fig. 28. Sprague dawley rat에서의 혈중 포도당 농도에 대한 진피 추출물과 진피 발효 추출물의 영향 [Effect of citrus peel extract and fermented citrus peel extract on blood sugar level in SD-rats. CP 0.1: citrus peel extract powder 0.1%, CP 0.5: citrus peel extract powder 0.5%, FCP 0.1: fermented citrus peel extract powder 0.1%, FCP 0.5: fermented citrus peel extract powder 0.5%. Values are represented as the mean±SD (n=8). Values with different superscripts within the each group are significantly different (p<0.05).]

3.8.4 발효 진피 추출물이 혈중 지질에 미치는 영향

10주 동안 CP 및 FCP 투여에 의한 혈중 총콜레스테롤, HDL-콜레스테롤, LDL-콜레스테롤, 중성지방(triglyceride)의 변화와 이를 근거로 동맥경화지수(AI)를 계산하였다.

먼저 혈중 총콜레스테롤 함량은 Fig. 29에 나타낸 것처럼 고지방식이로 대조군이 79.1±4.6 mg/dL로 정상군의 70.3±9.7 mg/dL보다 유의적인 증가를 나타내어 식이에 의한 상승이 유도된 것으로 확인되었으며, 시험물질의 투여로 유의적인 감소 효과가 확인되었고, 실험군에서의 효과도 FCP 0.5군이 총콜레스테롤 56.8±4.4 mg/dL로 정상군 이하 수준까지 감소되어 혈중 총콜레스테롤 저하 효과를 보였고, CP 0.1군과 CP 0.5군 역시 각각 64.6±5.4 mg/dL, 59.5±4.7 mg/dL로 감소되었다. 그러나 FCP 0.1군은 대조구 보다는 낮았으나, CP군 보다는 높은 68.5±8.0 mg/dL로 확인되어 실험동물의 개체간의 차이가 다소 발생한 것으로 사료된다. 이상의 결과는 Jeong 등(2000)이 rat에 0.1%의 플라보노이드(hesperidin, naringin, hesperetin, naringenin) 표준물질과 이와 동일한 함량의 플라보노이드를 가지는 진피 주정 추출물 투여로 총 콜레스테롤이 최고 약 35% 정도 감소되었다고 보고한 것과 비교할 때 비슷한 수준을 나타내었고, Kim 등(2003)이 rat를 대상으로 hesperetin 0.02%를 투여한 후, 총 콜레스테롤이 약 25% 정도 감소되었다고 보고한 것보다는 다소 높았다. 그리고 Bok 등(2000)은 naringin 표준물질을 0.02, 0.05% SD rat에 투여하였을 때 혈중 총콜레스테롤 함량이 유의적인 감소를 나타낸다고 보고하였으며, 동시에 콜레스테롤 생합성에 과정에서 율속효소로 작용하는 HMG-CoA reductase 활성을 최대 50%정도 감소시킨다고 보고하여 플라보노이드의 콜레스테롤 저하 작용의 주된 기작이 HMG-CoA reductase 활성 억제 때문임을 제시하였다.

Fig. 29. Sprague dawley rat에서의 총 콜레스테롤 함량에 대한 진피 추출물과 진피 발효 추출물의 영향 [Effect of citrus peel extract and fermented citrus peel extract on total cholesterol contents in SD-rats. CP 0.1: citrus peel extract powder 0..1%, CP 0.5: citrus peel extract powder 0.5%, FCP 0.1: fermented citrus peel extract powder 0.1%, FCP 0.5: fermented citrus peel extract powder 0.5%. Values are represented as the mean±SD (n=8). Values with different superscripts within the each group are significantly different (p<0.05).]

혈중 HDL-콜레스테롤 변화는 Fig. 30에서 보듯이 정상군 57.4±9.4 mg/dL와 비교하여 대조군에서 57.0±2.9 mg/dL로 나타나 고지방식이에 의한 HDL-콜레스테롤의 유의적인 변화는 관찰되지 않았다. HDL-콜레스테롤 함량은 정상군 수준의 유지 또는 증가되는 것이 이로운 것으로 알려져 있다. 그러나 시험물질 투여에 의해 총콜레스테롤 감소와 동일한 경향으로 모든 실험군이 유의적으로 감소되어 다소 부정적인 결과로 나타났으나 이는 총콜레스테롤의 감소 폭이 컸기 때문에 이와 동반되어 나타나는 현상인 것으로 사료된다.

Fig. 30. Sprague dawley rat에서의 HDL 콜레스테롤 함량에 대한 진피 추출물과 진피 발효 추출물의 영향 [Effect of citrus peel extract and fermented citrus peel extract on HDL-cholesterol contents in SD-rats. CP 0.1: citrus peel extract powder 0..1%, CP 0.5: citrus peel extract powder 0.5%, FCP 0.1: fermented citrus peel extract powder 0.1%, FCP 0.5: fermented citrus peel extract powder 0.5%. Values are represented as the mean±SD (n=8). Values with different superscripts within the each group are significantly different (p<0.05).]

혈중 LDL-콜레스테롤 변화는 정상군 9.8±2.2 mg/dL와 비교하여 대조군에서 18.4±3.7 mg/dL로 유의적으로 증가하여 고지방식이에 의해 LDL-콜레스테롤 함량이 약 2배 정도 증가된 것으로 확인되었다. Fig. 31에서 보는 것처럼 시험물질 투여에 의해 LDL-콜레스테롤 함량은 모든 실험군에서 유의적 감소 효과를 확인하였다. FCP 0.5군에서는 12.4±2.3 mg/dL로 가장 큰 감소를 나타내었으나, CP 0.1과 CP 0.5군 역시 13.0±3.6 mg/dL, 13.0±1.9 mg/dL로 LDL-콜레스테롤 함량에서는 발효에 따른 효과가 크지 않음을 알 수 있었다.

Fig. 31. Sprague dawley rat에서의 LDL 콜레스테롤 함량에 대한 진피 추출물과 진피 발효 추출물의 영향 [Effect of citrus peel extract and fermented citrus peel extract on LDL-cholesterol contents in SD-rats. CP 0.1: citrus peel extract powder 0..1%, CP 0.5: citrus peel extract powder 0.5%, FCP 0.1: fermented citrus peel extract powder 0.1%, FCP 0.5: fermented citrus peel extract powder 0.5%. Values are represented as the mean±SD (n=8). Values with different superscripts within the each group are significantly different (p<0.05).]

총콜레스테롤과 HDL-콜레스테롤의 차이를 HDL-콜레스테롤에 대한 백분비로 나타내는 동맥경화지수(AI; Atherogenic index)는 Fig. 32에서처럼 대조구가 0.39±0.05로 정상군에 비해 유의적인 증가가 확인되었으며, 실험군에서는 총콜레스테롤 감소 효과가 가장 우수하게 확인된 FCP 0.5군 보다 오히려 CP 0.5와 FCP 0.1군이 각각 0.29±0.06, 0.29±0.04로 더 낮게 확인되었다. 이는 FCP 0.5에 의해 총콜레스테롤이 감소되면서 HDL-콜레스테롤 또한 감소폭이 컸으며, 반면에 CP 0.1과 FCP 0.1은 상대적으로 HDL-콜레스테롤의 감소가 적었기 때문이다. 따라서 총콜레스테롤 감소 효과는 FCP 0.5가 AI지수는 CP 0.5와 FCP 0.1이 가장 낮게 나타났다. 콜레스테롤은 세포막형성, 호르몬 생성 등에 중요한 역할을 한다. 그러나 혈중에 고농도로 존재하는 상태를 고지혈증(hypercholesterolemia)이라 하는데, 이는 coronary heart disease(CHD)의 주요 위험인자이다. 혈중 콜레스테롤 농도를 낮추는 것이 CHD의 발병율을 낮추는 데 효과적이라는 많은 역학조사에서 얻은 결과로서 혈장 콜레스테롤을 1% 낮추면 CHD 발병율을 2% 감소시킬 수 있다고 한다(Despres et al. 2000; Chapman 2006). HDL-콜레스테롤은 말초조직으로부터 과잉의 콜레스테롤을 간으로 이동시키고 거품세포 형성을 방해하여 동맥경화의 진행과정을 늦추는 역할을 하는 것으로 알려져 있는데, 최근 동맥경화를 포함한 심혈관계질환의 예방과 치료에서 HDL-콜레스테롤의 역할에 대한 연구가 많이 이루어지고 있다(Tall 1990).

Fig. 32. Sprague dawley rat에서의 동맥경화지수에 대한 진피 추출물과 진피 발효 추출물의 영향 [Effect of citrus peel extract and fermented citrus peel extract on antherogenic index in SD-rats. CP 0.1: citrus peel extract powder 0..1%, CP 0.5: citrus peel extract powder 0.5%, FCP 0.1: fermented citrus peel extract powder 0.1%, FCP 0.5: fermented citrus peel extract powder 0.5%. Values are represented as the mean±SD (n=8). Values with different superscripts within the each group are significantly different (p<0.05).

고지방식이로 인한 혈중 중성지방의 변화는 Fig. 33에서처럼 정상군이 50.1±8.6 mg/dL인 것과 비교하여 대조군이 74.5±13.2 mg/dL로 유의적인 증가현상을 보여 식이에 의해 정상적으로 비만이 유도되었음을 확인할 수 있었다. 비만에 가장 중심적인 지표가 되는 중성지방 감소에 대한 시험물질의 효과는 CP 0.1군을 제외한 모든 시험군에서 상당히 유의적인 효과를 나타내었다. CP 0.1군은 74.0±17.2 mg/dL로 대조구와 거의 동일한 수준을 유지하였으나, 나머지 시험군에서는 정상군 수준으로 회복되었고, 특히 FCP 0.5에서는 34.6±5.5 mg/ dL로 정상군보다 낮은 수준으로 확인되었다. 중성지방은 체지방 및 비만과 밀접한 관계가 있는 것으로 알려져 있는데, 본 결과로 진피 추출물 자체로도 체중 감량 또는 혈중 지질을 개선하는 효과가 있지만 발효를 통해 향상된 효과를 확인하였고, 추가 연구를 통해 기능성 식품 소재로 활용 가능성이 있다고 사료된다.

Fig. 33. Sprague dawley rat에서의 고지방식이로 인한 혈중 중성지방에 대한 진피 추출물과 진피 발효 추출물의 영향 [Effect of citrus peel extract and fermented citrus peel extract on triglyceride contents in SD-rats. CP 0.1: citrus peel extract powder 0..1%, CP 0.5: citrus peel extract powder 0.5%, FCP 0.1: fermented citrus peel extract powder 0.1%, FCP 0.5: fermented citrus peel extract powder 0.5%. Values are represented as the mean±SD (n=8). Values with different superscripts within the each group are significantly different (p<0.05).]

3.8.5 지방조직 무게변화

시험물질이 체내지방조직에 미치는 영향은 복부지방조직의 대표적인 백색 지방조직인 후복강 지방조직(retroperitoneal adipose tissue)과 부고환 지방조직(epididymal adipose tissue) 무게의 합을 내장지방조직(visceral adipose tissue) 무게로 계산하여 확인하였다(Kim et al. 2007). 고지방식이 급여로 인해 체내 지방이 축적되어 시험물질을 투여하지 않은 대조군에서 내장지방조직이 체중 100 g 당 6.77±0.67 g으로 증가되어 비만 유도로 인해 체내지방도 축적되었음을 알 수 있었다. 시험물질 투여에 따른 체내지방 함량의 변화에서는 FCP 0.5에서만 체중 100 g당 5.60±0.66 g으로 유의적인 감소 효과가 확인되었다(Table 19). 그리고 CP 0.1과 CP 0.5는 약한 감소 경향을 나타내었으나 유의적이지는 않았다. 이상의 결과를 종합해 볼 때 비만의 가장 대표적이고 직접적인 지표가 되는 체중과 체지방 함량에서 FCP 만이 유일하게 통계적으로 유의적인 감소 효과를 나타내었고, 체중 및 체지방의 감소로 인해 중성지방 역시 크게 감소되었다. 따라서 발효를 하지 않은 일반 진피 추출물에서도 항비만 효능이 확인되지만, 발효를 통해 생체 내에 흡수가 쉬운 형태인 aglycone 플라보노이드가 다량 생성됨과 동시에 총 플라보노이드 함량이 높아짐으로서 보다 소량으로 우수한 효과를 가질 수 있다는 것을 확인하였고, Jung 등(2003)이 naringenin을 400 mg/day 투여하여 사람을 대상으로 임상실험을 수행한 결과 고콜레스테롤군에서 naringenin 섭취로 LDL-콜레스테롤이 유의적으로 감소했다고 보고하여 실제 임상에서도 진피 플라보노이드의 효과가 확인되었으며, 생물전환을 통해 제조된 발효 진피 플라보노이드가 항비만 효과를 가지는 기능성 소재로 개발될 수 있는 충분한 가능성이 있다고 사료된다.

Table 19. Sprague dawley rat에서의 지방 축적에 대한 진피 추출물과 진피 발효 추출물의 영향 [Effect of ethanol extract of citrus peel and fermented citrus peel on body fat accumulation in SD rats

<제4장 요약>

가. 진피 플라보노이드 생물전환 미생물의 분리 및 동정

1. β-glucosidase활성 균주 분리

β-glucosidase 활성을 가지는 4종의 분리균 중 Y-12 균주가 배양액 mL당 555 mU/mL으로 활성이 가장 높았으며, 4종 모두 진피 분말 첨가 배지에서 생물전환을 통해 생진피에서는 거의 검출되지 않는 naringenin과 hesperetin이 검출됨을 확인하였다. Y-12 균주가 naringenin 15.8 μg/mL, hesperetin 17.1 μg/mL을 생성하여 총 32.9 μg/mL의 전환물을 생성하여 전환능이 가장 우수한 것으로 확인되었다. 그리고 생성된 aglycone 플라보노이드인 naringenin과 hesperetin을 표준물질과 UV spectrum을 비교하여 일치함을 확인하였다.

2. 균주 동정 및 발효 조건 규명

생물전환능이 가장 우수한 Y-12 균주의 18S rDNA의 염기서열을 분석하여 NCBI의 blast search를 수행한 결과, A. pullulans와 상동성 100%로 확인되어 A. pullulans Y-12 균주로 명명하였다.

분리균의 최적 발효 조건을 확인한 결과 물 100중량부 기준에 0.8중량부의 casitone, 25℃, 150 rpm, 3일로 확인되었다. 또한 진피 발효 배지 제조 시 진피분말의 첨가량은 효율적인 미생물 발효와 최종 추출물의 회수율을 고려하여 결정하여야 하는데, 진피 분말을 10% 이상으로 첨가했을 경우에는 멸균 후 배지의 점성이 높아져 교반의 효율이 현저히 떨어지며, 3% 미만 첨가시에는 점성이 낮아 교반 및 발효는 정상적으로 진행될 수 있으나 첨가되는 진피의 양이 소량인 결과 최종 회수되는 추출물의 양도 적어지므로 발효의 효율과 추출물의 양을 고려할 때 3~10중량부 정도가 최적이라고 판단된다.

나. 발효 진피 추출물의 in vitro 효능 확인

1. 지방전구세포(3T3-L1 cell)의 분화 억제능

FCP와 CP를 세포배양 배지에 25 μg/mL, 50 μg/mL 농도로 처리하여 지방 축적률을 비교해 본 결과, 시료 무처리구와 비교하여 FCP는 25 μg/mL 처리 농도에서 지방 축적률 46%, 50 μg/mL 농도에서 44%로 나타나 CP의 79, 71%보다 지방 축적률이 현저히 감소됨을 확인하였다. TG 함량 또한 CP가 25 μg/mL 농도에서 414 nM/mg인 반면 FCP에서는 46 nM/mg으로 분화 이전의 preadipocyte 상태 수준에 가깝게 감소되었으며, GPDH 효소 활성 또한 발효 진피가 분화 이전 수준으로 낮아짐을 확인하였다.

2. 산화적 손상에 의한 β-cell 보호 효과

고농도의 당에 노출된 HIT-T15 cell의 산화적 스트레스에 대한 세포의 회복능은 FCP와 CP 모두에서 양호한 결과를 나타내었다. 고농도 당처리에 의해 생존률 53%를 나타낸 대조구에 비해 FCP 0.01 mg/mL 첨가군과 CP 0.25 mg/mL 첨가군에서 동일하게 생존률이 89%로 높아져 고농도의 당에 의한 스트레스로부터 보호 효과가 높은 것으로 조사되었고, FCP에서 상대적으로 낮은 농도에서 좋은 효과를 나타내는 것을 확인하였다. 인슐린 분비 개선 효과에서도 FCP와 CP 두 시료 모두에서 개선되는 효과를 보였으며 0.025 mg/mL 처리 농도에서 FCP가 정상세포 이상으로 회복됨을 확인하였다.

다. 발효 진피 추출물의 in vivo 항비만 효능 확인

1. 플라보노이드 고함량 분말 제조

발효 진피 추출물의 플라보노이드 함량을 높이기 위해 발효, 추출 및 농축 후 농축물을 소량의 증류수에 재현탁하여 불용성분을 회수하고 동결건조를 통해 분말화한 결과 분말 g당 총 플라보노이드 함량이 35.7%인 고농도의 분말을 얻어 CP 보다 플라보노이드 함량이 약 8배 높은 분말을 제조하였다. 각 플라보노이드 함량은 narirutin 21.4 μg/g, naringin 0.9 μg/g, hesperidin 249.3 μg/g, naringenin 49 μg/g, hesperetin 37.1 μg/g이였고, 이를 실험동물 식이에 첨가 하였다.

2. 발효 진피 추출물의 in vivo 항비만 효과

FCP와 CP를 식이에 각각 0.1, 0.5%되게 첨가하여 총 10주간 급여한 결과 고지방 식이만 급여한 대조구에 비해 FCP 0.5% 첨가군에서 체중이 554 g으로 대조구에 비해 약 42 g 감소되어 유의적인 감소효과를 나타내는 것으로 확인되었다. 그리고 혈중 지질에서도 실험군 전체에서 감소되는 경향을 나타내었고, 특히 FCP 0.5% 첨가군에서 LDL-콜레스테롤 12.4±2.3 mg/dL, 중성지방 34.6±5.5 mg/dL로 유의적으로 감소하였다. 지방 조직의 무게에서도 역시 체중 100 g당 후복강 지방 3.26±0.40 g, 부고환 지방 2.35± 0.34 g으로 대조구 보다 각각 약 15%, 20% 감소되어 유의적인 감소 효과를 나타내었다. 따라서 진피의 발효로 인해 플라보노이드 추출 효율이 높아짐과 동시에 체내에서 바로 흡수가 가능한 aglycone 형태의 naringenin과 hesperetin이 상당량 생성되면서 진피의 항비만 효능이 보다 증대되어 건강기능성 소재로서 충분한 가치가 있을 것으로 기대된다.

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Claims (7)

1. 삭제
2. 삭제
3. (1) 진피를 분말화하는 단계;
   (2) 상기 진피 분말을 Aureobasidium pullulans를 이용하여 발효시켜 진피의 플라보노이드 성분이 비배당체(aglycon)로 생물적 전환이 이루어지도록 하는 단계;
   (3) 상기 (2)단계에서 얻은 발효물에서 발효된 진피 분말만 분리해내는 단계;
   (4) 상기 단계의 발효된 진피 분말을 주정으로 추출하는 단계; 및
   (5) 주정 추출물에 물을 첨가하여 물에 용해되지 않고 침전된 부분만을 회수하는 단계로 이루어지며,
   상기 단계 (2)에서 Aureobasidium pullulans를 이용하여 진피를 발효시키는 조건은 물 100중량부, 진피 분말 3~10중량부, casitone 0.6~1.0중량부의 조성으로 하여, 발효 온도 20~28℃, 교반 속도 50~200 rpm으로 1~4일 발효시키는 것을 특징으로 하는,
   항비만 효과를 가지는 진피 발효 추출물의 제조방법.
4. 삭제
5. 제3항의 방법에 의하여 제조되는 것을 특징으로 하는,
   항비만 효과를 가지는 진피 발효 추출물.
6. 제5항의 진피 발효 추출물을 유효 성분으로 하는,
   체지방감소, 혈중지질개선 또는 비만 예방 및 개선용 식품.
7. 제5항의 진피 발효 추출물을 유효 성분으로 하는,
   체지방감소, 혈중지질개선 또는 비만 예방 및 개선용 약품.