CN1395573A - 类黄酮的提取方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种由含有合适的类黄酮苷和/或其接合物的原料生产富集的类黄酮苷元的提取物的方法，该方法包括下列步骤：(i)以酶促方式将类黄酮苷或其接合物转化成类黄酮苷元；(ii)调节pH以使类黄酮苷元可溶并除去不溶性部分；和(iii)调节pH以使可溶性类黄酮苷元变得相对不溶并形成含有它们的提取物。

Description

类黄酮的提取方法
发明领域
本发明涉及一种从含有类黄酮苷和/或其接合物的原料中提取类黄酮苷元的方法。更具体地说，本发明提供了一种使用含水溶剂由植物物质生产富集的类黄酮苷元的提取物的有效方法。
背景技术
类黄酮是一类具有包括将其用作治疗剂、抗菌剂和抗氧化剂在内的广泛应用的植物化学物质。它们能够治疗和/或预防一定范围内的医学上的病症和疾病，举例来说包括诸如心脏病、阿尔茨海默病、痴呆和癌症这样的变性疾病。类黄酮的特征和特性充分公开在科学文献中。
对’天然’植物化学药物的需求正在逐渐增加且这种需求在世界人口的平均年龄稳步增加的同时也在进一步增加。此外，占这些人口中年龄较轻的部分为治疗或预防医学上的疾病而正在转向选择天然药物。此外，对不含有机溶剂残余物、特别是那些以工业化方式合成的残余物这样的物质和对使用以对环境影响最低的方式生产的产品存在强烈的需求。整个社会也认为使用对环境影响最低的可生物降解的物质和方法具有很高的价值。
类黄酮是一小组植物多酚类、即由15个碳原子基础骨架组成的三环结构。植物类黄酮苷元(即不含连接的糖的类黄酮)以不同结构形式出现。然而，所有结构形式均在其母核上含有15个碳原子且它们按照C6-C3-C6构象、即通过可以或不可以形成第三个环的3个碳单位连接的两个芳香环排列。
类黄酮在饮食和药物中的重要作用正在越来越得到重视。正是红葡萄酒、绿茶、特级初榨橄榄油、大豆产品、水果和蔬菜、各种传统的草药药茶和药酒中的类黄酮至少部分导致因消耗它们而产生的有益作用。
价值得到充分确立的一组类黄酮是异黄酮类。异黄酮类具有一定的特征结构并可形成特定的异构型类黄酮。异黄酮类的有益作用是广泛的，包括提示它们是导致东亚区一定人群中乳腺癌和前列腺(prostrate)癌发生率降低的传统东方饮食中的要素。
尽管异黄酮类出现在其它科的植物中，但是它们绝大部分与豆科植物、特别是与豆科的蝶形花亚科极为相关，所述的蝶形花亚科包括许多众所周知的诸如三叶草、豆类植物(pulses-beans)、大豆和豌豆这样的饲料作物和诸如荆豆和染料木这样的灌木。
异黄酮类除对人和动物健康有益外，近来已经证实它们在动物饲料工业上的应用，其中给予补充了异黄酮类的饲料的猪表现出每日平均体重获得增加、但摄入的饲料并没有增加。猪的屠体肌肉的百分比也得到提高且每日估计的肌肉产生量较高。
尽管在一个完美的世界中我们都希望从精细选择的食品、膳食和饮料中获得足够的这些化合物，但实际上尤其是对城市的劳动者来说，这通常恰恰是不可能的。因此，对可以便利和有效地用作饮食补充剂或治疗剂的富含类黄酮的制品存在需要和需求。
用于提取类黄酮的现有技术一般存在下列缺点中的一个或多个：(i)它们涉及使用毒性试剂；(ii)它们需要过度的多次提取；(iii)它们涉及以糖基化形式(类黄酮苷)提取类黄酮；(iv)它们过度消耗时间；和(v)它们涉及使用大量可燃性的溶剂。
本发明寻求克服现有技术的缺陷并提供一种与现有技术方法相比以相对高的产率分离类黄酮的简单而便利的方法。
本发明的公开内容
本发明提供了一种由含有合适的类黄酮苷和/或其接合物的原料生产富集的类黄酮苷元的提取物的方法，该方法包括下列步骤：
(i)以酶促方式将类黄酮苷或其接合物转化成类黄酮苷元；
(ii)调节pH以使类黄酮苷元可溶并除去不溶性部分；和
(iii)调节pH以使可溶性类黄酮苷元变得相对不溶并形成含有它们的提取物。
就本发明的目的而言，术语″类黄酮″是具有下列一般通式的任意植物多酚或其二聚体、三聚体或聚合物：
用于本发明目的的特定类黄酮包括：查耳酮类(chacones)；二氢查耳酮类(dihydrochalones)；噢哢类；黄烷酮类；黄酮类；新类黄酮；儿茶素类；黄酮醇类；二氢黄酮醇类；原花色素类；黄烷类；黄烷-3-醇类和双类黄酮；它们的各种甲氧基化和其它修饰形式，诸如接合物、诸如酰基接合物，而更具体地说，用于本发明目的的特定类黄酮包括：金合欢素、芹菜配基、贝加因、柯因、金圣草黄素、橡精、dihydrobinetin、二氢莰非醇、地奥亭、儿茶酸、表儿茶酸、圣草酚、非瑟酮、黄颜木素、高良姜精、橙皮素、异鼠季亭、莰非醇、藤黄菌素/木犀草素、桑色素、杨梅黄酮、柚配基、木蝴蝶素A、ponciretin、六羟黄酮、五羟黄酮、刺槐亭、黄芩配基、水飞蓟素部分、水飞蓟素、异水飞蓟素、次水飞蓟素、黄芩新素II、福桔黄素、沃贡宁；以及异黄酮类，诸如染料木碱、黄豆苷原、7-羟-4’-甲氧异黄酮、鹰嘴豆素A、baptenin和红车轴草素，它们具有下列一般结构通式：
这些原料可以改变且优选包括诸如含有类黄酮苷和/或其接合物的植物或植物部位或其制备物这样的植物原料。植物原料特别包括：叶；花瓣；萼片；花；叶柄；枝条；根；茎；种子；豆荚；块茎；树皮；形成层；木材；倍子；果实；蔬菜；草药；细菌；藻类；蕨类植物；树汁；树脂；外皮，诸如葡萄、苹果、洋葱和鳄梨的外皮；皮，包括柑桔属的皮；果实外皮；诸如苹果的苹果酱；果酒的果渣；谷物外皮；稻草；干草；来自橄榄、油菜籽或canola的含油种子饼；或其它含油作物的提取物。原料还可以是诸如修饰的细菌、藻类或真菌和GM作物这样的遗传修饰(遗传工程)的生物体及其部位和产物。
将一类特定的原料浸泡并使诸如豆科植物种子这样发芽的种子萌发。在豆科植物种子中，除大豆外，在干燥的种子中基本上不含异黄酮，但是发现当它们从浸泡的状态发育成籽苗时，出现一定含量的的异黄酮类且该提取物中异黄酮的含量和基于干燥种子重量的产率均显著提高。这种情况可以持续至叶的籽苗出现和首批叶发生为止。
此外，种子的发育和类黄酮的合成可能受到温度的影响且优选使种子的发育和由此异黄酮类的产生在约23-28℃下发生。可以理解的是：一般来说，就种子的幼苗而言，产率在较高的温度(达上限)下则较高，而就同龄种子而言，产率在较低的温度下则较低，这是基于对发芽时温度作用的充分认识的结果。
申请人还发现可以将预萌发的大豆用作原料以生产充分富集的类黄酮的产物。在这方面，大豆在干燥种子中含有大量的异黄酮苷类。然而，可以进行浸泡和发芽以便产生将所述苷类转化成苷元类的酶。在这方面，优选约在室温(25℃)下将大豆浸泡至少1天(onday)以便活化内源性酶且由此提高按照本发明获得的提取物中异黄酮的含量。产生苷元类必不可少的较高含量的酶可以满足种皮下根的发育。此外，提取物中开始出现较佳含量的异黄酮类和每粒种子的产量均依赖于温度。
提取这类种子和籽苗可以产生可以描述为50-60％或50-60％以上蛋白质含量的富集(异)黄酮类化合物的蛋白质提取物。可以通过洗涤掉水溶性碳水化合物等以提高蛋白质的含量而将这些富集的蛋白质浓缩物转化成(异)黄酮蛋白质分离物。可以通过增加破碎的发芽种子和籽苗的细度来进一步提高产量，这种情况在原料特别坚固时尤其如此。
用于本发明目的的植物包括含有类黄酮苷和/或其接合物的任意植物，不过，特别优选的植物是豆科植物，诸如大豆、鹰嘴豆(鹰嘴豆属，诸如鹰嘴豆)、白草香木犀(白草香木樨)、紫花苜蓿或苜蓿(紫苜蓿)或车轴草属的种类。可以理解的是来自不同植物的物质的组合可以构成所述的原料。
优选类黄酮苷和/或其接合物的转化是完全的。然而，更为可能且更为实际的是原料中部分类黄酮苷和/或其接合物没有被转化成类黄酮苷元类。显然转化程度越高，则从该提取方法中回收的类黄酮苷元类越多。在任何情况下，用包括该方法所需产出量在内的操作参数来测定本发明方法中获得的转化率。
可以改变用于转化类黄酮苷的酶且这些酶包括具有水解苷键的能力的酶，诸如来自包括糖苷酶、β-糖苷酶、β-半乳糖苷酶、β-葡糖醛酸糖苷酶、果胶酶、桔皮苷酶、花色素酶、鼠李淀粉酶(rhamnodiastase)、柚苷酶或高峰淀粉酶的组。
其它酶包括那些诸如异黄酮7-O-苷-6″丙二酸丙二酰酯酶这样适合于水解葡萄糖(糖)部分与接合部分(例如酰基)之间的类黄酮苷接合物上的键的酶或可能在合适的植物中发现的等同的酶。
这类酶可以通过商购获得或来自本领域技术人员显而易见的来源，包括：动物，诸如来自猪的肝脏；植物，诸如车轴草属的种类、鹰嘴豆属的种类、向日葵属的种类、草木樨属的种类、苜蓿属的种类、茶的种类、李属的种类(例如苦味扁桃、扁桃、欧洲甜樱桃、杏)、欧鼠李和冻绿；真菌，诸如曲霉属的种类，包括黑色曲霉或米曲酶、红色糖多孢菌、刺槐和根瘤菌属的种类；诸如酒明串珠菌、啤酒片球菌和植物乳芽孢杆菌这样的细菌或诸如类细菌种类这样的肠内细菌；以及酵母，诸如啤酒糖酵母、异常汉逊氏酵母、细尖克勒克氏酵母和铁红假丝酵母(Candidapulcherimma)。
本发明还扩展至诸如那些获自遗传修饰(遗传工程)生物体的遗传工程的酶的用途。在这方面，应用遗传操作，可以使用可另外产生不足量的酶或具有不充分活性的酶的植物或微生物。此外，还可以将遗传工程用于改进酶的特征、诸如其活性。所有这类遗传工程产物能够用于本发明的方法。
随着具体情况的不同，将类黄酮苷或其接合物以酶促方式转化成类黄酮苷元这一过程可能涉及使用多种酶，可以将这些酶同时或依次使用以便获得必需的转化。本领域技术人员能够确定至少基于对方法和原料的需要的酶转化反应的性质。
在某些情况中，将类黄酮苷和/或其接合物转化成类黄酮苷元这一过程可能需要用顺序或同时使用的多种酶进行处理。在这方面，类黄酮苷和/或其接合物可能需要在转化成类黄酮苷元前转化一种中间体形式的化合物或多种化合物。对转化成中间体和所用特定酶的需求对本领域技术人员而言是显而易见的。例如，首先必须使用α鼠李糖苷酶(alpha-rhamnosidase)将narangin(一种苷)转化成江户樱花苷(中间体苷)且然后通过使用β糖苷酶水解葡萄糖部分而转化成其类黄酮苷元形式柚配基(naringinin)。
在酶转化成类黄酮苷元前，还可以预处理类黄酮苷以便除去一个或多个糖残基或其部分。在这方面，可以处理类黄酮苷以便水解某些糖残基或诸如糖单位这样的其部分，从而产生部分转化的类黄酮苷。在这种选择中，可以通过使用强酸水解而从在类黄酮苷上至少保留一个糖残基的类黄酮苷上除去一个或多个糖残基。
可能需要调节其它变化因素以便从给出的提取方法且更具体地说是酶转化法中获得最佳性能。控制这些变化因素和产生最佳转化的特定组合条件对本领域技术人员来说是显而易见的。这类变化因素包括温度、含湿量和添加其它溶质或酶稳定剂。
当原料是具有相对完整的含有类黄酮苷和/或其接合物和酶的细胞结构的植物物质时，一般将类黄酮苷和/或其接合物由适合于将其转化成类黄酮苷元的酶进行胞内分离。在这种情况中，可以通过至少破坏植物物质的细胞结构而使所述酶与类黄酮苷和/或其接合物接触。
因此，本发明还提供了一种由含有类黄酮苷和/或其接合物的植物物质生产富集的类黄酮苷元的提取物的方法，该方法包括下列步骤：
(i)破坏植物物质的细胞结构以便使其中含有的类黄酮苷或其接合物与其中适合于将类黄酮苷或其接合物转化成类黄酮苷元的至少一种酶接触且由此将类黄酮苷或其接合物转化成类黄酮苷元；
(ii)调节pH以使类黄酮苷元可溶并分离出不溶性部分；和
(iii)调节pH以使类黄酮苷元相对不溶并分离类黄酮苷元。
至少破坏细胞结构的处理方法包括使细胞破碎的处理方法且是可变和对本领域技术人员而言是显而易见的。它们包括：诸如研磨、压碎、捣击或滚压、冷冻和融化这样的处理方法；诸如半纤维素酶或纤维素酶这样的酶处理方法；超声处理方法；干燥法；接触紫外线；使用包括挤压和密封分批施压在内的减压或升压的处理方法；微生物消化或青贮；接触氧化性和其它化学物质；洗涤剂处理或上述方法的任意组合。
可以理解的是在进一步加工前应将破坏方法中使用的防碍其它处理步骤的任何成分从反应混合物中除去。
另外可以理解的是可以将按照本发明方法生产的提取物进行进一步处理以便进一步提高所关注的类黄酮的浓度。在这方面，可以实施诸如醇浸提这样的其它纯化方案。在这方面，已经发现通过对本发明的提取物进行醇(例如甲醇、乙醇或含水醇)浸提并蒸发溶剂可以获得约2-6倍显著富集浓度的类黄酮苷元类。
如上所述，原料中可以包含酶和类黄酮苷和/或其接合物。然而，该原料可以包括类黄酮苷和/或其接合物以及不足量酶乃至不含酶以便进行必要的转化。在这类情况中，本发明的方法可以进一步包括添加适合于将类黄酮苷和/或其接合物转化成类黄酮苷元的酶的步骤。
因此，本发明还提供了一种从含有类黄酮和/或其接合物的原料中提取类黄酮苷元的方法，该方法包括下列步骤：
(i)通过向原料中添加适合于将类黄酮苷和/或其接合物转化成类黄酮苷元的酶而将类黄酮苷和/或其接合物转化成类黄酮苷元；
(ii)调节pH以使类黄酮苷元可溶并分离出不溶性部分；和
(iii)调节pH以使类黄酮苷元相对不溶并从溶液中分离类黄酮苷元。
一旦产生了类黄酮苷元，就必须防止它发生聚合或其它不需要的修饰。例如可能需要限制或除去多酚氧化酶的活性以便防止类黄酮苷元的聚合。这一结果可以通过例如加热这样的物理方式或例如二氧化硫、焦亚硫酸钠、氢氰酸、一氧化碳、蛋白质消化酶或酶类这样的化学方式和/或通过使用例如通过提供二氧化碳气体或氮气这样的缺氧方法或通过真空抽吸而实现。在后一种手段中，将缺氧维持至通常可以将多酚氧化酶活性持久消除或另一方面直到从含有多酚氧化酶的液体或固体中分离出类黄酮苷元为止。
调节pH以使类黄酮苷元可溶。因此，可以将pH调节到至少约为8.5且更优选至少为9.6、11或12或另一方面调节至约为9.6-12。然而，所需特定水平的pH调节至少随所提取的特定类黄酮苷元的不同而改变。
本发明方法中碱提取结果的效率是令人意外的，正如提取产率随pH的升高超过异黄酮类实际上100％(99.9％)电离的pH值(当pH＝pKa+3个pH单位或约为10.2时)而增加一样，在该pH值下，异黄酮苷元类完全是水溶性的。提取持续增加，甚至预计在pH12-12.5下导致异黄酮类分解的pH’s下。
此外，预计产率在pH升至得到完全电离的pH以上(pKa+3)时不会提高，反而会因碱催化氧化的增加率而导致降低。已经发现染料木黄酮和鹰嘴豆素A具有约7.2的pKa’s。这一结果与改变酸沉淀的pH所观察到的作用相似，一旦染料木黄酮和鹰嘴豆素A异黄酮苷元类完全有效地(99+％)不带电荷，则在按质子离子浓度计的1000倍变化中也没有观察到一次产率的改变。
可以使用对本领域技术人员而言显而易见的大量方式中的任意一种来调节pH以使类黄酮苷元可溶，包括添加诸如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙这样的碱、可以是液体或固体形式的其它碱金属和碱土金属氢氧化物或乙酸钠或氨气。改变pH以确保足够比例的类黄酮苷元溶解。可以进一步处理剩余的不溶性植物物质以便将类黄酮苷元更完全地提取入液相。这类进一步的处理方法包括洗涤、冲洗和渗滤不溶性植物物质。
一旦类黄酮苷元充分溶解，则可以通过本领域技术人员用于分离可溶性和不溶性部分显而易见的常规方法中的任意一种或它们的组合来除去不溶性部分。这类方法包括：沉降、过滤和离心。可以理解的是为了本发明的目的，术语″分离出不溶性部分″及其显而易见的变化形式包括除去部分不溶性部分且更具体地说包括除去绝大部分可以通过离心或其它显而易见的方式获得的不溶性部分。
优选通过通入最小反应体积的气体来进行碱提取以避免类黄酮分解。在这方面，已经令人意外地发现在碱提取过程中通入最小反应体积的气体显著提高了产率。在碱提取过程中可以以不同方式将通入的气体减小到最低限度，包括但不限于避免搅拌样品、喷射、剧烈搅拌、其它形式的气体与液体样品的混合。另一方面，为防止通气，碱提取可以在氧减少或无氧环境中进行、诸如在氮气或氩气环境中或在将吸附氧气的化合物导入碱溶液的条件下进行。
然后调节pH以使类黄酮苷元可溶。因此，可以将pH调节至约为2或3或2-6或更优选约为3-5.6，诸如3.5、3.6、5.3或5.6。然而，所需特定水平的pH调节至少随所提取的特定类黄酮苷元的不同而改变。可以依据经验从事测定指定类黄酮苷元的最佳pH的试验的本领域技术人员通常可以确定用于本方法该阶段的最佳pH。
可以使用本领域技术人员显而易见的许多方式中的任意一种来调节pH以使类黄酮苷元不溶，包括添加诸如可以是液体、固体或气体形式的盐酸、硫酸、磷酸、硝酸、乳酸、酒石酸、柠檬酸、乙酸或丙酸这样的酸。改变pH以确保足够比例的类黄酮苷元不溶。如果需要，可以通过搅拌来进行pH调节以便确保反应物充分混合且绝大部分类黄酮苷元类实际上能够完全酸化。可以处理可溶性部分以便进一步使类黄酮苷元更完全地转入不溶性相。
一旦将类黄酮苷元充分分离为混悬液或沉淀，则可以通过本领域技术人员用于分离可溶性和不溶性部分的常规方法中的任意一种或它们的组合来除去不溶性部分，这类方法包括：沉降、过滤、结晶、共结晶和离心。还可以加入盐以便辅助分离并可以根据需要通过蒸发或部分冷冻来浓缩该反应混合物。还可以辅助分离以便降低温度或冷冻反应体积。
还可以通过其它常规技术进行分离，诸如使用有机溶剂、选择性膜过滤和包括薄层层析、液相层析或高效液相层析在内的层析法。还可以通过将反应混合物酸化的含水制备物或含水有机制备物吸附在活性碳上来纯化或浓缩它们。
用于纯化的其它手段在于将来自酸提取步骤的沉淀溶于适宜溶剂且然后改变该溶液而使一种或多种非类黄酮成分变得不溶并沉淀出来，用于该方法的合适的步骤是将所述沉淀溶于乙醇且然后通过添加丙酮来改变，接着预计任意共溶的糖类、皂草苷类和蛋白质会或多或少沉淀至一定程度。可以蒸发剩余的溶液并回收浓缩的提取物或可以进一步处理该溶液。
将植物物质用作提取原料的一种可能出现的复杂情况是在提取过程中不需要的植物蛋白共沉淀。在这方面，在提取过程中为分离类黄酮苷元而控制的各种条件可能不足以使类黄酮苷元与其它植物蛋白分离。这一问题可以通过用于原料或提取工艺过程中的其它处理步骤来解决以便至少减少与共沉淀相关的难题。
因此，本发明可以进一步包括一种处理方法，其中对不需要的蛋白质进行修饰以便它们不会过度干扰对本发明方法中类黄酮苷元的提取。这类处理方法包括可实现下列目的的那些方法：(i)在碱化步骤后可溶性相中不需要的蛋白质的浓度降低和(ii)酸化步骤后可溶性相中不需要蛋白质或蛋白质物质的浓度增加。
所述的处理方法可以改变且包括那些对本领域技术人员而言属于显而易见的方法。本发明包括的处理方法包括：加热处理、例如使用单宁或膨润土进行的化学处理、酶处理或由碱性pH调节或由确保不需要的蛋白质是可以从有意义的可溶性类黄酮苷元中分离出的不溶性形式的碱提取步骤而获得反应混合物前使植物物质放电。其它手段是使由碱提取步骤产生的反应混合物通过装填了吸附蛋白质的物质的柱。
另一方面，可以用诸如可使不需要的蛋白质在酸性介质中转化成可溶形式的胃蛋白酶或木瓜蛋白酶这样的蛋白酶处理由酸提取步骤产生的反应混合物。还可以使用大小排阻层析，包括可以使用凝胶过滤或大小排阻滤膜，这种滤膜带有足够小以使类黄酮分子通过而不允许较大的蛋白质分子通过的孔。还可以使用其它生物方式，包括用消化或吸附微生物的蛋白质发酵。青贮粉碎的原料也可能有助于该提取方案。
如上所述，本发明的方法提供了相对高产率的诸如异黄酮类这样的类黄酮。例如，产率可能至少高于25％使用相同工艺但使用有机溶剂提取的方法所得到的产率，更优选至少高于50％且甚至更优选至少高于67％的公开产率。
实施例
除非另有说明：(i)使用与用于提取的溶液相同pH的溶液将来自下文实施例中碱提取的布滤液冲洗2次；(ii)通过通入最小量的气体并按照下列一般方法进行下文实施例中的全部碱提取：(a)用较大量的水使植物原料分散、通常至少2次-4次以上；(b)开始向溶液-混悬液中加入少量体积的浓氢氧化钠溶液(约5M)；(c)随后当接近所选择的pH值时，逐滴加入氢氧化钠溶液；(d)使氢氧化钠与所述的溶液-混悬液高效混合(通入最少量的气体)且时间允许该混合物达到稳定的pH值；(d)在达到最终所需的pH后，再经过2-5分钟后检验数值并在所述数值已经发生偏移的情况下调节pH；和(iii)使用薄层层析或通过UV光谱法来测定实施例中所涉及的所有类黄酮的产量。
实施例1A
在10月上旬采集在1999年冬季生长在西澳洲西南的地下三叶草(TrifoliumsubterraneumL.)(长)茎上的约1kg叶样品，将其储存在约20℃下1天并在5℃储存10天。将这种储存的约0.5kg叶材料切碎并保存在塑料袋中。
将25g三叶草叶与50g酸洗涤的湿白沙混合并用研钵和研杵研磨3.5分钟。将研磨的叶和沙物质转入密封的塑料袋中10分钟并在约62℃下进行热处理20分钟。
第2天将该热处理的物质转入烧杯并加入200mL去离子水，在搅拌的同时从滴管中加入5M氢氧化钠以便使该混悬液的pH升至pH9.6。通过使该混悬液过3层细纱布除去粗纤维物质，通过以2,000rpm离心2分钟而除去通过纱布的淤渣样物质。
然后将所分离溶液的pH调节至5.3。将pH5.3的该混合物保持在约1℃下48小时且然后通过部分冷冻该溶液并分离形成的冰而浓缩且由此的最终体积约为100mL，将剩余的溶液和沉淀通过滤纸过滤。
在40℃下干燥滤纸和保留的沉淀物并按照非研磨形式的C方法的改进方法来测定异黄酮的含量。M.Francis和A.J.Millington，(“地下三叶草异黄酮含量的变种差异：其估计值的测定通过一种显微技术来进行”(’Varietalvariationintheisoflavonecontentofsubterraneanclover：itsestimationbyamicrotechnique’)，C.M.Francis和A.J.Millington，《澳大利亚农业研究杂志》(AustralianJournalofAgriculturalResearch)，第16卷，第557-64页，1965)。
通过测定4张滤纸的重量以便计算出平均重量并从测定的实验用滤纸及其保留的物质的重量中扣除该平均重量来计算滤纸上保留的该物质的重量。
结果
滤纸上保留的物质的重量为0.35g。干燥过滤的沉淀物中异黄酮类的含量为：染料木黄酮26.1g/100g、鹰嘴豆素A8.5g/100g、7-羟基-4’-甲氧异黄酮2.1g/100g；未检测到黄豆苷元。经计算，从25g三叶草叶中提取的异黄酮类为0.128g。
实施例1B
在10月上旬采集在1999年冬季生长在西澳洲西南cultivarTrikkala的地下三叶草(TrifoliumsubterraneumL.)(长)茎上的约1kg叶样品，将其储存在约20℃下1天并在5℃储存10天。
将这种储存的约0.5kg叶材料切碎并保存在塑料袋中。将25g三叶草叶与50g酸洗涤的湿白沙混合并用研钵和研杵研磨3.5分钟。将研磨的叶和沙物质转入密封的塑料袋中10分钟并且然后在约62℃下进行热处理20分钟。
第2天将该热处理的物质转入烧杯并加入200mL去离子水，在搅拌的同时从滴管中加入5M氢氧化钠以便使该混悬液的pH升至pH12.0。通过使该混悬液过3层细纱布除去粗纤维物质。
然后将所分离溶液和混悬液的pH调节至5.6。将pH5.6的该混合物保持在约1℃下48小时且然后通过部分冷冻该溶液并分离形成的冰而浓缩且由此的最终体积约为100mL，将剩余的溶液和沉淀通过滤纸过滤。在40℃下干燥滤纸和保留的沉淀物并如实施例1A中所述测定异黄酮含量。
通过测定4张滤纸的重量以便计算出平均重量并从测定的实验用滤纸及其保留的物质的重量中扣除该平均重量来计算滤纸上保留的该物质的重量。
结果
滤纸上保留的物质的重量为1.1g。干燥过滤的沉淀物中异黄酮类的含量为：染料木黄酮7.3g/100g、鹰嘴豆素A2.4g/100g、7-羟基-4’-甲氧异黄酮0.55g/100g；未检测到黄豆苷元。经计算，从25g三叶草叶中提取的异黄酮类为0.113g。
实施例1C
在10月上旬采集在1999年冬季生长在西澳洲西南cultivarTrikkala的地下三叶草(TrifoliumsubterraneumL.)(长)茎上的约1kg叶样品，将其储存在约20℃下1天并在5℃储存10天。将这种储存的约0.5kg叶材料切碎并保存在塑料袋中。
将26g三叶草叶与52g酸洗涤的湿白沙混合并用研钵和研杵研磨3.5分钟。将研磨的叶和沙物质转入密封的塑料袋中10分钟且然后在约62℃下进行热处理20分钟。
第2天将该热处理的物质转入烧杯并加入200mL去离子水，在搅拌的同时从滴管中加入5M氢氧化钠以便使该混悬液的pH升至pH12.0。通过使该混悬液过3层细纱布除去粗纤维物质。然后将所分离溶液和混悬液的pH调节至3.5。将pH3.5的该混合物保持在约1℃下48小时且然后通过部分冷冻该溶液并分离形成的冰而浓缩且由此的最终体积约为100mL，将剩余的溶液和沉淀通过滤纸过滤。在40℃下干燥滤纸和保留的沉淀物并如实施例1A中所述测定异黄酮含量。
通过测定4张滤纸的重量以便计算出平均重量并从测定的实验用滤纸及其保留的物质的重量中扣除该平均重量来计算滤纸上保留的该物质的重量。
结果
滤纸上保留的物质的重量为1.09g。干燥过滤的沉淀物中异黄酮类的含量为：染料木黄酮11.1g/100g、鹰嘴豆素A3.8g/100g、7-羟基-4’-甲氧异黄酮0.85g/100g；未检测到黄豆苷元。经计算，从26g三叶草叶中提取的异黄酮类为0.171g。
相反，使用相同方案和等量原料，但使碱提取产物再进行通过烧结玻璃的过滤步骤而得到：滤纸上保留的物质的重量为0.415g、染料木黄酮6.3g/100g、鹰嘴豆素A1.25g/100g、7-羟基-4’-甲氧异黄酮0.40g/100g。经计算，从26g三叶草叶中提取的异黄酮类为0.033g。
实施例1D
在10月上旬采集在1999年冬季生长在西澳洲西南cultivarTrikkala的地下三叶草(TrifoliumsubterraneumL.)(长)茎上的约1kg叶样品，将其储存在约20℃下1天并在5℃储存10天。将这种储存的约0.5kg叶材料切碎并保存在塑料袋中。
将26g三叶草叶与52g酸洗涤的湿白沙混合并用研钵和研杵研磨3.5分钟。将研磨的叶和沙物质转入密封的塑料袋中10分钟且然后在约62℃下进行热处理20分钟。
第2天将该热处理的物质转入烧杯并加入150mL去离子水，在搅拌的同时从滴管中加入5M氢氧化钠以便使该混悬液的pH升至pH11.0。通过使该混悬液过3层细纱布除去粗纤维物质。使在碱性三叶草混悬液中沉淀的部分淤渣沉降并通过将该液体与剩余沉降出的物质一起倾入另一烧杯而分离。
然后将该溶液和混悬液的pH调节至3.6。将pH3.6的该混合物保持在约1℃下48小时且然后通过部分冷冻该溶液并分离形成的冰而浓缩且由此的最终体积约为100mL，将剩余的溶液和沉淀通过滤纸过滤。在40℃下干燥滤纸和保留的沉淀物并如实施例1A中所述测定异黄酮含量。
通过测定4张滤纸的重量以便计算出平均重量并从测定的实验用滤纸及其保留的物质的重量中扣除该平均重量来计算滤纸上保留的该物质的重量。
结果
滤纸上保留的物质的重量为1.25g。干燥过滤的沉淀物中异黄酮类的含量为：染料木黄酮15.5g/100g、鹰嘴豆素A5.2g/100g、7-羟基-4’-甲氧异黄酮1.30g/100g；未检测到黄豆苷元。经计算，从26g三叶草叶中提取的异黄酮类为0.125g。
实施例1A-1D沉淀物中异黄酮类的比例分别为染料木黄酮10、10、10、10：鹰嘴豆素A3.2、3.3、3.4、3.4：
7-羟基-4’-甲氧异黄酮0.8、0.8、0.8、0.8，由此表明电离平衡可能极为相似且可能涉及全部三种产物共有的7位置上的酚OH。
实施例1E
从已经在约5℃下储存1个月的与混有Trikkala和Larisa地下三叶草植物一起生长的最近(开始开花后)田地上切下地下三叶草叶。连接的叶柄的长度为1-1.5cm长。
将10g部分研磨约70秒并在5分钟后加入偏亚硫酸氢钠溶液以便对终浓度为1.2％叶重的该物质防腐。将植物物质冷冻储存至提取为止，此时将各样品与水混合并将pH调节至所选择的值，2小时后，将它们通过布过滤，将过滤的固体物质冲洗2次，将过滤的溶液调节至pH2并在用滤纸过滤和将过滤的物质温热干燥前在20℃下储存过夜。
结果
将结果列在下面的表1中。
                           表1
  样品 碱提取(pH) 产量A(异黄酮类) 产率B(异黄酮类)
    A     9     0.35g     11.9
    B     10     0.45g     13.9
    C     11     0.48     13.2
    E     12     0.56     13.6
    F     12.5     0.68     10.6
A-每100g叶物质中异黄酮类的量
B-沉淀物中异黄酮类的含量g/100g
实施例1F
按照实施例1E中所述、再使用在pH10或pH12下提取前于58-64℃下加热40分钟的步骤来处理与实施例1E中相同的叶物质。
结果将结果列在下面的表2中。
                           表2
  样品 碱提取(pH) 产量A(异黄酮类) 产率B(异黄酮类)
    A     10     0.46g     19.2
    B     12     0.77g     19.5
A-每100g叶物质中异黄酮类的量
B-沉淀物中异黄酮类的含量g/100g
实施例1G
从恰好开始开花的生长有晚季Trikkala地下三叶草植物的浅沟中切下地下三叶草叶。小叶与叶柄的比例为77.5％：22.5％。
制备4批的11g叶，用研钵和研杵将每批样品与约4g硅沙一起研磨90秒，接着在约3.5分钟的期限后加入偏亚硫酸氢钠溶液(终浓度为0.2％的三叶草重量)以便对该物质防腐，将各批样品置于单独的塑料袋中并通过热水浴加热至58-63℃下40分钟。
第2天将各批样品合并、加入去离子水(约300mls)并在通过布过滤粗物质前在pH12下提取约20分钟，将过滤的固体物质冲洗2次并将碱性溶液分成等份的77.5mls且将每份离心3.5分钟。在储存过夜并在第2天通过滤纸过滤前将各离心的溶液调节至pH2.0、3.0、4.0和5.0。将过滤的物质温热干燥。
结果
将结果列在下面的表3中。
                              表3
    样品   酸提取(pH) 产量A(异黄酮类) 产率B(异黄酮类)
    A     2     0.89g     33.2
    B     3     0.90g     36.2
    C     4     0.85g     33.8
    D     5     0.84g     33.2
A-每100g叶物质中异黄酮类的量
B-沉淀物中异黄酮类的含量g/100g
实施例1H
从已经在约5℃下储存3天的与混有Trikkala和Larisa地下三叶草植物一起生长的最近(开始开花后)田地上切下地下三叶草叶。
将11g部分研磨约90秒并在5分钟后与水混合并将该混合物的pH调节至pH10，在不同的时间期限后，将它们通过布过滤，将过滤的固体物质冲洗2次，将过滤的溶液调节至pH2并在用滤纸过滤和将过滤的物质温热干燥前在20℃下储存过夜。
结果
将结果列在下面的表4中。
                               表4
  样品 碱提取时间(分钟) 产量A(异黄酮类) 产率B(异黄酮类)
    A     7     0.46g     6.26
    B     14     0.53g     7
    C     60     0.48g     6.6
A-每100g叶物质中异黄酮类的量
B-沉淀物中异黄酮类的含量g/100g
实施例1I
从已经在约5℃储存下16天的与混有Trikkala和Larisa地下三叶草植物一起生长的最近(开始开花后)田地上切下地下三叶草叶。
将10g部分研磨约70秒并在5分钟后加入偏亚硫酸氢钠溶液以便对终浓度为0-2.0％叶重的该物质防腐。在提取前将该植物物质储存在室温下5天，此时将各样品与水混合并将pH调节至pH10下1.5小时，然后将它们通过布过滤，将过滤的固体物质冲洗2次，将过滤的溶液调节至pH2并在用滤纸过滤和将过滤的物质温热干燥前在20℃下储存过夜。
结果
将结果列在下面的表5中。
                                 表5
    样品 焦亚硫酸钠的％ 产量A(异黄酮类) 产率B(异黄酮类)
    A     0     0.565     13
    B     0.4     0.74     13
    C     0.8     0.87     19.1
    D     1.2     0.93     16.7
    E     1.6     0.81     15.8
    F     2.0     0.89     15.3
A-每100g叶物质中异黄酮类的量
B-沉淀物中异黄酮类的含量g/100g
实施例1J
从已经在约5℃储存下25天的与混有Trikkala和Larisa地下三叶草植物一起生长的最近(开始开花后)田地上切下地下三叶草叶。
将16g部分研磨约90秒并在5分钟后加入偏亚硫酸氢钠溶液以便对终浓度为0或1.2％叶重的该物质防腐。将该物质在59-64℃下加热40分钟。将样品与水混合并将pH调节至pH12下1.5小时，然后将它们通过布过滤，将过滤的固体物质冲洗2次，将过滤的溶液调节至pH2并在用滤纸过滤和将过滤的物质温热干燥前在20℃下储存过夜。
结果
从用0.2％偏亚硫酸氢钠防腐的16g小叶中获得0.502g干燥的沉淀物，其中异黄酮的含量约为24.3g/100g或约0.76g/100g叶物质或以干重计为4.1％。
从用1.2％偏亚硫酸氢钠防腐的16g小叶中获得0.710干燥的沉淀物，其中异黄酮的含量约为24.0g/100g或约1.07g/100g叶物质或以干重计为5.66％。
实施例1K
从已经在约5℃储存下25天的与混有Trikkala和Larisa地下三叶草植物一起生长的最近(开始开花后)田地上切下地下三叶草叶。
将16g部分研磨约90秒并在5分钟后加入偏亚硫酸氢钠溶液以便对终浓度为1.2％叶重的该物质防腐。将样品与水混合并将pH调节至pH10下1.5小时，然后将它们通过布过滤，将过滤的固体物质冲洗2次，将过滤的溶液调节至pH2并在用滤纸过滤和将过滤的物质温热干燥前在20℃下储存过夜。
结果
从pH10下提取的16g小叶中获得1.10g干燥的沉淀物，其中异黄酮的含量约为12.6g/100g或约0.86g/100g叶物质或以干重计为4.57％。
实施例2A
(1)将苦白意大利羽扇豆(白羽扇豆)浸入自来水中1天，期间更换2次水。使羽扇豆在约25℃的室温下萌发且在第10天当根充分发育且在该阶段首批叶在开放的两半子叶之间形成时，用研钵和研杵将56g批量的萌发的羽扇豆与沙一起研磨；
(2)将来自(1)中的研磨物质保留不同的时间期限(16分钟-5小时，参见下文)以便使存在的染料木黄酮苷水解；
(3)将水解的研磨物质与约300mL水一起制成混合的溶液-混悬液并将pH调节至pH12.0，且在30℃下将pH11.9-12.0维持给定的时间(参见下文)；
(4)将来自(3)的混合物通过布过滤并在柔和B型通用离心机中以约600-100rpm离心5分钟；
(5)将来自(4)的过滤溶液调节至pH2.0并将酸化的溶液保留过夜以使形成的沉淀沉降且然后过滤并干燥。
结果
将结果列在下面的表6中。
                           表6
  样品   水解时间 碱提取(pH/时间)   产率A(染料木黄酮)
    A     16分钟     12/31分钟   1.8g/100g干燥沉淀物400mg/100g干燥种子重量
    B     49分钟     12/35分钟   1.81g/100g干燥沉淀物338mg/100g干燥种子重量
    C     100分钟     12/35分钟   1.8g/100g干燥沉淀物337mg/100g干燥种子重量
    D     5小时     12.1/40分钟   1.9g/100g干燥沉淀物346mg/100g干燥种子重量
A-甲醇浸出的染料木黄酮的含量
以干重计，将合并的干燥沉淀物测定为含有约6％水分以及59％蛋白质、4.2％灰分和17.8％可提取的己烷。
实施例2B
将羽扇豆种子浸湿24小时且然后在需要研磨1-1.5前保留不同的时间期限(23小时、4天和5天)，接着在pH10.5下将粗膏状物提取1.25小时。将所得混合物通过布过滤以便除去沉淀且然后酸化至pH3.5并保存，此后通过滤纸过滤以便分离酸性沉淀物。
结果
将提取结果列在在下面的表7中：
                        表7
    样品     水解时间 染料木黄酮产率A 染料木黄酮产率B
    A     23小时     痕量     -
    B     4天   110mg/100g     0.56
    C     5天   208mg/100g     1.12
A-染料木黄酮的量/干燥种子原料的量
B-沉淀物中的含量g/100g
C-计算为6.4g/100g的甲醇浸出中染料木黄酮的浓度
实施例2C
在2次密闭1小时(在约8小时和20小时时)条件下将白意大利羽扇豆湿浸24小时且然后每隔12小时湿浸约1小时，此后湿浸不同的时间期限(12小时-9天)。接着用研钵和研杵将湿浸的种子与少量沙一起研磨约10分钟并保存在密闭烧杯中不同的时间期限(65分钟-145分钟)，此后在pH10-12下提取、通过双层布粗滤、酸化(pH2-3.5)并在通过滤纸过滤前保存过夜。
结果
将结果列在下面的表8中。
                                      表8
  样品 再次湿浸的#  水解时间(分钟) 碱提取(pH/时间) 酸提取(pH) 产量A 产率B
    A     1     65     12/2小时     2  痕量  -
    B     1     65     12/2小时     3.5  痕量  -
    C     3     110     12/78分钟     3.5  41mg  0.153
    D     5     145     10/4.5小时     3.5  50mg  0.35
    E     7     145     12/4.5小时     2  73mg  0.33
    F     7     145     12/4.5小时     3.5  94mg  0.35
    G     9     80     12/110分钟     2  96mg  0.33
    H     9     75     12/75分钟     3.5  106mg  0.34
    K     11     80     12/3.25分钟     3.5  129mg  0.40
    L     11     60     12/205分钟     3.5  129mg  0.41
    M     18     95     12/205分钟     3.5  160mg  0.65
    N     17     68     12/5.25小时     2  181mg  0.93
A-每100g干燥种子中的染料木黄酮
B-沉淀物中的含量g/100g
实施例2D
将平均重量为0.15g的cultivarGungurru的狭叶羽扇豆(狭叶羽扇豆)浸入自来水中1天，期间换几次水且然后使其在约25℃D的室温下萌发不同的时间期限(4-8天)。
用研钵和研杵将全部种子与少量沙一起研磨约5分钟并在pH12下提取60-90分钟前在密封烧杯中保存不同的时间期限(65-88分钟)、通过双层布粗滤、在pH3.5下酸化并在通过滤纸过滤前保存过夜。
结果
将结果列在下面的表9中。
                               表9
  样品 种子年限 水解时间 碱提取(pH/时间) 产量A(染料木黄酮) 产率B(染料木黄酮)
    A     4天   80分钟 12/80分钟   42mg     0.20
    B     5天   75分钟 12/90分钟   80mg     0.37
    C     6天   67分钟 12/60分钟   98mg     0.45
    D     7天   88分钟 12/75分钟   154mg     0.82
    E     8天   65分钟 12/75分钟   144mg     0.99
    F     9.5天   120分钟 12/330分钟   185mg     1.31
A-每100g干燥种子中的染料木黄酮
B-沉淀物中的含量g/100g
实施例3A
将平均重量为0.16g(烘箱干燥的0.15g)大豆种子湿浸11小时，但在前7小时后不进行气密1小时的步骤。排空水并保存45分钟后，将种子粉碎并使用研钵和研杵将其与加入的沙一起充分捣击约5分钟且然后在约25℃的室温下保存在不含水分的密闭烧杯中。
80分钟后，用调节至pH12的碱性溶液将该粗膏状物浸提2.5小时，此后过滤，随后将过滤的溶液调节至pH2.0。使酸化的溶液在约20℃下沉降过夜，此后通过滤纸过滤并干燥，然后用醇浸提称重的部分并检测异黄酮溶液的浓度。
结果
从100粒种子中获得7.27g干燥的沉淀物，每100g甲醇浸出约0.15g异黄酮类，近似为70mg异黄酮类/100g干燥种子。
实施例3B
在2次密闭1小时(在约8小时和20小时时)条件下将大豆种子湿浸24小时且此后每隔12小时湿浸约1小时。用研钵和研杵将种子与少量沙一起研磨约5-10分钟并保存在密闭烧杯中不同的时间期限，此后用碱性溶液提取、通过双层布粗滤、酸化并在通过滤纸过滤前保存过夜。
结果
在研磨并持续80分钟前湿浸24小时并维持5小时、在pH12下用碱提取2小时、然后酸化至pH3.5的种子具有下列产量：
从100粒种子中获得7.387g干燥的沉淀物，其中每100g中约含0.15g异黄酮类，近似为73mg异黄酮类/100g干燥种子。
湿浸24小时且此后维持1.5天的种子处于几mm长种皮下可见的第一个阶段。在研磨并持续110分钟后，在pH12下将粗膏状物提取140分钟，在通过布过滤后将滤液分开并分成两个相等的部分且分别酸化至pH3.5和4.5。产量如下：
pH3.5时获得4.30g干燥的沉淀物，其中每100g中约有0.20g的异黄酮类，近似为118mg/100g干燥种子。
pH4.5时获得4.84g干燥的沉淀物，其中每100g中约有0.23g的异黄酮类，近似为144mg/100g干燥种子。
湿浸24小时且此后维持4天的种子处于恰从种皮到子叶相对于根而言向下弯曲且轻度开放的点出现的子叶的阶段。将种子粉碎并用研钵和研杵将其与加入的沙一起充分捣击约5分钟，然后在约25℃的室温下将它们保存在防止水分损耗的密封烧杯中，140分钟期限后，用调节至pH12的碱性溶液将粗膏状物浸提150分钟，此后过滤，随后将过滤溶液调节至pH3.5。使该酸化的溶液在约20℃下沉降过夜，此后将其通过滤纸过滤并干燥，然后将称重的部分用醇浸提并将异黄酮的产量列在下面。
从60粒种子中获得6.17g干燥的沉淀物，其中每100g中约含有0.336g异黄酮类或近似为223mg/100g干燥种子。甲醇浸提物中的浓度为1.25g/100g。
将另一批大豆种子湿浸2小时且然后保持1.5小时，此后用研钵和研杵将其与少量沙一起研磨10分钟并在加盖的烧杯中保存至2小时、在pH12下用碱性溶液提取2小时、然后用布过滤并冲洗、酸化至pH3.5并在通过滤纸过滤和干燥前保存过夜。
从100粒种子中获得5.88g干燥的沉淀物，其中每100g中约含0.20g的异黄酮类或近似为80mg/100g干燥种子。
实施例4
用研钵和研杵将8g来自薄荷(椒样薄荷)植物的叶与沙一起捣击并加入少量水、持续1.5分钟并使如此产生的叶的膏状物保持稳定13分钟以使其中含有的圣草枸橼甙(圣草酚-7-鼠李科甙(rhaminoside)苷)水解。
然后将叶膏状物制成约150mL混合的溶液-混悬液并将pH调节至pH12.0且将pH维持在pH11.8-12.0下90分钟。将该混合物通过布过滤后，将pH调节至pH2.0。将酸化的溶液保留过夜以使形成的沉淀沉降，此后将其在第2天在滤纸上过滤并干燥。
结果
干燥的沉淀物重0.372g。将乙醇浸提的圣草酚测定约为2.5g/100g干燥沉淀物。将该结果计算为约118mg/100g薄荷叶物质。
实施例5
具有约2.5cm长的根而没有可见的上述叶芽的以商品方式提供的浸提Kabuli亚型鹰嘴豆商购自市场并将其保存在约5℃下的冰箱中且在不同的时间浸提各批产品并使其进一步发育至包括适当萌发播种在内的阶段。通过取这些种子、粉碎并用研钵和研杵将它们与加入的沙一起充分捣击约10分钟且然后在约25-28℃的室温下保存在防水分的密闭烧杯中来测试这些种子，在至少1.25-3小时后，用调节至pH12的碱性溶液将粗膏状物浸提至少1小时，此后过滤，随后将过滤溶液调节至pH3.5。
使酸化的溶液在约20℃下沉降过夜，此后通过滤纸过滤并干燥、然后用醇浸提称重的部分并检测异黄酮溶液的浓度。
结果
冰箱中保存的是正如从作为种子形成的根的弯曲部分测定的购买后不进行额外浸提的样品、即在没有可见叶芽而根达2.6cm的阶段的种子，从60粒种子中获得9.15g干燥的沉淀物，其中每100g中约含0.08g异黄酮类。甲醇浸提物中的浓度为0.6g/100g。
从60粒处于没有可见叶芽而根达4.4cm的阶段的种子中获得8.94g干燥的沉淀物，其中每100g中约含0.39g的异黄酮类。甲醇浸提物中的浓度为3.0g/100g。
从处于形成至完全出叶芽阶段的40粒种子中获得6.17g干燥的沉淀物，其中每100g约含0.36g异黄酮类。甲醇浸提物中的浓度为2.2g/100g。
芽的子叶在达1.2cm长的萌芽与达5cm或5cm以上但在鹰嘴豆籽苗根上没有侧根的根之间的大缺口处被分离出来，从处于该阶段的67粒种子中获得8.08g干燥的沉淀物，其中每100g约含0.41g异黄酮类。甲醇浸提物中的浓度为2.4g/100g。
子叶通过达2.5cm长的萌芽与达6.7cm长且具有达1.4cm长的侧根完全开放，从处于该阶段的61粒种子中获得8.41g干燥的沉淀物，其中每100g约含0.67g异黄酮类。
当在粉碎并持续一定间隔后用额外步骤加工来自已经达到叶芽完全形成阶段的种子批量的种子时，将它们加热至60℃下40分钟并在过滤后离心，此后酸化至pH2.0，从50粒种子中获得2.61g干燥的沉淀物，其中每100g约含0.75g异黄酮类。
在所述的实施例中，重要的是需注意碱性pH提取作用可能并非是仅增加植物物质上的负电荷的氢氧离子和由此促使带负电荷的离子化的类异黄酮苷元类因负离子-负离子排斥而进入溶液所导致的结果。在这种情况中，仅在升高的pH下将该植物物质保留较长时间会导致增加量的类异黄酮扩散入溶液。而浸提的量实际上依赖于时间，当浸提时间从5分钟增加至1小时时，产量几乎不变，而当在pH10下浸提时，确实对pH的改变反应很快，在pH9.5下提取三叶草叶物质并通过布过滤，当用pH12的溶液而非pH9.5的溶液冲洗布过滤的固体时，进行2分钟操作的提取产量增加了27％。
据推定升高pH不仅可以使苷元变成水溶性的，而且能够通过改变植物物质的物理性质-通过使存在的结构开放而减少物理截留或通过改变一定的化学环境、可能是通过改变保持一定结合方式的类黄酮的平衡来使它们扩散入溶液。后者的机理可能是对发现使用碱提取而非常规有机溶剂提取而可导致产量较高的一种解释。
在本说明书的上下文中，除非另有说明，将术语″包括″或其变化形式理解为包含所述的整体或整体组，但不排除任何其它的整体或整体组。

Claims (39)

1.一种由含有合适的类黄酮苷和/或其接合物的原料生产富集的类黄酮苷元的提取物的方法，该方法包括下列步骤：
(i)以酶促方式将类黄酮苷或其接合物转化成类黄酮苷元；
(ii)调节pH以使类黄酮苷元可溶并除去不溶性部分；和
(iii)调节pH以使可溶性类黄酮苷元变得相对不溶并形成含有它们的提取物。
2.一种根据权利要求1的方法，其中通过将pH调节至约8.5-12.5而使所述的类黄酮苷元可溶。
3.一种根据权利要求1的方法，其中通过将pH调节至约9-12而使所述的类黄酮苷元可溶。
4.一种根据权利要求1的方法，其中通过将pH调节至约11-12而使所述的类黄酮苷元可溶。
5.一种根据权利要求1的方法，其中通过将pH调节至至少约8.5而使所述的类黄酮苷元可溶。
6.一种根据权利要求1的方法，其中通过将pH调节至至少约为9而使所述的类黄酮苷元可溶。
7.一种根据权利要求1的方法，其中通过将pH调节至至少约为9.6而使所述的类黄酮苷元可溶。
8.一种根据权利要求1的方法，其中通过将pH调节至约11或12而使所述的类黄酮苷元可溶。
9.一种根据权利要求1-8中任意一项的方法，其中通过通入最低量的反应体积的气体来调节pH，由此使类黄酮的分解减少到最低限度。
10.一种根据权利要求1-9中任意一项的方法，其中通过添加碱来调节pH。
11.一种根据权利要求10的方法，其中所述的碱是氢氧化钠、乙酸钠、氢氧化钾、氢氧化钙或氨气。
12.一种根据权利要求1-11中任意一项的方法，其中通过沉降、过滤和离心中的任意一种或它们的组合来除去步骤(ii)中的不溶性部分。
13.一种根据权利要求1-12中任意一项的方法，其中通过将pH调节至约为2-6而使所述的类黄酮苷元变得不溶。
14.一种根据权利要求1-12中任意一项的方法，其中通过将pH调节至约为2-5.6而使所述的类黄酮苷元变得不溶。
15.一种根据权利要求1-12中任意一项的方法，其中通过将pH调节至约为2-3.5而使所述的类黄酮苷元变得不溶。
16.一种根据权利要求1-12中任意一项的方法，其中通过将pH调节至约为2、3.5、3.6、5.3或5.6而使所述的类黄酮苷元变得不溶。
17.一种根据权利要求1-16中任意一项的方法，其中通过添加酸来添加步骤(iii)中的pH。
18.一种根据权利要求17的方法，其中所述的酸是盐酸、硫酸、磷酸、乙酸、硝酸、乳酸、酒石酸、柠檬酸或丙酸。
19.一种根据权利要求1-18中任意一项的方法，其中通过沉降、过滤、结晶、共结晶和离心中的任意一种或多种方法来除去步骤(iii)中的不溶性部分。
20.一种根据权利要求1-19中任意一项的方法，其中步骤(iii)进一步包括至少下面之一：添加一种盐以便辅助分离；通过蒸发或部分冷冻而浓缩该反应混合物；和/或降低该反应混合物的温度以便改善辅助的分离。
21.一种根据权利要求1的方法，其中所述的类黄酮选自包括下列物质的组：查耳酮类(chacones)；二氢查耳酮类(dihydrochalones)；噢哢类；黄烷酮类；黄酮类；新类黄酮；黄酮醇类；二氢黄酮醇类；原花色素类；黄烷类；黄烷-3-醇类和双类黄酮；它们的各种甲氧基化和其它修饰形式；金合欢素；芹菜配基；贝加因；儿茶酸；柯因；金圣草黄素；橡精；dihydrobinetin；二氢莰非醇；地奥亭；儿茶酸；表儿茶酸；圣草酚；非瑟酮；黄颜木素；高良姜精；橙皮素；异鼠季亭；莰非醇；藤黄菌素/木犀草素；桑色素；杨梅黄酮；柚配基；木蝴蝶素A；ponciretin；六羟黄酮；五羟黄酮；刺槐亭；黄芩配基；水飞蓟素部分；水飞蓟素；异水飞蓟素；次水飞蓟素；黄芩新素II；福桔黄素；沃贡宁；以及异黄酮类。
22.一种根据权利要求1的方法，其中所述的类黄酮是染料木黄酮、黄豆苷原、7-羟基-4’-甲氧异黄酮、鹰嘴豆素A、baptenin或红车轴草素。
23.一种由含有合适的类黄酮苷和/或其接合物的植物或植物物质生产富集的类黄酮苷元的提取物的方法，该方法包括下列步骤：
(i)以酶促方式将类黄酮苷或其接合物转化成类黄酮苷元；
(ii)调节pH以使类黄酮苷元可溶并除去不溶性部分；和
(iii)调节pH以使可溶性类黄酮苷元变得相对不溶并形成含有它们的提取物。
24.一种根据权利要求23的方法，其中将所述的植物进行了遗传修饰。
25.一种根据权利要求23或24的方法，其中所述的植物部位选自包括下列植物部位的组：叶；花瓣；萼片；花；叶柄；枝条；根；茎；种子；豆荚；块茎；树皮；形成层；木材；倍子；果实；蔬菜；草药；蕨类植物；树汁；树脂；外皮，诸如葡萄、苹果、洋葱和鳄梨的外皮；皮，包括柑桔属的皮；果实外皮；诸如苹果的苹果酱；果酒的果渣；谷物外皮；稻草；干草；来自橄榄、油菜籽或canola的含油种子饼；及其它含油作物的提取物。
26.一种根据权利要求23-25中任意一项的方法，其中所述的植物是豆科植物，诸如大豆、鹰嘴豆(鹰嘴豆属，诸如鹰嘴豆)、白草香木犀(白草香木樨)、紫花苜蓿或苜蓿(紫苜蓿)或车轴草属的种类。
27.一种根据权利要求23-26中任意一项的方法，其中所述的酶是一种或多种选自包括下列酶在内的组的酶：糖苷酶类、β-糖苷酶类、β-半乳糖苷酶、β-葡糖醛酸糖苷酶、果胶酶类、桔皮苷酶、花色素酶、鼠李淀粉酶(rhamnodiastase)、柚苷酶或高峰淀粉酶。
28.一种根据权利要求23-27中任意一项的方法，其中所述的酶是外源性的并将其加入到类黄酮苷和/或其接合物中。
29.一种根据权利要求23-28中任意一项的方法，其中以依次方式使用大多数酶。
30.一种由含有类黄酮苷和/或其接合物的植物物质生产富集的类黄酮苷元的提取物的方法，该方法包括下列步骤：
(i)破坏植物物质的细胞结构以便使其中含有的类黄酮苷或其接合物与其中适合于将类黄酮苷或其接合物转化成类黄酮苷元的至少一种酶接触且由此将类黄酮苷或其接合物转化成类黄酮苷元；
(ii)调节pH以使类黄酮苷元可溶并分离出不溶性部分；和
(iii)调节pH以使类黄酮苷元相对不溶并分离类黄酮苷元。
31.一种根据权利要求30的方法，其中通过下列方法破坏所述的细胞结构：研磨、粉碎、捣击或滚压；冷冻和融化；用诸如半纤维素酶类或纤维素酶类这样的酶处理；超声处理；干燥法；接触紫外线；使用包括挤压和密封分批施压在内的减压或升压的处理方法；微生物消化或青贮；接触氧化性和其它化学物质；洗涤剂处理；或上述方法的任意组合。
32.一种根据权利要求30或31的方法，其中所述的植物物质是种子且将其预处理以便促使其中产生将类黄酮苷及其接合物转化成类黄酮苷元必不可少的酶。
33.一种根据权利要求32的方法，其中所述的预处理步骤包括将种子湿浸足够的时间期限以便促使所述酶产生。
34.一种根据权利要求33的方法，其中将所述的种子湿浸约10天或10天以下。
35.一种根据权利要求33的方法，其中将所述的种子湿浸约0.5-10天。
36.一种通过一种方法生产的富集的类黄酮苷元的提取物，在该方法中如下处理含有合适的类黄酮苷和/或其接合物的原料：
(i)以酶促方式将类黄酮苷或其接合物转化成类黄酮苷元；
(ii)调节pH以使类黄酮苷元可溶并除去不溶性部分；和
(iii)调节pH以使可溶性类黄酮苷元变得相对不溶并形成所述的提取物。
37.一种通过一种方法生产的富集的类黄酮苷元的提取物，在该方法中如下处理含有合适的类黄酮苷和/或其接合物的植物物质：
(i)以酶促方式将类黄酮苷或其接合物转化成类黄酮苷元；
(ii)调节pH以使类黄酮苷元可溶并除去不溶性部分；和
(iii)调节pH以使可溶性类黄酮苷元变得相对不溶并形成所述的提取物。
38.一种通过一种方法生产的富集的类黄酮苷元的提取物，在该方法中如下处理含有合适的类黄酮苷和/或其接合物的植物物质：
(i)破坏植物物质的细胞结构以便使其中含有的类黄酮苷或其接合物与其中适合于将类黄酮苷或其接合物转化成类黄酮苷元的至少一种酶接触且由此将类黄酮苷或其接合物转化成类黄酮苷元；
(ii)调节pH以使类黄酮苷元可溶并分离出不溶性部分；和
(iii)调节pH以使类黄酮苷元相对不溶并形成所述的提取物。
39.一种根据权利要求37或38的富集的类黄酮苷元的提取物，其中所述的植物物质选自诸如大豆、羽扇豆或三叶草这样的豆科植物。
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