CN101175406A - 作为治疗剂的无取代b环类黄酮和黄烷的混合物制剂 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了包含两类特殊化合物——无取代B环类黄酮和黄烷——的混合物的组合物，在本文中称为UP736，该组合物用于预防和治疗涉及血小板聚集和血小板诱导型血栓形成的疾病和病症。本发明还提供了包含UP736以及可注射或口服的抗凝剂、抗血小板剂、非甾类抗炎药(NSAID)和COX－2选择性抑制剂的新组合物，和使用所述组合物来预防和治疗涉及血小板聚集和血小板诱导型血栓形成的疾病和病症的方法。最后，本发明提供了如下方法，该方法将UP736与抗血小板剂、抗凝剂、预防剂和NSAID组合使用，作为降低这些药物的剂量，减少与急性或慢性施用这些药物相关的副作用；抵消或对抗急性或慢性施用这些药物的危险；和获得额外和/或多重临床益处的手段。

Description

作为治疗剂的无取代B环类黄酮和黄烷的混合物制剂
发明领域
本发明涉及预防和治疗涉及血小板聚集和血小板诱导型血栓形成的疾病和病症。具体而言，本发明涉及包含两类特殊化合物——无取代B环类黄酮和黄烷——的混合物的新组合物，在本发明中也称为UP736，该组合物用于预防和治疗由血小板聚集和血小板诱导型血栓形成介导的疾病和病症。本发明还涉及使用UP736和可注射或可口服的抗凝剂、抗血小板剂、非甾类抗炎药(NSAID)和COX-2选择性抑制剂一起使用并作为佐药和/或协同剂、和/或增效剂的方法。最后，本发明涉及如下方法，该方法将UP736与抗血小板剂、抗凝剂、预防剂和NSAID组合使用作为降低这些药物的剂量、减少与急性或慢性施用这些药物有关的副作用；抵消或对抗急性或慢性施用这些药物的危险，及实现额外和/或多重的临床益处的手段。
发明背景
花生四烯酸(AA)从细胞膜中的释放与代谢通过几种不同途径导致代谢物的生成。可论证地，最重要的途径中的两种是由5-脂氧合酶(LOX)和环氧合酶(COX)酶类介导的。这些途径是平行的，分别导致白三烯和前列腺素的生成，它们在炎症反应的引发和发展以及血小板聚集中扮演重要角色。因此，造成这些介质(mediator)生成的酶已成为许多针对炎症治疗和有助于疾病如类风湿性关节炎、骨关节炎、和动脉血栓形成的发病的血小板聚集调节的新药的目标。
抑制环氧合酶(COX)是大多数非甾类抗炎药(NSAIDS)的作用机制。COX酶有两种不同的同工型(COX-1和COX-2)，它们共享约60％的序列同源性，但表达谱和功能不同。COX-1是与生理学上重要的前列腺素的生成相关的构成型，其帮助调整正常的生理功能，例如血小板聚集、胃中细胞功能的保护和维持正常的肾功能(Dannhardt和Kiefer(2001)Eur.J.Med.Chem 36：109-26)。第二种同工型COX-2是可被前致炎细胞因子如白介素-1β(IL-β)和其他生长因子诱导的酶形式(Herschmann(1994)Cancer Metastasis Rev.134：241-56；Xie等，(1992)Drugs Dev.Res.25：249-65)。该同工型催化从花生四烯酸(AA)生成前列腺素E2(PGE2)。由于COX抑制剂的作用机理与大多数常规NSAID的作用机理交迭，因此COX抑制剂被用于治疗许多同样的症状，包括与短期病症和慢性病中的炎症相关的动脉血栓形成、疼痛和肿胀。
血小板在正常止血中具有关键作用。在血管损伤后，血小板通过受损的内皮壁渗出到胞外基质中，在那里被胞外基质内的各种成分活化，所述成分包括胶原、蛋白聚糖、纤连蛋白和其它粘着糖蛋白。在与胞外基质接触后，血小板经历多个连续反应，包括粘附和变形、分泌两类微粒和聚集。已经确定了两种有效的血小板聚集介质：腺嘌呤二磷酸(ADP)和血栓烷A2(TxA2)。在血小板被胞外基质成分活化后，从中释放ADP。除了介导血小板的聚集外，ADP还增强ADP从其它血小板中的释放，从而形成血小板聚集的正反馈回路。TxA2由血小板合成和释放，也是血小板聚集的重要刺激物。TxA2与ADP一起建立自催化反应，导致逐步形成扩大的血小板聚集物。聚集的血小板对于随后的血液凝结过程很重要。这些活化的血小板刺激血浆凝血因子的局部活化，导致产生强化血小板聚集物的纤维蛋白凝块。近期的研究认为，凝血系统的所有膜结合反应都能够被局限于活化血小板的表面(Conde等，(2005)Blood 106：1604-1611)。
尽管血小板的粘附和活化是对突发血管损伤的修复导向响应，但通过一系列自身持续放大回路不受控地进行此过程会导致管腔内形成血栓、血管阻塞、和短暂的缺血或梗塞(Ruggeri(2002)Nat.Med.S：1227-34)。血小板参与正常止血和动脉血栓形成两者的能力取决于它们的粘附性能和它们响应各种刺激、极快地被活化的能力。
天然血小板只表达COX-1。血小板处理PGH2以主要产生TxA2，其由血小板响应胶原、凝血酶和其它刺激而合成和释放。TxA2通过其与G-蛋白偶联受体TxA2受体的相互作用来诱导不可逆的血小板聚集。因此，TxA2为放大血小板对各种激动剂的响应提供了机理。而且，TxA2是有效的血管收缩剂，其诱导血管平滑肌细胞的增殖，并且是促动脉粥样硬化的。作为血管收缩剂，TxA2促进正常的血小板聚集。通过抑制COX-1酶，阿司匹林能减少TxA2的产生，从而减少血小板聚集(Patrono等，(2006)The New England JournalMedicine.353：22：237)。
前列环素产生于动脉和心脏的内皮衬里(endothelial lining)。强血管舒张剂前列环素(PGI2)的平衡与血栓烷如TxA2的平衡对于保持正常的心血管功能至关重要(Bunting等，(1983)Br.Med.Bull.39：271)。PGI2和TxA2两者都取决于动脉内皮衬里和心脏组织产生的COX-1和COX-2(Caughey等，(2001)J Immunol，167：2831；Ribuot等，(2003)Cardiovascular Res 58：582)。已经显示COX-1和COX-2的比率会影响PGI2和TxA2两者的平衡。COX-1代谢花生四烯酸，并主要将该脂肪酸转化为TxA2，而诱导的COX-2处理花生四烯酸，将它转化为PGE2和PGI2(Oh-ishi(1997)Biochem.Biophys.Res.Commun.230：110；Brock等，(1999)J.Biol.Chem.274：11660)。PGI2通过其与PGI2受体的相互作用，响应所有激动剂来抑制血小板聚集。TxA2是主要源自COX-1的前列腺素类(主要来自血小板)，其生物合成对阿司匹林抑制是高度敏感的(Rocca等，(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99：7634-9)。另一方面，PGI2主要源自COX-2(McAdam等，(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96：272-7)，且对阿司匹林抑制较不敏感。COX-2的高度选择性抑制可以通过分流类花生酸(eicosanoid)COX-1途径内的花生四烯酸，使得相对于TxA2(COX-1途径)倾向于PGI2的合成平衡(COX-2途径)而促进血栓形成(Gaetano(2003)Trends in Pharmacological Sciences.24(5)：245-252)。
血小板聚集在动脉血栓形成的诱导和发展中具有非常重要的作用，动脉血栓形成是深静脉血栓形成、肺栓塞、动脉粥样硬化、心肌梗塞、导致脑血管事件的脑血管血栓形成和/或脑血管栓塞的主要原因。抗血小板药如阿司匹林、和抗凝血药如肝素和华法林(Verheugt(2005)Presse Med.34-1325)、凝血酶特异性抑制剂如水蛭素、地西卢定、比伐卢定和凝血酶非特异性抑制剂如他汀类(statins)(Shen(2006)Front Biosci.11：113)是目前用于控制血栓栓塞的标准药物。然而，由严重出血和高剂量短期抗血小板治疗引起的并发症是抗凝血药的主要副作用。已经显示较小剂量的抗凝血药与中至低剂量的抗血小板化合物如阿司匹林组合使用在减少高危患者的出血威胁方面具有重要的治疗价值(Harrington等，(2004)Chest.126.3 Suppl.513S)。
由于血小板环氧合酶的不可逆抑制和防止形成TxA2，在预防急性心肌梗塞和预防急性阻塞性卒中方面，阿司匹林型药物已经被长期用于减少心血管疾病的危险(Hennekens(2002)Am.J.Manag.Care8(22 Suppl.)：S691)。长期使用阿司匹林和其它抗血小板水杨酸酯的最常见副作用是由COX-1抑制所致的胃粘膜局部腐蚀，COX-1对保持粘膜衬里的完整性很重要。胃粘膜的这种损伤能导致从隐血损失到由于严重胃十二指肠(gastoduodental)损伤所致的急性GI出血。短期高剂量施用抗血小板药也有其自身危险，例如显著增加卒中的可能和手术程序后的出血。调整最佳剂量是减少这些副作用的一个选择(Kong(2004)Am.J.Cardiovasc.Drugs 4(3)：151)。推荐将75mg-150mg的每日剂量用于长期预防使用。无疑，能够改善阿司匹林的抗血小板作用而不会增加其副作用的任何化合物将具有重要的治疗优点(Patrono等，(2005)New Eng.J.Med.353：22；2373)。不幸的是，目前没有这种选择可供使用，尽管使用抗分泌药如质子泵抑制剂能够减少服用抗血小板药物的患者上胃肠道出血的危险。
为了解决阿司匹林和其它经典NSAID的毒性，尤其是由于选择性COX-1抑制所致的胃肠道溃疡和出血，在药物开发过程已经施行了两种对策。第一种对策涉及寻找COX-2的选择性抑制剂，它通过保留COX-1对胃粘膜的保护功能来减少胃肠道副作用(DeWitt(1999)Mol.Pharmac.4：625-631)。这种努力导致成功地开发了几种市售药物，例如塞来考昔(Celecoxib)和罗非考昔(Rofecoxib)，它们能选择性对抗COX-2。在临床试验中，证实COX-2选择性抑制剂具有显著的效能来对抗疼痛和其它炎性症状而具有较低胃肠道事件发生率。然而，许多与使用选择性COX-2抑制剂相关的副作用已经逐渐出现。例如，已经发现这些化合物会促进过敏和哮喘发作、引起急性肾衰竭、充血性心力衰竭、使冠状动脉和脑血管疾病恶化、延长断骨生长和溃疡愈合、抑制免疫系统使人对病毒性脑膜炎侵袭敏感、及促进溃疡在具有胃腐蚀(gastric erosion)或具有幽门螺旋杆菌感染的患者中生长(Rainsford(2001)J.Physiol.-Paris 95：11-19)。近期报告对于一些高度选择性COX-2抑制剂，只有在剂量水平达到COX-1活性也被抑制的水平时才能观察到明显的抗炎作用(Wallace等，91999)Br.J.Pharmac.126：1200-1204.)，而且由COX-2酶在炎症过程后期产生的抗炎前列腺素类(Gilroy等，(1999)Nature Med.5：698-701)也进一步挑战选择性COX-2抑制剂的功效。
2004年，临床试验显示出与另一种NSAID萘普生相比，高度选择性COX-2抑制剂罗非考昔(Vioxx)增加心脏病发作的危险随着时间推移高出两倍后，该药物自动地退出了市场。此外，由国家癌症研究所发起的关于塞来考昔(Celebrex)的临床试验显示，长期高剂量使用这种COX-2选择性抑制剂会使心脏病发作危险增加超过两倍。来自另一种选择性COX-2抑制剂伐地考昔(Bextra)的心血管危险也已经开始被关注(Meier B.Marketing Intensified Trouble for PainPills.The New York Times，December 19，2004)。事实上，近期科学文献综述揭示，早在2000年就观察到源于罗非考昔(Vioxx)和其它选择性COX-2抑制剂的心血管事件危险增加(Juni等，(2004)Lancet.364(9450)：2021-2029；Clark(2004)Drug Safety 27(7)：427-456)。越来越多的证据显示这种心脏毒性的主要原因是这类药物的极高的COX-2选择性(Neal等，(2004)J.Pharm Sci.7(3)：332-336)。
近期的数据显示，COX-2在健康器官如肾致密斑/cTALH和髓间质细胞(Harris等，(Aug.2004)Acta Physiol Scand 181(4)：543-7)；内皮细胞(Parente and Perretti(Jan.2003)Biochem Pharmacol.65(2)：153-9)；和脑(Hoffmann(Nov.2000)Curr Med Chem.7(11)：1113-20)中表达。在肾中，需要COX-2酶从花生四烯酸制备PGE2和PGI2(前列环素)。尤其是PGI2是体内钠平衡的关键调节剂(Harris(2000)J Am Soc Nephrol 11：2387)。COX-2选择性抑制剂在肾内抑制PGE2和PGI2导致钠和水潴留和血压升高，由于PGE2降低钠的再吸收，而PGI2是强血管舒张剂，它保持肾血流与肾小球滤过率之间的平衡，或者更简单地说，体内产生的尿量。PGI2还刺激肾素释放，其引起醛固酮释放的增加，然后醛固酮增加钠的再吸收和钾分泌(Carmichael and Shankel(1985)Am J Med 78：992；Whelton andHamilton(1991)J Clin Pharmacol 31：588)。为了保持正常的肾灌注，肾上调PGI2的合成以抵消血管收缩剂的作用来保持正常的肾功能。大多数健康个体通过其自身平衡摄入的液体与尿分泌之间的平衡来保持正常的血压，而不受引起血管收缩或血管舒张的化合物的干扰。在这些个体中，不需要由PGI2抵消血管收缩剂的作用。但在具有高血压的那些个体中，发现Vioxx会进一步升高血压(Lamarque(2004)Bulletin du Cancer(Montrouge)91：S117；Whelton等，(2001)Am JTher 85：85)。这种血压升高可能导致急性心肌梗塞(AMI)的发生率上升(Deray(2004)Presse Med 33：483)。
COX-2酶还诱导PGE2和PGI2在心脏中的表达，这样可避免急性心肌梗塞(AMI)(Dai and Kloner(2004)J Cardiovascul PharmacolTherapeutics 9：51)。近期在家兔和小鼠体内的研究已经显示，在诱导型AMI过程中，COX-2作为抗梗塞介质被明显上调以阻碍该事件(Shinmura等，(2000)PNAS 97：10197；Guo等，(2000)Basic ResCardiol 95：479)。这种抗梗塞活性防止发生进一步的损害，从而保护心脏功能(Bolli等，(2002)Am J Physiol 282：H1943)。在动物模型中，研究者已经显示，当给大鼠施用选择性COX-2抑制剂对比安慰剂时，PGI2水平消失。这种PGI2的缺少阻止大鼠心脏抵消诱导型AMI事件(Bolli等，(2002)Am J Physiol 282：H1943；Shinmura等，(2002)Am.J Physiol 283：H2534)。当COX-2被选择性抑制时，会以相对于PGI2远远更高的水平产生TxA2。由TxA2引起的血管收缩被PGI2诱导的血管舒张抵消，这会减少心脏周围动脉内的血流。这种血流减少和营养物及氧递送的限制可能使敏感患者的平衡偏向于AMI(Bing and Lomnicka(2002)J.Am Coll.Cardiol 39：521)。
总之，近期对环氧合酶同工型及其功能的评价已经证明，缺少可察觉的COX-1抑制是对观察到的与Vioxx(罗非考昔)和其它高选择性COX-2抑制剂相关的心血管副作用增加的可信解释。甚至建议应避免使用高度COX-2选择性NSAID的同时不使用合适的COX-1抑制剂(例如低剂量的阿司匹林)(Neal等，(2004)J.Pharm.Pharmaceut.Sci.7(3)：332-336)。
近期抗炎工作已经集中在寻找能抑制环氧合酶和脂氧合酶两者的药物(Parente(2001)J.Rheumatol.28：2375-2382；Bertolini等，(2001)Pharmac.Res.44：437-450)。显示对COX和LOX具有双重特异性的抑制剂应具有抑制多种花生四烯酸代谢途径的明显益处。这些抑制剂将通过限制前列腺素(PG)以及多种白三烯(LT)的生成阻断它们的炎性作用。这包括PGE2、LTB4、LTD4和LTE4(也称为anaphalaxis慢反应物质)的血管舒张、血管通透性和趋化性作用。其中，LTB4具有最有效的趋化性以及化学增活(chemokinetic)作用(Moore(1985)，Prostanoids：pharmacological，physiological and clinicalrelevance，Cambridge University Press，N.Y.，pp.229-230)。
阻断PGE2以及多种白三烯(LT)的炎性作用的意义是基于近期的发现，即选择性COX-2抑制剂的明显缺陷与使花生四烯酸途径分流至脂氧合酶途径相关，从而引起过度产生致炎性、趋化性、胃损伤性和支气管收缩性的白三烯(Celotti and Laufer(2001)Pharmac.Res.43：429-436)。
已经确定NSAID诱导的胃炎主要源自LOX的代谢物，尤其是LTC4和LTB4(Kirchner等，(1997)Prostaglandins Leukot.Essent.Fatty Acids 56：417-423)。通过刺激白细胞浸润、闭塞微血管、减少粘膜血流和释放调节剂、蛋白酶和自由基，白三烯导致大量胃上皮损伤。选择性LOX抑制剂已显示出可显著降低吲哚美辛诱导的溃疡的严重性或防止吲哚美辛诱导的溃疡形成(Fosslien(1998)AnnalsClin.Lab.Sci.28：67-81)。还已经确定，通过抑制COX途径，阿司匹林和其它COX抑制剂将花生四烯酸代谢物转向LOX途径，从而引起支气管收缩性白三烯的释放增加，同时导致半胱氨酰白三烯水平增加，其导致慢性鼻结膜炎、鼻息肉、和类似于滞后病毒呼吸感染的哮喘。阿司匹林诱导型哮喘(AIA)在哮喘人群中的流行率为约10至20％，抗白三烯药物已被用来治疗患有AIA的患者(Babu and Salvi(2000)Chest 118：1470-1476)。
双重抑制剂还显示了其它治疗益处。已经发现它们可减少大鼠模型中关节炎心脏的冠状动脉血管收缩(Gok等，(2000)Pharmac.60：41-46)、并可显著降低人内乳动脉中由血管紧张素II诱导的收缩(Stanke-Labesque等，(2000)Cardiovascular Res.47：376-383)。阿片受体活化能够引起在中脑神经元中由花生四烯酸的LOX代谢物介导的神经递质释放的突触前抑制。通过用COX和LOX双重抑制剂治疗脑神经元可协同增加阿片样物质的效力。这可能导致CNS止痛药物治疗的发展，包括降低阿片样物质和COX/LOX双重抑制剂的剂量的结合(Christie等，(1999)Inflamm.Res.48：1-4)。COX和LOX双重抑制剂还能够在早期和晚期防止晶状体蛋白诱导的眼炎症(Chang等，J.Ocular Pharmac.5：353-360)。
COX和LOX双重抑制剂不仅抑制引起急性炎症的前列腺素，而且解决与慢性炎症症状直接相关的吞噬性(phagocytic)白三烯的积累。此外，双重抑制剂还保护心脏避免COX-1抑制活性。这些性质显示出，COX和LOX双重抑制剂相比选择性COX-2抑制剂和NSAID可能具有明显优点。在合成药物供试品的体内模型中已经显示这种观点是正确的(Fiorucci等，(2001)Biochem.Pharmac.62：1433-1438)。
发明概述
本发明一般涉及组合物，该组合物配制用于预防和治疗涉及血小板聚集和血小板诱导型血栓形成的疾病和病症。该组合物在本文中称为UP736。该组合物包含两种特殊化合物种类——无取代B环类黄酮和黄烷——的混合物。包含无取代B环类黄酮和黄烷及其混合物的组合物已在2002的3月1日提交的第10/091,362号美国申请，发明名称为“作为有效的COX-2抑制剂的无取代B环类黄酮的鉴别”、2002年3月22日提交的第10/104,477号美国申请，发明名称为“从金合欢属中分离COX-2和5-脂氧合酶双重抑制剂”和2003年7月22日提交的第10/427,746号美国申请，发明名称为“具有COX-2和5-脂氧合酶双重抑制活性的制剂”中描述。这些参考文献分别被全文纳入本文作为参考。
本发明包括一种新组合物，其包含至少一种无取代B环类黄酮、至少一种黄烷和至少一种药物的混合物，该药物选自可注射的抗凝剂，选自包括但不限于肝素、达肝素、依诺肝素和亭扎肝素(tinzaparin)；口服抗凝剂，选自包括但不限于华法林、维生素K拮抗剂和维生素K还原酶抑制剂；抗血小板剂，选自包括但不限于阿司匹林、氯吡格雷(clodipogrel)和双嘧达莫(dipyridamole)；抗心绞痛药，选自包括但不限于硝酸酯、β-阻断剂、钙阻断剂、血管紧张素转化酶抑制剂、和钾通道激活剂；非甾类抗炎药(NSAID)，选自包括但不限于对乙酰氨基酚、布洛芬、萘普生、双氯芬酸、水杨酸酯和吲哚美辛；或COX-2选择性抑制剂，选自包括但不限于罗非考昔、塞来考昔、依托度酸和美洛昔康。
组合物中无取代B环类黄酮与黄烷的比例可基于预防和治疗特定疾病或病症的适应症和特殊需要来调节。通常，无取代B环类黄酮与黄烷的比例范围可为约99∶1无取代B环类黄酮∶黄烷至约1∶99无取代B环类黄酮∶黄烷。在本发明的具体实施方案中，无取代B环类黄酮与黄烷的比例选自：约90∶10、80∶20、70∶30、60∶40、50∶50、40∶60、30∶70、20∶80和10∶90。在本发明优选的实施方案中，组合物中无取代B环类黄酮与黄烷的比例为约85∶15。所述无取代B环类黄酮和黄烷可以是合成的和/或从单种植物或多种植物中分离的。在优选实施方案中，无取代B环类黄酮是从一种或多种黄芩属植物中分离的，黄烷是从一种或多种金合欢属和钩藤属植物中分离的。
本发明还包括治疗和预防涉及血小板聚集和血小板诱导型血栓形成的疾病和病症的方法。该方法包括向有需要的主体施用组合物，该组合物包含合成和/或从单种植物或多种植物分离的无取代B环类黄酮和黄烷的混合物。使用纯化酶在不同细胞系和多种动物模型中证实了这种方法的功效。
能够用本发明方法预防和治疗的涉及血小板聚集和血小板诱导型血栓形成的疾病和病症包括但不限于：深静脉血栓形成、肺栓塞、动脉粥样硬化、心肌梗塞、导致脑血管事件的脑血管血栓形成和/或脑血管栓塞、导致局部缺血和梗塞的外周循环和/或微循环血栓形成、涉及左心房血液停滞和血栓形成的心房纤维性颤动、致血栓(thrombogenic)位置，包括人造植入物如机械心瓣膜、除颤器(defibricator)、用于递送药物的手术植入物、和人造髋、关节和其它外源器官。
本发明还包括使用UP736作为辅助剂和/或协同剂、和/或增效剂的方法，所述方法包括向有需要的主体施用有效量的组合物，该组合物包含至少一种无取代B环类黄酮、至少一种黄烷和至少一种药物的混合物，该药物选自可注射的抗凝剂、口服抗凝剂、抗血小板剂、抗心绞痛药、非甾类抗炎药(NSAID)或COX-2选择性抑制剂。可注射抗凝剂的例子包括但不限于肝素、达肝素、依诺肝素和亭扎肝素。口服抗凝剂的例子包括但不限于华法林、维生素K拮抗剂和维生素K还原酶抑制剂。抗血小板剂的例子包括但不限于阿司匹林、氯吡格雷和双嘧达莫。抗心绞痛药的例子包括但不限于硝酸酯、β-阻断剂、钙阻断剂、血管紧张素转化酶抑制剂、和钾通道激活剂。非甾类抗炎药(NSAID)包括但不限于对乙酰氨基酚、布洛芬、萘普生、双氯芬酸、水杨酸酯和吲哚美辛。最后，COX-2选择性抑制剂的例子包括但不限于罗非考昔、塞来考昔、依托度酸和美洛昔康。
本发明还包括减少抗血小板剂、抗凝剂、预防剂、NSAID和COX-2选择性抑制剂的标准剂量，以实现相同或改进的临床效果的方法。该方法包括向有需要的主体施用有效量的组合物，该组合物包含至少一种无取代B环类黄酮和至少一种黄烷的混合物与所述抗血小板剂、抗凝剂、预防剂、NSAID或COX-2选择性抑制剂的组合。
本发明还包括与至少一种非甾类抗炎药和至少一种COX-2选择性抑制剂组合使用UP736作为辅助剂和/或协同剂、和/或增效剂的组合物和方法，所述非甾类抗炎药(NSAID)选自包括但不限于对乙酰氨基酚、布洛芬、萘普生、双氯芬酸、水杨酸酯和吲哚美辛，所述至少一种COX-2选择性抑制剂选自包括但不限于罗非考昔、塞来考昔、依托度酸和美洛昔康。所述组合物和方法可减少获得相同或改进的临床效果所需的NSAID剂量；使得与急性或慢性施用这些药物相关的副作用降低并抵消或对抗急性或慢性施用NSAID的危险。所述方法还提供了实现额外和/或多重临床益处的方法，如下详述。该方法包括向有需要的主体施用有效量的组合物，该组合物包含无取代B环类黄酮和黄烷的混合物与至少一种NSAID和至少一种COX-2选择性抑制剂和药学上可接受的载体的组合。
本发明还包括通过将抗血小板剂、抗凝剂、预防剂、NSAID和COX-2选择性抑制剂与UP736组合施用，来减少或消除与急性或慢性施用这些药物相关的副作用的组合物和方法。该方法包括向有需要的主体施用有效量的组合物，该组合物包含无取代B环类黄酮和黄烷的混合物与所述抗血小板剂、抗凝剂、预防剂、NSAID或COX-2选择性抑制剂和药学上可接受的载体的组合。
本发明还包括通过将抗血小板剂、抗凝剂、预防剂、NSAID和COX-2选择性抑制剂与UP736共同施用，来抵消或对抗与急性或慢性施用这些药物相关的危险的方法。该方法包括向有需要的主体施用有效量的组合物，该组合物包含无取代B环类黄酮和黄烷的混合物与所述抗血小板剂、抗凝剂、预防剂或NSAID和药学上可接受的载体的组合。
最后，本发明包括通过共同施用抗血小板剂、抗凝剂、预防剂、NSAID和COX-2选择性抑制剂与UP736的组合，来获得额外和/或多重临床益处的方法。如下所述，UP736是有效的抗氧化剂，其调节NFκB和PPAR-γ的信使RNA的生成，从而导致TNFα、IL-1β、IL-6和其它致炎细胞因子在基因表达水平和蛋白质产生水平上的特异性下调。该方法包括向有需要的主体施用有效量的组合物，该组合物包含合成的和/或从单种植物或多种植物中分离的无取代B环类黄酮和黄烷的混合物与所述抗血小板剂、抗凝剂、预防剂、NSAID或COX-2选择性抑制剂和药学上可接受的载体的组合。
可用于下列发明的无取代B环类黄酮，在本文中也称为无取代B环黄酮和黄酮醇，包括由下面通式表示的化合物：
Figure S2006800163286D00121
其中
R1、R2、R3、R4和R5独立地选自：-H、-OH、-SH、OR、-SR、-NH2、-NHR、-NR2、-NR3 +X-，单个糖或者多个糖组合的碳、氧、氮或硫糖苷，所述糖包括但不限于戊醛糖、甲基戊醛糖、己醛糖、己酮糖及它们的化学衍生物；
其中
R是具有1-10个碳原子的烷基；及
X选自药学上可接受的抗衡阴离子，包括但不限于氢氧根、氯离子、碘离子、硫酸根、磷酸根、乙酸根、氟离子、碳酸根等。
可用于下列发明的黄烷包括由下面通式表示的化合物：
其中
R1、R2、R3、R4和R5独立地选自：H、-OH、-SH、-OCH3、-SCH3、-OR、-SR、-NH2、-NRH、-NR2、-NR3 +X-，所述取代基的酯，包括但不限于没食子酸酯、乙酸酯、肉桂酰基和羟基肉桂酰基酯、三羟基苯甲酰酯和咖啡酰酯及它们的化学衍生物；单个糖或者多个糖组合的碳、氧、氮或硫糖苷，所述糖包括但不限于戊醛糖、甲基戊醛糖、己醛糖、己酮糖及它们的化学衍生物；二聚、三聚以及其他多聚黄烷；
其中
R是具有1-10个碳原子的烷基；及
X选自药学上可接受的抗衡阴离子，包括但不限于氢氧根、氯离子、碘离子、硫酸根、磷酸根、乙酸根、氟离子、碳酸根等。
本发明的无取代B环类黄酮可由合成方法获得，和/或从一种或多种下列科的植物中提取，包括但不限于：番荔枝科(Annonaceae)、菊科(Asteraceae)、紫葳科(Bignoniaceae)、使君子科(Combretaceae)、菊科(Compositae)、大戟科(Euphorbiaceae)、唇形科(Lahiatae)、樟科(Lauranceae)、豆科(Leguminosae)、桑科(Moraceae)、松科(Pinaceae)、凤尾蕨科(Pteridaceae)、中国蕨科(Sinopteridaceae)、榆科(Ulmaceae)和姜科(Zingiberaceae)。该无取代B环类黄酮可由高等植物属提取、浓缩和纯化，所述植物属包括但不限于：假鹰爪属(Desmos)、Achyrocline、木蝴蝶属(Oroxylum)、榆绿木属(Buchenavia)、香青属(Anaphalis)、山芫荽属(Cotula)、鼠麴草属(Gnaphalium)、蜡菊属(Helichrysum)、矢车菊属(Centaurea)、泽兰属(Eupatorium)、亚马逊巴香草(Baccharis)、乌桕属(Sapium)、黄芩属(Scutellaria)、Molsa、羽萼木属(Colebrookea)、水苏属(Stachys)、牛至属(Origanum)、新塔花属(Ziziphora)、山胡椒属(Lindera)、黄肉楠属(Actinodaphne)、金合欢属(Acacia)、鱼藤属(Derris)、甘草属(Glycyrrhiza)、崖豆藤属(Millettia)、水黄皮属(Pongamia)、灰毛豆属(Tephrosia)、波罗蜜属(Artocarpus)、榕属(Ficus)、粉叶蕨属(Pityrogramma)、隐囊蕨属(Notholaena)、松属(Pinus)、榆属(Ulmus)和山姜属(Alpinia)。
本发明的生物活性黄烷可由合成方法获得，和/或从选自金合欢属和/或钩藤属的一种或多种植物提取。在优选实施方案中，所述金合欢属植物选自包括但不限于：儿茶(A.catechu)、金合欢(A.concinna)、金合欢(A.farnesiana)、阿拉伯胶树(A.senegal)、A.speciosa、阿拉伯金合欢(A.arabica)、A.caesia、羽叶金合欢(A.pennata)、藤金合欢(A.sinuata)、黑荆(A.mearnsii)、A.picnantha、银荆(A.dealbata)、大叶相思(A.auriculiformis)、A.holoserecia和马占相思(A mangium)。在优选实施方案中，钩藤属植物选自：Uncaria gambir、恒春钩藤(U.lanosa)、U.hirsute、U.africana、U.elliptica、U.orientalis、U.attenuate、U.acida、北越钩藤(U.homomalla)、白钩藤(U.sessilifructus)、U.sterrophylla、U.bernaysii、华钩藤(U.sinensis)、U.callophylla、钩藤(U.rhychophylla)、猫爪草(U.tomentosa)、U.longiflora、U.hirsute、U.cordata和U.borneensis。
在优选实施方案中，无取代B环类黄酮由一种或多种黄芩属植物分离，黄烷由一种或多种金合欢属和钩藤属植物分离。
如上所述，无取代B环类黄酮与黄烷的比例范围可为约99∶1无取代B环类黄酮∶黄烷至约1∶99无取代B环类黄酮∶黄烷。在本发明的具体实施方案中，无取代B环类黄酮与黄烷的比例选自：约90∶10、80∶20、70∶30、60∶40、50∶50、40∶60、30∶70、20∶80和10∶90。在本发明优选的实施方案中，组合物中无取代B环类黄酮与黄烷的比例为约85∶15。
应该理解的是，上面的概述和下面的详述都仅仅是代表性的和说明性的，并非限制所要求权利的发明。
附图说明
图1显示了从黄芩(S.baicalensis)(lot#RM052302-01)根分离的标准化提取物的HPLC色谱图，其中无取代B环类黄酮含量为82.2％。从图中可见，用HPLC/PDA/MS阐明了下列10种化合物：黄芩苷、汉黄芩素-7-葡糖苷酸、木蝴蝶素A7-葡糖苷酸、黄芩黄素、汉黄芩素、白杨黄素-7-葡糖苷酸、去甲汉黄芩素-7-葡糖苷酸、黄芩素、白杨黄素和木蝴蝶素A。
图2显示了用80％MeOH水溶液从儿茶(A.catechu)中提取的黄烷的HPLC色谱图。
图3使用来自实施例11(n＝9-10)的组合数据，用图表显示了治疗组相对于载体对照组的出血时间和出血时间增加百分比。使用Student t-检验表示和分析了治疗组相对于载体对照组的平均出血时间和出血时间增加百分比。治疗组的出血时间延长以相对于载体对照组的出血时间增加百分比表示。
图4用图表显示了实施例12的结果。在该实施例中，在切断各小鼠尾尖(0.3mm)前1小时，向体重为22±2g的5只ICR源雄性小鼠单独口服施用100mg/kg剂量的UP736，或者将其与3、10和30mg/kg的阿司匹林组合施用。此外，类似地向小鼠单独施用3、10、30和100mg/kg阿司匹林。认为出血时间相对于对照组动物延长百分之五十或更多(50％)是显著的。
具体实施方案
本文使用了各种术语提及本发明的多个方面。为帮助阐明本发明组成部分的说明，提供了以下定义。
应注意的是，术语“a”和“an”实体是指一个或多个该实体；例如“a”类黄酮指一种或多种类黄酮。同样地，术语“a”或“an”、“一个或多个”和“至少一个”在此处可互换使用。
本文所用的“无取代B环类黄酮”是特殊的类黄酮种类，其芳香B环上没有取代基，如下面的通式所示：
Figure S2006800163286D00151
其中
R1、R2、R3、R4和R5独立地选自：-H、-OH、-SH、-OR、-SR、-NH2、-NHR、-NR2、-NR3 +X-，单个糖或者多个糖组合的碳、氧、氮或硫糖苷，所述糖包括但不限于戊醛糖、甲基戊醛糖、己醛糖、己酮糖及它们的化学衍生物；
其中
R是具有1-10个碳原子的烷基；及
X选自药学生可接受的抗衡阴离子，包括但不限于氢氧根、氯离子、碘离子、硫酸根、磷酸根、乙酸根、氟离子、碳酸根等。
本文所用的“黄烷”是指特殊的类黄酮种类，通常可由下面的通式表示：
其中
R1、R2、R3、R4和R5独立地选自：H、-OH、-SH、-OCH3、-SCH3、-OR、-SR、-NH2、-NRH、-NR2、-NR3 +X-、取代基的酯，包括但不限于没食子酸酯、乙酸酯、肉桂酰基和羟基肉桂酰基酯、三羟基苯甲酰酯和咖啡酰酯及它们的化学衍生物；单个糖或者多个糖组合的碳、氧、氮或硫糖苷，所述糖包括但不限于戊醛糖、甲基戊醛糖、己醛糖、己酮糖及它们的化学衍生物；二聚、三聚以及其他多聚黄烷；
其中
R是具有1-10个碳原子的烷基；及
X选自药学上可接受的抗衡阴离子，包括但不限于氢氧根、氯离子、碘离子、硫酸根、磷酸根、乙酸根、氟离子、碳酸根等。
用于本文时，“治疗”包括治疗和/或预防。当使用时，治疗涉及人以及其它动物。
“药学上或治疗学上有效的剂量或量”指足以引发所需的生物学结果的剂量水平。该结果可以是疾病的病征、症状或起因的缓解或生物学系统的任何其他所期望的改变。
“安慰剂”指用无活性物质代替足以引发所期望的可以缓解疾病的病征、症状或起因的生物学结果的药学上或治疗学上有效的剂量或量。
“主体”或“患者”是向其施用本文所述的组合物的活体、人或动物。因此，本文描述的发明可用于兽用以及人用，术语“患者”或“主体”不应被理解为限制方式。在兽用情况下，可如下所述考虑动物的体重确定剂量范围。
“基因表达”指将基因转录到mRNA。
“蛋白质表达”指将mRNA翻译成蛋白质。
本发明一般涉及一种组合物，其配制用于预防和治疗涉及血小板聚集和血小板诱导型血栓形成的疾病和病症。该组合物在本文中称为UP736。该组合物包含单独的或混合的两种特定化合物种类——无取代B环类黄酮和黄烷。
组合物中无取代B环类黄酮与黄烷的比例可基于预防和治疗特定疾病或病症的适应症和特殊需要来调节。通常，无取代B环类黄酮与黄烷的比例范围可为约99∶1无取代B环类黄酮∶黄烷至约1∶99无取代B环类黄酮∶黄烷。在本发明的具体实施方案中，无取代B环类黄酮与黄烷的比例选自：约90∶10、80∶20、70∶30、60∶40、50∶50、40∶60、30∶70、20∶80和10∶90。在本发明优选的实施方案中，组合物中无取代B环类黄酮与黄烷的比例为约85∶15。
在本发明的一个实施方案中，标准化的无取代B环类黄酮提取物包含纯度为1-99％(重量比)的总无取代B环类黄酮活性化合物，如实施例3、4、和8中所描述。黄芩苷是提取物中的主要活性成分，其在总无取代B环类黄酮中占约50-90％(重量比)。在优选实施方案中，该标准化提取物含有＞70％总无取代B环类黄酮，其中＞75％的无取代B环类黄酮是黄芩苷。
在一个实施方案中，标准化的黄烷提取物包含纯度为1-99％(重量比)的总黄烷活性化合物，如实施例5、6和7中所描述。儿茶素是提取物中的主要活性成分，占总黄烷的50-90％(重量比)。在优选实施方案中，该标准化黄烷提取物含有＞50％总黄烷，其中＞70％的黄烷是儿茶素。
在一个实施方案中，通过以99∶1至1∶99(无取代B环类黄酮∶黄烷)的比例混合上述植物提取物或合成的其等价物制备了UP736。无取代B环类黄酮与黄烷的优选比例为85∶15无取代B环类黄酮∶黄烷，如实施例9中所描述。无取代B环类黄酮在UP736中的浓度可以为从约1％至99％，黄烷在UP736中的浓度可以为从99％至1％。在本发明的优选实施方案中，总无取代B环类黄酮在UP736中的浓度为约75％，其中黄芩苷的含量为UP736总重的约60％；总黄烷在UP736中的浓度为约10％，其中儿茶素的含量为约9％。在此实施方案中，UP736中的总活性成分(无取代B环类黄酮加上黄烷)＞总重量的80％。
本发明包括使用酶和体内模型评价无取代B环类黄酮和黄烷的不同组合物，以优化制剂并获得所期望的生理学活性。到目前为止，本发明的申请人没有见到任何关于仅将无取代B环类黄酮和黄烷组合作为主要生物学活性成分来治疗疾病和病症的制剂的报导。无取代B环类黄酮的其中一个芳环没有取代在使得这些化合物有效方面具有非常重要的作用。和许多其它非甾类抗炎药(NSAID)和天然存在的化合物不同，无取代B环类黄酮如黄芩苷在其分子的一侧具有低极性的芳环，而在另一侧具有高极性的葡糖苷酸和两个羟基。这种结构上的排列使得这些化合物可以靶向于组织和细胞。将无取代B环类黄酮和黄烷组合产生在本文中称为UP736的组合物，它为类花生酸系统的COX和LOX途径两者都提供了增效的和有效的调节剂。
本文清楚地证实，无取代B环类黄酮和黄烷的组合提供了更平衡的COX-1和COX-2酶调节。例如，对COX-1的选择性超过150倍的COX-1选择性抑制剂阿司匹林可引起胃肠道副作用。相反，对抗COX-2酶的效能高出50-200倍的选择性COX-2抑制剂Vioxx、塞来考昔和Bextra不会引起同等程度的的胃肠道损伤，然而，这些COX-2选择性药物增加了心血管的危险。
从黄芩中分离的纯化成分黄芩苷对COX-1和COX-2的抑制曲线显示出对COX-2的选择性几乎为两倍(COX-1的IC50测定为0.44μg/mL/酶单位，COX-2的IC50测定为0.28μg/mL/单位)。然而，包含大于90％从儿茶中分离的儿茶素的组合物对COX-1和COX-2的抑制曲线显示出对COX-1的选择性几乎为三倍。对于儿茶素，COX-1抑制的IC50计算为0.11μg/mL/酶单位，对于COX-2的IC50计算为0.42μg/mL/单位。
将从黄芩根提取的无取代B环黄酮与从儿茶树皮分离的黄烷混合物以80∶20的比例组合，获得在下文中称为UP736的组合物，它可提供平衡的COX-1对COX-2选择性，为2∶1。这种制剂提供了黄芩苷的较大COX-2活性与儿茶素的较大COX-1活性之间的平衡，为类花生酸途径提供了最佳调节，而没有与COX-1选择性NSAID相关的胃肠道副作用和与COX-2选择性抑制剂相关的心血管危险。
而且显著的是目前可用的上述药物与天然制剂UP736的作用机理完全不同。阿司匹林、罗非考昔、塞来考昔和伐地考昔通过共价键不可逆地结合至COX酶，以形成牢固结合的酶-抑制剂复合物。这种剧烈的相互作用完全改变了酶和侧袋(side pocket)的活性位置并破坏了酶(Walker等，(2001)Biochem.357：709-718)。另一方面，由于其抗氧化性质，UP736中的类黄酮通过较弱和可逆的结合抑制COX酶。在这种相互作用过程中，COX酶的结构和功能没有被不可逆地改变，从而使得UP736具有更好的耐受性和安全性。
使用体外脂氧合酶筛选测定来评价从儿茶中分离的黄烷提取物对LOX活性的抑制。通过将黄烷添加到无取代B环类黄酮中，UP736还能抑制5-脂氧合酶(LOX)的活性。LOX的抑制导致直接涉及慢性炎症症状的的吞噬性白三烯的积累的降低，而且还可减少潜在的胃肠道副作用。显然无取代B环类黄酮与黄烷的组合提供了显著减少白三烯产生的额外益处。在提高效力和减少如背景技术部分所述的副作用方面，这种白三烯产生的减少到目前为止优于常规非甾类抗炎药如布洛芬。
还通过两种动物研究证实了包含无取代B环类黄酮和黄烷提取物混合物的制剂的优点，这些研究显示这种新组合物具有出人意料的协同作用。用于这两个研究的组合物包含获自木蝴蝶(Oroxylumindicum)种子提取物(10.0g)(lot#040723)的无取代B环类黄酮和源自Urticaria gambir全植物提取物(40.0g)(lot#UG0407-050420)的黄烷的混合物，其中所述木蝴蝶种子提取物的无取代B环类黄酮-白杨黄素含量为62.3％，所述Urticaria gambir全植物提取物的总儿茶素含量为32.5％。将上述两种提取物以80∶20的混合比例组合，得到了称为UP736的制剂(50.0g，Lot#BH-283-14-1)。在急性炎症动物模型即小鼠耳肿胀实验中，使用吲哚美辛作为对照，以100mg/kg的剂量单独口服施用来自于木蝴蝶种子的无取代B环类黄酮提取物、单独口服施用来自Unicaria gambir全植物的黄烷提取物、以及口服施用这些提取物的组合(UP736)。UP736对耳肿胀的抑制(50.8％抑制率)明显优于相同剂量的单独成分，Uncaria gambir提取物和木蝴蝶提取物的抑制率分别为36.5％和31.7％。
在另一个体内的花生四烯酸诱导的小鼠耳肿胀抑制实验中，在称为UP736-K的制剂中也观察到了协同作用，该制剂是以9∶1的比例混合来自黄芩根的包含25％黄芩苷的无取代B环类黄酮提取物和来自Uncaria gambir全植物的40％儿茶素提取物。UP736-K包含24％黄芩苷和4％儿茶素。使用吲哚美辛作为对照，以100mg/kg的剂量单独口服施用来自黄芩根的无取代B环类黄酮提取物、单独口服施用来自Unicaria gambir全植物的黄烷提取物、和口服施用这些提取物的组合(UP736-K)。相对于每种单独的提取物，UP736-K在减少水肿方面显示出了统计学上显著的提高。
此外，由于不同的生物利用度，即生物学上活性的化合物渗入上皮细胞膜的速率和百分比以及生物学上活性的化合物的局部浓度，将所述两种不同类型的化合物(较高极性的黄烷对较低极性的无取代B环类黄酮)组合，可由生物学上活性的黄烷提供快速、就地的(on-site)COX/LOX抑制，并且由生物学上活性的无取代B环类黄酮提供对COX/LOX途径更长期的调节。在口服施用后，UP736中的无取代B环类黄酮需要约两小时到达有效浓度。然而，无取代B环类黄酮的血清浓度将在口服后约10小时内保持高于上述的治疗水平。为了补偿无取代B环类黄酮缺少的迅速的生物利用度，儿茶素型黄烷制剂提供了补充的益处。关于儿茶素、槲皮素和表没食子儿茶素-3-没食子酸酯的生物利用度研究(Kao等，(2000)Endocrinology 141(3)：980-987；Koga和Meydani(2001)Am.J.Clin.Nutr.73：941-948；Lee等，(2002)Cancer Epidemiol.BiomarkerPrevention 11：1025-1032)显示出，儿茶素的Cmax和Tmax发生迅速(约45分钟)，半衰期报导为2小时。因此，通过组合无取代B环类黄酮和黄烷，渗透迅速的儿茶素在口服后约0.5小时内到达有效的血清浓度。当儿茶素浓度降低时，第二活性成分，无取代B环类黄酮达到生物活性浓度，该浓度将在口服施用后持续多至12小时。总之，UP736制剂被设计为具有来自黄烷如儿茶素的迅速原位COX/LOX作用、以及来自无取代B环类黄酮如黄芩苷的更长的持续作用。还可以通过局部递送该制剂实现这种协同和补充作用。
最后，在该制剂的包含大量的无取代B环类黄酮(80重量％)和相对较低浓度的黄烷(20重量％)的优选实施方案中，更有效的抗氧化性的黄烷将作为天然防腐剂防止无取代B环类黄酮的氧化降解并且同时中和及缓冲该组合物，从而使得可以在最佳的pH和离子化条件下递送主要的活性成分——无取代B环类黄酮。儿茶素包含四个酚羟基，这使得该化合物更具酸性，并对氧化应激敏感。儿茶素极高的氧自由基吸收能力(ORAC为20,000)证实了其抗氧化性质。基于纯儿茶素在各种条件下的应激测试，如pH、在H2O2和金属离子的存在下，确定了(得到了数据但未显示)儿茶素在中性条件下在4℃和40℃时都是稳定的，但在碱性条件下或当暴露于金属离子如Fe3+时是不稳定的。即使在弱碱性条件(pH＝7.5)下，儿茶素也会分解。然而，可以用许多防腐剂保护它，这些防腐剂包括但不限于二氯化锡(SnCl2)、硫酸氢钠/焦亚硫酸钠(SBS)、和其它防腐剂。
本发明包括新组合物，该组合物包含至少一种无取代B环类黄酮、至少一种黄烷和至少一种药物的混合物，所述药物选自：可注射的抗凝剂，选自包括但不限于肝素、达肝素、依诺肝素和亭扎肝素；口服抗凝剂，选自包括但不限于华法林、维生素K拮抗剂和维生素K还原酶抑制剂；抗血小板剂，选自包括但不限于阿司匹林、氯吡格雷和双嘧达莫；抗心绞痛药，选自包括但不限于硝酸酯、β-阻断剂、钙阻断剂、血管紧张素转化酶抑制剂、和钾通道激活剂；非甾类抗炎药(NSAID)，选自包括但不限于对乙酰氨基酚、布洛芬、萘普生、双氯芬酸、水杨酸酯和吲哚美辛；或COX-2选择性抑制剂，选自包括但不限于罗非考昔、塞来考昔、依托度酸和美洛昔康。
本发明还包括治疗和预防涉及血小板聚集和血小板诱导型血栓形成的疾病和病症方法。血栓形成是有害的血块形成，该血块可能是静脉或动脉的。UP736能够用作抗血小板剂、抗凝剂和预防剂，用于预防和治疗上述疾病和病症。该方法包括向有需要的主体施用有效量的组合物，该组合物包含合成的和/或从单种植物或多种植物中分离的无取代B环类黄酮和黄烷的混合物。
能够用本发明方法预防和治疗的涉及血小板聚集和血小板诱导型血栓形成的疾病和病症包括但不限于：深静脉血栓形成、肺栓塞、动脉粥样硬化、心肌梗塞、导致脑血管事件的脑血管血栓形成和/或脑血管栓塞、导致局部缺血和梗塞的外周循环和/或微循环血栓形成、涉及左心房血液停滞和血栓形成的心房纤维性颤动、致血栓位置，包括人造植入物如机械心瓣膜、除颤器、用于递送药物的手术植入物、和人造髋、关节和其它外源器官。
本发明还包括使用UP736作为辅助剂和/或协同剂、和/或增效剂的方法，所述方法包括向有需要的主体施用有效量的组合物，该组合物包含至少一种无取代B环类黄酮、至少一种黄烷和至少一种药物的混合物，所述药物选自可注射的抗凝剂、口服抗凝剂、抗血小板剂、抗心绞痛药、非甾类抗炎药(NSAID)或COX-2选择性抑制剂。可注射的抗凝剂的例子包括但不限于肝素、达肝素、依诺肝素和亭扎肝素。口服抗凝剂的例子包括但不限于华法林、维生素K拮抗剂和维生素K还原酶抑制剂。抗血小板剂的例子包括但不限于阿司匹林、氯吡格雷和双嘧达莫。抗心绞痛药的例子包括但不限于硝酸酯、β-阻断剂、钙阻断剂、血管紧张素转化酶抑制剂、和钾通道激活剂。非甾类抗炎药(NSAID)包括但不限于对乙酰氨基酚、布洛芬、萘普生、双氯芬酸、水杨酸酯和吲哚美辛。最后，COX-2选择性抑制剂的例子包括但不限于罗非考昔、塞来考昔、依托度酸和美洛昔康。
本发明还包括减少抗血小板剂、抗凝剂、预防剂、NSAID和COX-2选择性抑制剂的标准剂量，以实现相同或改进的临床效果的方法。该方法包括向有需要的主体施用有效量的组合物，该组合物包含合成的和/或从单个或多种植物中分离的至少一种无取代B环类黄酮和至少一种黄烷的混合物和药学上可接受的载体与所述抗血小板剂、抗凝剂、预防剂、NSAID或COX-2选择性抑制剂的组合。
UP736是源自两种常规植物的天然产物，其包含抗氧化剂和以多种途径有助于身体的其它天然存在的食用化合物(dietarycompound)。UP736不是选择性COX-2抑制剂，而是对COX-1的选择性比对COX-2的选择性高2.25倍，而且此外天然抑制5-脂氧合酶(LOX)，该酶调节产生多种血管舒张的和趋化性的白三烯的途径。根据酶抑制测定，与高度选择性COX-2药物——罗非考昔和塞来考昔——相比，UP736对COX-2的天然抑制活性低约50-400倍，如表1所示。
表1.UP736相对于已知的COX-2抑制剂的COX-2活性
    化合物   相对于COX-1的COX-2选择性
    罗非考昔   250
    塞来考昔   30
    Licofelone   1
    UP736   0.44
    吲哚美辛   0.016
    阿司匹林   0.006
UP736还是有效的抗氧化剂，能天然调节NFκB和PPAR-γ的信使RNA的产生，从而导致TNFα、IL-1β、IL-6和其它致炎细胞因子在基因表达水平和蛋白质产生水平上的特异性下调。
本发明还包括与至少一种非甾类抗炎药(NSAID)和至少一种COX-2选择性抑制剂组合使用UP736作为辅助剂和/或协同剂、和/或增效剂的组合物方法，所述非甾类抗炎药包括但不限于对乙酰氨基酚、布洛芬、萘普生、双氯芬酸、水杨酸酯和吲哚美辛；所述COX-2选择性抑制剂包括但不限于罗非考昔、塞来考昔、依托度酸和美洛昔康。所述组合物和方法可减少实现相同或改进的临床效果所需的NSAID剂量；使得与急性或慢性施用NSAID有关的副作用降低，并抵消或对抗急性或慢性施用NSAID的危险。由于TNFα、IL-1β、IL-6和其它如上所述的致炎细胞因子的特异性下调，所述组合物和方法还实现了额外的和/或多种临床益处。
本发明还包括通过将抗血小板剂、抗凝剂、预防剂、NSAID和COX-2选择性抑制剂与UP736组合施用，来降低或消除与急性或慢性施用所述药物相关的副作用的组合物和方法。该方法包括向有需要的主体施用有效量的组合物，所述组合物包含合成的和/或从单个或多种植物中分离的无取代B环类黄酮和黄烷的混合物与所述抗血小板剂、抗凝剂、预防剂、NSAID或COX-2选择性抑制剂和药学上可接受的载体的组合。
本发明还包括通过将抗血小板剂、抗凝剂、预防剂、NSAID和COX-2选择性抑制剂与UP736共同施用，来抵消或对抗与急性或慢性施用所述药物相关的危险的方法。该方法包括向有需要的主体施用有效量的组合物，所述组合物包含合成的和/或从单个或多种植物中分离的无取代B环类黄酮和黄烷的混合物与所述抗血小板剂、抗凝剂、预防剂、NSAID或COX-2选择性抑制剂和药学上可接受的载体的组合。
最后，本发明包括通过共同施用抗血小板剂、抗凝剂、预防剂、NSAID和COX-2选择性抑制剂与UP736的组合，来实现额外的和/或多重临床益处的方法。如上所述，UP736是有效的抗氧化剂，它能调节NFκB和PPAR-γ的信使RNA的产生，从而导致TNFα、IL-1β、IL-6和其它致炎细胞因子在基因表达水平和蛋白质产生水平的特异性下调。该方法包括向有需要的主体施用有效量的组合物，该组合物包含合成的和/或从单种植物或多种植物中分离的无取代B环类黄酮和黄烷的混合物与所述抗血小板剂、抗凝剂、预防剂、NSAID或COX-2选择性抑制剂和药学上可接受的载体的组合。
本发明涉及包含本发明治疗剂的治疗组合物。本发明的治疗剂能够以任意合适的方法施用，包括例如肠胃外、局部、口服或局部(local)给药，例如通过注射或通过气雾剂皮内给药。具体给药方式应取决于所要治疗的病症。预期可通过任何体液、或体液所能达到的任何靶点或任何组织施用本发明的药物。在本发明的优选实施方案中，通过口服剂型给药。这种递送能够局部施用至任何受影响的区域。治疗组合物能够以各种单位剂量形式施用，这取决于给药方法。例如，适于动物口服给药的单位剂量形式包括散剂、片剂、丸剂和胶囊剂。本发明治疗组合物的优选递送方法包括静脉内给药和通过例如注射或局部给药的局部给药。本发明的治疗剂可施用至任何动物，优选为哺乳动物，更优选为人。
对于递送的特定方式，本发明的治疗组合物可以配制成包括其它成分，例如药学上可接受的赋形剂、佐剂和/或载体。例如，本发明的组合物可以配制到待治疗动物可耐受的赋形剂中。这种赋形剂的例子包括但不限于：纤维素、二氧化硅、葡萄糖结合剂(dextrate)、蔗糖、羧甲淀粉钠、磷酸钙、硫酸钙、水、盐水、林格液(Ringer’sSolution)、右旋糖溶液、甘露醇、Hank’s溶液、以及其他含水生理平衡盐溶液。也可使用非水载体如不挥发性油、芝麻油、油酸乙酯或甘油三酯。其他有用的制剂包括含有增粘剂的混悬剂，增粘剂为例如羧甲基纤维素钠、山梨醇或葡聚糖。赋形剂还可含有少量添加剂，如提高等渗性和化学稳定性的物质。缓冲剂的例子包括磷酸盐缓冲剂、碳酸氢盐缓冲剂、三羟甲基氨基甲烷缓冲剂、组氨酸、柠檬酸盐和甘氨酸或它们的混合物，而防腐剂的例子包括硫柳汞、邻或间甲酚、福尔马林和苯甲醇。标准的制剂可以是可注射的液体或可吸收于合适的液体中以作为注射用混悬剂或注射用溶液的固体。因此，在非液体制剂中，赋形剂可以包括右旋糖、人血清蛋白、防腐剂等，并可在给药之前向其中加入无菌水或盐水。
在本发明的一个实施方案中，所述组合物还可包括佐剂或载体。佐剂是通常能在预防和治疗与COX和LOX通道有关的适应症时提高制剂功能的典型物质。合适的佐剂包括但不限于：弗氏佐剂；其它细菌细胞壁成分；铝基盐类；钙基盐类；硅石；硼、组氨酸、硫酸葡糖胺、硫酸软骨素、葡萄糖酸铜、多核苷酸；维生素D、维生素K、类毒素；鲨鱼和牛软骨；血清蛋白；病毒外壳蛋白；其他源自细菌的制剂；γ干扰素；嵌段共聚物佐剂如Hunter′s Titermax佐剂(VaxceLTM.，Inc.Norcross，Ga.)；Ribi佐剂(可获自Ribi ImmunoChemResearch，Inc.，Hamilton，Mont.)；和皂苷及其衍生物如Quil A(可获自Superfos BiosectorA/S，丹麦)。载体为提高治疗组合物在治疗动物中的半衰期的典型化合物。合适的载体包括但不限于：聚合物控释制剂、可生物降解的植入物、脂质体、细菌、病毒、油、酯和二醇类。
本发明的一个实施方案为能够将本发明的组合物缓慢释放至动物内的控释剂型。这里所用的控释剂型包括在控释赋形剂内的本发明组合物。合适的控释载体包括但不限于：生物相容的聚合物、其他聚合物基质、胶囊、微胶囊、微粒、大丸剂制剂(bolus preparation)、渗透泵、扩散装置、脂质体、脂质球(liposphere)和透皮给药系统。本发明的其它控释制剂包括在施用至动物时原位形成固体或凝胶的液体。优选的控释制剂是可生物降解的(即可生物侵蚀的)。
一旦配制好所述治疗组合物，可将它储存在无菌小瓶中作为溶液剂、混悬剂、凝胶剂、乳剂、固体或脱水或冻干粉末；或直接与其他惰性载体一起制成胶囊和/或片剂用于口服。这种剂型可以现成的施用形式储存，或者需要在即将给药前重构。施用包含所述组合物的制剂的用于全身给药的方式可以是通过口服、皮下、肌内、静脉、鼻腔或阴道或是直肠栓剂。
可有效治疗特定失调或病症的组合物的量取决于所述失调或病症的特性，并可由标准临床技术确定。此外，可任选地采用体外或体内测定来帮助确定最佳的剂量范围。所述制剂所用的精确剂量还取决于给药途径和疾病或病症的严重程度或发展，并且应该根据专业人员和每个病人的情况确定。有效剂量可以通过源自体外或动物试验系统的剂量-反应曲线外推得出。例如，通过施用分级剂量的所述组合物并观察所期望的效果，可以容易地确定该组合物的有效量。
本发明的治疗方法包括向有需要的患者内部(interanlly)或局部施用治疗有效量的组合物，所述组合物包含无取代B环类黄酮和黄烷的混合物、或包含至少一种无取代B环类黄酮、一种黄烷和一种药物的混合物，所述药物选自：可注射的抗凝剂、口服抗凝剂、抗血小板剂、抗心绞痛药、非甾类抗炎药(NSAID)或COX-2选择性抑制剂。混合物的纯度包括，但不限于0.01％至100％，其取决于用于获得该化合物的方法学。在优选实施方案中，无取代B环类黄酮和黄烷的混合物和含有其的药物组合物的剂量为有效、无毒的量，通常选自0.01至200mg/kg体重的范围内。本领域技术人员使用常规临床试验能够确定用于治疗特定疾病的最优剂量。
实施例1描述了制备提取物的通用方法。该提取方法从所研究的每一个物种中获得了有机和水提取物。各种物种的提取结果列于表2中。为了有效地鉴定来源于植物提取物的活性化合物，使用了高通量分馏方法，如实施例2所述。简言之，分别使用两种不同的方法分馏了活性有机和水提取物。将馏分收集到96深孔板上。然后测试各馏分的生物学活性。
实施例3描述了屏风草(Scutellaria orthocalyx)有机提取物中所含的活性无取代B环类黄酮的分离、纯化和鉴定。参考图1，阐明了十种化合物，其中黄芩苷被鉴定为主要的活性成分。
实施例4和表3列出了无取代B环类黄酮在来自三种不同植物物种的五种活性植物提取物中的含量和数量。相对于水提取物而言，无取代B环类黄酮更非常多地存在于有机提取物中。
实施例5描述了儿茶有机提取物中所含的活性成分的分离、纯化和鉴定。使用实施例5所述的方法，儿茶素和表儿茶素被鉴定为是来自儿茶根的有机提取物中的两种主要活性化合物，其IC50值为5-7μg/mL。实施例6描述了来自儿茶和Urticaria gambit的活性提取物的HPLC定量。结果列于表4中，该结果显示在儿茶的有机和水提取物中由HPLC确定的黄烷含量分别为30.4％和1.0％。实施例7描述了用于从金合欢属中制备标准化提取物的常规方法。在该实施例中，用不同溶剂系统自儿茶提取黄烷。结果列于表5中。本发明的改进方法包括：用有机溶剂或有机溶剂和/或水的组合提取包含黄烷的经研磨植物生物质；中和的提取物的中和及浓缩；和通过重结晶和/或色谱法纯化所述提取物。从表5中可以看出，80％甲醇水溶液是用于从金合欢属植物中提取黄烷的一种优选溶剂。如上所述，能够从金合欢属和钩藤属植物中分离这些黄烷。本发明的方法可以扩展至从包含这些化合物的任何植物来源中分离这些化合物。
实施例8描述了用于从各种黄芩属物种中制备标准化提取物的通用方法。在实施例8中，用不同的溶剂系统从两种黄芩属物种中提取无取代B环类黄酮。结果列于表6和表7中。本发明的方法包括：用单种或有机溶剂和/或水的组合提取包含无取代B环类黄酮的经研磨植物生物质；中和的提取物的中和及浓缩；和通过重结晶和/或色谱法纯化所述提取物。如上所述，能够从多于二十个科的植物中分离这些无取代B环类黄酮。本发明的方法可以扩展至从包含这些化合物的任何植物来源中分离这些化合物。
实施例9描述了用于制备UP736组合物的通用方法，该组合物包含适当地混合两种标准化提取物，它们分别包含无取代B环类黄酮和黄烷。在实施例9所列的通用方法中，使用分别从金合欢属和黄芩属分离的两种标准化提取物、添加或不添加赋形剂，制备了所述组合物。实施例9所用的金合欢属提取物包含＞60％总黄烷，如儿茶素和表儿茶素，黄芩属提取物包含＞70％无取代B环类黄酮，主要是黄芩苷。黄芩属提取物包含其它少量的无取代B环类黄酮，如表8所列。任选地将一种或多种赋形剂添加到所述组合物中。添加的赋形剂量可以基于所期望的各成分的实际活性含量调整。必须根据各批成分的产品规格和QC结果生成各单个批次产品的混合表。推荐在2-5％范围内的活性成分的附加量以满足产品规格。实施例9举例说明了为一批UP736生成的混合表(Lot#G1702)。还制备了不同混合比例的配制的UP736产品并测试了它们的生物学活性。
实施例10说明了包含UP736和阿司匹林混合物的组合物在抑制花生四烯酸诱导的血小板聚集方面的协同作用。结果列于表9和10中，它们表明尽管单独的UP736在高至10μM的浓度下具有很小的抗聚集活性，但在UP736剂量低至0.007μM时就显著增加了阿司匹林的抗聚集作用。
理论上，降低阿司匹林的剂量能够降低出血并发症的危险。然而，极低剂量的阿司匹林将不能有效地治疗或预防某些疾病和病症。例如，对于急性心肌梗塞的长期治疗，低于75mg的日剂量的作用尚不明确(Hennekens(2002)Am J.Manag.Care 8(22Suppl)：S691-700)。此外，在不响应低剂量阿司匹林的个体中会发生阿司匹林耐药性(Patrono(2005)Thromb.Haemost.8：1597-602)。本发明通过使用UP736显著增强由低剂量阿司匹林提供的抗血小板聚集活性而解决了这个问题。
实施例11举例说明了UP736单独使用和与阿司匹林组合使用对出血时间的作用很小。结果列于表11-14中。
注意在本申请全文中提供了多个引文。每一个引文都被特别地全文纳入本文作为参考。
下列实施例仅仅是为了说明性的目的而提供，并非用于限制本发明的范围。
实施例
下列实施例仅仅是为了说明的目的而提供，并非用于限制本发明的范围。
实施例1.从金合欢属、钩藤属和黄芩属植物中制备有机和水提取物
将来自儿茶树皮、毛钩藤(Uncaria hirsute)地上部分、华钩藤(Uncaria sinensis)地上部分、猫爪草(Uncaria tomentosa)树皮、直萼黄芩(Scutellaria orthocalyx)根、黄芩(Scutellaria baicalensis)根或美黄芩(Scutellaria lateriflora)全株的植物材料研磨成粒径不大于2mm的颗粒。然后将研细的干植物材料(60g)转移至锥形瓶中并添加甲醇：二氯甲烷(1∶1)(600mL)。将混合物震荡一小时，过滤，并再次用甲醇：二氯甲烷(1∶1)(600mL)提取生物质。合并有机提取液，真空蒸发得到有机提取物(见下表2)。在有机提取之后，将该生物质风干并用超纯水(600mL)提取一次。过滤水溶液并冷冻干燥以得到水提取物(见下表2)。
表2：金合欢属、钩藤属和黄芩属物种的有机和水提取物的收率
植物来源 数量   有机提取物   水提取物
儿茶树皮 60g   27.2g   10.8g
直萼黄芩(Scutellaria orthocalyx)根 60g   4.04g   8.95g
黄芩(Scutellaria baicalensis)根 60g   9.18g   7.18g
美黄芩(Scutellaria lateriflora)(全株) 60g   6.54g   4.08g
毛钩藤(Uncaria hirsute)地上部分 60g   2.41g   0.90g
华钩藤(Uncaria sinensis)地上部分 60g   3.94g   1.81g
猫爪草(Uncaria tomentosa)树皮 60g   6.47g   2.31g
实施例2.活性提取物的HTP分馏
将来自活性植物的有机提取物(400mg)装填至预填充的快速柱(2cm ID×8.2cm，10g硅胶)。使用Hitachi高通量纯化(HTP)系统，用梯度流动相(A)50∶50EtOAc∶己烷和(B)甲醇在30分钟内由100％A变为100％B以5mL/min的流速洗脱该柱。用宽波长UV检测器监控分离过程并采用Gilson馏分收集器将馏分以1.9mL/孔收集至96深孔板内。将样品板在低真空度和离心下干燥。用DMSO(1.5mL)溶解每孔中的样品，取部分(100μL)进行生物学抑制测定。
将来自活性植物的水提取物(750mg)溶解于水(5mL)中，通过1μm针头式过滤器过滤并转移至4mL高压液相色谱(HPLC)小瓶中。然后通过自动进样器将该溶液注射到预填充的反相柱上(C-18，15μm粒径，2.5cm ID×10cm接预柱)。使用Hitachi高通量纯化(HTP)系统，用梯度流动相(A)水和(B)甲醇在20分钟内由100％A变为100％B洗脱该柱，然后用100％甲醇以10mL/min的流速洗脱5分钟。用宽波长UV检测器监控分离过程并采用Gilson馏分收集器将馏分以1.9mL/孔收集至96深孔板内。将样品板冷冻干燥。用超纯水(1.5mL)溶解每孔的样品，取部分(100μL)进行生物学抑制测定。
实施例3.源自黄芩属有机提取物的活性无取代B环类黄酮的分离和纯化
将如实施例1所述由直萼黄芩分离的有机提取物(5g)装填至预填充快速柱(120g硅石，40μm粒径32-60μm，25cm×4cm)，并用梯度流动相(A)50∶50 EtOAc∶己烷和(B)甲醇在60分钟内从100％A变为100％B以15mL/min的流速进行洗脱。以10mL/馏分将馏分收集到试管内。真空蒸发溶剂并将各馏分中的样品溶于1mLDMSO，将20μL等分试样转移至96孔浅碟形板并测定生物学活性(数据未显示)。根据生物学测定结果，将活性馏分#31至#39合并并蒸发。HPLC/PDA和LC/MS分析显示主要化合物的保留时间为8.9分钟，MS峰位于272m/e。将产物在C18半制备柱(25cm×1cm)上用梯度流动相(A)水和(B)甲醇进一步纯化，周期为45分钟，流速为5mL/min。收集88个馏分，得到5.6mg浅黄色固体。通过HPLC/PDA和LC/MS并与标准品和NMR数据比较来确定纯度。1HNMR：δppm.(DMSO-d6)8.088(2H，m，H-3′，5′)，7.577(3H，m，H-2′，4′，6′)，6.932(1H，s，H-8)，6.613(1H，s，H-3).MS：[M+1]+＝271m/e。鉴定该化合物为黄芩黄素。
使用制备C-18柱色谱分离了其他无取代B环类黄酮，并使用由黄芩(Scutellaria baicalensis)根(lot#RM052302-01)分离的标准化提取物鉴定，其无取代B环类黄酮含量为82.2％。如图1所示，采用HPLC/PDA/MS阐明11种结构。参照图1，所鉴定的11种化合物为黄芩苷、汉黄芩素-7-葡糖苷酸、木蝴蝶素A7-葡糖苷酸、黄芩黄素、汉黄芩素、白杨黄素-7-葡糖苷酸、5-甲基-汉黄芩素-7-葡糖苷酸、黄芩素、去甲汉黄芩素、白杨黄素和木蝴蝶素A。
实施例4.由直萼黄芩(根)、黄芩(根)和木蝴蝶(种子)分离的活性提取物中无取代B环类黄酮的HPLC定量
确定了无取代B环类黄酮在从3种不同的植物物种中分离的5种活性提取物中的存在和数量，并在表3中给出。应用HPLC对所述无取代B环类黄酮进行定量分析，使用Luna C-18柱(250×4.5mm，5μm)，采用1％磷酸和乙腈，在22分钟内从80％到20％梯度。采用UV检测器在254nm处检测无取代B环类黄酮，并基于保留时间通过与无取代B环类黄酮标准品的对照进行鉴定。
表3活性植物提取物中无取代B环类黄酮的含量
活性提取物   提取物重量   由生物质可提取的％   无取代B环类黄酮总量    无取代B环类黄酮在提取物中的％
  直萼黄芩(水提取物) 8.95g 14.9％ 0.2mg 0.6％
  直萼黄芩(有机提取物) 3.43g 5.7％ 1.95mg 6.4％
  黄芩(水提取物) 7.18g 12.0％ 0.03mg 0.07％
  黄芩(有机提取物) 9.18g 15.3％ 20.3mg 35.5％
  木蝴蝶(有机提取物) 6.58g 11.0％ 0.4mg 2.2％
实施例5.儿茶有机提取物中活性化合物的分离和纯化
将如实施例1所述从儿茶根部分离的有机提取物(5g)装填至预填充快速柱(120g硅石，40μm粒径32-60μm，25cm×4cm)，并用梯度流动相进行洗脱，(A)50∶50 EtOAc∶己烷和(B)甲醇，以15mL/min的流速在60分钟内从100％A变为100％B。以10mL/馏分将馏分收集到试管内。真空蒸发溶剂并将各馏分中的样品溶于DMSO(1mL)，将20μL等分试样转移至96孔浅碟形板并测定生物学活性(数据未显示)。根据生物学测定结果，将活性馏分#32至#41合并并蒸发，得到2.6g固体。HPLC/PDA和LC/MS分析显示两种主要化合物的保留时间分别为15.8和16.1分钟。将产物在C18半制备柱(25cm×1cm)上进一步纯化，装载212.4mg产物，并以梯度流动相(A)水和(B)乙腈(ACN)洗脱60分钟，流速为5mL/min。收集到88个馏分并分离了两种活性化合物，即化合物1(11.5mg)和化合物2(16.6mg)。通过与标准品(儿茶素和表儿茶素)和NMR数据比较，由HPLC/PDA和LC/MS数据确定纯度。
化合物1.13C NMR：δppm(DMSO-d6)27.84(C4)，66.27(C3)，80.96(C2)，93.78(C9)，95.05(C7)，99.00(C5)，114.48(C12)，115.01(C15)，118.36(C16)，130.55(C11)，144.79(C14)，155.31(C6)，156.12(C10)，156.41(C8).1H NMR：δppm.(DMSO-d6)9.150(1H，s，OH)，8.911(1H，s，OH)，8.835(1H，s，OH)，8.788(1H，s，OH)，6.706(1H，d，J＝2Hz，H2′)，6.670(1H，d，J＝8.0Hz，H-6′)，6.578(1H，dd，J＝2，8Hz，H-5′)，5.873(1H，d，J＝2Hz，H8)，5.670(1H，d，J＝2Hz，H6)，4.839(1H，d，J＝4Hz，OH)，4.461(1H，d，J＝7.3Hz，H2)，3.798(1H，m，H3)，2.625(1H，m，H4b)，2.490(1H，m，H4a).MS：[M+1]+＝291m/e。鉴定该化合物为儿茶素。
化合物2.13C NMR：δppm(DMSO-d6)28.17(C4)，64.87(C3)，78.02(C2)，94.03(C9)，95.02(C7)，98.44(C5)，114.70(C12)，114.85(C15)，117.90(C16)，130.56(C11)，144.39(C14)，155.72(C6)，156.19(C10)，156.48(C8).1H NMR：δppm.(DMSO-d6)9.083(1H，s，OH)，8.873(1H，s，OH)，8.777(1H，s，OH)，8.694(1H，s，OH)，6.876(1H，d，J＝2Hz，H2′)，6.646(2H，s，H-5′，6 ’)，5.876(1H，d，J＝2Hz，H8)，5.700(1H，d，J＝2Hz，H6)，4.718(1H，s，OH)，4.640(1H，d，J＝4.5Hz，H2)，3.987(1H，d，J＝4.5Hz，H3)，2.663(1H，dd，J＝4.6，6.3Hz，H4b)，2.463(1H，dd，J＝4.6，6.3Hz，H4a).MS：[M+1]+＝291m/e.鉴定该化合物为表儿茶素。
实施例6.源自儿茶和Unicaria gambir的活性提取物的HPLC定量
使用光电二极管阵列检测器(HPLC/PDA)和Luna C18柱(250mm×4.6mm)，通过HPLC对分离自儿茶木芯的有机和水提取物中黄烷的含量进行了定量。在20分钟内，使用梯度乙腈从10％至30％ACN将黄烷由柱上洗脱，然后用60％ACN洗脱5分钟。结果如表4所示。图2显示HPLC纯化图。以儿茶素和表儿茶素为标准品，根据保留时间和PDA数据定量黄烷。两种主要黄烷的保留时间分别为12.73分钟和15.76分钟。
表4.活性植物提取物中的黄烷含量
  来自儿茶木芯的活性提取物     提取物重量   由生物质可提取的％     黄烷在提取物中的％
  水提取物     10.8g   18.0％     0.998％
  有机提取物     27.2g   45.3％     30.37％
使用光电二极管阵列检测器(HPLC/PDA)和Luna C18柱(250mm×4.6mm)，通过HPLC对分离自Unicaria gambir全株的标准化提取物(Lot#UG0407-050420)中的黄烷含量进行了定量。在20分钟内，使用梯度乙腈从10％至30％ACN将黄烷由柱中洗脱，然后用60％ACN洗脱5分钟。使用儿茶素为标准品根据保留时间和PDA数据定量黄烷为包含28.6％儿茶素和3.9％表儿茶素。
实施例7.由儿茶制备标准化提取物
用以下溶剂系统提取儿茶(500mg研细的树皮)。(1)100％水，(2)80∶20水∶甲醇，(3)60∶40水∶甲醇，(4)40∶60水∶甲醇，(5)20∶80水∶甲醇，(6)100％甲醇，(7)80∶20甲醇∶THF，(8)60∶40甲醇∶THF。将提取物浓缩并真空干燥。通过HPLC，使用光电二极管阵列检测器(HPLC/PDA)和250mm×4.6mm C18柱鉴定各提取物中的化学成分。以儿茶素和表儿茶素作为标准品，根据保留时间和PDA数据定量化学成分。结果列于表5中。如表5所示，以80％甲醇/水溶剂提取得到的黄烷提取物的黄烷成分浓度最高。
表5.用于由儿茶产生标准化黄烷提取物的溶剂
提取溶剂 提取物重量   由生物质可提取的％   儿茶素总量     儿茶素在提取物中的％
  100％水 292.8mg   58.56％   13mg     12.02％
  水∶甲醇(80∶20) 282.9mg   56.58％   13mg     11.19％
  水∶甲醇(60∶40) 287.6mg   57.52％   15mg     13.54％
  水∶甲醇(40∶60) 264.8mg   52.96％   19mg     13.70％
  水∶甲醇(20∶80) 222.8mg   44.56％   15mg     14.83％
  100％甲醇 215.0mg   43.00％   15mg     12.73％
  甲醇∶THF(80∶20) 264.4mg   52.88％   11mg     8.81％
  甲醇∶THF(60∶40) 259.9mg   51.98％   15mg     9.05％
实施例8.从多种黄芩属物种中制备标准化的无取代B环类黄酮提取物
用25mL如下溶剂系统提取直萼黄芩(500mg研细的根)两次。(1)100％水，(2)80∶20水∶甲醇，(3)60∶40水∶甲醇，(4)40∶60水∶甲醇，(5)20∶80水∶甲醇，(6)100％甲醇，(7)80∶20甲醇∶THF，(8)60∶40甲醇∶THF。将提取物合并，浓缩并真空干燥。通过HPLC，使用光电二极管阵列检测器(HPLC/PDA)和250mm×4.6mm C18柱鉴定各提取物中的化学成分。以黄芩黄素、黄芩苷、黄芩素和汉黄芩素作为标准品，根据保留时间和PDA数据定量化学成分。结果列于表6。
表6.从直萼黄芩提取的无取代B环类黄酮的定量
提取溶剂 提取物重量   由生物质可提取的％ 类黄酮总量     类黄酮在提取物中的％
  100％水 96mg   19.2％ 0.02mg     0.20％
  水∶甲醇(80∶20) 138.3mg   27.7％ 0.38mg     0.38％
  水∶甲醇(60∶40) 169.5mg   33.9％ 0.78mg     8.39％
  水∶甲醇(40∶60) 142.2mg   28.4％ 1.14mg     11.26％
  水∶甲醇(20∶80) 104.5mg   20.9％ 0.94mg     7.99％
  100％甲醇 57.5mg   11.5％ 0.99mg     10.42％
  甲醇∶THF(80∶20) 59.6mg   11.9％ 0.89mg     8.76％
  甲醇∶THF(60∶40) 58.8mg   11.8％ 1.10mg     10.71％
用50mL甲醇和水的如下混合物提取黄芩(1000mg研细的根)两次：(1)100％水，(2)70∶30水∶甲醇，(3)50∶50水∶甲醇，(4)30∶70水∶甲醇，(5)100％甲醇。将提取物合并，浓缩并在低真空下干燥。通过HPLC，使用光电二极管阵列检测器(HPLC/PDA)和250mm×4.6mm C18柱鉴定化学成分。以黄芩黄素、黄芩苷、黄芩素和汉黄芩素作为标准品，根据保留时间和PDA数据定量各提取物中的化学成分。结果列于表7。
表7.从黄芩中提取的无取代B环类黄酮的定量
提取溶剂 提取物重量   由生物质可提取的％   类黄酮总量     类黄酮在提取物中的％
  100％水 277.5mg   27.8％   1mg     0.09％
  水∶甲醇(70∶30) 338.6mg   33.9％   1.19mg     11.48％
  水∶甲醇(50∶50) 304.3mg   30.4％   1.99mg     18.93％
  水∶甲醇(30∶70) 293.9mg   29.4％   2.29mg     19.61％
  100％甲醇 204.2mg   20.4％   2.73mg     24.51％
实施例9.用来自黄芩根的标准化无取代B环类黄酮提取物和来自儿茶树皮的标准化黄烷提取物制备制剂
采用分别从金合欢属和黄芩属中分离的两种标准化提取物，连同一种或多种赋形剂配制本文中称为UP736的新组合物。下面给出了制备这种组合物的通用实施例。该实施例所用的金合欢属提取物含有＞60％的总黄烷，为儿茶素和表儿茶素，黄芩属提取物含有＞70％无取代B环类黄酮，其主要为黄芩苷。黄芩属提取物包含如表8所列的其他少量无取代B环类黄酮。向组合物中添加一种或多种赋形剂。黄烷和无取代B环类黄酮的比例可以根据适应症和对产品的生物学活性的具体要求调节。赋形剂的量可以基于各成分的实际活性含量调节。必须根据各批成分的产品规格和QC结果生成各单个批次产品的混合表。推荐在2-5％范围的活性成分附加量以满足产品规格。表8说明了为一批UP736生成的混合表(Lot#G1702)。
将无取代B环类黄酮含量为82.2％(黄芩苷)的黄芩根提取物(38.5kg)(lot#RM052302-01)；总黄烷含量为80.4％的儿茶树皮提取物(6.9kg)(lot#RM052902-01)；以及赋形剂(5.0kg Candex)合并，得到混合比例为85∶15的UP736制剂(50.4kg)。表8显示该特定UP736批次(Lot#G1702)中活性无取代B环类黄酮和黄烷的量，其用实施例4和6中的方法确定。
参见表8，该特定UP736批次含有86％总活性成分，包含75.7％无取代B环类黄酮和10.3％黄烷。以胶囊剂的形式由该批次UP736(50.0kg)生产两种不同剂量水平的最终产品：每剂量125mg(60个胶囊)和每剂量250mg(60个胶囊)。
采用相同方法，使用来自黄芩的标准化无取代B环类黄酮提取物和来自儿茶树皮的标准化黄烷提取物的组合物制备另外两批UP736，所述组合物的混合比例分别为50∶50和20∶80。
表8.UP736的无取代B环类黄酮和黄烷含量
    活性成分     ％含量
    1类黄酮
    a黄芩苷     62.5％
    b少量类黄酮
    i汉黄芩素-7-葡糖苷酸     6.7％
    ii木蝴蝶素A7-葡糖苷酸     2.0％
    iii黄芩黄素     1.5％
    iv汉黄芩素     1.1％
    v白杨黄素-7-葡糖苷酸     0.8％
    vi5-甲基-汉黄芩素-7-葡糖苷酸     0.5％
    vii黄芩素     0.3％
    viii去甲汉黄芩素     0.3％
    ix白杨黄素     ＜0.2％
    x木蝴蝶素A     ＜0.2％
    c无取代B环类黄酮总量     75.7％
    2黄烷
    a儿茶素     9.9％
    b表儿茶素     0.4％
    c黄烷总计     10.3％
    3总活性成分     86％
实施例10.包含UP736和阿司匹林混合物的组合物对抑制花生四烯酸诱导的血小板聚集的协同作用的证实
在血小板聚集测试中，使用从新西兰兔制备的富血小板血浆，证实了包含UP736和阿司匹林混合物的组合物对抑制花生四烯酸诱导的血小板聚集的协同作用。将兔(2.75±0.25kg)用柠檬酸三钠(最终浓度为0.13M)处理。将UP736、阿司匹林或其组合溶于0.3％DMSO，然后与所述血浆在37℃温育5分钟。通过聚集物的光密度来定量所述化合物的激动或拮抗作用。用于激动作用的显著性标准是相对于花生四烯酸响应有≥50％血小板聚集。用于拮抗作用的显著性标准是抑制≥50％花生四烯酸诱导的血小板聚集。在该测试中，在富血小板兔血浆中，分别测试不同浓度的UP736(10、2和0.2μM)和阿司匹林(30和3μM)作为血小板聚集的激动剂或拮抗剂。表9显示了实验结果(实验#1)。
表9.UP736和阿司匹林的混合物对抑制
AA诱导的血小板聚集的协同作用
阿司匹林浓度(μM) UP736浓度(μM)   N   激动作用   拮抗作用
000 10.02.00.2   222   0％0％0％   3％0％0％
3.03.03.0 10.02.00.2   222   0％0％0％   100％100％100％
30.03.0 00   22   0％0％   100％1％
在以相同实验条件下进行的另一个测试(实验#2)中，测定较低浓度(0.2、0.067、0.022和0.007μM)的UP736和浓度为3μM的阿司匹林的混合物。结果列于表10中。
血小板聚集研究的结果证实，单独的UP736在高至10μM的浓度下具有极小的抗聚集活性(表9和表10)。然而，即使在所测定的最低浓度(0.007μM)下，UP736也能显著提高极低剂量阿司匹林(3μM)的抗血小板聚集活性。
表10.UP736和阿司匹林的混合物对抑制
AA诱导的血小板聚集的协同作用
阿司匹林浓度(μM)   UP736浓度(μM)   N   激动作用   拮抗作用
0   0.2   2   0％   9％
3.0   0.2   2   0％   100％
3.03.03.0   0.0670.0220.007   222   0％0％0％   100％100％100％
3.0   0   2   0％   8％
实施例11.UP736和UP736与阿司匹林的混合物对出血时间的作用
尽管UP736表现出与阿司匹林在抑制血小板聚集方面的协同作用(表9和10)，但单独的UP736和与阿司匹林的组合都没有显示出对小鼠出血时间有充分的作用。根据Minsker和Kling(1997)Thrombosis Research 10：619-622)和Butler等，(1982)ThrombHaemostas 47：46-49描述的方法进行出血时间测定。在标准化切断各小鼠尾尖(1.0mm)前一小时，向五只ICR雄性小鼠施用受试物。立即将束缚在固定器上的小鼠垂直悬挂起来，使尾尖浸入包含37℃盐水的试管中。没有设置最大中止时间。当观察到真正出血时开始测量，在出血中断15秒或更长的任何时间后停止测量。使用Student t-检验分析数据。在一个测定(实验#3)中，向每组5只ICR雄性小鼠口服单独施用3、10、65和100mg/kg阿司匹林或单独或与3、10和65mg/kg阿司匹林组合施用剂量为100mg/kg的UP736。结果列于表11中，该表显示了治疗组相对于载体对照组的平均出血时间和出血时间增加百分比。参考表11，结果证实UP736对出血时间的作用并不显著，UP736与从3mg/kg至65mg/kg浓度逐渐升高的阿司匹林的组合的作用有限，并且小于由单独100mg/kg阿司匹林提供的作用。在相同实验条件下重复该测定(实验#4)。结果列于表12中，该表显示了治疗组相对于载体对照组的平均出血时间和出血时间增加百分比(n＝5)。从表11和12中能够看出，从两个实验中获得了非常一致的结果。合并由两个实验得到的数据并表示在表13和图3中(n＝9-10)。
表11.实验#3(n＝5)中平均出血时间和出血时间增加百分比
治疗组   平均出血时间±SD(秒)   相对于载体对照组的变化％
    载体   65±11.0   -
    3mg/kg阿司匹林   77.2±13.0   18.7↑
    10mg/kg阿司匹林   74.4±15.4   14.5↑
    65mg/kg阿司匹林   105±15.1   61.5*↑
    100mg/kg阿司匹林   119±14.0   83*↑
    3mg/kg阿司匹林+100mg/kg UP736 82±12.6 26.2+↑
    10mg/kg阿司匹林+100mg/kg UP736 76.5±17.7 17.7+↑
    65mg/kg阿司匹林+100mg/kg UP736 113.2±33.3 74.2+↑
    100mg/kg UP736   76.4±13.0   17.5↑
表12.实验#4(n＝5)中平均出血时间和出血时间增加百分比
治疗组   平均出血时间±SD(秒)   相对于载体对照组的变化％
    载体   72.6±13.0   -
    3mg/kg阿司匹林   89.4±9.7   23.1↑
    10mg/kg阿司匹林   84.6±9.0   16.5↑
    65mg/kg阿司匹林   96±6.4   32.2*↑
    100mg/kg阿司匹林   126.2±14.3   73.8*↑
    3mg/kg阿司匹林+100mg/kg UP736 92.0±9.3 26.7*↑
    10mg/kg阿司匹林+100mg/kg UP736 92.6±16.4 27.5*↑
    65mg/kg阿司匹林+100mg/kg UP736 112.8±16.0 55.3*↑
    100mg/kg UP736   83.4±6.8   14.9↑
表13.平均出血时间和出血时间增加百分比(实验#3和#4)(n＝9-10)
治疗组   平均出血时间±SD(秒)   相对于载体对照组的变化％ P值
    载体   68.8±12.0   -   -
    3mg/kg阿司匹林   83.3±12.6   21.7↑   0.016854
    10mg/kg阿司匹林   79.5±13.1   15.6↑   0.072734
    65mg/kg阿司匹林   100.5±11.9   46.1↑   1.32E-05
    100mg/kg阿司匹林   122.6±13.9   78.2↑   2.85E-08
    3mg/kg阿司匹林+100mg/kg UP736 87.0±11.7 26.5↑ 0.002958
    10mg/kg阿司匹林+100mg/kg UP736 85.4±17.9 24.1↑ 0.028458
    65mg/kg阿司匹林+100mg/kg UP736 113.0±25.5 64.2↑ 0.00013
    100mg/kg UP736   79.9±10.5   16.1↑   0.041085
为了证实出血时间结果，在独立的研究(实验#5)中，使用改良的程序再次测试UP736或UP736与阿司匹林的组合。在切断各小鼠尾尖(0.3mm)前1小时，向各组5只ICR源雄性小鼠(重量22±2g)组单独或与3、10和30mg/kg阿司匹林组合口服施用100mg/kg剂量的UP736。此外，类似地给小鼠单独施用3、10、30和100mg/kg阿司匹林。立即将固定器中的小鼠垂直悬挂起来，使各尾巴的末端2cm浸入包含37℃盐水的试管中。设置最大中止时间为180秒。如果出血在180秒观察期内的任何时间停止15秒或更长时间，则中断测量，不应考虑随后的任何出血。认为出血时间相对于对照组动物延长百分之五十或更多(50％)是显著的。结果与从上述实验(实验#3和#4)中观察到的结果一致。剂量为100mg/kg的UP736对出血时间的作用不显著，100mg/kg UP736与30mg/kg阿司匹林组合的作用小于由单独100mg/kg阿司匹林提供的作用(表14和图4)。
表14.实验#5(n＝5)中平均出血时间和出血时间增加百分比
治疗组     平均出血时间±SD(秒)   相对于载体对照组的变化％
  载体     44.4±15.0   -
  3mg/kg阿司匹林     42.8±26.2   0
  10mg/kg阿司匹林     39.8±22.4   0
  30mg/kg阿司匹林     56.4±27.3   27↑
  100mg/kg阿司匹林     75.0±38.8   70*↑
  载体2(20％DMSO)     55.4±32.5   -
  3mg/kg阿司匹林+100mg/kg UP736 53.2±27.1 0
  10mg/kg阿司匹林+100mg/kg UP736 69.6±45.4 27↑
  30mg/kg阿司匹林+100mg/kg UP736 87.2±59.2 58*↑
  100mg/kg UP736     45.4±23.1   0

Claims (39)

1.一种组合物，其包含至少一种无取代B环类黄酮、至少一种黄烷和至少一种药物的混合物，所述药物选自：可注射的抗凝剂、口服抗凝剂、抗血小板剂、抗心绞痛药、非甾类抗炎药(NSAID)或环氧合酶-2(COX-2)选择性抑制剂。
2.权利要求1的组合物，其中在所述组合物中，无取代B环类黄酮与黄烷的比例选自约99∶1无取代B环类黄酮∶黄烷至约1∶99无取代B环类黄酮∶黄烷的范围。
3.权利要求2的组合物，其中在所述组合物中无取代B环类黄酮∶黄烷的比例为约85∶15。
4.权利要求1的组合物，其中所述无取代B环类黄酮选自具有下面结构的化合物：
Figure S2006800163286C00011
其中
R1、R2、R3、R4和R5独立地选自：-H、-OH、-SH、-OR、-SR、-NH2、-NHR、-NR2、-NR3 +X-，单个糖或者多个糖组合的碳、氧、氮或硫糖苷，所述糖包括戊醛糖、甲基戊醛糖、己醛糖、己酮糖及它们的化学衍生物；
其中
R是具有1-10个碳原子的烷基；及
X选自药学上可接受的抗衡阴离子，包括氢氧根、氯离子、碘离子、硫酸根、磷酸根、乙酸根、氟离子和碳酸根。
5.权利要求1的组合物，其中所述黄烷选自具有下面结构的化合物：
Figure S2006800163286C00021
其中
R1、R2、R3、R4和R5独立地选自：H、-OH、-SH、-OCH3、-SCH3、-OR、-SR、-NH2、-NRH、-NR2、-NR3 +X-、取代基的酯，独立地选自没食子酸酯、乙酸酯、肉桂酰基和羟基肉桂酰基酯、三羟基苯甲酰酯和咖啡酰酯；单个糖或者多个糖组合的碳、氧、氮或硫糖苷，所述糖包括戊醛糖、甲基戊醛糖、己醛糖、己酮糖及它们的化学衍生物；二聚、三聚以及其他多聚黄烷；
其中
R是具有1-10个碳原子的烷基；及
X选自药学上可接受的抗衡阴离子，包括但不限于氢氧根、氯离子、碘离子、硫酸根、磷酸根、乙酸根、氟离子、碳酸根。
6.权利要求1的组合物，其中所述无取代B环类黄酮和所述黄烷获自有机合成，或者是由植物分离的。
7.权利要求6的组合物，其中所述无取代B环类黄酮和所述黄烷从选自下列的植物部位中分离：茎、茎皮、树干、树皮、嫩枝、块茎、根、根皮、嫩芽、种子、根茎、花及其他生殖器官、叶及其他地上部分。
8.权利要求6的组合物，其中所述无取代B环类黄酮由选自下列科的植物中分离：番荔枝科、菊科(Asteraceae)、紫葳科、使君子科、菊科(Compositae)、大戟科、唇形科、樟科、豆科、桑科、松科、凤尾蕨科、中国蕨科、榆科和姜科。
9.权利要求6的组合物，其中所述无取代B环类黄酮由选自下列属的植物中分离：假鹰爪属、Achyrocline、木蝴蝶属、榆绿木属、香青属、山芫荽属、鼠麴草属、蜡菊属、矢车菊属、泽兰属、亚马逊巴香草、乌桕属、黄芩属、Molsa、羽萼木属、水苏属、牛至属、新塔花属、山胡椒属、黄肉楠属、金合欢属、鱼藤属、甘草属、崖豆藤属、水黄皮属、灰毛豆属、波罗蜜属、榕属、粉叶蕨属、隐囊蕨属、松属、榆属和山姜属。
10.权利要求6的组合物，其中所述黄烷由选自下列种的植物中分离：儿茶、金合欢(Acacia concinna)、金合欢(Acacia farnesiana)、阿拉伯胶树、Acacia speciosa、阿拉伯金合欢、Acacia caesia、羽叶金合欢、藤金合欢、黑荆、Acacia picnantha、银荆、大叶相思、Acaciaholoserecia和马占相思；Uncaria gambir、恒春钩藤、Uncaria hirsute、Uncaria africana、Uncaria elliptica、Uncaria orientalis、Uncariaattenuate、Uncaria acida、北越钩藤、白钩藤、Uncaria sterrophylla、Uncaria bernaysii、华钩藤、Uncaria callophylla、钩藤、猫爪草、Uncarialongiflora、Uncaria hirsute、Uncaria cordata和Uncaria borneensis。
11.权利要求6的组合物，其中所述无取代B环类黄酮从一种或多种黄芩属植物中分离，所述黄烷从一种或多种金合欢属和钩藤属植物中分离。
12.权利要求1的组合物，其中所述可注射的抗凝剂选自肝素、达肝素、依诺肝素和亭扎肝素。
13.权利要求1的组合物，其中所述口服抗凝剂选自华法林、维生素K拮抗剂和维生素K还原酶抑制剂。
14.权利要求1的组合物，其中所述抗血小板剂选自阿司匹林、氯吡格雷(clodipogrel)和双嘧达莫。
15.权利要求1的组合物，其中所述抗心绞痛药选自硝酸酯、β-阻断剂、钙阻断剂、血管紧张素转化酶抑制剂、和钾通道激活剂。
16.权利要求1的组合物，其中所述NSAID选自对乙酰氨基酚、布洛芬、萘普生、双氯芬酸、水杨酸酯和吲哚美辛。
17.权利要求1的组合物，其中所述COX-2选择性抑制剂选自罗非考昔、塞来考昔、依托度酸和美洛昔康。
18.一种治疗和防止涉及血小板聚集和血小板诱导型血栓形成的疾病和病症的方法，该方法包括向有需要的主体施用有效量的组合物，该组合物包含无取代B环类黄酮和黄烷的混合物以及药学上可接受的载体。
19.权利要求18的方法，其中所述组合物的施用剂量选自0.01至200mg/kg体重。
20.权利要求18的方法，其中给药途径选自：口服、局部、栓剂、静脉内和皮内、胃内(intragaster)、肌肉内、腹膜内和静脉内给药。
21.权利要求18的方法，其中所述涉及血小板聚集和血小板诱导型血栓形成的疾病和病症选自：深静脉血栓形成、肺栓塞、动脉粥样硬化、心肌梗塞、导致脑血管事件的脑血管血栓形成和/或脑血管栓塞、导致局部缺血和梗塞的外周循环和/或微循环血栓形成、涉及左心房血液停滞和血栓形成的心房纤维性颤动、致血栓位置，包括人造植入物如机械心瓣膜、除颤器、用于递送药物的手术植入物、和人造髋、关节和其它外源器官。
22.一种使用组合物作为辅助剂和/或协同剂、和/或增效剂来递送药物的方法，该组合物包含至少一种无取代B环类黄酮和至少一种黄烷的混合物，所述药物选自可注射的抗凝剂、口服抗凝剂、抗血小板剂、抗心绞痛药、非甾类抗炎药(NSAID)或环氧合酶-2(COX-2)选择性抑制剂，所述方法包括向有需要的主体组合施用所述药物与所述无取代B环类黄酮与黄烷的混合物的组合。
23.权利要求22的方法，其中所述可注射的抗凝剂选自肝素、达肝素、依诺肝素和亭扎肝素。
24.权利要求22的方法，其中所述口服抗凝剂选自华法林、维生素K拮抗剂和维生素K还原酶抑制剂。
25.权利要求22的方法，其中所述抗血小板剂选自阿司匹林、氯吡格雷和双嘧达莫。
26.权利要求22的方法，其中所述抗心绞痛药选自硝酸酯、β-阻断剂、钙阻断剂、血管紧张素转化酶抑制剂、和钾通道激活剂。
27.权利要求22的方法，其中所述NSAID选自对乙酰氨基酚、布洛芬、萘普生、双氯芬酸、水杨酸酯和吲哚美辛。
28.权利要求22的方法，其中所述COX-2选择性抑制剂选自罗非考昔、塞来考昔、依托度酸和美洛昔康。
29.权利要求22的方法，其中所述组合物的施用剂量选自0.01至200mg/kg体重。
30.权利要求22的方法，其中给药途径选自：口服、局部、栓剂、静脉内和皮内、胃内、肌肉内、腹膜内和静脉内给药。
31.一种减少药物标准剂量的方法，所述药物选自抗血小板剂、抗凝剂、预防剂、NSAID和COX-2选择性抑制剂，所述方法包括施用组合物，该组合物包含至少一种无取代B环类黄酮和至少一种黄烷的混合物与所述抗血小板剂、抗凝剂、预防剂或NSAID的组合。
32.权利要求31的方法，其中所述组合物的施用剂量选自0.01至200mg/kg体重。
33.权利要求31的方法，其中给药途径选自：口服、局部、栓剂、静脉内和皮内、胃内、肌肉内、腹膜内和静脉内给药。
34.一种减少或消除由急性或慢性施用药物所引起的副作用的方法，所述药物选自抗血小板剂、抗凝剂、预防剂和NSAID，所述方法包括施用组合物，该组合物包含至少一种无取代B环类黄酮和至少一种黄烷的混合物与所述抗血小板剂、抗凝剂、预防剂、NSAID或COX-2选择性抑制剂的组合。
35.权利要求34的方法，其中所述组合物的施用剂量选自0.01至200mg/kg体重。
36.权利要求34的方法，其中给药途径选自：口服、局部、栓剂、静脉内和皮内、胃内、肌肉内、腹膜内和静脉内给药。
37.一种抵消或对抗急性或慢性施用药物的危险的方法，所述药物选自抗血小板剂、抗凝剂、预防剂、NSAID和COX-2选择性抑制剂，所述方法包括施用组合物，该组合物包含至少一种无取代B环类黄酮和至少一种黄烷的混合物与所述抗血小板剂、抗凝剂、预防剂或NSAID的组合。
38.权利要求37的方法，其中所述组合物的施用剂量选自0.01至200mg/kg体重。
39.权利要求37的方法，其中给药途径选自：口服、局部、栓剂、静脉内和皮内、胃内、肌肉内、腹膜内和静脉内给药。
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