ITRM20110600A1 - Uso di una miscela di catechina ed epicatechina per l'inibizione della funzione piastrinica - Google Patents
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Landscapes
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Description
DESCRIZIONE
“Uso di una miscela di catechina ed epicatechina per l’inibizione della funzione piastrinicaâ€
SETTORE DELL’INVENZIONE
La presente invenzione concerne miscele di flavonoidi, in particolare catechina ed epicatechina, in grado di svolgere un’azione sinergica nell’inibire la funzione piastrinica. Queste miscele hanno una potenziale applicazione nella terapia antipiastrinica, in tutti i campi in cui sia necessaria una inibizione della funzione piastrinica, e nella terapia antiossidante, in tutti quei campi in cui sia necessaria una inibizione dello stress ossidativo.
TECNICA ANTERIORE
I polifenoli sono una classe di sostanze conosciute per il loro ruolo di antiossidanti. Negli ultimi decenni, si à ̈ osservato un crescente interesse attorno ai polifenoli in seguito al risultato di studi prospettici ed epidemiologici che hanno mostrato gli effetti benefici di queste sostanze, soprattutto in ambito di prevenzione delle malattie cardiovascolari (1-5). Fra i nutrienti ad alto contenuto di polifenoli va segnalato il cacao, di cui à ̈ particolarmente nota l’attività vasodilatante ed antipiastrinica (6).
La frutta, le bevande (succhi di frutta, vino, te, caffà ̈, cioccolato e birra), vegetali, legumi e cereali sono le principali fonti di polifenoli nella dieta.
I flavonoidi sono una classe di molecole antiossidanti note per migliorare il danno ossidativo delle proteine sia in vivo che in vitro. Sono composti polifenolici presenti nelle piante, nella frutta e nei vegetali. La struttura del flavonoide consiste di due anelli aromatici, legati insieme da tre atomi di carbonio per formare un eterociclo ossigenato.
I flavonoidi potrebbero essere divisi in molte classi, in base alle caratteristiche dell’eterociclo: flavonoli (quercetina, chemferolo), flavoni (luteolina, apigenina), isoflavoni (genisteina, daidzeina), antociani (delfinidina, cianidina), flavanoli (epicatechina, catechina), proantocianidine e flavanoni (esperitina).
Attualmente à ̈ stato supposto che i flavonoidi esercitano una serie di effetti benefici sulla salute umana grazie alle loro proprietà anti-ossidanti come scavenger dei radicali liberi (7, 8). Studi epidemiologici hanno indicato che incidenze più basse di malattie cardiovascolari e aterosclerosi sono associate ad un consumo di flavonoidi dalla frutta, dai vegetali e dal vino rosso (9-11).
Le catechine, composti fenolici presenti nel tà ̈, cacao e vino rosso, sono le molecole che danno il maggior contributo di potere antiossidante tra i flavonoidi e si à ̈ dimostrato che hanno effetti antiossidanti in molti sistemi biologici tra cui le piastrine (12-20).
Studi prospettici quali ad esempio l’European Prospective Investigation into Cancer and Nutrition (21) hanno evidenziato un tasso più basso di infarto miocardico e di ictus nel quartile dei soggetti con il più elevato consumo di cioccolato (7,5 g / die). Lo Stockholm Heart Epidemiology Program (22), ha mostrato (nei pazienti con pregresso infarto miocardico acuto) una riduzione di mortalità cardiaca nel gruppo a più alto consumo di cioccolato in pazienti non diabetici.
Tuttavia, la mancanza di studi d’intervento randomizzati/controllati limitano le conclusioni ed il reale utilizzo di supplementi ricchi di polifenoli.
Le proprietà benefiche dei polifenoli sul sistema cardiovascolare possono essere dovute alla loro capacità di esercitare effetti antipertensivi (10), di ridurre i livelli di colesterolo (6) e di migliorare la sensibilità all'insulina (6).
Il consumo di cibi ricchi di polifenoli come il cacao (6) Ã ̈ in grado di ridurre la pressione sanguigna; uno studio di Taubert ha mostrato una diminuzione della pressione sistolica e diastolica dopo l'assunzione di cioccolato fondente; l'effetto ipotensivo era associato ad un aumento dei livelli circolanti di S-nitroso-glutatione (23), una specie bioattiva di ossido nitrico. Una meta-analisi di studi randomizzati controllati ha confermato l'azione ipotensiva di polifenoli contenuti nel cacao (24); tuttavia, considerando la piccola dimensione del campione su cui sono stati effettuati questi studi e le grandi differenze nel contenuto di flavonoidi nel cioccolato, sarebbe opportuno allargare il campione e utilizzare fonti a contenuto noto di polifenoli.
I dati sulla funzione piastrinica sono scarsi e discordanti (25). Numerosi lavori hanno dimostrato in vitro che diversi isoflavoni o quercetina, una classe di flavonoidi, inibiscono l’aggregazione piastrinica indotta da collagene e ADP (26,27). Inoltre i flavonoidi sono in grado di inibire l’attivazione piastrinica mediante il blocco dell’attività delle Fyn kinase e la fosforilazione delle tirosine (27).
Esperimenti in vitro hanno anche evidenziato che estratti del vino rosso sono in grado di aumentare l’ossido nitrico di derivazione piastrinica (28).
Questi studi evidenziano però che l’inibizione dell’attività piastrinica indotta da polifenoli à ̈ dovuta a singoli composti e non ad una miscela di composti.
Generalmente un singolo composto fenolico à ̈ considerato responsabile degli effetti benefici osservati dopo supplementazione con una dieta ricca di polifenoli (29,30). Tuttavia, la possibilità che un singolo composto fenolico sia capace di svolgere un’attività antipiastrinica à ̈ debolmente supportata dal confronto degli studi in vitro e vivo. Infatti, negli studi in vitro, la concentrazione minima effettiva dei singoli composti fenolici utilizzata per inibire l’attivazione piastrinica à ̈ molto più elevata rispetto a quella ottenuta in vivo dopo supplementazione di alimenti ricchi di flavonoidi (31-33).
Studi precedenti hanno ipotizzato che miscele di polifenoli possano svolgere attività antipiastrinica ma le concentrazioni usate in vitro presuppongono l’utilizzo nell’uomo di dosaggi elevati con potenziali effetti collaterali. Usare miscele di polifenoli che, singolarmente, hanno una potente attività antipiastrinica potrebbe ridurne il dosaggio nell’uomo, ottenendo lo stesso effetto ma con minore rischio di effetti collaterali.
Gli autori della presente invenzione hanno dimostrato che la catechina, insieme alla quercitina, à ̈ in grado di inibire l’attivazione piastrinica mediante la riduzione dei radicali liberi dell’ossigeno, aumento dell’ossido nitrico piastrinico e riduzione della NADPH ossidasi (34-36).
Le catechine ed epicatechine sono flavonoidi che stanno suscitando molta attenzione a causa non solo della loro grande capacità anti-ossidante ma della loro abbondanza nella dieta.
Il brevetto US 7,754,760 concerne composizioni comprendenti epicatechina e l’uso di tali composizioni per indurre vasodilatazione nell’uomo e negli animali. Il brevetto US 7,868,042 concerne composizioni comprendenti epicatechina per migliorare la funzione renale. La domanda di brevetto WO 2002/081651 concerne metodi per ottenere un effetto protettivo sul sistema cardiovascolare mediante somministrazione di catechina, epicatechina, quercetina e/o resveratrolo.
I radicali liberi dell’ossigeno (ROS) sono implicati in numerosi pathways critici per il processo infiammatorio alla base dell’aterosclerosi: dall’iniziale produzione delle “strie lipidiche†all’attivazione piastrinica responsabile poi della progressione della lesione fino alla rottura del trombo.
Le piastrine partecipano allo sviluppo delle patologie aterotrombotiche promuovendo lo sviluppo e la degenerazione della lesione aterosclerotica.
La cascata di attivazione piastrinica (in cui includiamo il legame recettore-mediato delle piastrine all’endotelio, lo scivolamento, l’adesione, l’aggregazione e la formazione del trombo) à ̈ finemente regolata.
In seguito ad attivazione piastrinica indotta da collagene o acido arachidonico, si ha attivazione della NADPH ossidasi che porta ad un aumento dei ROS. Questi a loro volta sono in grado di indurre formazione di isoprostani che amplificano l’attivazione piastrinica aumentando il recruitment.
Questo modello di attivazione piastrinica à ̈ stato analizzato dagli autori della presente invenzione. In un lavoro recentemente pubblicato (37) à ̈ stato dimostrato che soggetti affetti da granulomatosi cronica, patologia in cui si ha una carenza di funzione o di presenza di subunità della NADPH ossidasi, in particolare della NOX2, le piastrine presentano una ridotta capacità di formare trombi associata a ridotta produzione di ROS piastrinici e isoprostani.
Quando isoprostani esogeni venivano aggiunti in piastrine di pazienti affetti da granulomatosi cronica si ripristinava in questi campioni la capacità di formare trombi.
Fino ad ora non à ̈ stato mai sperimentato se due polifenoli, di cui il cacao à ̈ particolarmente ricco, epicatechina e catechina, abbiano un’azione sinergica nell’inibire la funzione piastrinica.
DESCRIZIONE DELL’INVENZIONE
La presente invenzione descrive l’attività sinergica di catechina ed epicatechina. Esperimenti in vitro dimostrano che catechina ed epicatechina, a concentrazioni analoghe a quelle riscontrate nel sangue di un campione di volontari sani e fumatori, supplementati con un alimento ricco in polifenoli (cacao amaro), sono in grado di svolgere singolarmente una debole attività antipiastrinica. Questa attività inibitoria viene sorprendentemente potenziata quando le piastrine sono incubate con i due polifenoli in miscela, dimostrando che catechina ed epicatechina hanno un’azione sinergica nell’inibire la funzione piastrinica.
I risultati ottenuti nella presente invenzione dimostrano che una miscela di flavonoidi quali catechina ed epicatechina à ̈ in grado di inibire l’attivazione piastrinica nei fumatori a concentrazioni simili a quelle riscontrate in circolo dopo assunzione di cioccolato fondente (>85% di cacao). Il meccanismo postulato à ̈ mediato dall’inibizione della formazione di isoprostani tramite inibizione della NADPH ossidasi.
La scoperta che una miscela di catechina ed epicatechina, a concentrazioni tali da poter essere raggiunte nell’uomo anche dopo assunzione orale di specifici supplementi, ha effetti antipiastrinici permette di sviluppare appropriate formulazioni da utilizzare nella terapia orale antipiastrinica.
Forma pertanto oggetto dell’invenzione una miscela di catechina ed epicatechina per uso nel trattamento e/o nella prevenzione di patologie in cui à ̈ desiderata l’inibizione della funzione piastrinica.
Preferibilmente la catechina à ̈ somministrata in una quantità tale che la concentrazione sierica di catechina à ̈ tra 0.1 µM e 10 µM.
Più preferibilmente la quantità di catechina somministrata varia da 0.15 mg/Kg a 0.3 mg/Kg.
Ancora preferibilmente l’epicatechina à ̈ somministrata in una quantità tale che la concentrazione sierica di epicatechina à ̈ tra 0.1 µM e 10 µM.
In una forma preferita dell’invenzione la quantità di epicatechina varia da 5 mg/Kg a 8 mg/Kg.
In una forma preferita dell’invenzione il trattamento o la prevenzione di patologie in cui à ̈ desiderata l’inibizione della funzione piastrinica à ̈ indirizzato ad un soggetto scelto nel gruppo di: un soggetto sano, un soggetto fumatore, un soggetto affetto o a rischio di malattia cardiovascolare, un soggetto a rischio di infarto miocardico o un soggetto con patologie associate ad elevati livelli di stress ossidativo.
Nella presente invenzione molecole con funzione antipiastrinica sono molecole in grado di interagire negativamente con la funzione piastrinica prevenendo così la formazione di trombi. Un soggetto fumatore à ̈ un soggetto tabagista che fa uso cronico di un numero di sigarette > a 10/die.
Un soggetto a rischio di malattia cardiovascolare à ̈ un soggetto che presenta fattori di rischio associati ad una aumentata incidenza di malattie cardiovascolari o ha sofferto un pregresso evento cardiovascolare.
Un soggetto a rischio di infarto miocardico à ̈ un soggetto che presenta fattori di rischio associati ad una aumentata incidenza di infarto del miocardio.
Un soggetto con patologie associate ad elevati livelli di stress ossidativo à ̈ un paziente diabetico, obeso, ipercolesterolemico, un fumatore.
La presente invenzione verrà descritta in esempi non limitativi, facendo riferimento alle seguenti figure:
Figura 1. Livelli sierici di epicatechina (pannello A) e catechina (pannello B) prima e dopo due ore dall’assunzione di 40 g di cioccolato fondente in fumatori e soggetti sani mediante analisi HPLC. I dati sono presentati come valori medi SE. (*p<0.05).
Figure 2. Livelli sierici di epicatechina (pannello A) e catechina (pannello B) prima e dopo due ore dall’assunzione di 40 g di cioccolato al latte in fumatori e soggetti sani mediante analisi HPLC. I dati sono presentati come valori medi SE. (*p<0.05).
Figura 3. Effetto di dosi scalari di epicatechina (0.1-10 Î1⁄4M), catechina (0.1-10 Î1⁄4M), epicatechina catechina (0.1-10 Î1⁄4M) o NOX2ds-tat (0.1-10 Î1⁄4M) sulla produzione piastrinica di ROS (Reactive Oxigen Species) (A e B, relativi a soggetti sani o fumatori, rispettivamente), sulla produzione di sNOX2-dp piastrinica (C e D, relativi a soggetti sani o fumatori, rispettivamente), sulla formazione di 8-iso-PGF2 piastrinico (E e F, relativi a soggetti sani o fumatori, rispettivamente) e sul recruitment piastrinico (G e H, relativi a soggetti fumatori e sani, rispettivamente). Gli esperimenti sono stati effettuati su campioni di sangue prelevati da 5 soggetti fumatori e 5 soggetti sani, *p<0.001. L’analisi della significatività statistica viene fatta rispetto ai campioni attivati senza pretrattamento con catechina ed epicatechina e all’interno dei singoli punti paragonando l’effetto di catechina ed epicatechina singolarmente rispetto alla miscela dei due. L’effetto della miscela di catechina ed epicatechina si dimostra sempre significativamente superiore all’effetto osservato dopo trattamento in vitro con i singoli composti.
Figure 4. Produzione piastrinica di ROS (A), livelli di sNOX2-dp piastrinica (B), livelli di 8-iso-PGF2 α piastrinico (C), livelli di TxB2piastrinico (D), produzione piastrinica di NOx (E) e recruitment piastrinico (F) prima e dopo 2 ore dall’assunzione di 40 g di cioccolato fondente o al latte in soggetti fumatori e soggetti sani. I dati sono presentati come valori medi SE (*p<0.05).
MATERIALI E METODI
Pazienti
Venti soggetti sani (Healthy subjects, HS) e 20 fumatori, selezionati in base all’età e al sesso (Tabella 1) hanno accettato di partecipare nello studio, che à ̈ stato effettuato tra Ottobre e Dicembre 2010.
Tabella 1. Caratteristiche cliniche di soggetti sani (HS) e fumatori.
Variabili Soggetti Sani (HS) Fumatori Valore P
(n=20) (n=20)
Età media (anni)* 33±11 33±11 0.954
Maschi/Femmine 7/13 7/13 1.0
Altezza (cm)* 168.7±8.5 168.7±10.1 1.0
Peso (Kg)* 65.5±9.8 64.75±9.5 0.808
BMI* 23±2.8 22.8±3.3 0.775
Pressione sistolica (mmHg)* 113±10 114±12 0.977
Pressione diastolica(mmHg)* 68±6 68±8 0.983
Sigarette/giorno* 0 11±5.2 <0.001
*I dati sono espressi come valore medio ± SD.
Non vi erano differenze tra i due gruppi, ad eccezione dell’abitudine al fumo.
Ciascun fumatore consumava un numero medio di 11 sigarette al giorno (valore medio tra 6 e 28). Tutti i partecipanti allo studio non avevano assunto alcuna terapia nel mese precedente. In tutti i soggetti à ̈ stata compiuta una anamnesi completa e i soggetti sono stati esaminati fisicamente. Soggetti con insufficienza epatica, disordini renali gravi (creatinina serica >2.8 mg/dL), malattia cerebro-vascolare acuta, infarto miocardico acuto, dislipidemia, diabete, ipertensione, o in terapia con antiossidanti o qualunque farmaco noto per interferire con la funzione piastrinica, sono stati esclusi dallo studio.
Protocollo clinico
I soggetti sono stati casualmente assegnati in due gruppi di trattamento, e hanno ricevuto ciascuno 40 g di cioccolato fondente (≥85% di cacao) o 40 g di cioccolato al latte (≤35% di cacao), da assumere alle 8 del mattino a stomaco vuoto secondo un protocollo di studio incrociato, a singolo cieco. Tra le due somministrazioni (cioccolato fondente e cioccolato al latte) à ̈ intercorsa una settimana di “wash-out†.
Le valutazioni di laboratorio sono state eseguite su campioni di sangue prelevati 2 ore dopo l’assunzione della cioccolata fondente ed analogo prelievo à ̈ stato eseguito due ore dopo l’assunzione della cioccolata al latte.
Tipi di cioccolato utilizzati nello studio
In questo studio à ̈ stato utilizzato cioccolato disponibile in commercio. Viene definito cioccolato fondente qualsiasi cioccolato comprendente almeno 85% di cacao e cioccolato al latte qualsiasi cioccolato comprendente meno di 35% di cacao.
Rispetto al cioccolato al latte (40 g), il cioccolato fondente (40 g) ha un maggiore contenuto di fibre (3 vs 0 g) ed un minore contenuto in colesterolo (0 vs 10 mg), sodio (20 vs 40 mg) e zucchero (5 vs 20 g). Inoltre, non ci sono differenze significative nel contenuto calorico tra la cioccolata fondente (230 Calorie) e al latte (220 Calorie).
Randomizzazione e occultamento della ripartizione
Un soggetto non coinvolto nello studio ha assegnato dei codici ai trattamenti dello studio, ha casualmente collocato i partecipanti ad una sequenza di trattamento con cioccolato fondente o al latte e conservato la chiave di lettura in una busta sigillata. La randomizzazione à ̈ stata effettuata mediante una procedura basata su una sequenza numerica casuale. Gli autori ed i tecnici del laboratorio non erano a conoscenza del tipo di trattamento.
Sono stati registrati i valori basali di attivazione piastrinica e di stress ossidativo, misurando i seguenti parametri: recruitment piastrinico, produzione di ROS, livello di peptide derivato solubile di NOX2 (sNOX2-dp), livello di 8-iso-PGF2 α, ossido nitrico (NO) e formazione di trombossani. Gli stessi parametri sono stati misurati due ore dopo l’ingestione di cioccolata. I partecipanti sono stati studiati dopo 24 ore di astinenza da un cibo ricco in polifenoli. Inoltre, prima di ogni esperimento, i soggetti sani hanno osservato un periodo di digiuno di otto ore, i fumatori sono stati per almeno 2 ore senza fumare.
Preparazione del campione e determinazione della epicatechina e della catechina mediante HPLC
100 Î1⁄4l di siero sono stati estratti due volte con 0.8 ml seguiti da 0.5 ml di etil acetato mediante rotazione in vortex per 1 min in fiala da 1 mL. Dopo aver centrifugato la miscela per 5 minuti a 3500 g, il supernatante comprendente etil acetato à ̈ stato rimosso, campionato ed evaporato a secchezza in corrente di azoto (38). I campioni essiccati sono stati disciolti in metanolo (0.1 ml) prima dell’analisi in HPLC.
La determinazione dell’epicatechina (EC) e della catechina à ̈ stata effettuata usando un sistema HPLC serie Agilent 1200 Infinity fornito di una colonna Eclipse plus C18(4.6 x 100mm). Tutte le analisi sono state condotte a 25 °C. E’ stata utilizzata una fase mobile isocratica acqua-metanolo (80:20) ad una velocità di flusso di 1.2 ml/min e la rilevazione UV à ̈ stata effettuata a 280 nM. Il volume di campione iniettato à ̈ stato di 20 Î1⁄4l. I picchi cromatografici degli analiti sono stati identificati per confronto con quelli dello standard (39).
Preparazione delle piastrine e studio in vitro
Lo studio in vitro à ̈ stato effettuato su campioni di sangue prelevati da 5 soggetti sani e 5 fumatori selezionati in base all’età e al sesso (6 maschi e 4 femmine, età media 32±4 anni), che non avevano precedentemente assunto cioccolato fondente o al latte.
Per ottenere un plasma ricco in piastrine (PRP), i campioni sono stati centrifugati per 15 minuti a 180 g. Per evitare contaminazione con i leucociti, solo il 75% superiore del PRP à ̈ stato raccolto. Lo strato di piastrine à ̈ stato sospeso in tampone HEPES, pH 7.4 (2x10<8>piastrine/mL, a meno di diversa indicazione). Le piastrine sono state attivate con o senza acido arachidonico (AA, 0.5 mM) per 10 min a 37 °C o con collagene (6�g/ml) per la misurazione del recruitment piastrinico ed il supernatante à ̈ stato conservato a -80°C, a meno di diversa indicazione.
E’ stato analizzato l’effetto di catechina (codice C1251, Sigma Aldrich St. Louis, Missouri U.S.A.), epicatechina (codice E-1753, Sigma Aldrich St. Louis, Missouri U.S.A.), epicatechina catechina o un inibitore di NADPH ossidasi (NOX2ds-tat) (SC-27636P, Santa Cruz Biotechnology, Inc. California U.S.A.) sulla produzione di ROS, sui livelli di NOX2-dp, sulla formazione di 8-iso-PGF2 α, sull’aggregazione, dopo attivazione delle piastrine. Le piastrine sono state incubate per 10 min a 37 °C con epicatechina 0.1-10ï€ Î1⁄4M, catechina 0.1-10 Î1⁄4M, epicatechina 0.1-10 Î1⁄4M catechina 0.1-10 Î1⁄4M o NOX2ds-tat 0.1-10 Î1⁄4M prima della stimolazione con gli agonisti quali acido arachidonico (codice A9673, Sigma Aldrich St. Louis, Missouri U.S.A) o collagene (codice 311501C, Mascia Brunelli, Milano Italia).
Produzione piastrinica di ROS
La sospensione di cellule à ̈ stata incubata con 2’7’-diclorofluoresceina diacetato (5 mmol/L) per 15 minuti a 37 °C. Dopo incubazione, le piastrine sono state attivate con acido arachidonico. La produzione piastrinica di ROS à ̈ espressa come valore medio di fluorescenza e la produzione di ROS nelle cellule stimolate à ̈ espressa come indice di stimolazione (livello medio di fluorescenza in cellule stimolate/livello medio di fluorescenza in cellule non stimolate) (S.I.).
L’intensità di fluorescenza à ̈ stata analizzata in un citometro Epics XL-MCL (Coulter Electronics) equipaggiato con un laser ad Argon a 510-550 mm (verde). Per ogni istogramma, sono state contate 50,000 piastrine per determinare la proporzione di piastrine positive. Il segnale fluorescente generato dalla sonda à ̈ stato espresso come intensità media di fluorescenza (S.I.). Il coefficiente di variabilità tra i saggi à ̈ stato del 5%.
Misurazione di 8-iso-PGF2 α nelle piastrine
Per misurare l’isoprostano 8-iso-PGF2 α la sospensione di cellule piastriniche à ̈ stata attivata con acido arachidonico. Il supernatante à ̈ stato conservato a -80°C fino a misurazione. La quantificazione degli isoprostani à ̈ stata effettuata misurando 8-iso-PGF2 α mediante un metodo di saggio EIA precedentemente descritto e validato (40) ed à ̈ stata valutata in studi in vivo ed in vitro. I coefficienti di variabilità nello stesso saggio e tra saggi sono stati del 5.8% e del 5.0% rispettivamente.
Rilevazione mediante ELISA di sNOX2-dp solubile.
Il peptide derivato da NOX2, un marcatore dell’attivazione di NADPH ossidasi, à ̈ stato analizzato negli studi in vivo ed in vitro mediante un metodo ELISA precedentemente descritto da Pignatelli et al. (41). Il peptide viene riconosciuto da uno specifico anticorpo monoclonale diretto verso la sequenza aminoacidica (224-268) della porzione extra-membrana di NOX2. Per misurare il livello di sNOX2-dp, la sospensione piastrinica à ̈ stata attivata con acido arachidonico e 100 µl sono stati conservati a -80°C fino a misurazione. I valori sono stati espressi come pg/ml, i coefficienti di variabilità nello stesso saggio e tra saggi sono stati del 5.2% e del 6% rispettivamente.
Valutazione del recruitment piastrinico
Il recruitment piastrinico à ̈ stato valutato utilizzando un metodo modificato rispetto a quello descritto da Krotz et al. (42). I campioni di PRP sono stati incubati (30 minuti a 37°C) con o senza dosi scalari di epicatechina (0.1-10 Î1⁄4M), catechina (0.1-10 Î1⁄4M), epicatechina catechina (0.1-10 Î1⁄4M), o NOX2ds-tat (un inibitore specifico di NADPH ossidasi) (0.1-10 Î1⁄4M), prima dell’attivazione con collagene (6 Î1⁄4g/ml). I solventi sono stati usati come controllo. In alcuni esperimenti catechina ed epicatechina sono state rimosse dal supernatante dopo 30 minuti di incubazione per valutare la ripresa della reattività piastrinica. L’aggregazione piastrinica indotta da collagene à ̈ stata misurata per 10 minuti. Successivamente, una uguale quantità di piastrine non trattate à ̈ stata aggiunta in ciascuna provetta, risultando quindi in un incremento della densità della soluzione e di conseguenza causando una riduzione nella trasmissione di luce.
L’aggregazione della nuova quantità di piastrine aggiunte in presenza di un aggregato già esistente à ̈ stata quindi misurata per 5 minuti ed espressa come percentuale dell’aggregazione che era stata inizialmente raggiunta (34). L’aggregazione piastrinica à ̈ stata misurata secondo il metodo di Born (34) e calcolata come differenza della trasmissione di luce (LT%) tra plasma ricco in piastrine (PRP) e plasma povero in piastrine (platelet poor plasma, PPP) come precedentemente descritto (36).
NOx piastrinico
Per determinare i metaboliti dell’ossido nitrico, nitriti e nitrati (NOx), à ̈ stato usato un kit per saggio colorimetrico (Tema Ricerca, Italia) su 100 ml della sospensione di piastrine non stimolate, mantenute in agitazione per 10 min a 37°C. I coefficienti di variabilità nello stesso saggio e tra saggi sono stati del 2.9 e 1.7% rispettivamente.
TxA2piastrinico
I campioni di PRP attivati con acido arachidonico (AA, 0.5 mM) sono stati centrifugati ed il supernatante conservato a – 80 °C. Il livello di TxA2piastrinico à ̈ stato determinato come descritto precedentemente (36,43). In breve, il livello di TxA2piastrinico à ̈ stato misurato valutando il suo metabolita stabile, TxB2, mediante un kit commerciale EIA (Amersham Pharmacia, Biotech, Little Chalfont, UK) ed à ̈ espresso come pg/10<8>cellule o ng/ml rispettivamente. I coefficienti di variabilità nello stesso saggio e tra saggi differenti con il kit EIA TxB2sono stati del 4.0% e del 3.6% rispettivamente.
ANALISI STATISTICA
Determinazione delle dimensioni del campione
La dimensione minima del campione à ̈ stata determinata rispetto ad un test t di Student per singolo campione a due code, con correzione di Welch, considerando (i) una differenza per la variazione di sNOX2-dp piastrinico nei fumatori da rilevare tra i trattamenti cioccolato fondente e al latte | Î ́|≥10, (ii) una deviazione standard delle differenze appaiate SD = 5, (iii) una probabilità di errore di tipo I α=0.05 e un potere 1- β=0.90.
Questo calcolo à ̈ risultato in n=12 pazienti, valore che à ̈ stato aumentato a n=20.
Metodi statistici
Le variabili continue sono riportate come valori medi ± SD, a meno che non sia indicato diversamente. I confronti tra fumatori e HS sono stati effettuati mediante test t di Student e sono stati appropriatamente ripetuti utilizzando test non parametrici (test (z) di Kolmogorov-Smirnov in caso di varianze non omogenee, come verificato con il test di Levene).
I dati dallo studio incrociato sono stati analizzati per gli effetti del trattamento e del periodo, effettuando uno split-plot ANOVA con un fattore tra i soggetti (sequenza di trattamento) e due fattori all’interno del soggetto (periodo 1 vs 2; prima vs dopo il trattamento) (44). E’ stato considerato l’intero modello, consentendo la valutazione di tutti gli effetti principali e interazioni “two-way e “three-way†. I confronti appaiati sono stati coretti mediante correzione di Bonferroni. Gli esperimenti in vitro sono stati analizzati mediante ANOVA. Un valore di p<0.05 à ̈ considerato significativo dal punto di vista statistico. Tutte le analisi sono state effettuate con un software SPSS-18.0 (SPSS Inc.)
RISULTATI
Livelli di epicatechina e catechina dopo assunzione di cioccolato in pazienti sani e fumatori
Livelli sierici di epicatechina e catechina prima e dopo due ore dall’assunzione di 40 g di cioccolato fondente o al latte nei soggetti fumatori e nei volontari sani sono stati analizzati mediante analisi HPLC.
Nei due gruppi di soggetti, la concentrazione di epicatechina e catechina nel sangue à ̈ stata misurata al livello basale e due ore dopo la somministrazione di cioccolato fondente (Fig. 1A e B) o al latte (Fig. 2A e B). L’epicatechina e la catechina nel sangue aumentavano in maniera significativa solo dopo l’assunzione di cioccolato fondente, ed in maniera simile nei due gruppi fumatori e non fumatori.
Studi in vitro: differenza tra soggetti sani e soggetti fumatori e effetto di una miscela di epicatechina e catechina
Formazione di ROS
Il valore basale di formazione di ROS nelle piastrine à ̈ significativamente più alto nei fumatori rispetto ai soggetti sani (Fluorescenza media 3.60±0.3 vs 1.3±0.2, p=0.004, rispettivamente, Fig. 3A-B).
Inoltre, la miscela di catechina ed epicatechina a concentrazioni nel range (0.1-10 Î1⁄4M) di quelle trovate nei volontari dopo supplementazione con 40 g di cioccolata fondente, inibisce la produzione piastrinica di ROS sia nei soggetti fumatori che i soggetti sani (Fig. 3A-B). L’effetto inibitorio à ̈ signifivo dal punto di vista statistico quanto si usa la miscela. I singoli polifenoli producono un effetto inibitorio significativamente minore rispetto a quello indotto dalla miscela di catechina ed epicatechina. L’efficacia della miscela à ̈ più evidente nei soggetti fumatori rispetto ai soggetti sani. Come controllo di massimo livello di inibizione à ̈ stato utilizzato il peptide bloccante la NOX2 (NOX2ds-tat).
Livelli di NOX2-dp piastrinici
NOX2-dp à ̈ la frazione del core catalitico della NADPH ossidasi che viene liberata in circolo in seguito ad attivazione dell’enzima a livello piastrinico. L’attivazione della NADPH ossidasi si associa a produzione di radicali liberi da parte delle piastrine attivate con acido arachidonico.
I livelli basali di sNOX2-dp sono più alti nei fumatori rispetto ai soggetti sani (14.5±4.6 pg/ml vs 8.8±1.9 pg/ml, p=0.02, rispettivamente, Fig.3C-D).
Inoltre, la miscela di catechina ed epicatechina, a concentrazioni nel range (0.1-10ï M) di quelle trovate nei volontari dopo supplementazione con 40 g di cioccolata fondente, à ̈ in grado di inibire l’attivazione della NADPH ossidasi come dimostrato dal ridotto rilascio extracellulare della frazione sNOX2-dp nelle piastrine attivate con acido arachidonico sia in soggetti sani che in soggetti fumatori. L’effetto inibitorio à ̈ signifivo dal punto di vista statistico quanto si usa la miscela (Fig.3C-D).
Nello stesso esperimento sono state usate catechina ed epicatechina separatamente e l’inibitore della NOX2 (NOX2ds-tat) come controllo di massimo livello di inibizione ottenibile. I singoli polifenoli producono un effetto inibitorio significativamente minore rispetto a quello indotto dalla miscela di catechina ed epicatechina. L’efficacia della miscela à ̈ più evidente nei soggetti fumatori rispetto ai soggetti sani.
Livelli di isoprostani piastrinici
La produzione di isoprostani piastrinici a livello basale à ̈ maggiore nei soggetti fumatori rispetto ai soggetti sani (20.1±6.1 pmol/L vs 14.1±4.9 pmol/L, p=0.03, rispettivamente, Fig. 3E-F).
L’attivazione della NADPH ossidasi si associa a produzione di isoprostani da parte delle piastrine attivate con acido arachidonico.
La miscela di catechina ed epicatechina a concentrazioni nel range (0.1-10ï M) di quelle trovate nei volontari dopo supplementazione con cioccolata à ̈ in grado di inibire la produzione di isoprostani piastrinici sia in soggetti sani che in soggetti fumatori (Fig.3E-F).
Nello stesso esperimento sono state usate catechina ed epicatechina separatamente e l’inibitore della NOX2 (NOX2ds-tat) come controllo di massimo livello di inibizione ottenibile.
I singoli polifenoli producono un effetto inibitorio significativamente minore rispetto a quello indotto dalla miscela di catechina ed epicatechina. L’efficacia della miscela à ̈ più evidente nei soggetti fumatori rispetto ai soggetti sani.
Recruitment piastrinico
Il recruitment piastrinico basale à ̈ maggiore nei fumatori rispetto ai soggetti sani (7.1±1.5% vs 4.15±1.17%, p=0.01, rispettivamente, Fig.3G-H).
L’attivazione della NADPH ossidasi si associa in ultimo alla propagazione del trombo valutata in questi esperimenti tramite studio in vitro dell’aggregazione piastrinica.
La miscela di catechina ed epicatechina a concentrazioni nel range (0.1-10ï M) di quelle trovate nei volontari dopo supplementazione con cioccolata à ̈ in grado di inibire il recruitment piastrinico sia in soggetti sani che in soggetti fumatori (Fig.3G-H).
Nello stesso esperimento sono state usate catechina ed epicatechina separatamente e l’inibitore della NOX2 (NOX2ds-tat) come controllo di massimo livello di inibizione ottenibile.
I singoli polifenoli producono un effetto inibitorio significativamente minore rispetto a quello indotto dalla miscela di catechina ed epicatechina. L’efficacia della miscela à ̈ più evidente nei soggetti fumatori rispetto ai soggetti sani.
In conclusione, nei soggetti fumatori si osserva una spiccata attivazione del sistema ossidativo della NADPH ossidasi, evidenziata da aumentato rilascio di NOX2-dp, ROS e isoprostani in associazione a più elevati livelli di recruitment piastrinico. In questi soggetti, le piastrine stimolate con acido arachidonico ed incubate con epicatechina, epicatechina catechina o con NOX2ds-tat hanno mostrato una significativa inibizione dello stress ossidativo e della funzione piastrinica. Questo à ̈ dimostrato dall’inibizione di ROS, dell’attivazione di NOX2, della formazione di 8-iso-PGF2α e dell’aggregazione piastrinica. L’epicatechina in maniera più evidente e la catechina in modo meno significativo, singolarmente inibiscono in maniera dose-dipendente lo stress ossidativo e la funzione piastrinica. Tuttavia l’effetto à ̈ significativamente maggiore per la miscela epicatechina+catechina. L’effetto inibitorio dei polifenoli si à ̈ osservato in maniera più significativa nelle piastrine ottenute dai fumatori che presentano di base livelli di rilascio di NOX2-dp, ROS, isoprostani e recruitment superiori ai non fumatori. Al contrario, l’inibizione dello stress ossidativo e della funzione piastrinica da parte di NOX2ds-tat à ̈ stato osservato sia nei fumatori che nei non fumatori.
Studio clinico: differenza tra soggetti sani e soggetti fumatori e effetto del cioccolato fondente o al latte
A livello basale i fumatori, rispetto ai soggetti sani, avevano una maggiore produzione piastrinica di ROS, sNOX2-dp, 8-iso-PGF2ï ¡ (Fig. 4A-C) e minore NOx piastrinico (Fig. 4E); la produzione piastrinica di TxB2era leggermente aumentata nei fumatori con una significatività al limite (p=0.048) (Fig. 4D). Inoltre, l’aggregazione piastrinica era maggiore nei fumatori rispetto ai soggetti sani (Fig.4F).
Dopo assunzione di cioccolata fondente, lo stress ossidativo nelle piastrine cambiava nei fumatori ma non nei soggetti sani. Infatti, dopo due ore dalla assunzione di cioccolata fondente, i fumatori mostravano meno ROS piastrinico e attivazione di NOX2 e un incremento in NOx piastrinico (Fig. 4A, 4B, 4E) rispetto al livello basale. La produzione di eicosanoidi nelle piastrine era modificata in maniera diversa dal cioccolato fondente in quanto l’8-iso-PGF2 α piastrinico diminuiva mentre il TxB2piastrinico non cambiava (Figura 4C-D). La somministrazione di cioccolata fondente riduceva l’aggregazione piastrinica nei fumatori ma non nei soggetti sani (Fig. 4F). Il cioccolato al latte non ha influenzato lo stress ossidativo nelle piastrine, la produzione di eicosanoidi e la funzione piastrinica nà ̈ nei fumatori nà ̈ nei soggetti sani (Fig. 4A-F).
L’importanza dell’invenzione sta nel fatto che le concentrazioni dei singoli polifenoli (0.1 Î1⁄4M), raggiungibili nel sangue umano dopo somministrazione di cacao, hanno una debole, seppur significativa attività antipiastrinica. Usando una miscela dei due polifenoli (epicatechina e catechina) alla concentrazione di 0.1 Î1⁄4M, si ottiene un ulteriore significativo aumento dell’attività antipiastrinica.
Livelli sierici di epicatechina e catechina aumentano dopo due ore dall’assunzione di cioccolato fondente in soggetti fumatori. Inoltre, dopo cioccolato fondente l’epicatechina à ̈ stata rilevata nella circolazione periferica sia dei fumatori che dei non fumatori a concentrazione simile a quella già riportata in letteratura (19). Al contrario, il livello di epicatechina nel sangue non à ̈ aumentato dopo la cioccolata al latte probabilmente poichà ̈ il suo contenuto in polifenoli à ̈ molto inferiore rispetto alla cioccolata fondente (45) o poichà ̈ l’effetto antiossidante del cacao à ̈ attenuato se il latte à ̈ aggiunto. Quindi, sono stati condotti esperimenti in vitro mediante incubazione delle piastrine con epicatechina, catechina e una miscela di essi.
Gli esperimenti hanno dimostrato che l’epicatechina, alla concentrazione trovata nel sangue periferico dopo somministrazione di cioccolata fondente, possiede proprietà antiossidanti. La sua incubazione con le piastrine di pazienti fumatori à ̈ risultata in una ridotta attivazione NOX2 ed una ridotta produzione di ROS. Questo effetto si à ̈ associato con una ridotta formazione di 8-iso-PGF2 α e aggregazione piastrinica, suggerendo una regolazione negativa di ROS nelle piastrine come meccanismo che potenzialmente impedisce l’attivazione delle piastrine attraverso la ridotta produzione di 8-iso-PGF2 α. Vale la pena notare che tali cambiamenti sono stati osservati solo nelle piastrine da fumatori mentre nessun effetto dell’epicatechina à ̈ stato rilevato nelle piastrine da non fumatori. Questo dovrebbe significare che la velocità di produzione di ROS intracellulare rappresenta una “condizione sine qua non†per ridurre lo stress ossidativo da parte di molecole con proprietà antiossidanti. Analoghe considerazioni si possono fare per la catechina. Tuttavia, à ̈ interessante notare che l’incubazione delle piastrine con un inibitore di NOX2 à ̈ risultata in una regolazione negativa dello stress ossidativo e dell’attivazione piastrinica anche nei soggetti sani. Quindi non si può escludere che un altro approccio farmacologico con nutrienti ricchi in polifenoli possa risultare in stress ossidativo e inibizione dell’attivazione piastrinica anche nei soggetti sani.
Inoltre, il presente studio fornisce la dimostrazione che nei fumatori la cioccolata fondente inibisce l’8-iso-PGF2 α piastrinico attraverso una regolazione negativa della produzione di ROS nelle piastrine indotta da NOX2.
ROS funziona come secondo messaggero dell’attivazione piastrinica attraverso la modulazione di vari meccanismi di segnalazione interna che includono l’attivazione di PLA2, l’inattivazione di ossido nitrico (NO) e la formazione di 8-iso-PGF2 α (32,34,36, 37,46). Gli isoprostani sono eicosanoidi chimicamente stabili che derivano dall’interazione di ROS con acido arachidonico (47); essi sono molecole pro-aggreganti che favoriscono la propagazione dell’aggregazione piastrinica attraverso l’attivazione della glicoproteina IIb/IIIa (37). NOX2 gioca un ruolo chiave nella formazione piastrinica di isoprostani come suggerito dalla bassa produzione di 8-iso-PGF2 α nelle piastrine prelevate da pazienti con una deficienza ereditaria di NOX2 (48).
La presente invenzione dimostra la sovra-regolazione di NOX-2 nelle piastrine da fumatori, rinforzando il concetto che l’abitudine a fumare à ̈ associata con stress ossidativo (49). L’aumento di NOX2 coincide con l’aumento di ROS, la formazione di 8-iso-PGF2α e l’aggregazione piastrinica, suggerendo un legame tra ROS generato da NOX2 e attivazione piastrinica indotta da 8-iso-PGF2 α. I fumatori hanno mostrato un debole incremento di TxB2piastrinico, che à ̈ apparentemente in contrasto con studi precedenti che non hanno mostrato alcuna differenza nel TxB2del siero di fumatori e non fumatori (50). Tuttavia, la differenza tra fumatori e non fumatori à ̈ stata di una significatività al limite (p=0.05), quindi non à ̈ possibile affermare con certezza che tale debole sovra-regolazione della cicloossigenasi-1 (COX1), enzima all’origine della sintesi di TXB2, sia di rilevanza biologica.
Nel presente studio à ̈ stata valutata l’ipotesi se un nutriente ricco in polifenoli possa regolare negativamente il NOX2 piastrinico e a sua volta ridurre l’attivazione piastrinica attraverso una riduzione nella formazione di 8-iso-PGF2 α. Questa ipotesi di studio à ̈ stata supportata dai risultati dello studio clinico poichà ̈ la cioccolata fondente, e non la cioccolata al latte, si à ̈ associata ad una regolazione negativa di ROS generato da NOX2piastrinico, della formazione di 8-iso-PGF2 α piastrinico e dell’aggregazione piastrinica. La riduzione dello stress ossidativo à ̈ stata probabilmete responsabile dell’aumentata produzione di NO poichà ̈ radicali liberi dell’ossigeno sono noti per inattivare NO o per ridurre l’attivazione di NO sintasi (34). Gli effetti antiossidanti e antipiastrinici sono stati osservati nei fumatori ma non nei non fumatori suggerendo che la produzione basale di ROS à ̈ un prerequisito per ridurre lo stress ossidativo mediante composti con proprietà antiossidanti. Questa scoperta à ̈ apparentemente in contrasto con una precedente comunicazione da parte degli autori della presente invenzione che ha mostrato che la Vitamina E, una molecola antiossidante, inibisce la formazione di perossidi lipidici (51) e l’aggregazione piastrinica in soggetti sani; tuttavia la vitamina E possiede altre proprietà che possono influenzare la funzione delle piastrine con meccanismi che non dipendono dalla sua azione antiossidante (52).
A differenza che su 8-iso-PGF2α, la cioccolata fondente ha mostrato una scarsa influenza su TxB2 piastrinico, indicando che l’attivazione COX1 non à ̈ influenzata da un nutriente ricco in polifenoli. Questo à ̈ in accordo con dati precedenti che mostrano che lo stress ossidativo ha una azione neutrale sulla attivazione di COX1 (37).
Il presente studio corrobora ed estende le precedenti comunicazioni mostrando che nutrienti ricchi in polifenoli quali il cioccolato fondente esercitano un effetto antipiastrinico con un effetto antiossidante. La presente invenzione dimostra per la prima volta che tale attività antipiastrinica à ̈ mediata dalla regolazione negativa di NOX2 e come risultato finale riduce la formazione di 8-iso-PGF2 α (19). L’inibizione della attivazione di NOX2 da parte dell’epicatechina à ̈ in linea con altri studi che mostrano che i polifenoli possiedono proprietà antiossidanti attraverso l’inibizione di ROS generati da NOX2 (53). Anche se l’epicatechina in sà ̈ può spiegare l’effetto inibitorio della cioccolata fondente, à ̈ plausibile che un sinergismo tra i polifenoli contribuisca all’effetto antipiastrinico in vivo. Infatti, la combinazione in vitro di epicatechina e catechina, un ulteriore polifenolo contenuto nella cioccolata fondente, ha potenziato l’effetto antiossidante e antipiastrinico ottenuto con un singolo polifenolo.
Questo à ̈ in accordo con uno studio precedente che ha mostrato che i polifenoli sinergizzano nell’inibire NADPH ossidasi nelle piastrine (34) e sembra suggerire che l’effetto antipiastrinico della cioccolata fondente possa essere attribuito non solo all’epicatechina ma anche agli altri polifenoli contenuti nel cioccolato fondente.
In conclusione lo studio dimostra che la miscela di catechina ed epicatechina inhibisce la funzione piastrinica. Tale effetto potrebbe spiegare l’effetto della cioccolata fondente e composizioni contenenti che regolano negativamente nelle piastrine i livelli di ROS generati da NOX2 e in ultimo inibiscono l’attivazione piastrinica attraverso l’inibizione di 8-iso-PGF2 α piastrinico
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Claims (1)
- RIVENDICAZIONI 1- Miscela di catechina ed epicatechina per uso nel trattamento e/o nella prevenzione di patologie in cui à ̈ desiderata l’inibizione della funzione piastrinica. 2- Miscela secondo la rivendicazione 1 in cui la catechina à ̈ somministrata in una quantità tale che la concentrazione sierica di catechina à ̈ tra 0.1 µM e 10 µM. 3- Miscela secondo la rivendicazione 2 in cui la quantità di catechina varia da 0.15 mg/Kg a 0.3 mg/Kg. 4- Miscela secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti in cui l’epicatechina à ̈ somministrata in una quantità tale che la concentrazione sierica di epicatechina à ̈ tra 0.1 µM e 10 µM. 5- Miscela secondo la rivendicazione 4 in cui la quantità di epicatechina varia da 5 mg/Kg a 8 mg/Kg. 6- Miscela secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti in cui il trattamento o la prevenzione di patologie in cui à ̈ desiderata l’inibizione della funzione piastrinica à ̈ indirizzato ad un soggetto scelto nel gruppo di: un soggetto sano, un soggetto fumatore, un soggetto affetto o a rischio di malattia cardiovascolare, un soggetto a rischio di infarto miocardico o un soggetto con patologie associate ad elevati livelli di stress ossidativo.
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