CN105315251A - 千层纸素a及其前体药物作为儿茶酚类药物增效剂的应用 - Google Patents

Abstract

一种千层纸素A及其前体药物作为儿茶酚类药物增效剂的应用属医药技术领域。该类化合物作为儿茶酚类药物增效剂，具有如下结构通式如(1)所示，其中，R为氢、羧酸酯及葡萄糖醛酸等取代基。上述千层纸素A及其前体药物中的一种或几种化合物均可与左旋多巴按一定比例混合后做成药物组合物并用于帕金森病的治疗，千层纸素A及其改造后的前体药物溶解度和透膜能力都得到改善，同时其体内代谢半衰期明显延长，超过多数儿茶酚类药物的体内半衰期，具有良好的成药前景。此外，该类化合物还可与儿茶酚类药物组成复方药物，并可采用口服缓释剂型进一步提升儿茶酚类药物的口服生物利用度及治疗效果。

Description

千层纸素A及其前体药物作为儿茶酚类药物增效剂的应用

技术领域

本发明属医药技术领域，具体涉及一种千层纸素A及其前体药物作为儿茶酚类药物增效剂的应用。

背景技术

儿茶酚类化合物具有多种药理活性，在炎症、癌症、神经递质传导、高血压以及糖尿病等多种疾病的治疗中发挥重要的作用。例如儿茶酚类药物左旋多巴作为多巴胺的前药来补充帕金森症(PD)患者脑中多巴胺的不足，多巴胺替代疗法是治疗帕金森症最有效的手段【EurNeurol.2009；62:1-8】。值得注意的是，左旋多巴只有到达大脑才能发挥作用，但由于其在外周组织中极易被儿茶酚-O-甲基转移酶(COMT)、尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶(UGT)、以及磺基转移酶(SULT)等Ⅱ相酶所代谢，单独使用时几乎没有药效，其中COMT酶介导的甲基化是儿茶酚类药物代谢的一条重要代谢途径。国内外临床研究已证实左旋多巴与COMT酶抑制剂联用能显著增强左旋多巴的疗效【PharmacolRev.1999；51:593-628】。开发安全高效的COMT酶抑制剂作为儿茶酚类药物的增效剂具有重要意义。

大量国内外研究认为儿茶酚基团是COMT酶抑制剂所必需的药效基团[CNSDrugReviews,2007；13(3):352–379]，但具有儿茶酚基团的化合物通常容易被COMT、UGT、SULT等Ⅱ相酶所代谢，具有消除迅速、生物利用度低、半衰期短等不良的ADME性质。为了增强COMT酶抑制剂的抑制能力和代谢稳定性，儿茶酚的邻位常常会引入硝基等吸电子基团，但硝基会在CYP等氧化酶作用下形成高反应活性的醌亚胺结构，进而同生物大分子结合产生严重的生物激活毒性(ChemResToxicol.2003；16(2):123-8.)。目前，已上市的COMT酶抑制剂(如托卡朋、恩托卡朋)在体内的抑制活性偏低、代谢半衰期短、连续使用易引发肝、肾毒性等诸多缺陷，长期使用会引发严重的不良反应【Neurology2004；62:39-46】。

发明人前期研究发现儿茶酚类黄酮化合物具有较好的COMT酶抑制活性，但其透膜能力较差，导致其口服生物利用度不佳。在此基础上，通过对系列化合物的结构-COMT抑制活性及结构-ADME属性研究发现6-甲氧基黄芩素(千层纸素A)虽然不具有儿茶酚基团，但仍具有较好的COMT酶抑制活性且其透膜能力得到明显改善。在此基础上，对千层纸素A进一步通过化学衍生形成前体药物，使其体内代谢半衰期得以延长，克服了黄酮儿茶酚类化合物在成药性上的缺陷，因而具有良好的口服成药前景。

发明内容

本发明针对已有儿茶酚类药物增效剂(如左旋多巴增效剂)存在的多种缺陷(体内抑制活性偏低、代谢迅速、连续使用易引发肝、肾毒性等)，在前期工作的基础上，通过系列化合物的结构-药效、结构-安全性、结构-ADME属性的多维属性评估和优化，研发了上述新型儿茶酚类药物的增效剂，该类增效剂具有安全、高效、口服吸收好等成药特征。

本发明提供了一种千层纸素A及其前体药物，该类化合物作为儿茶酚类药物增效剂，具有如下结构通式：

其中，R为氢、羧酸酯及葡萄糖醛酸等取代基。

所述羧酸酯为乙酸酯，丙酸酯，丁酸酯及其他烷基酯中的任意一种。

所述千层纸素A及其前体药物，其作用靶点为COMT酶，上述任意一种或几种化合物均可强效抑制人及哺乳动物外周分布的COMT酶，进而减缓该酶对儿茶酚类药物的代谢，提高儿茶酚类药物的血药浓度和持效时间。

所述千层纸素A及其前体药物在结构上不同于已报道的典型COMT酶抑制剂(均具有儿茶酚结构)，其并不具有儿茶酚结构，且在抑制类型上也并非竞争性抑制，而呈现出混合型抑制的特征。

本发明还提供了千层纸素A及其前体药物作为儿茶酚类药物增效剂的应用，上述千层纸素A及其前体药物中的一种或几种化合物均可与左旋多巴按一定比例混合后做成药物组合物并用于帕金森病的治疗。

千层纸素A或其前体药物与左旋多巴合用的摩尔比为1/5～10:1，优选摩尔比为1～5:1。

本发明提供千层纸素A及其前体药物作为儿茶酚类药物增效剂的应用，任意一种或几种化合物还可与其它儿茶酚类药物按照一定比例混合后做成药物组合物。如与甲基多巴做成药物组合物用于高血压症的治疗；与β受体激动剂异丙肾上腺素做成药物组合物用于支气管哮喘症的治疗。

上述药物组合物可采用各种药用口服剂型，如普通片剂、缓释片、胶囊剂、滴丸等口服剂。

本发明涉及的新型左旋多巴增效剂，具有如下四大优点：

1.安全性高，千层纸素A来源于中药黄芩，具有良好的安全性，其小鼠口服LD₅₀>2g/kg，同时对人体主要脏器细胞亦无明显毒性，且不会经CYP酶代谢激活产生活性中间体，不会与生物大分子形成毒性加合物；

2.高效，体外COMT抑制活性评估显示该类化合物的EC₅₀可达nM级，体内研究显示其与左旋多巴联用后，左旋多巴的AUC最高可增加48％；

3.优良的成药性：溶解度差、口服生物利用度低以及代谢迅速是儿茶酚类黄酮化合物普遍具有的重大缺陷，千层纸素A虽然不具有儿茶酚基团，但仍具有较好的COMT酶抑制活性且其透膜能力得到很大提升，尤其是其改造后的前体药物溶解度和透膜能力都得到改善，进而提高口服生物利用度；同时其体内代谢半衰期明显延长，超过多数儿茶酚类药物的体内半衰期。

4.代谢产物仍保留活性：千层纸素A在人体内的主要代谢产物为葡萄糖醛酸代谢产物，其代谢产物仍具有COMT酶抑制活性，在体内仍可发挥儿茶酚药物增效剂的用途。

附图说明

图1千层纸素A对人肝COMT酶抑制的浓度依赖性抑制图

图2千层纸素A人肝COMT酶抑制的抑制类型图

具体实施方式

下面结合实施例对本发明予以进一步说明，但并不因此而限制本发明。

本发明所用的主要设备及其型号为：UFLC-MS：ShimadzuLCMS-2010EV；UFLC-MS/MS：AB4000QTRAP；高速离心机：BeckmanAllegra64R。

实施例1.

千层纸素A-7-乙酰酯的制备

称取千层纸素A2.0g置于100ml三口瓶中，加入20ml二氯甲烷溶解，搅拌下加入吡啶2ml，乙酸酐1.5ml，25℃反应8h，TLC检测反应结束。加入水30ml猝灭反应，二氯甲烷50mlx3提取，合并二氯甲烷相，水洗30mlx2，无水硫酸钠干燥，过滤，将溶剂减压蒸干，残留物硅胶柱层析分离，得化合物千层纸素A-7-乙酰酯的制备1.6g，淡黄色固体。

¹HNMR(400MHz,d-DMSO)δ:2.31(s,3H),3.93(s,3H),7.09(d,J＝4Hz,2H),7.58-7.64(m,3H),8.13(d,J＝8Hz,2H),12.87(s,1H)；

¹³CNMR(100MHz,d-DMSO)δ:20.48,57.36,92.26,105.56,105.67,123.01,127.01,129.65,131.01,132.76,151.94,154.92,157.99,164.34,168.44,182.81.

实施例2

千层纸素A-7-丁酰酯的制备

称取千层纸素A1.0g置于50ml三口瓶中，加入10ml二氯甲烷溶解，搅拌下加入三乙胺1.5ml，在冰水浴下，缓慢滴加丁酰氯0.6ml，5～10℃反应6h，TLC检测反应结束。加入冰水20ml猝灭反应，二氯甲烷30mlx3提取，合并二氯甲烷相，水洗20mlx2，无水硫酸钠干燥，过滤，将溶剂减压蒸干，残留物硅胶柱层析分离，得化合物千层纸素A-7-丁酰酯的制备780mg，淡黄色固体。

¹HNMR(400MHz,d-DMSO)δ:0.96(t,J＝7.2Hz,3H),1.64(q,J＝7.6Hz,2H),2.37(t,J＝7.2Hz,2H),3.91(s,3H),7.10(d,J＝4Hz,2H),7.59-7.66(m,3H),8.12(d,J＝8Hz,2H),12.91(s,1H)；

¹³CNMR(100MHz,d-DMSO)δ:14.13,18.56,41.48,58.34,92.24,105.54,105.66,123.03,127.01,129.65,131.01,132.76,151.94,154.92,157.99,164.34,168.45,180.83.

实施例3.

千层纸素A-7-葡萄糖醛酸的制备

千层纸素A-7-葡萄糖醛酸是千层纸素A葡糖糖醛酸化代谢的代谢产物，对此，利用人肝微粒体为酶源结合生物制备及快速色谱技术对千层纸素A-7–葡萄糖醛酸进行制备，具体实验流程如下：

(1)在1.5mlEP管中加入以下溶液：Tris-HCl(50mM)815μl，MgCl2(150mM)100μl,HLM(20mg/ml)25μl,千层纸素A(100mM)10μl,震荡混匀；

(2)将EP管置于37℃预孵3min,加入UDPGA(40mM)50μl,震荡混匀，37℃反应；

(3)反应4h后，向反应体系中加入500μl乙腈，终止反应；

(4)4℃,20000g/min离心20min，将上清液收集于50ml离心管中；

(5)将样品加载到SPE柱上，依次进行水洗涤，甲醇洗涤，甲酸洗脱，收集洗脱液，减压蒸干得千层纸素A-7-葡萄糖醛酸10mg。

ESI-MS:m/z459为[M-H]^-。

实施例4

千层纸素A及其前体药物对人COMT酶的抑制活性测定

以L-dopa甲基化反应为探针反应，借助人肝细胞浆体外孵育体系，测定千层纸素A及其前体药物对COMT酶抑制的IC₅₀，具体实验流程如下：

(1)200微升体外代谢反应体系中，加入5mMMgCl₂，2mM二硫苏糖醇，150uM底物L-dopa，人肝细胞浆蛋白浓度为1mg/ml，抑制剂终浓度范围为0.05μM-50μM，于37℃条件下预孵3分钟；

(2)向反应体系中加入0.2mMS-腺苷蛋氨酸，起始反应；于37℃条件下反应30分钟后，加入200μl乙腈，剧烈震荡后，终止反应；

(3)采用高速冷冻离心机，在20,000×g的条件下，高速离心上述体系20分钟后，取上清，进行HPLC-MS/MS检测分析；通过检测L-dopa3-位甲基化代谢产物离子对[M-H]⁺m/z212.2＞195.1，对甲基化代谢产物进行定量检测。

该类化合物对COMT酶呈现出底物依赖性的抑制，各化合物的半数抑制浓度如表1所示，从中可以看出千层纸素A对COMT酶有较强的抑制活性(如图1所示)。Lineweaver–Burk及Dixon作图显示千层纸素A是COMT酶的非竞争性抑制剂(如图2所示)。

表1千层纸素A及其前体药物对人COMT酶的抑制活性及理化性质

实施例5

千层纸素A及其前体药物在S9中的代谢半衰期t_1/2测定

1)在1.5mlEP管中加入以下溶液：Tris-HCl(50mM)680μl,MgCl₂(50mM)100μl,DTT(40mM)50μl,UDPGA(40mM)50μl,PAPS(4mM)50μl,SAM(4mM)50μl,S9(20mM)10μl,震荡混匀；

2)将EP管置于37℃预孵3min,加入底物(0.5mM)10μl,震荡混匀，取出100μl反应液置于预先加入100μl乙腈的EP管中；

3)分别于5min,10min,20min,30min,40min时，取出100μl反应液置于预先加入100μl乙腈的EP管中，终止反应；

4)4℃,20000g/min离心20min，取上清液，UFLC进样分析；

5)分别读取每个时间点下的底物峰面积，并采用Oringe7.5软件计算千层纸素A及其前体药物在人肝S9中的代谢半衰期t_1/2值。

如表1所示，千层纸素A的体外半衰期比黄芩素有所改善，当其7位羟基形成乙酰酯，丁酰酯，其半衰期逐渐增加，代谢稳定性增强。

实施例6

千层纸素A及其前体药物的脂水分配系数logP测定

称取不同化合物，用正辛醇作溶剂，配制终浓度为50mmol/ml的溶液，置于离心管中；分别取底物溶液10ul置于两个离心管中；分别按照正辛醇和水1：1的比例配制终体积为200ul的溶液体系；将离心管涡旋1min,静置3h；分别吸取上层正辛醇相和下层水相各10ul置于离心管中，加入90ul乙腈，高效液相色谱分析；计算正辛醇/水体系中的上下相吸收峰面积比，得到脂水分配系数；

如表1所示，当千层纸素A的7位羟基形成乙酰酯和丁酰酯后，脂溶性增加。

实施例7

千层纸素A及其前体药物的透膜能力评估

采用Caco-2单细胞层模型，模拟药物经小肠上皮的吸收过程，将Caco-2细胞以1×105个/cm2的细胞密度种在中间具有聚碳酯膜的12孔Transwell培养板上，前两周每隔一天换液，以后每天换液，直到孵育21天左右，镜下观察细胞达到汇合，形成致密的单细胞层，同时通过测定跨膜电阻(TEER)以及标志物(荧光黄)的跨膜通量检测单细胞层的紧密性和完整性，然后在细胞层顶侧(绒毛面，A面)或底侧(基底面，B面)培养液中加入含有待测试化合物的药液，同时加药侧对侧加入空白缓冲溶液，开始转运实验，分别在30min、60min、90min、120min测定两侧药物组成及含量。利用公式：Papp＝ΔQ/(Δt·A·C₀)计算各组分的表观渗透系数(apparentpermeabilitycoefficients，Papp)，其中ΔQ为Δt内的转运量，A为膜面积，C₀为药物的初始浓度，从而评价其透膜能力；

如表1所示，当千层纸素的7位羟基形成乙酰酯，丁酰酯后，其在Caco-2细胞中的表观渗透系数增加，透膜能力增强。

实施例8.

千层纸素A及其前体药物与左旋多巴合用的大鼠整体药代学研究

选择18只Wistar大鼠，雌雄各半，按体重(180-220g)随机分为3组，6只/组开展单独口服左旋多巴及同时口服千层纸素A及其前体药物千层纸素A-7-乙酰酯、千层纸素A-7–丁酰酯、千层纸素A-7-O-葡萄糖醛酸对L-dopa的整体药代影响的研究(千层纸素或其前体药物与左旋多巴的摩尔比为1:1)。分别在采集给药前血浆及给药后5、10、15、30、45、60、90、120、180、240分钟的大鼠血浆样品0.5ml左右，置于预先肝素化的1.5ml尖底棕色离心管中，4000×g离心10分钟后，分离血浆后加入等体积的甲醇沉淀蛋白并高速离心(20,000×g)，去上清保存于-80℃冰箱待测。采用UFLC-ESI-MS测定各样品中左旋多巴的血药浓度，应用DAS2.0软件对血药浓度数据进行处理，并计算药动学参数。对大鼠血浆样本进行分析发现，高车前素前体药物在大鼠体内迅速水解，给药后15分钟已无法检测到前体药物。同时，高车前素及其前体药物均能显著提高大鼠血浆中L-dopa水平，其AUC分布增大了42％～56％，同时L-dopa的体内代谢半衰期亦有所延长(51～61％)。以上结果表明高车前素前体药物可在机体内水解释放出高车前素而发挥L-dopa增效剂的作用。

实施例9

千层纸素A及其前体药物与左旋多巴合用的摩尔比优化研究

与实施例8实验方法一致，开展优化千层纸素A及其前体药物与左旋多巴合用摩尔比的研究。实验结果见下表

表1千层纸素A及其前体药物与左旋多巴合用时对其PK参数的影响

实施例10

千层纸素A的小鼠口服急性毒性评估

选取昆明小鼠(购于大连医科大学实验动物中心)，雌雄各半，体重19-22g。将小鼠随机分组，每组20只，雌雄各半。千层纸素A混悬于0.5％CMC-Na中，浓度为1g/L。实验组包括千层纸素A不同剂量组(0.2～2g/kg)以及0.5％CMC-Na空白对照组。连续观察给药后小鼠的行为状态直至14天，并于第14天对不同给药组小鼠进行大体解剖并观察内脏情况。最大剂量组(2g/kg)给药组小鼠中只有3例死亡，其他剂量组均无死亡例。对死亡个体进行解剖并未发现肝、肾等主要器官的明显病变。实验结果提示小鼠口服千层纸素A的LD₅₀值大于2.0g/kg，属于无毒级别。

Claims (9)

1.一种千层纸素A及其前体药物，其特征在于该类化合物作为儿茶酚类药物增效剂，具有如下结构通式：

其中，R为氢、羧酸酯及葡萄糖醛酸等取代基。

2.按照权利要求1所述的一种千层纸素A及其前体药物，其特征在于所述羧酸酯为乙酸酯，丙酸酯，丁酸酯或他烷基酯中的任意一种。

3.按照权利要求1所述千层纸素A及其前体药物，其特征在于所述千层纸素A及其前体药物可通过抑制儿茶酚甲基化转移酶的活性来减缓左旋多巴等儿茶酚类药物的体内代谢，进而提高儿茶酚类药物的血药浓度及持效时间。

4.按照权利要求1所述的千层纸素A及其前体药物，其特征在于所述的该类化合物并非儿茶酚甲基化转移酶的底物，其在结构上不具有儿茶酚结构，同时其抑制类型为混合型抑制。

5.按照权利要求1所述的千层纸素A及其前体药物作为儿茶酚类药物增效剂的应用，其特征在于上述千层纸素A及其前体药物中的一种或几种化合物均可与左旋多巴按一定比例混合后做成药物组合物并用于帕金森病的治疗。

6.按照权力要去5所述的千层纸素A及其前体药物作为儿茶酚类药物增效剂的应用，其特征在于千层纸素A及其前体药物与左旋多巴合用的摩尔比为1/5～10:1。

7.按照权力要去5所述的千层纸素A及其前体药物作为儿茶酚类药物增效剂的应用，其特征在于千层纸素A及其前体药物与左旋多巴合用的摩尔比优选为1～5:1。

8.按照权利要求1所述的千层纸素A及其前体药物作为儿茶酚类药物增效剂的应用，其特征在于千层纸素A及其前体药物任意一种或几种化合物均可与其它儿茶酚类药物按照一定比例混合后做成药物组合物；与甲基多巴做成药物组合物用于高血压症的治疗；与β受体激动剂异丙肾上腺素做成药物组合物用于支气管哮喘症的治疗。

9.按照权利要求5或7所述的千层纸素A及其前体药物作为儿茶酚类药物增效剂的应用，其特征在于上述药物组合物可采用各种药用口服剂型，如普通片剂、缓释片、胶囊剂、滴丸等口服剂。