CN104987356A

CN104987356A - 一种熊果酸-糖酵解抑制剂dca偶联物及其应用

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Publication number: CN104987356A
Application number: CN201510318654.3A
Authority: CN
Inventors: 邵敬伟; 杨祥; 郑清; 陈秀芬; 禹小波; 向利平
Original assignee: Fuzhou University
Current assignee: Fuzhou University
Priority date: 2015-06-11
Filing date: 2015-06-11
Publication date: 2015-10-21

Abstract

本发明涉及一种熊果酸衍生物及其应用，具体说是一种熊果酸及其衍生物二氯乙酰化后形成的一类新的一种兼具抗肿瘤细胞凋亡和代谢双重靶向功能的熊果酸衍生物及其应用。如式(I)、(II)或（III）所示的熊果酸衍生物及其在制备抗肿瘤药物中的应用。

Description

一种熊果酸-糖酵解抑制剂DCA偶联物及其应用

技术领域

本发明涉及一种熊果酸衍生物及其应用，具体说是一种熊果酸及其衍生物二氯乙酰化后形成的一类新的一种兼具抗肿瘤细胞凋亡和代谢双重靶向功能的熊果酸衍生物及其应用。

背景技术

天然产物以其结构多样化且低毒性的作用优势而日益成为抗癌新药的重要来源。已有的研究表明目前70%的抗癌药物源于天然资源。因此从天然植物中提取活性成分作为先导物是设计合成新型抗癌药物的重要方法。熊果酸（UrsolicAcid，简称UA），CAS号：77-52-1，是一种天然来源的α-香树脂醇型五环三萜类化合物。据不完全统计，在自然界中的34科108种植物中都能够分离得到UA，其主要分布在女贞子、山楂、车前草、连翘等药用的植物中。药理学实验研究表明：熊果酸具有1）可抑制恶性肿瘤细胞增殖；2）诱导肿瘤细胞分化和凋亡；3）对多种致癌、促癌物有抵抗作用；4）抗肿瘤血管生成；5）具有增强免疫功能等多样化的抗性。另一方面，熊果酸对多种物质引发的肝损伤都有很好的保护作用，能显著而迅速降低体内丙氨酸氨基转移酶（ALT）和天冬氨酸氨基转移酶（AST）的水平，恢复肝功能，并可以预防肝纤维化，从而能够克服常规化疗药对肝损伤较大、毒性大的局限，在治疗的同时也可以起到良好的护肝效果，副作用小，毒性低。尽管熊果酸拥有上述多种优点，但其仍存在水溶性差，生物利用度低等不足，从而限制了其在临床方面的进一步应用。

靶向糖代谢异常的肿瘤细胞并减轻对正常组织的损伤是目前治疗肿瘤的有效策略。区别于正常细胞，肿瘤细胞即使在有氧条件下，也主要通过糖酵解方式分解葡萄糖获能，且肿瘤的恶性程度越高，糖酵解特征就越明显。利用糖酵解抑制剂等阻断糖酵解的进行，从而使得肿瘤细胞因能量供应缺乏而死亡，但正常细胞不受影响。糖酵解抑制剂二氯乙酸盐（DCA）作为一种廉价的用于治疗的新陈代谢紊乱的药物可以杀死多种瘤细胞，对肿瘤的生长有一定抑制效果。DCA发挥抗肿瘤作用主要通过促进肿瘤细胞氧化磷酸化、诱导凋亡，抑制肿瘤细胞生长。细胞的能量主要来自糖代谢，葡萄糖在体内氧化分解的途径包括糖酵解和氧化磷酸化。细胞活性和能量状态密切相关，由于恶性肿瘤生长迅速，常常出现葡萄糖摄取量增高、糖酵解增加和乳酸堆积现象。1970年，有学者发现 DCA能促进细胞葡萄糖氧化。而2007年加拿大Bonnet等发现DCA作为线粒体丙酮酸脱氢酶激酶 (pyruvatedehydrogenase kinase，PDK)的抑制剂，能够抑制人乳腺癌、非小细胞肺癌和胶质母细胞瘤细胞株的生长。其作用机制主要为：DCA能通过抑制 PDK去磷酸化激活丙酮酸脱氢酶（PDH)，从而产生大量的乙酰 CoA，乙酰 CoA进人线粒体后启动柠檬酸循环，促进葡萄糖的氧化磷酸化，在这一过程中释放大量的活性氧簇 (reactiveoxygenspecies，ROS)和细胞色素c，再加上线粒体膜去极化、膜电位降低，从而激活了线粒体介导的凋亡通路。同时还发现DCA能降低细胞内CA浓度、抑制活化 T细胞核因子，NFAT)及增加延迟整流钾通道 Kv1.5的表达 (促进外流)从而进一步促进凋亡、抑制肿瘤细胞生长。Sun的实验再次证实了DCA能促进乳腺癌细胞氧化磷酸化、显著增加凋亡蛋白酶caspase一3和 caspase一7的活性，从而促进凋亡，在体内外均能抑制转移性乳腺癌细胞生长，具有抗肿瘤细胞增殖和诱导凋亡的特性。大部分研究发现DCA在体外能增加某些药物的细胞毒作用、减少肿瘤细胞耐药。

研究表明，DCA一般口服给药就可以达100%的生物利用率。在动物及人类身上的研究显示DCA本身对正常细胞的毒性基本可以忽略，临床上DCA的毒副作用发生率并不高，在40多年的应用历史中，有报道显示患者可能在服用一定剂量的DCA后出现疼痛、麻木、疲倦等外周神经症状，但这些症状的发生率并不高，而且这些外周神经症状可能与患者的年龄和基础疾病相关，并且这些症状大多数是可逆的，停药后即自行消失，并不造成不可逆的器质性损伤。

发明内容

本发明涉及一种熊果酸衍生物及其应用，具体说是一种熊果酸和糖酵解抑制剂DCA偶联后形成的一类新的一种兼具抗肿瘤细胞凋亡和代谢双重靶向功能的熊果酸衍生物及其应用。通过生物利用度好的DCA与水溶性差的熊果酸进行共价偶联，从而改善化合物的理化性质，以解决熊果酸体内生物利用度低的问题，进一步利用二者抗癌作用机制的不同，以期获得安全可靠的、兼具抗肿瘤细胞凋亡和代谢双重靶向功能的新型抗肿瘤候选药物。

如式(I)、(II)、（III）所示的熊果酸衍生物

以及上述熊果酸衍生物在制备抗肿瘤药物中的应用。

合成技术路线见图1。

其中为了简写，用DCA-UA表示式(III)化合物，DCA-UP表示式(I)化合物，DCA-UH表示式(II)化合物。

本发明的优点在于对天然来源广泛的熊果酸进行结构改造，得到二氯乙酰化的一系列衍生化合物。该类化合物的在水溶性和在有机溶剂中的溶解性等理化性质方面较UA相比，均有所提高。体外细胞增殖抑制实验表明，DCA-UP和DCA-UH对肿瘤细胞株的增殖抑制作用优于熊果酸。同时，该类化合物能明显降低细胞中乳酸和ATP的含量。故该类衍生物是兼具抗肿瘤细胞凋亡和代谢双重靶向功能的新型抗肿瘤候选药物。

附图说明

图1. 熊果酸二氯乙酰类衍生物化学合成路线；

图2. DCA-UA 红外光谱图；

图3. DCA-UP 红外光谱图；

图4. DCA-UH 红外光谱图；

图5. 熊果酸体外细胞增殖抑制实验结果（MTT）；

图6 DCA-UA体外细胞增殖抑制实验结果（MTT）；

图7 DCA-UP体外细胞增殖抑制实验结果（MTT）；

图8 DCA-UH体外细胞增殖抑制实验结果（MTT）；

图9. 熊果酸二氯乙酰类衍生物溶解性测试；

图10. 熊果酸二氯乙酰类衍生物对肿瘤细胞内乳酸生成的影响；

图11. 熊果酸二氯乙酰类衍生物对肿瘤细胞内ATP含量的变化。

具体实施方式

为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但是本发明不仅限于此。

实施例1：DCA-UA的合成

室温下，0.5 g UA 溶于20 mL 1v/1v吡啶：二氯甲烷混合溶液，加入0.1eq DMAP，在磁力搅拌条件下，向前述溶液中缓慢滴加 108 μ L二氯乙酰氯，滴加完成后继续搅拌8-10h。反应完全后，减压蒸除二氯甲烷。向反应瓶中加入100 mL水析出产物，抽滤，用500 mL水洗滤饼至中性，真空干燥，柱层析得DCA-UA.

性状：白色粉末；产率：70.51%

IR数据:见2

HRMS：理论值：565.2857 m/z 实际值：565.2860 m/z

¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 5.97 (d, J = 2.9 Hz, 1H), 5.26 (d, J = 2.2 Hz, 1H), 4.67 (dd, J = 20.3, 18.0 Hz, 1H), 2.40 – 2.15 (m, 1H), 2.09 – 1.84 (m, 4H), 1.74 (s, 6H), 1.62 – 1.23 (m, 10H), 1.20 – 0.68 (m, 24H), 0.03 (d, J = 2.9 Hz, 1H).

实施例2：DCA-UP的合成

室温下，0.5 g DCA-UA 溶于20 mL二氯甲烷，在磁力搅拌条件下，向前述溶液中缓慢滴加 0.6mL 草酰氯，滴加完成后继续搅拌8-10h。反应完全后，减压蒸除气体和溶剂。磁力搅拌下，将前述产物溶于20 mL 二氯甲烷，并缓慢的向溶有0.4 g 哌嗪和100μL 三乙胺的20 mL二氯甲烷溶液中滴加。滴加完成后，继续搅拌12h。反应完全后，向反应瓶中补充加入20 mL 二氯甲烷，用50 mL 1N HCl 溶液萃取反应体系2-4次，直至pH为3-4，分液收集有机层，无水硫酸钠干燥，减压蒸除溶剂，得粗产物，柱层析后得衍生物DCA-UP。

性状：白色粉末；产率：92.71%；

IR数据:：见图3

HRMS：理论值：635.3741 m/z 实际值：635.3758 m/z

¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 5.96 (d, J = 1.9 Hz, 1H), 5.24 (s, 1H), 4.63 (d, J = 6.7 Hz, 1H), 3.84 (s, 4H), 3.08 (s, 4H), 2.40 (s, 1H), 2.19 (d, J = 13.8 Hz, 1H), 1.94 (s, 2H), 1.74 (t, J = 13.7 Hz, 6H), 1.61 – 1.41 (m, 6H), 1.41 – 1.18 (m, 4H), 1.06 (d, J = 35.4 Hz, 7H), 0.97 – 0.78 (m, 16H), 0.77 (d, J = 24.0 Hz, 5H), 0.02 (d, J = 2.1 Hz, 1H).

实施例3：DCA-UH的合成

室温下，0.5 g DCA-UA 溶于20 mL二氯甲烷，在磁力搅拌条件下，向前述溶液中缓慢滴加 0.6mL 草酰氯，滴加完成后继续搅拌8-10h。反应完全后，减压蒸除气体和溶剂。磁力搅拌下，将前述产物溶于20 mL 二氯甲烷，并缓慢的向溶有0.5 g 己二胺和100μL 三乙胺的20 mL二氯甲烷溶液中滴加。滴加完成后，继续搅拌12h。反应完全后，向反应瓶中补充加入20 mL 二氯甲烷，用50 mL 1N HCl 溶液萃取反应体系2-4次，直至pH为3-4，分液收集有机层，无水硫酸钠干燥，减压蒸除溶剂，得粗产物，柱层析后得衍生物DCA-UH。

性状：白色粉末；产率：91.66%；

IR数据：见图4

HRMS：理论值：665.4210 m/z 实际值：665.4210 m/z

¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 8.32 (s, 3H), 6.07 (s, 1H), 5.97 (d, J = 1.9 Hz, 1H), 5.34 (s, 1H), 4.63 (d, J = 5.6 Hz, 2H), 3.34 (s, 1H), 3.03 (s, 4H), 2.73 (s, 6H), 2.06 – 1.66 (m, 6H), 1.64 – 1.21 (m, 14H), 1.20 – 0.69 (m, 22H), 0.02 (d, J = 1.9 Hz, 1H).

实施例4 MTT 法检测药物对肿瘤细胞的增殖抑制作用

(1) 取处于对数生长期状态良好的细胞一瓶，胰蛋白酶消化，制成5×10⁴个/ml 的细胞悬液。

(2) 细胞悬液移入96 孔板，每孔100 μL，周围一圈用PBS 填充，置37℃ , 5% CO₂ 培养箱中培养24 h。

(3) 移去旧培养基，加入受试衍生物（用培养基将受试衍生物存储液稀释，设定不同作用浓度），每孔100ul，另设空白对照组、UA 对照组（UA 60μmol/L 或20umol/L）和紫杉醇对照组（60 umol/L 或20umol/L），每组设6 个复孔。药物作用24 h 后，吸弃含药培养基，于每孔中加入无血清、无酚红1640 培养基100ul，再加入MTT 溶液10ul，继续孵育4 h，终止培养。

(4) 小心吸弃96 孔板孔内上清液，每孔加入150ul DMSO，振荡10 min，于490 nm.

波长处在酶标仪上测定各孔光吸收值(OD 值)，计算细胞的增殖抑制率：抑制率（%）=（1- 用药组平均OD 值÷空白对照组平均OD 值）×100%，应用SPSS16.0 软件进行数据处理并计算癌细胞增殖的半数抑制浓度（IC₅₀）。见图5~8。化合物DCA-UP和DCA-UH对MCF-7、RL95-2、B16F10、4T1等多种肿瘤细胞株均具有明显抑制增殖作用。

实施例5 化合物溶解性测试

试了所合成的熊果酸二氯乙酰类衍生物在水、二甲基亚砜（DMSO）、N，N-二甲基甲酰胺（DMF）、二氯甲烷（DCM）、丙酮、乙酸乙酯（EA）、石油醚(PE)、甲醇中的溶解性。具体实验方法如下：

称取1 mg样品溶于0.2 mL溶剂中，观察其溶解情况，将溶解情况分为以下四个等级：

A：易溶，样品加入即刻全部溶解；

B：可溶，借助超声助溶5min后溶解；

C：微溶，超声波助溶5min后仍有部分不溶解；

D：不溶，超声波助溶5min后仍不溶解。

测试结果见图9。

本专利报道的三个化合物在水中的溶解度和在有机溶剂中的溶解度与UA相比，均有所改善。

实施例6肿瘤细胞中乳酸含量检测

（1）选取对数生长期的B16F10细胞均匀地铺在6孔板内，每孔大约50×10⁴个。

（2）将药物加入6孔板，培养24h。

（3）根据乳酸测试试剂盒配制酶工作液和试剂D显色液。按照下表的操作步骤依次加入相应的试剂。待测样品直接从药物作用后的培养基中吸取20μL。

上述溶液混匀后，530nm处测定各管的吸光值。根据计算公式：；

计算培养基中乳酸含量。见图10。

由图10可知，三个二氯乙酰类熊果酸衍生物DCA-UA、DCA-UP、DCA-UH能使细胞产生的乳酸量明显降低。说明DCA和UA及其衍生物偶联后的药物可抑制肿瘤细胞糖代谢作用。

实施例7肿瘤细胞中 ATP 含量检测

1. 样品的制备

（2）将药物加入24孔板，培养6h、12h和24h。

（3）吸出培养液，每孔加入40μL裂解液裂解细胞。裂解时需不断吹打使裂解液充分接触细胞。裂解后4℃12000g离心10min，取上清，-20℃保存。使用BCA蛋白浓度检测试剂盒测定样品中的蛋白浓度。

2. 标准曲线的测定准备和ATP检测工作液的制备

（4）冰浴ATP标准溶液、ATP检测裂解液和ATP检测试剂稀释液。将ATP标准溶液（0.5mM）用ATP检测裂解液稀释成0、0.1、1、5、10、20六个浓度梯度。

（5）按照ATP检测试剂：ATP检测试剂稀释液=1:100的比例配制ATP检测工作液，每个样品中需加入100μL。稀释后的ATP检测工作液在冰浴上暂存。

3. ATP浓度的测定

（6）加入100μL的ATP检测工作液到检测孔中，室温放置3min，使本底的ATP全部消耗掉。

（7）在检测孔加入10μL样品或标准品，混匀后迅速用多功能酶标仪的luminometer模式测定RLU值。绘制标准曲线并计算样品中ATP的含量。

见图11。

由图11可知，相对于空白组，加药组的ATP含量明显降低。说明说明DCA和UA及其衍生物偶联后对肿瘤细胞糖代谢途径的ATP生成有明显抑制作用。

Claims

1.如式(I)、(II)或（III）所示的熊果酸衍生物

。

2.如权利要求1所述的熊果酸衍生物在制备抗肿瘤药物中的应用。