CN102675406A

CN102675406A - 抗肿瘤活性的熊果酸含氮杂环类结构修饰物及其制备方法

Info

Publication number: CN102675406A
Application number: CN2012101804839A
Authority: CN
Inventors: 邵敬伟; 邹文滔
Original assignee: Fuzhou University
Current assignee: Fuzhou University
Priority date: 2012-06-04
Filing date: 2012-06-04
Publication date: 2012-09-19

Abstract

本发明涉及一种天然药用植物熊果酸的化学结构改造，具体说是一种具有抗肿瘤活性的熊果酸含氮杂环类结构修饰物及其制备方法。所述熊果酸含氮杂环类结构修饰物为下述通式（Ⅰ）的熊果酸含氮杂环衍生物，将熊果酸C-3位羟基氧化或乙酰后，C-17位羧基与哌嗪或其衍生物进行缩合反应以达到对熊果酸的结构改造，得到一系列熊果酸含氮杂环类结构修饰物。并测定其对人恶性黑色素瘤A-375细胞、人胃癌AGS及BGC-823细胞的体外抑制活性，MTT数据表明这类修饰物对三种癌细胞均具有一定的增殖抑制作用，部分化合物的抑制活性甚至优于紫杉醇。

Description

抗肿瘤活性的熊果酸含氮杂环类结构修饰物及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种天然药用植物熊果酸的化学结构改造，具体说是一种具有抗肿瘤活性的熊果酸含氮杂环类结构修饰物及其制备方法。

背景技术

熊果酸(Ursolic acid，UA)，又名乌索酸、乌苏酸，属五环三萜类化合物，化学名(3β)-3-Hydroxyurs-12-en-28-oic acid，其相对分子量为456.68，分子式为C₃₀H₄₈O₃，它以游离或糖苷的形式，广泛分布于自然界中。药理学研究发现，熊果酸具有广泛的生物学效应，熊果酸具有多种生物学活性，如抗癌、抗HIV、抗肝损伤、抗疟、抗炎抑菌等，其中尤以抗癌活性最为显著，其抗癌谱广，不仅对多种致癌、促癌物有抵抗作用，而且对多种肿瘤细胞体内外均有抑制作用。其副作用小，毒性低，显示出较大的临床应用潜力。

熊果酸的化学结构式为：

Figure 2012101804839100002DEST_PATH_IMAGE001

。

日前，国内外对熊果酸的研究报告多集中在熊果酸的提取分离工艺和药理学研究，特别是对熊果的抗癌作用研究已见报道。如：如王涛等的“熊果酸抗肿瘤作用及其机制研究进展”(《药物生物技术》，2008, 15 [2]）等等。研究表明，熊果酸具有抗始发突变、抗促癌作用、抗氧化作用、细胞毒作用、诱导癌细胞分化、抗血管生成作用、诱导细胞凋亡等。正是由于其显著的抗癌作用，使得对熊果酸结构修饰方面的研究较为深入。如林凤屏等的“熊果酸衍生物的合成、表征及其对癌细胞的抑制活性”（《应用化学》，2010, 27, 893-898）；孟艳秋等更是开发了熊果酸C-17位修饰成氨基酸、氨基醇、胺、杂环，C-3羟基氧化（或形成肟、乙酰化、乙酰氧亚氨基）等系列衍生物等多项专利。

杂环化合物具有特殊的生物活性，特别是含氮杂环化合物广泛应用于制药工业，将含氮杂环结构的基团接入某些药物母体上，经常能达到增强生物活性的作用。含氮杂环化合物与生命科学、医药开发的关系十分密切。在氮杂环化合物中，扮演着最重要角色的是五、六元杂环，也是目前人们聚焦的热点，例如：哌嗪、吡唑、吡啶、嘧啶、咪唑等环状结构正引起新药开发者的广泛关注，是近年来不断吸引人们眼球的新领域。

为了更深入研究熊果酸类化合物构效关系，本发明提供一种具有抗肿瘤活性的熊果酸含氮杂环类结构修饰物及其制备方法，该类修饰物是将C-3位羟基、C-17位羧基分别交叉进行化学基团改性，以供医学界作为药物进行筛选。此类化合物的合成及抗癌活性性研究国内外均未见其报道。

发明内容

本发明的目的是以熊果酸为先导化合物，提供一种具有抗肿瘤活性的含氮杂环类结构修饰物及其制备方法，设计出一系列熊果酸的含氮杂环类结构衍生物。

为了实现这一目的，本发明申请人通过一系列有益的试验，总结出熊果酸结构修饰物的抗癌活性及其溶解性大致存在如下构效关系：

1、将羟基酯化，同时C-17位羧基被氨基烷化成酰胺的改性熊果酸衍生物，细胞毒活性显著增强，但对正常细胞的毒性要小。一方面可能是适当的脂溶性使修饰物更容易穿过细胞膜，进入细胞内；另一方面，可能与癌细胞比正常细胞含有更多的酯酶、酰胺酶有关，有利于修饰物释放熊果酸和含氨基化合物，发挥抗癌作用，最终使药效得以提高。

2、将C-3或C-17位羧基酯化后的修饰物，其活性都下降。而C-3和C-17位羧基同时被酯化的修饰物，其抗癌活性进一步降低甚至消失，说明保持C-3或C-17位上的极性基团于药物活性是必须的，它们可能通过与细胞中的生物大分子（如DNA，蛋白质）形成氢键。

3、熊果酸在大部分有机溶剂和水中的溶解性都很差，生物膜透过性较差，口服吸收率、生物利用度低。因此在母体上引入一些氨基等极性基团后可改善其溶解性，从而可能会提高其生物活性。而哌嗪结构是许多药物分子的关键部位，含有哌嗪结构单元的多胺类衍生物具有抗菌、抗病毒等多种生理活性。哌嗪，又名对二氮己环，具有典型的对二仲胺结构六元环，是富氮杂环化合物的理想结构单元。该碱性基团因其毒性小，又能有效地调节药物的酸碱平衡常数和脂水分配系数，引入哌嗪环结构后修饰物的水（脂）溶性明显得到改善，体外抗癌活性也显著增强。

由此可见，形成酰胺类物质或连接哌嗪环等含氮杂环类化合物成为了一个改善熊果酸抗癌活性的潜在突破口。

基于上述几点考虑，本发明将C-3位羟基、C-17位羧基分别交叉进行化学基团改性，以供医学界作为药物进行筛选。

本发明采取的技术方案如下：

本发明所述熊果酸含氮杂环类结构修饰物为下述通式（Ⅰ）的熊果酸含氮杂环衍生物：

（Ⅰ）

其中：R1为羰基、乙酰氧基或羟基；R2为含氮杂环。

所述含氮杂环为哌嗪、N-（2-氨乙基）哌嗪或N-乙基哌嗪。

本发明还提供了所述的熊果酸含氮杂环类结构修饰物的制备方法。

当R1为羰基时，所述熊果酸含氮杂环衍生物的制备方法具体包括以下步骤：

（1）熊果酸和氯铬酸吡啶嗡盐反应制得3 -氧代熊果酸，其结构式如下：

Figure 2012101804839100002DEST_PATH_IMAGE003

；

（2）3 -氧代熊果酸经过草酰氯活化后，再与含氮杂环化合物反应得到熊果酸含氮杂环衍生物，结构式如式Ⅱ所示：

Ⅱ。

当R1为乙酰氧基时，所述熊果酸含氮杂环衍生物的制备方法具体包括以下步骤：

（1）熊果酸和乙酸酐反应制得3β-乙酰氧基熊果酸，其结构式如下：

；

（2）3β-乙酰氧基熊果酸经过草酰氯活化后，再与含氮杂环化合物反应制得熊果酸含氮杂环衍生物，结构式如式Ⅲ所示：

Ⅲ。

当R1为羟基时，所述熊果酸含氮杂环衍生物的制备方法具体包括以下步骤：

；

（2）3β-乙酰氧基熊果酸经过草酰氯活化后，再与含氮杂环化合物反应制得熊果酸含氮杂环衍生物1，结构式如式Ⅲ所示：

Ⅲ；

（4）熊果酸含氮杂环衍生物1经碱液处理水解得熊果酸含氮杂环衍生物，结构式如式Ⅳ所示：

Ⅳ。

所述碱液为氢氧化钠溶液或氢氧化钾溶液。

本发明还提供了所述的熊果酸含氮杂环类结构修饰物在制备用于治疗癌症药物中的应用。

本发明的反应流程，是通过下列步骤完成的：

（1）熊果酸（UA）分别与氯铬酸吡啶嗡盐(PCC)、乙酸酐反应制得3 -氧代熊果酸（化合物UA-2）、3β-乙酰氧基熊果酸（化合物UA-3）

（2）化合物2经过草酰氯活化后，再与相应的含氮杂环结构反应得到化合物UA-4a、5a、6a；

（3）化合物3经过草酰氯活化后，再与相应的含氮杂环结构反应制得化合物UA-4b、5b、6b；

（4）化合物UA-4b、5b、6b；经碱液处理水解得化合物UA-4c、5c、6c。

具体流程如下：

。

其中，化合物UA-2，3，4，4b，4c，5a，5b，5c，6a，6b，6c为通式（Ⅰ）的系列化合物，它们的相关基团R1，R2如下表所示：

Figure 2012101804839100002DEST_PATH_IMAGE009

。

本发明的优点在于，本发明对天然产物熊果酸进行结构改造，得到一系列熊果酸的结构修饰物，体外细胞增殖抑制实验表明，它们对三种癌细胞株包括人恶性黑色素瘤A-375细胞、人胃癌BGC-823以及AGS细胞等均具有明显的体外增殖抑制作用，部分甚至优于紫杉醇。其中化合物UA-5b的体外抗肿瘤效果最好。

具体实施方式

以下为本发明的具体实施例子以及对比实施例可以进一步清楚地了解本发明，但是它们不是对本发明的限定：

实施例1

3-氧代-熊果烷型-12-烯-28-羧酸（化合物UA-2）的制备

PCC的制备：在250mL三颈瓶中，剧烈搅拌情况下将50g CrO₃迅速加入到92ml 6mol/L盐酸溶液中，5min后将均相体系冰浴冷却。撤除冰浴后，再将40g吡啶由恒压漏斗缓慢地滴入三颈瓶中，至少10min内滴完，将反应体系重新冷却至0摄氏度，得橙黄色固体PCC，过滤，真空干燥2h后密封冷藏备用；

称取UA 0.5g，0.7g PCC，溶于10mL二氯甲烷中，常温常压下搅拌，采用TLC监测反应进程，6-9 h后结束反应，加水搅拌分散，氯仿萃取二次，每次25mL，混合有机相，减压蒸除氯仿，残余物用少许氯仿溶解，湿法上样，硅胶柱层析纯化（氯仿: 甲醇=50:1），干燥后得目标产物UA-2 0. 47g。

性状：白色粉末；产率：95 %；mp：289-291℃。

IR数据（KBr，cm^-1）及其归属：υ：32929(C-H伸缩振动)，1704（s，C=O伸缩振动)，1385（UA A区特征吸收)，1277 (UA B区特征吸收) cm^-1。

ESI-MS：m/z 453.5 [M-H]^-。

1H NMR(500 MHz，CDCl₃) δ：5.28 (s，1H，H-12 )，2.57 (m，1H，H-2a)，2.40 (m，1H，H-2b) ，2.24(d，1H，J = 11.2 Hz，H-18 )，1.11（d，6H，J = 1.9 Hz，CH₃×2），1.08（s，3H，CH₃），1.05 (s，3H，CH₃)，0.97 (d，3H，J = 6.3 Hz，CH₃)，0.88 (d，J = 6.4 Hz，3H，CH₃)，0.85（s，3H，CH₃）。

实施例2

3-氧代-熊果烷型-12-烯-28--酰氯的制备

250mg的UA-2溶解于10mL乙醚中，分批次、逐滴加入0. 25mL的草酰氯，室温下搅拌反应24-36 h，蒸除溶剂及反应产生的气体，加l0mL环己烷溶解得到的白色泡沫状固体，减压回收环己烷带出未反应净的草酰氯，回收2-3次，得3-氧代熊果酰氯中间体的粗品，备用。

实施例3

3-氧代-熊果烷型-12-烯-28--酰-(1-乙基)哌嗪（化合物UA-4a）的制备

取125ml N-乙基哌嗪，溶于15mL二氯甲烷中，缚酸剂三乙胺调节溶液pH至 8-9，加入30mg DMAP（4-二甲氨基吡啶）作催化剂，逐滴滴加上述新鲜3-氧代熊果酰氯中间体的二氯甲烷溶液，室温下搅拌反应，采用TLC监测反应进程，12-24 h后结束反应，减压蒸除反应溶剂，残余固体用二氯甲烷溶解，用浓度为1%的稀HCl溶液洗涤以除去过量的哌嗪及三乙胺等碱性杂质，洗涤2次，弃去水层，混合有机相，减压蒸出二氯甲烷后，残留固体水洗，50摄氏度干燥。干燥后的产物以乙酸乙酯:石油醚(2.5:1)进行硅胶柱层析纯化，无水乙醇热溶，冷却重结晶，得化合物UA-4a固体。

性状：白色粉末；产率：85.16%；mp：164-167℃。

IR数据（KBr，cm^-1）及其归属：υ：2944(C-H伸缩振动)，1709（s，C=O伸缩振动），1633（s，C=O伸缩振动，酰胺Ⅰ峰），1383（UA A区特征吸收），1269 (UA B区特征吸收) cm^-1。

ESI-MS：m/z 551.6 [M-H]⁺.

¹ H NMR (500 MHz， CDCl₃) δ 5.26 (s，1H，H-12)，3.66 (br，4H，-N(CH₂CH ₂)₂)，2.57 (m，1H，H-2a)，2.51 – 2.40 (m，6H，N(CH₂)₃)，2.38 (m，1H，H-2b)，1.14 – 1.08 (m，9H，CH₃×3)，1.07 (s，3 H，CH₃)，1.06 (s，3 H，CH₃)，0.96 (d，3H，J=6.3Hz，CH₃)，0.90 (d，3H，J=6.4Hz，CH₃)，0.82 (s，3 H，CH₃)。

实施例4

3-氧代-熊果烷型-12-烯-28--酰-哌嗪（化合物UA-5a）的制备

同UA-4a的合成方法，80mg哌嗪，溶于20mL二氯甲烷，加1mL三乙胺作缚酸剂，20mg DMAP作催化剂，缓慢加入新制3-氧代熊果酰氯中间体的二氯甲烷溶液，室温反应，采用TLC监测反应进程，5 h后停止反应，回收反应溶剂，残留固体水洗，干燥。以氯仿:甲醇(30:1)进行硅胶柱层析，湿法上样，得目标产物UA-5a。

性状：白色粉末；产率：70.4；mp：145-147℃。

IR数据（KBr，cm^-1）及其归属：υ：3421（N-H伸缩振动），2946(C-H伸缩振动)，1705（s，C=O伸缩振动），1634（s，C=O伸缩振动，酰胺Ⅰ峰），1370（UA A区特征吸收），1248（UA B区特征吸收）cm^-1。

ESI-MS：m/z 523.5 [M-H]⁺。

1H NMR (500 MHz， CDCl₃) δ5.27 (s，1H，H-12)，3.68 ((br，4H，-N(CH₂CH ₂)₂)，2.57 (m，1H，H-2a)，2.95 (m，6H，-N(CH₂)₂)，2.41 (m，1H，H-2b)，1.10 (s，3 H，CH₃)，1.06 (s，3 H，CH₃)，1.01（s，3H，CH₃），0.96（d, 3 H，J=6.5Hz，CH₃），0.92 (d，3H，J=6.3Hz，CH₃)，0.90 (s，3H，CH₃)，0.82 (s，3 H，CH₃)。

实施例5

3-氧代-熊果烷型-12-烯-28--酰-4-氨乙基哌嗪（化合物UA-6a）的制备

同UA-4a的合成方法，无需加入催化剂DMAP，由3-氧代熊果酰氯中间体直接同N-（2-氨乙基）哌嗪应制得UA-6a，柱层析纯化（氯仿:甲醇=25:1）。

性状：白色粉末；产率：75.4%；mp：128-131℃。

IR数据（KBr，cm^-1）及其归属：υ：3415（N-H伸缩振动），2944(C-H伸缩振动)，1704（s，C=O伸缩振动），1643（s，C=O伸缩振动，酰胺Ⅰ峰），1515（N-H弯曲振动，酰胺Ⅱ峰），1384（UA A区特征吸收），1285（UA B区特征吸收）cm^-1。

ESI-MS：m/z 566.4 [M-H]⁺。

1H NMR (500 MHz， CDCl₃) δ 6. 48 (s，1H，CONHCH₂)，5.34 (s，1H，H-12)， 3.45 – 3.34(m，1H，CONHCH2a)，3.23 (m，1H，CONHCH2b)，2.95（br，2H，CONHCH₂ CH ₂)，2.59 – 2.51 (m，4H，-NH(CH₂)₂)，2.52 – 2.35 (m，6H，CH₂×3)，1.12（s，3H，CH₃），1.10（s，3H，CH₃），1.06-1.03 (m，6H，CH₃×2)，0.98（s，3H，CH₃），0.90 (d，J = 6.4 Hz，3H，CH₃)，0.85（s，3H，CH₃）。

实施例6

3β-乙酰氧基-熊果烷型-12-烯-28-羧酸（化合物UA-3）的制备

1 g UA用10ml吡啶溶解，在冰浴条件下逐滴滴加4mL醋酸酐，并加入20mg的DMAP作催化剂，室温下搅拌反应，采用TLC监测反应进程，12 h后反应结束，然后减压蒸馏浓缩溶剂，加入大量冰水，析出白色固体，，用2 N HCl调节pH至酸性，蒸除溶剂，抽滤，水洗滤饼至中性，干燥，干燥后的产物干法上样，硅胶柱层析纯化（石油醚（60-90℃）:乙酸乙酯=4:1），甲醇热溶，冷却重结晶，得目标化合物固体UA-3。

性状：白色粉末；产率：95.17%；mp：285-288℃。

IR数据（KBr，cm^-1）及其归属：υ：3452（O-H伸缩振动），2925(C-H伸缩振动)，1794（s，C=O伸缩振动），1734（s，C=O伸缩振动），1371（UA A区特征吸收），1245 (s，C-O-C不对称伸缩振动) cm^-1。

ESI-MS：m/z 497.5 [M-H]⁺。

1H NMR（500MHz，CDCl₃）δ：5.33（t，1H，H-12，J=3.5Hz），4.49（t，1H，H-3，J=7.2Hz），2.22（d，1H，H-18，J=11.2Hz），2.07（s，3 H，CH₃COO），1.10（s，3 H，CH₃），0.98（s，3H，CH₃），0.96（s，3 H，CH₃），0.90（d，6H，J = 4.5 Hz，CH×2），0.88（s，3 H，CH₃），0.84（s，3 H，CH₃）。

实施例7

3β-乙酰氧基-熊果烷型-12-烯-28-酰氯的制备

250mg的UA-3溶解于10mL二氯甲烷中，逐滴加入0. 25mL的草酰氯，室温下搅拌反应，24-36 h后结束反应，蒸除溶剂及反应产生的气体，加l0mL环己烷溶解得到的白色泡沫状固体，减压回收环己烷带出未反应净的草酰氯，回收2-3次，得3β-乙酰氧基熊果酰氯中间体的粗品，备用。

实施例8

N-[3β-乙酰氧基-熊果烷型-12-烯-28-酰]-(1-乙基)哌嗪（化合物UA-4b）的制备

取125ml N-乙基哌嗪，溶于15mL二氯甲烷中，缚酸剂三乙胺调节溶液pH至 8-9，加入30mg DMAP作催化剂，逐滴滴加上述新鲜3β-乙酰氧基熊果酰氯中间体的二氯甲烷溶液，室温下搅拌反应，采用TLC监测反应进程，12-24 h后反应结束，减压蒸除反应溶剂，残余固体用二氯甲烷溶解，用浓度为1%的稀HCl溶液洗涤以除去过量N-乙基哌嗪及三乙胺等碱性杂质，洗涤2次，弃去水层，混合有机相，减压蒸出二氯甲烷后，残留固体水洗，50℃干燥。干燥后的产物以乙酸乙酯:石油醚(2:1)进行硅胶柱层析纯化，无水乙醇热溶，冷却重结晶，得化合物UA-4b，为白色粉末状固体。

性状：白色粉末；产率：69.5%；mp：182-185℃。

IR数据（KBr，cm^-1）及其归属：υ： 2943(C-H伸缩振动)，1735（s，C=O伸缩振动），1692（s，C=O伸缩振动，酰胺Ⅰ峰），1369（UA A区特征吸收），1248 (s，C-O-C不对称伸缩振动) cm^-1。

ESI-MS：m/z 595.3 [M-H]⁺。

1H NMR (500 MHz，CDCl₃) δ 5.24 (s，1H，H-12)，4.52 ((t，1H，J = 8.0 Hz， H-3)，3.65 (br，4H，-N(CH₂CH ₂)₂)，2.45-2.41 (m，6H，-N(CH₂)₃)，2.07 (s，3 H，CH₃COO)，1.14 – 1.08 (m，6H，CH₃×2)，0.97 (s，3 H，CH₃)，0.96 (s， 3 H，CH₃)，0.91-0.87 (m，9H，CH₃×3)，0.77 (s，3 H，CH₃)。

实施例9

N-[3β-乙酰氧基-熊果烷型-12-烯-28-酰]-哌嗪（化合物UA-5b）的制备

同UA-4b的合成方法，80mg哌嗪，溶于20mL二氯甲烷，缚酸剂三乙胺调节溶液pH至 8-9，20mg DMAP作催化剂，新鲜3β-乙酰氧基熊果酰氯中间体的的二氯甲烷溶液，室温反应5h，回收反应溶剂，残留固体水洗，干燥。以氯仿:甲醇(30:1)进行硅胶柱层析，得目标产物UA-5b。

性状：白色粉末；产率：70.1%；mp：149-152℃。

IR数据（KBr，cm^-1）及其归属：υ：3454（N-H伸缩振动），2927（C-H伸缩振动），1734（s，C=O伸缩振动），1632（s，C=O伸缩振动，酰胺Ⅰ峰），1371（UA A区特征吸收），1247（C-O-C不对称伸缩振动）cm^-1。

ESI-MS：m/z 567.3 [M-H]⁺。

1H NMR (500 MHz，CDCl₃) δ 5.25 (s，1H，H-12)，4.52 (t，1H，J =5.6Hz，H-3)，3. 72(br，4H，-N(CH₂CH ₂)₂)，3.18 (br，4H，-N(CH ₂)₂)，2.08（s，3 H，CH ₃CO），1.10（d, 3 H，CH₃，J=3.5Hz），1.01（s，3H，CH₃），0.99（d，3 H，CH₃，J=6.5Hz），0.96（s，3H，CH₃），0.92 – 0.87 (m，6H，CH₃×2)，0.75（s，3H，CH₃），0.72（s，3H，CH₃）。

实施例10

N-[3β-乙酰氧基-熊果烷型-12-烯-28-酰]-4-氨乙基哌嗪（化合物UA-6b）的制备

同UA-4b的合成方法，无需DMAP，直接由3β-乙酰氧基熊果酰氯中间体同N-（2-氨乙基）哌嗪反应制得UA-6a，柱层析纯化（氯仿:甲醇=25:1）。

性状：白色粉末；产率：69.5%；mp：147-150℃。

IR数据（KBr，cm^-1）及其归属：υ：3417（N-H伸缩振动），2946(C-H伸缩振动)，1735（s，C=O伸缩振动），1638（s，C=O伸缩振动，酰胺Ⅰ峰），1522（N-H弯曲振动，酰胺Ⅱ峰），1371（UA A区特征吸收），1246 (s，C-O-C不对称伸缩振动) cm^-1。

ESI-MS：m/z 610.7 [M-H]⁺。

1H NMR (500 MHz， CDCl₃) δ6. 44 (m，1H，CONHCH₂)，5.33 (s，1H，H-12)， 4.52 (dd，1H，J = 10.7，5.0 Hz，H-3)，3.48 – 3.35 (m，1H，CONHCH ₂a)，3.22 (m，1H，CONHCH ₂b)，3.00 ( br，2H，- CONHCH₂ CH ₂)，2.52（br，2H，NH(CH₂)₂），2.48（t，J=5.2Hz，4H，-N(CH₂)₂，2.07（s，3 H，CH₃CO），1.14（s，3H，CH₃），0.99（s，3H，CH₃），0.97（s，3H，CH₃），0.92 - 0.83（m，9H，CH₃×3），0.80（s，3H，CH₃）。

实施例11

N-[3β-羟基-熊果烷型-12-烯-28-酰]- (1-乙基)哌嗪（化合物UA-4c）的制备

称取UA-4b 0.3g，溶于10 ml CH₃OH-THF（1：1.5 v：v）中，加入1.0 ml 4N NaOH，室温下搅拌反应，采用TLC监测反应进程，3.5-5h后反应完全，向混合物中加入适量的水，2 N HCl调pH 3-4，减压蒸除溶剂，水洗沉淀至中性，柱层析纯化（乙酸乙酯:石油醚(3:1)），无水乙醇热溶，冷却重结晶的目标物UA-4c。

性状：白色粉末；产率：79.1%；mp：195-198℃。

IR数据（KBr，cm^-1）及其归属：υ：3428（O-H伸缩振动），2927(C-H伸缩振动)，1634（s，C=O伸缩振动，酰胺Ⅰ峰），1389（UA A区特征吸收），1273（UA A区特征吸收），1246（UA B区特征吸收）cm^-1。

ESI-MS：m/z 553.5 [M-H]⁺。

1H NMR(500 MHz，CDCl₃) δ 5.22 (s， 1H)，3.22 (dd，J = 10.9， 4.5 Hz， H-3)， 3.06 (br，4H，N(CH₂CH ₂)₂) ，2.45-2.12 (m，4H，-N(CH2)2)，1.09 (s，3H，CH₃)，1.00 (s，3H，CH₃)，0.98–0.93 (m，3 H，CH3)，0.92 (s，3H，CH₃)，0.88 (d, J = 6.2 Hz, 3H)，0.80 (s，3 H，CH3)，0.72 (s，3H，CH3)。

实施例12

N-[3β-羟基-熊果烷型-12-烯-28-酰]-哌嗪（化合物UA-5c）的制备

称取UA-5b 0.5945g，溶于20 ml CH₃OH-THF（1：1.5 v：v）中，加入2.0 ml 4N NaOH，室温下搅拌反应3.5 h，反应完全，向混合物中加入适量的水，2 N HCl调pH 3-4，减压蒸除溶剂，水洗沉淀至中性，柱层析纯化（氯仿:甲醇(25:1)），无水乙醇热溶，冷却重结晶。

性状：白色粉末；产率：87%；mp：250-252℃。

IR数据（KBr，cm^-1）及其归属：υ：3411（O-H伸缩振动），2922（C-H伸缩振动），1632（s，C=O伸缩振动，酰胺Ⅰ峰），1406（UA A区特征吸收）, 1252（UA B区特征吸收）cm^-1。

ESI-MS：m/z 525.2 [M-H]⁺。

1H NMR (500 MHz，CDCl₃) δ 5.24 (s，1H，H-12)，3.23 (dd，1H，J = 11.0， 4.9 Hz，H-3)，3. 60(br，4H，N(CH₂CH ₂)₂)，2.85 (br，4H，-N(CH ₂)₂)，2.46 (br，1H，H-18)，1.10（s，3H，CH₃），1.01（s，3H，CH₃），0.96（d，3 H，CH₃，J=6.5Hz），0.93（s，3H，CH₃），0.90（d，3 H，CH₃，J=6.5Hz），0.80（s，3H，CH₃），0.78（s，3H，CH₃）。

实施例13

N-[3β-羟基-熊果烷型-12-烯-28-酰]-4-氨乙基哌嗪（化合物UA-6c）的制备

同UA-4c的合成方法，由UA-6b水解反应制得UA-6c，柱层析纯化（氯仿:甲醇=20:1），乙醇热溶，冷却重结晶。

性状：白色粉末；产率：86.17%；mp：217-220℃。

IR数据（KBr，cm^-1）及其归属：υ：3393（O-H伸缩振动），2927(C-H伸缩振动)，1637（s，C=O伸缩振动，酰胺Ⅰ峰），1525（N-H弯曲振动，酰胺Ⅱ峰），1379（UA A区特征吸收），1279（UA B区特征吸收），1252（UA B区特征吸收）cm^-1。

ESI-MS：m/z 568.6 [M-H]⁺。

1H NMR (500 MHz, CDCl₃) δ6. 32 (m，1H，CONHCH₂)，5.24 (s，1H，H-12)，3.22 (d，1H，J = 10.9，4.5 Hz，H-3) ，2.91(br，4H，-N(CH₂CH ₂)₂)，2.53 (br，4H，-N(CH ₂)₂)，0.98–0.93 (m，3 H，CH₃)，0.92 (s，3 H，CH₃)，0.90–0.87 (m，6H，CH₃×2)，0.85（s，3H，CH₃），0.80 (s，3 H，CH₃)，0.72 (s，3 H，CH₃)。

实施例14

MTT法检测UA及其含氮杂环类结构修饰物的体外抗癌活性

取处于对数生长期状态良好的细胞一瓶，胰蛋白酶消化，制成5×10⁴个/mL的细胞悬液。

Figure 2012101804839100002DEST_PATH_IMAGE011

细胞悬液移入96孔板，每孔100μL，周围一圈用PBS填充，以避免板上各边缘孔内因水分挥发而引起药物浓度改变，随后置37℃, 5% CO₂培养箱中培养24 h。

移去旧培养基，加入新的含药培养基，药物浓度配制方法：DMSO溶解受试衍生物配成一定浓度的母液，用RPMI1640培养基将受试衍生物的母液稀释，设定不同作用浓度:1、5、10、15、20、40、60μmol/L，每孔100μL，另设空白对照组、UA对照组（UA 60μmol/L或20μmol/L）和紫杉醇对照组（60μmol/L或20μmol/L），每组设6个复孔。药物作用24 h后，吸弃含药培养基，于每孔中加入无血清、无酚红1640培养基100μL，再加入MTT溶液10μL，继续孵育4 h，终止培养。

Figure 2012101804839100002DEST_PATH_IMAGE013

小心吸弃96孔板孔内上清液，每孔加入150μL DMSO，振荡10 min，于490 nm波长处在酶标仪上测定各孔光吸收值(OD值)，计算细胞的增殖抑制率：抑制率（%）=（1-用药组平均OD值÷空白对照组平均OD值）×100%，应用SPSS16.0软件进行数据处理并计算癌细胞增殖的半数抑制浓度（IC₅₀），结果见表1。

如表1结果所示，所合成的UA结构修饰物对不同的肿瘤细胞均具有一定的增殖抑制作用，其中化合物UA-5a、5b、6b、5c和6c的体外抑制活性都要优于UA，UA-5b和5c甚至优于紫杉醇。说明，UA含氮杂环类结构修饰物具有较好的抗癌活性潜力。

表1 熊果酸及其结构修饰物对三种癌细胞的体外增殖抑制作用

IC₅₀ : Concentrations that inhibited 50% of the growth of the tumor cell line.

The results were expressed as mean±SD (fold, n≥6）, compared with UA, *P<0.05;**P<0.01。