CN103919765B

CN103919765B - 高车前素在制备儿茶酚药物增效剂中的应用及包含高车前素的药物组合物

Info

Publication number: CN103919765B
Application number: CN201410169644.3A
Authority: CN
Inventors: 王平; 汪福意; 宁静; 张辉
Original assignee: WUXI AIDEMEITE BIOLOGICAL TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: Shenyang Beichuang Medical Laboratory Co ltd
Priority date: 2014-04-24
Filing date: 2014-04-24
Publication date: 2016-06-15
Anticipated expiration: 2034-04-24
Also published as: CN103919765A

Abstract

本发明涉及高车前素在制备儿茶酚药物增效剂中的应用及包含高车前素的药物组合物。所述高车前素不仅可减缓儿茶酚类药物的体内代谢、提高其血药浓度及持效时间，同时还具有良好的安全性。本发明还涉及一种药物组合物，其包含所述高车前素和一种儿茶酚药物如左旋多巴、瑞香素，所述组合物能显著提高儿茶酚药物的血药浓度和代谢半衰期，进而提升儿茶酚药物的口服生物利用度及治疗效果。

Description

高车前素在制备儿茶酚药物增效剂中的应用及包含高车前素的药物组合物

技术领域

本发明涉及高车前素在制备儿茶酚药物增效剂中的应用，其可提高儿茶酚药物的口服生物利用度及体内持效时间，同时还具有良好的安全性。此外，还涉及一种包含所述高车前素的药物组合物，属于医药技术领域。

背景技术

儿茶酚类化合物是一类具有邻二羟基结构的化合物，广泛存在于动植物体内。多巴胺、肾上腺素、异丙肾上腺素等神经递质类化合物，儿茶素、茶多酚、瑞香素、秦皮素、丹参素、原儿茶醛、黄芩素等天然产物均具有儿茶酚结构。儿茶酚化合物具有显著的抗炎、抗氧化、神经保护及抗肿瘤等活性，但该类化合物的代谢稳定性极差，在人体内易被儿茶酚-O-甲基转移酶(COMT)、磺酸化转移酶、葡萄糖醛酸转移酶等II相代谢酶快速代谢清除。例如，帕金森症治疗药物左旋多巴(L-dopa)是一个典型的儿茶酚类药物，其口服吸收后可在外周组织被脱酸酶及COMT酶快速代谢导致其入脑量不到给药量的1％，因而单独使用时几乎没有药效。因此，临床上L-dopa使用时需与外周脱羧酶抑制剂和COMT酶抑制剂联合使用方可增加L-dopa的血药浓度，进而提升其治疗效果。儿茶酚甲基化转移酶(COMT)是一种镁离子依赖型的酶，其以SAM作为甲基供体催化儿茶酚类底物的甲基化，生成O-甲基化儿茶酚和S-腺苷-L-高半胱氨酸(GuldbergandMarsden1975)。COMT酶的底物包括一系列的儿茶酚类化合物，其在机体的主要生理作用是代谢清除活性或毒性的儿茶酚。COMT酶介导的甲基化是左旋多巴(L-dopa)、多巴胺、肾上腺素、异丙肾上腺素等神经递质类药物，以及儿茶素、瑞香素、秦皮素、丹参素、原儿茶醛、黄芩素等天然活性物质的主要代谢途径。国内外大量研究已证实将COMT酶抑制剂与上述儿茶酚类药物联用确能显著增强儿茶酚类药物的血药浓度并延长其体内驻留时间，进而提升其疗效(PharmacolRev.1999；51:593-628)。尤其将L-dopa与COMT抑制剂如托卡朋，恩他卡朋合用已成为目前临床治疗帕金森症的金标准。然而，目前已上市的COMT酶抑制剂如托卡朋、恩托卡朋存在体内的抑制活性偏低、代谢半衰期短、连续使用易引发肝、肾毒性等诸多缺陷，在临床上的应用也受到多种限制。此外，帕金森症患者则需要频繁用药，长期使用托卡朋、恩托卡朋等现有COMT酶抑制剂后会引发严重的不良反应(Neurology2004；62:39-46)。因此开发新型安全高效的COMT抑制剂作为儿茶酚类药物的增效剂一直是国内外新药研发的一大热点。

专利CN101433545A和CN102755312A公开了黄酮作为新型帕金森症治疗药物的应用，表明黄酮类化合物可用于帕金森症的预防与治疗，其具有高安全性、高活性等优点。然而，上述专利中提到的黄酮多酚类化合物均具有溶解度差、体内代谢快、成药性差等缺陷。因此，寻找安全、有效、且具有良好的口服成药性及适宜的药代行为的COMT酶抑制剂对于帕金森症的治疗至关重要。

高车前素，又名粗毛豚草素，结构式为4’,5,7-三羟基-6-甲氧基黄酮，结构如式1，其不仅属于非儿茶酚类黄酮化合物，还在B环含有亲水基团。目前，尚未有关于高车前素作为儿茶酚类化合物增效剂应用的报道。

发明内容

针对当前COMT抑制剂研发中存在的诸多问题，本发明的目的之一在于提供高车前素在制备儿茶酚药物增效剂中的应用。所述高车前素属于非儿茶酚类黄酮化合物，其克服了目前药用黄酮化合物的溶解度差、体内代谢快等缺陷，其可采用95％乙醇提取结合柱分离等手段从植物毛莲蒿中高效获取，省去了繁琐的合成步骤，大幅度节约成本并显示出了良好的儿茶酚类药物增效活性。

本发明针对已有COMT酶抑制剂存在的多种缺陷如体内抑制活性偏低、连续使用易引发肝、肾毒性等，以及黄酮类化合物普遍具有的溶解度差、体内代谢快等缺陷，在前期工作的基础上，通过系列化合物的筛选与结构-药效、结构-安全性、结构-ADME属性的多维属性评估和优化，发现天然产物高车前素可作为新型儿茶酚甲基化转移酶强效抑制剂使用，该类抑制剂可强效抑制儿茶酚甲基化转移酶，进而减缓儿茶酚类药物的体内代谢、提高其血药浓度及持效时间，其抑制儿茶酚甲基化转移酶的EC₅₀值低于30纳摩，具有安全、高效、成药性好等特征，是优异的儿茶酚药物的增效剂。

所述高车前素作为儿茶酚药物增效剂与儿茶酚药物联合用药。所述联合用药是所述高车前素单独成药后与儿茶酚类药物联合使用，或与儿茶酚药物混合后做成药物组合物使用。在该联合用药中高车前素与儿茶酚药物的摩尔比为1:10～10:1，例如2:10，5:10，8:10，10:8，10:5，10:2，优选摩尔比为1:1～5:1。所述儿茶酚药物包括左旋多巴和/或瑞香素。

本发明的目的之一还在于提供一种药物组合物，其包括所述高车前素和儿茶酚药物，高车前素可抑制儿茶酚类药物的体内代谢，进而可作为儿茶酚药物的增效剂使用。所述高车前素与儿茶酚药物合用的摩尔比为1:10～10:1，例如2:10，5:10，8:10，10:8，10:5，10:2，优选摩尔比为2:1～5:1。所述儿茶酚药物包括左旋多巴和/或瑞香素。

所述药物组合物可采用多种剂型，如普通片剂、缓释片、胶囊剂、滴丸、注射剂等剂型。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

1.安全性高：所述高车前素具有良好安全性，其小鼠口服LD50>2g/kg，同时对人体主要脏器细胞亦无明显毒性，且不会经CYP酶代谢激活产生活性中间体，不会与生物大分子形成毒性加合物；

2.高效：体外COMT抑制活性评估显示高车前素的EC₅₀可达nM级。

3.增效：所述高车前素与儿茶酚药物联合用药，提高儿茶酚药物的血药浓度和代谢半衰期，提升左儿茶酚药物的口服生物利用度及治疗效果。体内研究显示其与L-dopa联用后，L-dopa的AUC最高可增加71％；

4.较好的成药性：高车前素较普通黄酮化合物提高了溶解度，利于其剂型的开发及提高口服生物利用度。同时其体内代谢半衰期明显延长；

5.代谢产物仍保留活性：高车前素在人体内的主要代谢产物为葡萄糖醛酸代谢产物，其代谢产物仍具有COMT酶抑制活性，在体内仍可发挥儿茶酚药物增效剂的用途。

6、经济环保：高车前素可采用95％乙醇提取结合柱分离等手段从植物毛莲蒿中高效获取，省去了繁琐的合成步骤，大幅度节约成本

附图说明

式1为高车前素的结构式

图1为高车前素对人肝COMT酶抑制的浓度依赖性抑制图

图2为高车前素对人肝COMT酶抑制的抑制类型图

具体实施方式

为更好地说明本发明，便于理解本发明的技术方案，本发明的典型但非限制性的实施例如下：

实施例1.高车前素的小鼠口服急性毒性评估

选取昆明小鼠(购于大连医科大学实验动物中心)，雌雄各半，体重19-22g。将小鼠随机分组，每组20只，雌雄各半。高车前素混悬于0.5％CMC-Na中，浓度为1g/L。实验组包括高车前素不同剂量组(0.2～2g/kg)以及0.5％CMC-Na空白对照组。连续观察给药后小鼠的行为状态直至14天，并于第14天对不同给药组小鼠进行大体解剖并观察内脏情况。最大剂量组(2g/kg)给药组小鼠中只有3例死亡，其他剂量组均无死亡例。对死亡个体进行解剖并未发现肝、肾等主要器官的明显病变。实验结果提示小鼠口服高车前素的LD50值大于2.0g/kg，属于无毒级别。由此可见，高车前素类化合物具有高安全性。

实施例2.高车前素类化合物对人COMT酶的抑制活性测定

以L-dopa甲基化反应为探针反应，借助人肝细胞浆体外孵育体系，测定高车前素类化合物对COMT酶抑制的IC50，具体实验流程如下：

(1)200微升体外代谢反应体系中，分别加入MgCl₂，二硫苏糖醇，底物L-dopa，人肝细胞浆蛋白浓度为1mg/ml，高车前素(终浓度分别为2.5，5，10，20，50，75，100nM)和Tris-HCl缓冲液；另设空白对照组(不加高车前素)。

(2)向反应体系中加入0.2mMS-腺苷蛋氨酸，起始反应；于37℃条件下反应30分钟后，加入200μl乙腈，剧烈震荡后，终止反应；孵育体系中各辅因子、L-dopa和高车前素的加入量可见表1。反应体系于37℃条件下预孵3分钟；

表1.孵育体系中各辅因子、L-dopa的浓度

(3)采用高速冷冻离心机，在20,000×g的条件下，高速离心上述体系20分钟后，取上清，进行HPLC-MS/MS检测分析；通过检测L-dopa3-位甲基化代谢产物离子对(m/z212.2＞195.1)，对甲基化代谢产物进行定量检测。

根据不同浓度高车前素对COMT酶的抑制强度，作高车前素对人肝COMT酶抑制的浓度依赖性抑制图1.

高车前素对COMT酶呈现出底物依赖性的抑制，其半数抑制浓度EC₅₀为21nM，其抑制活性甚至优于已上市COMT酶抑制剂托卡朋，可见高车前素对COMT酶有较强的抑制活性。此外，Lineweaver–Burk及Dixon作图显示高车前素是COMT酶的非竞争性抑制剂，见图2。

实施例3.高车前素与L-dopa合用的大鼠整体药代学研究

18只Wistar大鼠，雌雄各半，按体重(180-220g)随机分组，6只/组开展单独口服L-dopa及同时口服高车前素(50mg/kg)与L-dopa(50mg/kg)的整体药代学研究，并与阳性对照(托卡朋)对L-dopa药动学影响进行对比。分别在采集给药前血浆及给药后5、10、15、30、45、60、90、120、180、240分钟的大鼠血浆样品0.5ml左右，置于预先肝素化的1.5ml尖底棕色离心管中，4000×g离心10分钟后，分离血浆后加入等体积的甲醇沉淀蛋白并高速离心(20,000×g)，去上清保存于-80℃冰箱待测。采用UFLC-ESI-MS测定各样品中L-dopa的血药浓度，应用DAS2.0软件对血药浓度数据进行处理，并计算药动学参数。结果表明，相对于阳性对照(托卡朋)，高车前素能显著提高大鼠血浆中L-dopa水平，其AUC增大了33％，同时体内代谢半衰期延长了0.3倍，以上结果显示高车前素发挥了L-dopa增效剂的作用。高车前素与左旋多巴合用，提高左旋多巴的血药浓度和代谢半衰期，增强治疗效果。

实施例4.高车前素与左旋多巴联合用药的混合比例优化

按实施例3分别开展高车前素与左旋多巴的混合比例为1：10，1：5，1：1，2：1，5：1和10：1时高车前素对左旋多巴血药浓度的影响，平行开展左旋多巴对照组(不混入高车前素)，结果见表2。

表2.高车前素与左旋多巴不同比例混合时对左旋多巴体内代谢的影响

由此可见，与平行左旋多巴对照组相比，高车前素与左旋多巴的比例为2：1到5：1范围中左旋多巴的AUC增长了41～56％，同时半衰期延长了33～52％。相比其他比例，对左旋多巴的体内代谢影响最为显著。

相比现有技术，具有安全性高、抑制活性高、成药性好以及代谢产物具有保留活性以及经济环保等技术效果。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细组成，但本发明并不局限于上述详细组成，即不意味着本发明必须依赖上述详细组成才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims

1.高车前素在制备左旋多巴增效剂中的应用，其特征在于，高车前素作为药物增效剂与左旋多巴联合用药；所述联合用药中高车前素与左旋多巴的摩尔比为2:1～5:1；所述高车前素抑制儿茶酚甲基化转移酶的EC₅₀值低于30纳摩。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述联合用药为高车前素单独成药后与左旋多巴联合使用，或与左旋多巴混合后做成药物组合物使用。

3.一种药物组合物，其特征在于，其包含高车前素和左旋多巴，所述药物组合物中高车前素与左旋多巴的摩尔比为2:1～5:1。

4.根据照权利要求3所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物采用的剂型选自普通片剂、缓释片、胶囊剂、滴丸或注射剂中的任意一种。