CN104116730A - 二氢杨梅素作为活性成份在制备帕金森症治疗药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种含二氢杨梅素的植物提取物及其作为强效儿茶酚甲基化转移酶抑制剂的应用。含二氢杨梅素的植物提取物可用做帕金森症治疗药物左旋多巴的增效剂，体外活性测定发现该植物提取物抑制儿茶酚甲基化转移酶的IC50可达微摩尔-纳摩尔级。大鼠整体药代研究发现二氢杨梅素及与含二氢杨梅素的植物提取物左旋多巴联合使用后，可显著提高左旋多巴的血药浓度。此外，二氢杨梅素及含二氢杨梅素的植物提取物安全性高，不会经代谢激活产生活性中间体，不会与生物大分子形成毒性加合物，因此不会引发肝、肾毒性，提示其在帕金森症的辅助治疗中具有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属医药技术领域，具体涉及二氢杨梅素单体及含二氢杨梅素的植物提取物，其活性成分二氢杨梅素可作为强效儿茶酚甲基化转移酶抑制剂，增强左旋多巴药效进而用做帕金森症治疗药物。
背景技术
帕金森症(PD)是脑内多巴胺不足导致的一种慢性中枢神经系统退化性失调症，其在老年人中的发病率高达1.7%【Neurology.2000;54:S24-7】。我国是世界上PD患者最多的国家，随着我国老龄化社会的来临，PD带来的医疗、家庭、社会等问题越发广泛和严峻。PD治疗药物左旋多巴需与儿茶酚甲基化转移酶（COMT）抑制剂合用后方可在体内发挥药效【Eur Neurol.2009;62:1-8】。然而，已上市的COMT酶抑制剂（如托卡朋、恩托卡朋）的代谢半衰期短、体内活性不理想、且连续使用易引发严重的肝毒性【Neurology2004;62:39-46】。而PD患者需频繁用药，长期使用现有药物会引发严重肝损伤。因此研发安全强效的新型COMT抑制剂或辅助治疗药物一直是帕金森症治疗领域的研究热点之一。
国内外已有研究发现很多天然的儿茶酚类化合物都是儿茶酚甲基化转移酶的底物，但部分底物还显现出了高效的COMT抑制活性，即其可通过与左旋多巴竞争COMT酶而减缓体内COMT酶对左旋多巴的代谢清除。我们前期系统开展了中草药化学成分抑制COMT活性的筛选，发现天然黄酮儿茶酚类化合物具有较强的COMT抑制活性，尤其是以二氢杨梅素为代表的C环黄酮儿茶酚类化合物显现了良好的COMT抑制活性，有望作为左旋多巴的增效剂使用并用于帕金森症的 临床治疗。
二氢杨梅素作为一种黄酮儿茶酚化合物（图1），具有抗氧化【药学学报，2003，38（4）：241】，降血脂【茶叶科学，2007，27（3）：221-225】，抗肿瘤【癌症，2001,20(12)：1372】，抑菌【天然产物的开发与利用，2004，15（1）：40-42】，保肝护肝【中国中医药科技，2002，9(3):155】等多种药理活性。二氢杨梅素是藤茶等葡萄科蛇葡萄属植物中的主要化学成分，其在藤茶春夏幼嫩茎叶中二氢杨梅素的含量达到样品干重的20%以上,幼叶中的心叶可达40%以上【中国中药杂志,2000;7:423-425】。藤茶等葡萄科蛇葡萄属植物在我国南方（广东，广西，云南、贵州、湖南、江西、福建等省区）被制成保健茶饮用，已有数百年历史。此外，二氢杨梅素及含有二氢杨梅素的植物提取物不仅具有降血糖，降血脂，抗氧化等多种功效，同时还表现出了高安全性，并被作为食品添加剂在我国广泛使用。综上所述，考虑到二氢杨梅素及含有二氢杨梅素的植物提取物的高安全性及良好的COMT抑制活性，其有望成为安全强效的新型COMT抑制剂并用于帕金森症的辅助治疗。
发明内容
本发明提供了一种含二氢杨梅素的植物提取物或二氢杨梅素单体作为帕金森症辅助治疗药物的应用。具体特征在于二氢杨梅素及含二氢杨梅素的植物提取物可作为强效COMT酶抑制剂，减缓帕金森症治疗药物左旋多巴的外周代谢进而提高其疗效。二氢杨梅素的结构式如下：
本专利所述的二氢杨梅素是从天然草药化学成分中筛选出的一种高效、安全的COMT酶抑制剂，可有效改善当前临床使用COMT酶抑制剂存在的多种缺陷，如连续使用易引发肝、肾毒性等。
本专利涉及的二氢杨梅素及含二氢杨梅素的植物提取物，其特征在于该提取物或二氢杨梅素单体可单独成剂型后与帕金森症治疗药物（左旋多巴、卡比多巴/左旋多巴）联合使用。也可与帕金森症治疗药物（左旋多巴、卡比多巴/左旋多巴）按比例混合后作为药物组合物使用。儿茶酚甲基化转移酶抑制剂与左旋多巴混合使用时的比例介于1:1～10:1之间。
本专利涉及的天然COMT酶抑制剂（二氢杨梅素或含二氢杨梅素的植物提取物）的优点如下：1、高安全性，二氢杨梅素及含二氢杨梅素的植物提取物毒性很小，其小鼠口服后的LD50大于2.0g/kg(无毒级别)。此外，其对人体主要脏器细胞也无明显毒性，且不会经代谢激活产生活性中间体，不会与生物大分子形成毒性加合物；2、COMT酶抑制活性显著，其半数抑制浓度IC50可达微摩尔-纳摩尔级；3、体内PK实验结果显示，含二氢杨梅素的植物提取物与L-dopa（左旋多巴）联合用药后，L-dopa的AUC可明显增加；4、二氢杨梅素不易穿透血脑屏障，不会干扰中枢中内源性神经递质的甲基化代谢。
附图说明
图1.二氢杨梅素的化学结构式。
图2.二氢杨梅素对COMT酶抑制IC50图。
图3.二氢杨梅素对COMT酶抑制效应图。
具体实施方式
下列实施例是为了进一步说明本发明，而不是要限制其范围。
实施例1.二氢杨梅素及含二氢杨梅素的植物提取物对人COMT酶的抑制活性测定
以L-dopa甲基化反应为探针反应，借助人肝细胞浆体外孵育体系，测定二氢杨梅素及含二氢杨梅素的植物提取物（藤茶总黄酮，含二氢杨梅素48%）对COMT酶抑制的IC50，具体实验流程如下：
（1）200微升体外代谢反应体系中，加入5mM MgCl2，2mM二硫苏糖醇，150μM底物L-dopa，人肝细胞浆蛋白浓度为1mg/ml，抑制剂终浓度范围为0.05μM-50μM，于37℃条件下预孵3分钟；
（2）向反应体系中加入S-腺苷蛋氨酸（终浓度为0.2mM），起始反应；于37℃条件下反应30分钟后，加入200μl乙腈，剧烈震荡后，终止反应；
（3）采用高速冷冻离心机，在20,000×g的条件下，高速离心上述体系20分钟后，取上清，进行HPLC-MS/MS检测分析；通过检测L-dopa3-位甲基化代谢产物离子对[M-H]+m/z212.2＞195.1，对甲基化代谢产物进行定量检测。
二氢杨梅素及含二氢杨梅素的植物提取物都对COMT酶呈现出底物依赖性的抑制，二氢杨梅素半数抑制浓度为931nM，藤茶总黄酮的半数抑制浓度为249μg/L。此外，Lineweaver–Burk及Dixon作图均显示二氢杨梅素是COMT酶的混合型竞争性抑制剂。
实施例2.二氢杨梅素及含二氢杨梅素的植物提取物的安全性评估。
选取昆明小鼠（购于大连医科大学实验动物中心），雌雄各半，体重18-21g。将小鼠随机分组，每组20只，雌雄各半，分别开展二氢杨梅素和藤茶总黄酮的小鼠口服急性毒性试验。二氢杨梅素和藤 茶总黄酮提取物分别混悬于0.5%CMC-Na中。实验组包括二氢杨梅素不同剂量组（0.1～2g/kg）；藤茶总黄酮不同剂量组（0.1～2g/kg）以及0.5%CMC-Na组。计算LD50发现二氢杨梅素及含二氢杨梅素的藤茶总黄酮提取物（含二氢杨梅素76%）小鼠口服的LD50值大于2.0g/kg，属于无毒级别。此外，在加入辅因子NADPH或其生成体系的人肝微粒体孵育体系中，分别加入二氢杨梅素及含二氢杨梅素的藤茶总黄酮（目标物终浓度为100μM)及还原型谷胱甘肽（终浓度为1000μM）,37℃下孵育120分钟后，用等体积的乙腈终止反应，离心除去蛋白后借助AB Qtrap5500进行加合物的LC-MSMS检测，利用中性丢失扫描法检测是否有活性加合物被捕捉到。同时设置托卡朋作为阳性对照，结果显示二氢杨梅素及含二氢杨梅素的植物提取物都不会经代谢激活产生活性中间体，不会与生物大分子形成毒性加合物，因此不会因代谢激活引发肝、肾毒性，安全性好。
实施例3.二氢杨梅素及含二氢杨梅素的植物提取物与L-dopa联用的整体药代学研究
选择18只Wistar大鼠，雌雄各半，体重180-220g，随机分为3组（口服L-dopa/卡比多巴对照组，藤茶总黄酮/L-dopa/卡比多巴组,二氢杨梅素/L-dopa/卡比多巴组），6只/组开展L-dopa的整体药代学研究。其中藤茶总黄酮含二氢杨梅素76%，服用剂量为2g/kg,二氢杨梅素口服剂量为2g/kg。分别在采集给药前血浆及给药后5、10、15、30、60、120、180、240分钟的大鼠血浆样品0.5ml左右，置于预先肝素化的1.5ml尖底棕色离心管中，4000×g离心10分钟后，分离血浆后加入等体积的甲醇沉淀蛋白并高速离心（20,000×g），取上清保存于-80℃冰箱待测。采用UFLC-MS/MS测定各样品中L-dopa的血药浓度，应用DAS2.0软件对血药浓度数据进行处理，并计算药动学参数。结果表明，相对于单独口服L-dopa/卡比多巴对照组，二氢杨梅素，藤茶提取总黄酮都能显著提高大鼠血浆中L-dopa水平， 二氢杨梅素组AUC增大了31%，藤茶提取总黄酮组AUC增大了42%。以上结果显示二氢杨梅素发挥了L-dopa增效剂的作用。
本发明含二氢杨梅素的植物提取物可用做帕金森症治疗药物左旋多巴的增效剂，体外活性测定发现该植物提取物抑制儿茶酚甲基化转移酶的IC50可达微摩尔-纳摩尔级。大鼠整体药代研究发现二氢杨梅素及与含二氢杨梅素的植物提取物左旋多巴联合使用后，可显著提高左旋多巴的血药浓度。此外，二氢杨梅素及含二氢杨梅素的植物提取物安全性高，不会经代谢激活产生活性中间体，不会与生物大分子形成毒性加合物，因此不会引发肝、肾毒性，提示其在帕金森症的辅助治疗中具有良好的应用前景。
Claims (5)
1.二氢杨梅素作为活性成份在制备帕金森症治疗药物中的应用。
2.按照权利要求1所述的应用，其特征在于：
所述二氢杨梅素是指二氢杨梅素单体和/或含二氢杨梅素的植物提取物；
二氢杨梅素单体和/或含二氢杨梅素的植物提取物对人体儿茶酚甲基化转移酶具有显著抑制活性，可作为左旋多巴的增效剂并用于联合治疗帕金森症。
3.按照权利要求1所述的应用，其特征在于：含二氢杨梅素的植物提取物是指以葡萄科、杨梅科、杜鹃科、藤黄科、大戟科或柳科植物中的一种或二种以上的茎和/或叶为原料的C1-C4的醇提取物或其部分纯化物，提取物中二氢杨梅素的质量含量在20%-99.5%之间。
4.按照权利要求1或2所述的应用，其特征在于：
所述二氢杨梅素作为人体外周儿茶酚甲基化转移酶的强效抑制剂；
其可与帕金森症治疗药物左旋多巴及卡比多巴合用（质量比为1：10或1:4）；
或其也可与帕金森症治疗药物左旋多巴及卡比多巴按一定比例（质量比为1：10或1:4）混合后做成药物组合物使用，用于帕金森症的治疗；其中二氢杨梅素与左旋多巴联合使用时的摩尔比介于1:1～10:1之间，优选摩尔比为3:1～6:1。
5.按照权利要求1或2所述的应用，其特征在于：
所述二氢杨梅素与药物学上可接受的载体混合，制成以下口服剂型后使用：片剂、缓释片、胶囊剂或滴丸。
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