CN101474314A - 儿茶素在制药中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了儿茶素在制药领域中的新用途。本发明的儿茶素是以绿茶、半发酵茶、发酵茶和普洱茶为原料，通过萃取的方法从茶叶中提取得到的天然产物。药理试验结果表明，儿茶素具有显著地抑制蛋白质酪氨酸磷酸酶的功能。可用于治疗或预防II型糖尿病、治疗或预防肥胖性糖尿病、治疗或预防肥胖病。由于是从茶叶中提取的纯天然物质，具有无毒副作用，服用安全可靠的优点。

Description

儿茶素在制药中的应用

技术领域

本发明涉及儿茶素的用途，尤其涉及在制药领域中的用途。

背景技术

糖尿病(Diabetes mellitus)是一种严重危害现代人类健康的疾病，主要由遗传和环境因素相互作用而引起，是一组以慢性血葡萄糖水平增高为特征的代谢病群。主要特点是血糖过高、糖尿、多尿、多饮、多食、消瘦、疲乏。据世界卫生组织的统计，到2025年糖尿病患者将上升到3亿人。在临床上糖尿病主要分为两种类型：I型糖尿病和II型糖尿病，其中II型糖尿病占发病总数的80％～90％，II型糖尿病的病因主要是机体组织对胰岛素的阻抗和胰岛B细胞分泌胰岛素相对不足，胰岛素阻抗是指胰岛素作用的靶器官或靶组织如肝脏、肌肉、脂肪组织等对一定量的胰岛素的生物学反应低于预计的正常水平，据统计，有50％新诊断的II型糖尿病患者已存在一种或一种以上的慢性并发症，因此糖尿病及其并发症已经对人类的健康构成了重大的威胁。

目前临床上虽有一些药物用于治疗II型糖尿病，但均具有一些毒副作用。例如，以前认为是最有希望的治疗II型糖尿病的一类药物，目前临床上仍然使用的thiazolidinedione(四氢噻唑二酮)类药物，它们是通过过氧化物酶增生物激活γ受体增加脂肪细胞分化增殖来提高胰岛素敏感性的一类药物，现已发现它们通常导致患者体重增加并具有一些其它的副作用，因此目前急需安全、有效的靶标药物。

人体和动物体内有许多蛋白质酪氨酸磷酸酶，它们和酪氨酸激酶一道控制着蛋白质酪氨酸的磷酸化作用，这些酶在细胞内信号传导过程中发挥着重要的作用，并且与许多病理现象都有密切的联系，其中蛋白质酪氨酸磷酸酶1B(Protein Tyrosine Phosphatase1B，PTP1B)是最热门的研究对象之一，因为近年来对PTP1B的体内和体外的研究发现PTP1B是一个治疗II型糖尿病和肥胖症的重要靶标，因此对PTP1B的抑制是一种治疗II型糖尿病和肥胖症的极有前景的疗法。PTP1B由435个氨基酸残基组成，分子量49666Da，它在各种细胞中都广泛表达，包括像肝脏、肌肉和脂肪这些作为胰岛素代谢的重要调节剂的组织。近年来的研究已经证明，PTP1B是胰岛素信号的一个特异性负调节剂，PTP1B基因敲除的小鼠对胰岛素有极强的敏感性，并且用高脂肪食料长期喂养仍然不增加体重；另外还发现，用PTP1B反义寡核苷酸可以恢复糖尿病小鼠对胰岛素的敏感性，这也阐明了PTP1B在糖尿病状态下的作用；另外在糖尿病病人体内PTP1B的活性要比正常人高30％。这些研究表明，PTP1B能调节胰岛素信号而且这种把PTP1B作为靶标来抑制的方式在治疗II型糖尿病和肥胖症上具有重要的临床应用前景。

近年来，国内外的很多研究人员一直都在寻找选择性的PTP1B抑制剂，虽然特异的、有效的和安全的非肽类抑制剂还未发现，但PTP1B抑制剂的研究已经取得了一定的进展。目前已发现的大多数PTP1B抑制剂为肽类或毒性较强的物质，例如非选择性的PTP抑制剂钒酸盐和过钒酸盐等，无法作为药物进行开发。其它如中国专利申请CN1794989A，所提到的PTP1B抑制剂为N-(((((1，3-噻唑-2-基)氨基)羰基)苯基)磺酰基)苯丙氨酸衍生物及相关化合物，需要通过多步化学合成得到，生产工艺复杂。从传统中药资源中筛选PTP1B抑制剂是最有希望的方法之一，现已有从中药等天然植物中分离提取得到的PTP1B抑制剂，如中国专利申请CN1521157A，在植物紫金牛和小连翘中分离得到了一系列PTP1B抑制物对苯醌类化合物及其衍生物。还有在中药厚朴制剂抑制PTP1B的专利申请(200710055256.2)。但至今尚未发现茶叶中明确结构的茶色素抑制PTP1B的有关报道。

本发明人对茶叶，尤其是普洱茶在制药中的应用进行了系统的研究，对普洱茶及其制剂在制备治疗或预防糖尿病的药中的应用，已于2008年11月21日申请了中国发明专利(专利申请号：200810233620.4)。在此基础上，本发明人对茶叶中的几种有效成份，作了更加深入细致的试验与研究，取得多项令人感到振奋的进展。

发明内容

本发明的目的在于提供儿茶素的新用途，即儿茶素在制药中的新应用。

实际上，本发明涉及儿茶素在制备治疗或预防II型糖尿病的药中的应用。

涉及儿茶素在制备治疗或预防肥胖性糖尿病的药中的应用。

涉及儿茶素在制备治疗或预防肥胖病的药中的应用。

涉及儿茶素在制备抑制蛋白质酪氨酸磷酸酶的药中的应用。

本发明的目的通过下述技术方案予以实现。

儿茶素是我国传统食品茶叶中的主要成分，和咖啡因同属茶叶中的两大重要机能性成分。儿茶素是茶叶中提取的一类多羟基酚类化合物，因其分子中含儿茶酚结构，故将其统称为儿茶素(Catechins)，又称茶单宁。

天然产生的八大儿茶素为儿茶素(C)、表儿茶素(EC)、没食子儿茶素(GC)、表没食子儿茶素(EGC)、儿茶素没食子酸酯(CG)、表儿茶素没食子酸酯(ECG)、没食子儿茶素没食子酸酯(GCG)和表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)，其

(式I)化学结构式如式II。

所述的八大儿茶素都具有相同的母核结构，如式I所示。

(式II)

本发明所述的儿茶素是指从绿茶、半发酵茶(乌龙茶、铁观音)、发酵茶(红茶)和普洱茶中提取的具有如式I中所示的黄烷醇类化合物母核结构的各种儿茶素单体(C、EC、GC、EGC、CG、ECG、GCG、EGCG，如式II所示)及这些儿茶素单体的混合物。儿茶素制剂可以是通过以儿茶素为原料或原料之一所制备到的一种制剂。制剂以儿茶素为主要原料或原料之一，包括儿茶素颗粒、儿茶素片剂、儿茶素浸膏、儿茶素丸剂、儿茶素口服液或儿茶素针剂。

本发明所述的儿茶素的制备方法，采用以下步骤：

1.茶叶→乙酸乙酯提取物→Sephadex LH-20(5cm×95cm)分离→95％(V/V)乙醇洗脱，速度控制在2mL/min→收集洗脱液，含ECG、EGC、EGCG混合物→冻干混合物，得到儿茶素粉末；

2.茶叶→蒸馏水浸提物→乙酸乙酯萃取，除去有机相→甲醇溶解儿茶素粗提物→Sephadex LH-20(5cm×95cm)分离→氯仿:甲醇:汽油(V:V:V)＝1:2:1洗脱→收集洗脱液，含C、EC、GC、ECG、EGC、EGCG混合物→冻干混合物，得到儿茶素粉末；

3.茶叶→氯仿索氏提取→乙醇索氏提取→活性炭脱色(0.5g活性炭/15g茶叶乙醇提取液)→减压浓缩干燥→冻干混合物，得到儿茶素粉末。

为了更好地理解本发明的实质，下面将用相应的药理试验及结果来说明儿褐素在制药领域中的新用途。

A.PTP1B抑制剂IC₅₀的测定原理和反应体系

PTP1B是一种磷酸酶，它可以使磷酸化的蛋白质去磷酸化。儿茶素体外靶标选用基因工程技术克隆的人PTP1B催化结构域(ΔPTP1B)。由于ΔPTP1B具有完整的PTP1B催化部位结构和活性，所以是一种很好的用于体外模拟PTP1B的实验模型。在大肠杆菌中表达PTP1B的催化结构域，经纯化后以对硝基苯磷酸二钠盐(p-NPP)为底物，测定PTP1B的活性。p-NPP可以被PTP1B去磷酸化，变成对硝基苯酚，颜色呈黄色，通过检测410nm处光吸收值的变化来间接检测酶活性的变化情况。

B.各种物质对ΔPTP1B的抑制作用通过测定其半数抑制浓度(IC50)来衡量，儿茶素对ΔPTP1B抑制作用(即IC50)的具体测定方法如下：

测定IC50的酶活反应体系：25mM Mops pH7.0；1mg/ml BSA；0.1M NaCl；0.1mM EDTA；1mM DTT；10mM p-NPP；5uL不同浓度的儿茶素；5nM ΔPTP1B。37℃反应30min后，加入100ul 0.2M NaHCO₃终止反应，在410nm处测定酶反应前后的吸光度。

抑制剂按照1/2梯度稀释，不同浓度的抑制剂对应不同的抑制率，用抑制率对抑制剂浓度作图，将各个梯度的吸收值与未加抑制组分的吸收值相除，得出的数值为抑制百分数，当达到50％时，所对应稀释倍数的浓度即为IC₅₀。

C.测定结果

儿茶素按照25mg/ml(W/V)浓度用蒸馏水溶解，配制成儿茶素溶液，按2倍梯度进行稀释，稀释后每个浓度梯度的样品加入到PTP1B活性测定的反应体系中，测定每个稀释浓度对PTP1B的抑制能力，以茶褐素的浓度(mg/ml)作为IC₅₀的单位，测得IC₅₀为0.357mg/ml。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

试验结果清楚地表明，儿茶素能有效的抑制PTP1B的活性，其半数抑制浓度IC₅₀可达到0.357mg/ml，可作为与蛋白质酪氨酸磷酸酶1B相关疾病的食品、药物或药物组合成分；并可作为治疗II型糖尿病、肥胖症等一系列和PTP1B相关疾病的食品、药物或药物组合。而且由于本发明是从茶叶中提取得到的天然产物，对人体无毒副作用，服用安全可靠，这一点是现有技术无法实现的。

具体实施方式

实施例1

——儿茶素粉剂的制备

加10倍的90～95℃蒸馏水(W/V)浸提茶叶20min，过滤后冷却至室温，加等体积乙酸乙酯萃取1～3次，低温真空浓缩有机相并回收乙酸乙酯，冷冻干燥浓缩液去除残留有机溶剂，即得到粗儿茶素制品，用甲醇溶解儿茶素制品，过Sephadex LH-20(5cm×95cm)，用氯仿:甲醇:汽油(V:V:V)＝1:2:1的洗脱液洗脱，收集含C、EC、GC、ECG、EGC、EGCG混合物的洗脱液，冻干混合物得到儿茶素粉末。

实施例2

以实施例1所制备的儿茶素粉剂来研究其对人PTP1B催化结构域(ΔPTP1B)的抑制作用，儿茶素按照25mg/ml(W/V)浓度用蒸馏水溶解，配制成儿茶素溶液，按2倍梯度进行稀释，测定每个稀释浓度对PTP1B的抑制能力，以儿茶素的浓度(mg/ml)作为IC₅₀的单位，测得IC₅₀为0.357mg/ml。

最后还需要指出，以上列举的仅是本发明的具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均认为是本发明的保护范围。

Claims (6)

1.儿茶素在制备治疗或预防II型糖尿病的药中的应用。

2.儿茶素在制备治疗或预防肥胖性糖尿病的药中的应用。

3.儿茶素在制备治疗或预防肥胖病的药中的应用。

4.儿茶素在制备抑制蛋白质酪氨酸磷酸酶的药中的应用。

5.根据权利要求1～4所述的应用，其中所述的儿茶素是以绿茶、半发酵茶、发酵茶和普洱茶为原料，通过萃取的方法从茶叶中提取得到的天然产物。

6.根据权利要求1～4所述的应用，其中所述的儿茶素制剂可以是通过以儿茶素为原料或原料之一制备得到的一种制剂，包括儿茶素冲剂、儿茶素粉剂、儿茶素浸膏、儿茶素丸剂、儿茶素口服液或儿茶素胶囊。