CN109549938A - 原花青素类化合物在预防和/或治疗胰岛素抵抗的产品中的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供原花青素类化合物在制备与胰岛素抵抗相关疾病药物中的用途。所述原花青素类化合物为从马蔺种子中提取得到,所述化合物具有改善胰岛素抵抗的作用,可用于制备预防或治疗胰岛素抵抗相关疾病的药物。
Description
技术领域
本发明属于植物中药物活性化合物开发领域,特别是涉及原花青素类化合物在制备与胰岛素抵抗相关疾病药物中的用途。
背景技术
胰岛素抵抗(Insulin resistance,IR)是指胰岛素作用的靶器官,如肝脏、肌肉和脂肪组织等,对胰岛素的敏感性降低,导致糖脂代谢速率减弱。在正常的生理状况下,胰岛素能促进胰岛素作用的靶器官如肝脏、骨骼肌和脂肪组织对葡萄糖的摄取,从而使体内多余的葡萄糖快速利用和转运。当机体胰岛素分泌不足或胰岛细胞无法分泌胰岛素时,胰岛素靶组织对胰岛素的敏感性急剧下降,使机体内的血糖值超出正常范围。虽然短时间内分泌的胰岛素能维持其血糖平衡并发挥其生物效应,但同时也会加重IR负担。长期以来这种恶性循环会导致胰岛β细胞功能受损,胰岛素的分泌代偿能力减弱,机体的糖脂代谢紊乱加重,并最终导致T2DM(II型糖尿病)。IR也是导致肥胖、代谢综合症、心脑血管疾病及其并发症的主要因素。
目前,许多研究指出线粒体功能紊乱是诱发胰岛素抵抗的主要因素,同时线粒体功能损伤也会导致其他一系列的代谢性疾病如代谢综合症、糖尿病及肥胖等。由此可见,维持线粒体正常的生理状态,有助于改善和治疗胰岛素抵抗。线粒体生理状态主要通过线粒体内源性活性氧、线粒体膜电势、线粒体ATP含量及线粒体质量数等来表现。
马蔺(Iris lactea Pall.var.Chinensis(Fisch.)Koidz)是被子植物门(Angiospermae)鸢尾科(Iridaceae)鸢尾属(Iris)的多年生草本宿根植物。目前为止,已经从马蔺的种子中分离得到多种化学成分,包括黄酮类、苯醌类、低聚茋类等。现代药理学对马蔺中的主要活性成分进行了研究,发现马蔺具有多种药理活性,如放射增敏作用、抗辐射作用、增强免疫力、抗生育、抗着床作用等。但是近年来对马蔺的化学成分和药理作用研究多局限于马蔺子甲素的射增敏作用,而对其他化学成分及活性作用研究尚不深入也未见报到。因此,对马蔺中其具有活性的化学成分的开发和药理作用的研究具有重要意义。
发明内容
本发明目的是提供原花青素类化合物在预防和/或治疗胰岛素抵抗的产品中的用途,所述原花青素类化合物具有够改善胰岛素抵抗的作用。
本发明提供的原花青素类化合物的用途中,所述所述原花青素类化合物包括以下结构式的化合物中的至少一种,各化合物的结构式和命名如下:
本发明提供的上述原花青素化合物在制备预防和/或治疗胰岛素抵抗的药物中的应用。
所述产品可以是药物、保健品或其他改善胰岛素抵抗的产品。当为药物时,所述药物为预防和/或治疗糖尿病、高血压、高血脂、心血管疾病、代谢综合征中的至少一种的药物。进一步地,所述糖尿病为II型糖尿病。
进一步地,所述药物为胰岛素增敏剂。
所述胰岛素增敏剂为促进胰岛素靶组织对葡萄糖的摄取的药物。该药物能提高胰岛素刺激下胰岛素靶组织细胞(如脂肪细胞)对葡萄糖的摄取,提高胰岛素靶组织对胰岛素的敏感性。
进一步地,所述药物为AKT激动剂。
所述AKT激动剂为提高脂肪细胞胰岛素信号通路中AKT蛋白磷酸化水平的药物。
AKT又称为蛋白激酶B(PKB),是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,该蛋白在细胞进程中扮演着重要的角色,如葡萄糖代谢、细胞凋亡、细胞增殖、细胞转运等多方面。在葡萄糖代谢过程中活化的AKT通过磷酸化途径而激活胰岛素信号通路中的多种酶、激酶和转录因子等下游因子,进而调节细胞功能和胰岛素信号的传递。通常活化的AKT通过激活其下游的磷脂酰肌醇激酶3(PI3K)而促使葡萄糖转运蛋白从胞浆转位到细胞膜上,加快葡萄糖的吸收利用,从而发挥胰岛素信号传递的作用。
磷酸化后的AKT有调节细胞多种功能的作用,如AKT激活AS160,进而促进葡萄糖转运蛋白-4(GLUT-4)转座和肌肉细胞对葡萄糖的摄取; AKT也磷酸化GSK3β而抑制其活性,促进葡萄糖的代谢和调节细胞周期等。
进一步地,所述药物为线粒体损伤修复药物和/或线粒体功能紊乱调节药物。
所述线粒体损伤修复药物为修复线粒体损伤的药物,所述线粒体功能紊乱调节药物为调节线粒体功能紊乱的药物。进一步地,所述药物为线粒体靶向抗氧化剂、线粒体合成激动剂、线粒体ATP合成激动剂或线粒体膜电位调节剂。
所述线粒体靶向抗氧化剂为降低线粒体活性氧水平的药物,所述线粒体合成激动剂为增加线粒体数目的药物,所述线粒体ATP合成激动剂为提高线粒体ATP合成速率的药物,所述线粒体膜电位调节剂为维持线粒体正常的膜电势的药物。
越来越多的研究发现线粒体功能紊乱是诱发胰岛素抵抗的主要因素。线粒体是机体能量供应中心,也是糖脂类化合物代谢的主要场所,当线粒体功能发生障碍时,会导致一系列的代谢疾病如糖尿病、神经退行性病、心肌缺血再灌注损伤及老化退行性疾病等。胰岛素抵抗下脂肪细胞中线粒体已遭受损伤,功能紊乱,表现为线粒体内源性活性氧水平升高,线粒体膜电位降低,ATP含量减少,线粒体数目减少,从而导致线粒体功能紊乱。因此,本发明所述药物进一步可以是通过降低线粒体活性氧水平、增加线粒体数目、提高线粒体ATP合成速率、维持线粒体正常的膜电势等途径改善线粒体功能的药物。
进一步地,所述药物为线粒体生物发生调节剂。
所述线粒体生物发生调节剂为调节线粒体生物发生的药物。
线粒体生物发生是线粒体自我更新和损伤修复的机制之一,与线粒体功能及能量代谢密切相关。线粒体生物发生是由PGC-1α激发引发的,其主要辅助NRF和Tfam因子表达。只有线粒体生物发生保持稳定,线粒体才能正常行使功能,而当线粒体生物发生这个源头出现障碍时,其下游的生物事件如线粒体DNA复制,转录和翻译、线粒体质量控制(分裂 /融合)及氧化磷酸化过程都会受到损伤,最终引起线粒体内环境紊乱,功能发生障碍。在IR(胰岛素抵抗)、肥胖和II型糖尿病动物模型的肌肉组织中发现线粒体数量减少、线粒体呼吸能力减弱,线粒体生物合成减少。因此,所述药物可以是通过调节线粒体生物发生从而改善线粒体功能的药物。
进一步地,所述药物为线粒体DNA片段修复剂。
所述线粒体DNA片段修复剂是修复胰岛素抵抗下已受损的线粒体DNA片段的药物。
本发明通过实验表明,胰岛素抵抗状态下中线粒体DNA是损伤的,因此所述药物可以是通过修复受损的线粒体DNA片段的药物,从而恢复线粒体功能。
进一步地,所述药物为PGC-1α激动剂、NRF1激动剂、Tfam激动剂、脂肪细胞分裂蛋白Drp1拮抗剂中的任意一种。
所述PGC-1α激动剂、NRF1激动剂和Tfam激动剂分别为提高肪细胞中线粒体生物发生相关基因PGC-1α、NRF1和Tfam mRNA表达水平的药物,所述脂肪细胞分裂蛋白Drp1拮抗剂为能降低脂肪细胞分裂蛋白Drp1的表达水平的药物。
线粒体生物发生是由PGC-1α激发引发的,其主要辅助NRF和 Tfam因子表达。线粒体是一种动态细胞器,不断的进行着分裂和融合所形成的形态学变化,两者相互依存,共同构成快速循环的网络,调节线粒体质量控制。在不同的能量需求下,融合提高线粒体对物质的利用,满足高能需求;当能量需求降低时,分裂加快。提高肪细胞中线粒体生物发生相关基因PGC-1α、NRF1和Tfam mRNA表达水平的药物,和/ 或降低脂肪细胞分裂蛋白Drpl的表达水平都有利于线粒体生物发生。
本发明还提供了上述原花青素类化合物在制备胰岛素增敏剂和/或 AKT激动剂中的应用。
本发明还提供了上述原花青素类化合物作为PGC-1α激动剂、NRF1 激动剂、Tfam激动剂、脂肪细胞分裂蛋白Drpl拮抗剂中的任意一种的应用。
本发明的有益效果是:
(1)本发明中提供的从马蔺种子中提取的原花青素类化合物能促进胰岛素靶组织对葡萄糖的摄取、提高脂肪细胞胰岛素信号通路中AKT 蛋白磷酸化水平,改善胰岛素抵抗,用于制备预防和/或治疗胰岛素抵抗相关疾病的药物。
(2)本发明中原花青素类化合物能通过降低线粒体活性氧水平、增加线粒体数目、提高线粒体ATP合成速率、维持线粒体正常的膜电势,改善线粒体功能,从而改善胰岛素抵抗。
(3)本发明中原花青素类化合物通过改善线粒体生物发生,继而调节其下游的线粒体DNA表达,线粒体质量控制,从而使线粒体结构保持完整,发挥正常的生理功能。特别是提高肪细胞中线粒体生物发生相关基因PGC-1α、NRF1和Tfam mRNA表达水平,从而改善胰岛素抵抗,为治疗胰岛素抵抗及相关疾病的提供新方向。
(4)本发明更加全面挖掘了马蔺的药用价值、拓展了其临床应用,为开发治疗糖脂代谢紊乱相关疾病的潜在植物来源的药物提供更多的参考依据。
附图说明
图1是原花青素类处理后3T3-L1脂肪细胞2-NBDG摄取的影响;
图2是原花青素类对3T3-L1脂肪细胞中p-AKT表达的影响;
图3是原花青素类对3T3-L1脂肪细胞线粒体内源性活性氧的影响;
图4是原花青素类对3T3-L1脂肪细胞线粒体膜电势的影响;
图5是原花青素类对3T3-L1脂肪细胞ATP合成的影响;
图6是原花青素类对3T3-L1脂肪细胞线粒体质量数的影响;
图7是原花青素类对3T3-L1脂肪细胞线粒体DNA损伤的影响;
图8是原花青素类对3T3-L1脂肪细胞线粒体分裂融合蛋白表达的影响;
图9是原花青素对3T3-L1脂肪细胞线粒体生物发生相关mRNA表达水平的影响:(a)PGC-1α,(b)NRF1,(c)Tfam mRNA的表达水平。
具体实施方式
下面通过具体实施例和具体实验对本发明所述应用做进一步说明,对所述原花青素改善胰岛素抵抗的作用进行验证和说明。
实验材料和准备:
1.实验材料、试剂与仪器
受试样品包括6个原花青素类化合物:Catechin(P-1)、Epicatechin (P-2)、Procyanidin B7(P-3)、Procyanidin B6(P-4)、Procyanidin B3 (P-5)、Procyanidin B1(P-6),均是从马蔺种子中分离纯化制得,经 HPLC检测纯度均在95%以上,其化学结构式如下:
本发明实验所用的材料与试剂见表1。
表1材料与试剂
(1)2-NBDG配制
将2-NBDG粉末用DMSO溶解配制成10mM的母液,使用时用无糖DMEM稀释至终浓度为100μM。
(2)Western blotting工作液的配制如下:
a.10%SDS溶液的配制
称取10g SDS,加入100mL超纯水,50℃水浴溶解,室温保存。如出现沉淀,水浴溶化后仍可使用。
b.SDS-PAGE电泳液(5×)的配制
称取15.1g Tris,94.0g Glycine,5.0g SDS,加超纯水溶解,定容至 100mL,室温保存。使用时可将5×电泳液稀释为1×电泳液,可重复使用2~3次,室温保存。
c.转膜液(10×)的配制
称取15.15g Tris,72.0g Glycine,用时稀释为1×转膜液,方法:量取10×转膜液50mL,加甲醇100mL,用超纯水补至500mL,即10×转膜液∶甲醇∶水=1∶2∶7,可重复使用3~5次,4℃冰箱保存。
d.TBS(10×)的配制
称取12.12g Tris,40.03g NaCl,加超纯水溶解,HCl调PH=7.6(加 HCl大约3.5mL),定容至500mL,4℃冰箱保存。
(3)MitoSox TM
将MitoSox TM用DMSO溶解配制成5mM的母液,使用时用无酚蓝的DMEM稀释成5μM。
(4)JC-1
将JC-1用DMSO溶解配制成10mM的母液,使用时用无酚蓝的 DMEM稀释成10μM。
(5) Green FM
将 Green FM用DMSO溶解配制成1mM的母液,使用时用无酚蓝的DMEM稀释成200nM。
(6)Mitotempo
将Mitotempo用DMSO溶解配制成1mM的母液,使用时用无酚蓝的DMEM稀释成100nM。
(7)Cccp
将Cccp用DMSO溶解配制成10mM的母液,使用时用无酚蓝的 DMEM稀释成10μM。
(8)ATP标准溶液
将ATP标准溶液用ATP检测裂解液分别稀释成0.01、0.05、0.1、 0.5、1、5和10μM。
本发明所使用的实验仪器与设备见表2。
表2仪器与设备
2.实验方法
本发明使用统计学软件SPSS17.0进行实验数据的分析和整理,统计结果用平均值±标准值表示,两组间均数的比较采用独立样本 t检验,*表示P<0.5说明具有统计学意义,**表示P<0.01说明其差异具有极显著统计学意义。
IR模型的建立和验证:参考专利CN107898779A中所述方法。
一、3T3-L1细胞2-NBDG摄取的检测
细胞处理:将3T3-L1前脂肪细胞以5×104个/mL的密度接种至12 孔板中,待细胞密度长到80%以上时,进行诱导分化,在诱导分化成熟后的第8天,向细胞液加入1μM Dex建立IR模型。分别设置正常组、模型组、阳性药物组和药物处理组,除正常组用完全培养基培养之外,其余各组用1μM Dex培养,阳性药物组并在其中加入1μM Rosi(罗格列酮);药物处理组中各加入10μM单体化合物培养48h后,空白组和模型组内部分别分为两组,一组用100nM的胰岛素刺激15min,另一组用高糖DMEM培养15min;阳性药物组和药物处理组也同样用100nM的胰岛素刺激15min,之后所用的处理组吸走培养液。
处理完成后将所有实验组用DPBS洗1次,加入500μL胰酶37℃消化1min,加入2mLDPBS吹打均匀,1000g离心6min。弃去上清液,每孔加入1mL含有10μM2-NBDG的无糖培养基37℃孵育30min,用流式在波长488nm,515~545nm检测荧光强度。
荧光探针2-NBDG(2-[N-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diaxol-4-ylamino] -2-deoxyglucose)是一种2-脱氧葡萄糖荧光类似物,能特异性结合胞内的葡萄糖,检测时有较高的灵敏性。采用荧光标记的葡萄糖类似物 2-NBDG检测3T3-L1脂肪细胞对葡萄糖的摄取。如图1所示,通常胰岛素抵抗的细胞或机体中2-NBDG的荧光强度极弱,处于本底值,说明细胞或机体对葡萄糖的摄取能力弱。实验结果显示,正常组中2-NBDG 的摄取能力高于胰岛素抵抗模型组中的葡萄糖摄取能力;当正常组中加胰岛素刺激后细胞对2-NBDG的摄取能力明显增强。模型组中细胞对葡萄糖的摄取能力较弱,而当模型组中加入胰岛素刺激后细胞对2-NBDG 的摄取能力并没有发生明显的变化,荧光值增加的幅度很低,与正常组中胰岛素刺激后的细胞的葡萄糖摄取能力差异较明显。阳性药物Rosi 中胰岛素刺激后细胞对2-NBDG的摄取能力也明显上升。
从图1可以看出,原花青素类各个单体化合物干预后,都能不同程度促进胰岛素刺激下脂肪细胞对2-NBDG的摄取,其中化合物P-5和P-6 作用最显著,具有改善胰岛素抵抗的潜力。
二、3T3-L1细胞AKT磷酸化的检测
细胞处理同实施例2,最后收集细胞,并用Western blotting检测AKT 蛋白的表达水平。
本实施例通过检测受试化合物对细胞中p-AKT表达的影响,考察受试化合物是否具有促进细胞吸收利用葡萄糖,增强胰岛素信号传递过程,改善胰岛素抵抗的作用。
实验结果如图2所示,正常组中无AKT的磷酸化表达,而正常组中胰岛素刺激后AKT的磷酸化表达水平明显升高;模型组也无AKT的磷酸化表达,而模型组中的脂肪细胞给予胰岛素刺激后AKT蛋白的磷酸化表达水平有微弱地上升,而相比于正常组中的胰岛素刺激后AKT 蛋白的磷酸化表达水平是极低的;阳性药物Rosi中胰岛素刺激后细胞 AKT的磷酸化表达水平升高。原花青素各个单体化合物处理后,都能不同程度提高p-AKT的表达水平,促进3T3-L1脂肪细胞细胞对葡萄糖摄取、增强胰岛素敏感性。
三、IR的3T3-L1脂肪细胞线粒体内源性活性氧的检测
细胞处理:将3T3-L1前脂肪细胞以5×104个/mL接种至12孔板中,培养液培养至细胞完全汇合2天后,进行诱导分化。在诱导分化成熟后的第8天,分别设置正常组(Con)、模型组(Mod)、阳性药物组 (mitotempo)、药物处理组,用1μM Dex处理细胞48h建立模型。其中阳性药物组中加入1μM Rosi;药物处理组中各加入10μM单体化合物。
处理完成后将所有实验组用PBS洗1次,加入500μL胰酶37℃消化1min,加入2mLPBS吹打均匀,1000g离心6min。弃去上清液,每孔加入1mL含有5μM MitoSox TM的无酚蓝培养基37℃孵育30min,用流式细胞仪在激发波长495nm处检测荧光强度。
活性氧(ROS)是一类含氧单电子还原产物,具有多种形式如超氧阴离子、过氧化氢等,其作为机体的一种活性小分子,具有一定的生物学功能如信号传递、细胞增殖、细胞凋亡等。通常线粒体是机体细胞内产生活性氧的主要场所,正常情况下,线粒体产生的ROS是机体所必须的,用来维持正常的信号传递等作用;而当线粒体功能发生障碍或者外界的因素如氧化应激、内质网应激等诱发机体产生大量的活性氧,此时这些过剩的活性氧会反过来损伤线粒体生物发生蛋白、线粒体DNA及细胞膜上的脂类及相关蛋白,从而引起线粒体功能紊乱等其他疾病。本发明采用特异性检测线粒体内源性活性氧的荧光探针MitoSox,通过流式细胞仪检测原花青素类化合物对脂肪细胞线粒体内源性活性氧的影响。
实验结果如图3所示,Con组内探针的荧光强度较弱;Mod(IR) 组中的荧光强度处于很高的水平,说明Mod中细胞内含有大量的线粒体活性氧。阳性对照mitotempo是一种靶向线粒体抗氧化剂,能快速高效清除超氧自由基和烷基自由基,其作用后细胞线粒体活性氧水平明显降低。原花青素类化合物各单体作用后细胞线粒体活性氧水平均有所下降,其中P-5和P-6能极显著降低细胞线粒体活性氧的产生,且与Mod 组相比具有差异显著性,具有极好的清除线粒体活性氧能力。
四、IR的3T3-L1脂肪细胞线粒体膜电势的检测
细胞处理同实施例4,其中阳性药物组所加药物为Cccp,处理完成后将所有实验组用PBS洗1次,加入500μL胰酶37℃消化1min,加入 2mL PBS吹打均匀,1000g离心6min。弃去上清液,每孔加入1mL含有10μM JC-1的无酚蓝培养基37℃孵育30min,用流式细胞仪在激发波长495nm、529/590nm处检测荧光强度。
正常的线粒体膜电势对于维持线粒体进行氧化磷酸化和维持线粒体功能所必需的。因此,线粒体膜电势的高低是评价线粒体功能的重要指标之一。本实验中采用可特异性检测线粒体膜电势的荧光探针JC-1,此荧光探针可特异性检测线粒体膜电势,其根据线粒体膜电势的高低而表现出红色和绿色荧光形式,通过流式细胞仪检测原花青素类化合物对脂肪细胞线粒体膜电势的影响。
结果如图4所示,Con组内线粒体膜电势处于较高的水平;Mod(IR) 组中膜电势降低,说明Mod中细胞膜电势损伤严重。阴性对照Cccp是一种强有效的线粒体氧化磷酸化解偶联剂,促使线粒体内膜对H+产生通透性,导致线粒体内膜两侧膜电位丧失。原花青素类化合物各单体作用后细胞线粒体膜电势水平均有所升高,其中P-1和P-5能显著升高线粒体膜电势,恢复线粒体膜电位。
五、IR的3T3-L1脂肪细胞ATP含量的检测
细胞处理同实施例4,其中阳性药物组所加药物为Rosi,细胞处理结束后,参照ATP检测试剂盒的说明书,进行样品处理、ATP标准曲线的配制、ATP检测工作液的配制及浓度的测定。
线粒体负责的最终氧化磷酸化的结果是产生ATP,ATP担任着机体能量的快速供应。当机体中的能量ATP供应不足,无法满足机体正常代谢所需要的能量时,此时线粒体会代偿性的产生ATP,但是长时间的这种代偿性条件下,会更加快速的损伤线粒体,从而影响产生ATP的速率。本实验中采用ATP含量测定试剂盒测定原花青素类化合物对3T3-L1脂肪细胞中ATP产生的影响。
实验结果如图5所示,正常成熟脂肪细胞(Con)中ATP的含量较高;Mod组中的ATP的含量显著低于Con组,说明胰岛素抵抗的脂肪细胞中线粒体产生ATP过程受阻,ATP合成下降;Rosi处理后线粒体合成ATP的速率加快,ATP含量增加。原花青素类化合物各单体作用后细胞线粒体ATP含量均有所增加,其中P-3、P-4、P-5和P-6能显著增加线粒体ATP含量。
六、对IR的3T3-L1脂肪细胞线粒体质量数的影响
细胞处理同实施例4,其中阳性药物组所加药物为Rosi,处理完成后将所有实验组用PBS洗1次,加入500μL胰酶37℃消化1min,加入 2mLPBS吹打均匀,1000g离心6min。弃去上清液,每孔加入1mL含有 10nM Green FM的无酚蓝培养基37℃孵育30min,用流式细胞仪在激发波长488nm处检测荧光强度。
线粒体质量是评价线粒体功能的重要指标,受损的线粒体内可明显观察到线粒体的数量减少,生物合成降低。本实施例中采用用于特异性检测线粒体质量数的荧光探针MitoTracker Green,该荧光探针是具有carbocyanine结构的一种细胞渗透型的试剂,通过标记线粒体的弱巯基的氯甲基官能团而显示出绿色荧光,其定位于线粒体的能力不受线粒体膜电位的影响,可作为定性检测线粒体质量数的一种方法。通过激光共聚焦定性分析原花青素类化合物对脂肪细胞线粒体质量的影响。
其结果如图6所示,Con组内探针的荧光强度较高,说明所含的线粒体数量多;Mod(IR)组中的荧光强度极低,几乎处于本底的荧光值,说明Mod中细胞内含有线粒体数量较少,线粒体合成遭受损伤。原花青素类化合物各单体作用后细胞线粒体质量数均有所增加,其中P-5和P-6 能明显增加线粒体数量,提高线粒体质量,促进线粒体生物发生。
七、对IR的3T3-L1脂肪细胞线粒体DNA损伤的影响
细胞处理同实施例4,处理后收集细胞,按照常规方法提取细胞基因组DNA,将电泳完的胶放到紫外成像系统中进行观察,若条带清晰且无拖尾现象,表明DNA完整性较好。
利用Long PCR检测3T3-L1细胞线粒体DNA的损伤:
a.根据文献提供的基因序列,引物由上海生物工程有限公司合成,线粒体DNA基因的引物序列如表3所示。
表3线粒体Long PCR引物序列
b.配制长短片段PCR扩增反应体系,如表4和5所示:
表4短片段PCR反应体系组分
表5长片段PCR反应体系组分
c.将上述反应溶液放PCR仪中进行扩增,长短片段PCR反应条件如表6和7所示:
表6短片段实时荧光定量PCR反应程序
表7长片段实时荧光定量PCR反应程序
d.PCR反应完成后立即进行DNA电泳,长片段用1%的琼脂糖凝胶120V电泳60min;短片段用0.5%的琼脂糖凝胶120V电泳50min,随后立即于凝胶成像系统中进行观察,拍照。
线粒体DNA损伤的程度采用PCR扩增出的长片段目的基因与短片段目的基因的比值来表示。本发明采用Long PCR的方法研究原花青素类化合物对3T3-L1脂肪细胞中线粒体DNA损伤的影响。
结果如图7所示,正常组中长片段扩增出的基因较多;而Mod组中扩增出的长片段明显少于Con组,表明IR模型中线粒体DNA是损伤的; Rosi处理后线粒体DNA扩增出的长片段显著增多。原花青素类化合物处理后,都能不同程度恢复已受损的线粒体DNA片段,其中化合物P-2 和P-4效果更佳。
八、IR的3T3-L1脂肪细胞线粒体分裂融合蛋白的检测
将3T3-L1前脂肪细胞以5×104个/mL接种至6孔板中,培养液培养至细胞完全汇合2天后,进行诱导分化,在诱导分化成熟后的第8天,用1μM Dex建立IR模型。分别设置正常组、模型组、阳性药物组和药物处理组,除正常组用完全培养基培养之外,其余各组用1μMDex培养,阳性药物组并在其中加入1μM Rosi(罗格列酮);药物处理组中各加入10μM单体化合物培养48h后,收集细胞,并用Western blotting 检测蛋白的表达水平。
线粒体是一种动态细胞器,不断的进行着分裂和融合所形成的形态学变化,两者相互依存,共同构成快速循环的网络,调节线粒体质量控制。在不同的能量需求下,融合提高线粒体对物质的利用,满足高能需求;当能量需求降低时,分裂加快。本实验采用Westernblotting的方法研究原花青素类化合物对3T3-L1脂肪细胞线粒体分裂和融合蛋白表达的影响。
结果如图8所示,各组中融合蛋白Mfn1和Mfn2表达水平几乎相同,而在Mod组中分裂蛋白Drp1高度表达,具有较高的表达水平,由此可以说明Mod组中分裂蛋白Drp1的高度表达加剧了线粒体的片段化,打破了线粒体的动态平衡;Rosi处理后分裂蛋白Drp1表达量有所下降。原花青素类化合物处理后,对融合蛋白Mfn1和Mfn2表达影响不明显,而分裂蛋白Drp1相比于Mod都能不同程度地降低,其中化合物P-5和 P-6作用较明显。
九、IR的3T3-L1脂肪细胞线粒体生物发生相关基因表达的检测
细胞处理同实施例4,处理后收集细胞,Trizol法抽提总RNA,然后进行逆转录合成cDNA,最后利用实时荧光定量PCR法检测3T3-L1 细胞中线粒体相关基因转录水平的变化。具体方法如下:
(1)Trizol法提取细胞总RNA
细胞经药物处理结束后,收集细胞并用Trizol法提取细胞总RNA,最后将提取的总RNA立即保存于-80℃超低温冰箱或立即用于逆转录。
(2)RNA检测与定量
a.RNA浓度和纯度测定
采用酶标仪进行RNA母液浓度测定,若数值过大可适当稀释成合适的浓度,再次测定RNA浓度。根据最后的测定浓度计算出1000ngRNA 所需的RNA母液的体积。然后用稀释的样品进行琼脂糖电泳,检测RNA 否降解或者掺有杂质。
b.琼脂糖电泳鉴RNA完整性
具体方法如下:1.1%琼脂糖凝胶的配置;2.微波炉加热30s,室温放置不烫手时,加入2μL1mg/mL溴化乙锭充分在锥形瓶内混匀。3.插好梳子立即倒入凝胶,待其凝结;4.上样:1μL母液+5μL Loading buffer (6×),在第一甬道加2μL RNA marker;5.电泳:100V电泳45min; 6.显影:在UV2/UV1下,调节聚焦和散焦情况下观察条带情况。凝胶条带:最上方的为28S,中间的为18S,最下方的为5S。未降解的情况下亮度比较应该是28S∶18S=2∶1。
(3)逆转录
a.以总RNA为模板,合成cDNA第一条链。取经过稀释后的RNA 样品进行逆转录,反应体系如下:
b.在72℃条件下3min热变性。
c.取10μL第一产物,再按照下表配制反应体系:
d.在70℃条件下逆转15min,得到的cDNA产物于-20℃保存。
a.目的基因的引物序列如表8所示:
表8实时荧光定量PCR引物序列
b.配制PCR扩增反应体系,如表9所示:
表9实时荧光定量PCR反应体系组分
c.将上述反应液放入荧光定量PCR仪中进行扩增,PCR反应条件如表10所示:
表10实时荧光定量PCR反应程序
每个循环结束后采集荧光信号,最后绘制溶解曲线以确定反应产物有无引物二聚体及非特异性扩增。在实时荧光定量PCR中,Ct值被认为与扩增基因的初始浓度紧密相关。
相对定量分析:目的基因的表达采用比较Ct值,用内参基因β-actin 来校正差异,变化的倍数量为计算公式为:其中ΔΔCt=(Ct目的基因-Ct内参基因)药物处理组-(Ct目的基因- Ct内参基因)Control。
本发明采用实时荧光定量PCR方法探究原花青素类化合物对 3T3-L1脂肪细胞中线粒体生物发生相关基因如PGC-1α、NRF1和Tfam mRNA表达水平的影响。
线粒体生物发生是由PGC-1α激发引发的,其主要辅助NRF和Tfam 因子表达。只有线粒体生物发生保持稳定,线粒体才能正常行使功能,而当线粒体生物发生这个源头出现障碍时,其下游的生物事件如线粒体DNA复制,转录和翻译、线粒体质量控制(分裂/融合)及氧化磷酸化过程都会受到损伤,最终引起线粒体内环境紊乱,功能发生障碍。
实验结果如图9所示,Mod组中PGC-1α、NRF1和Tfam这三个基因的表达水平都较低,与Con组相比具有明显的差异,由此可以说明在胰岛素抵抗状态下线粒体的生物发生过程已遭受损伤,不能行使正常的生理功能,从而表现出线粒体功能紊乱。Rosi处理后PGC-1α、NRF1 和Tfam基因表达水平均有所提高,并与Mod组相比差异较明显。原花青素类处理后均能不同程度增加PGC-1α、NRF1和Tfam这三者基因的表达水平,相比与其他化合物而言,化合物P-5和P-6能显著提高基因 PGC-1α、NRF1和Tfam mRNA表达水平。
综上所述,本发明实验结果表明,通过本发明马蔺种子中的原花青素类化合物干预后,都能不同程度促进胰岛素刺激下脂肪细胞对 2-NBDG的摄取、提高3T3-L1脂肪细胞中p-AKT表达水平、降低细胞线粒体活性氧水平、维持线粒体正常的膜电势、增加细胞线粒体质量数、增加细胞线粒体ATP含量、说明本发明马蔺种子中的原花青素类化合物能促进胰岛素靶组织对葡萄糖的摄取,提高对胰岛素的敏感性,具有改善胰岛素抵抗的潜力。通过进一步实验发现,本发明马蔺种子中的原花青素类化合物能不同程度恢复已受损的线粒体DNA片段、降低分裂蛋白Drp1的表达、增加PGC-1α、NRF1和Tfam这三者基因的表达水平,由此可以看出原花青素类化合物可通过改善线粒体生物发生,从而使线粒体结构保持完整,发挥正常的生理功能,为治疗胰岛素抵抗及相关疾病的提供新策略。综合评价原花青素类化合物能够改善胰岛素抵抗引起的脂肪细胞线粒体功能紊乱,为开发利用马蔺这种植物治疗II型糖尿病提供更多的科学依据。
以上所述仅为本发明的实施例,并非因此限制本发明的专利范围,凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换,或直接或间接运用在其他相关的技术领域,均同理包括在本发明的专利保护范围内。
Claims (10)
1.原花青素类化合物在制备预防和/或治疗胰岛素抵抗的产品中的应用;所述原花青素类化合物包括以下结构的化合物:
2.根据权利要求1所述应用,其特征在于,所述产品为药物,所述药物为预防和/或治疗糖尿病、高血压、高血脂、心血管疾病、代谢综合征中的至少一种。
3.根据权利要求2所述应用,其特征在于所述药物为胰岛素增敏剂。
4.根据权利要求2所述应用,其特征在于所述药物为AKT激动剂。
5.根据权利要求2所述应用,其特征在于,所述药物为线粒体损伤修复药物和/或线粒体功能紊乱调节药物。
6.根据权利要求2所述应用,其特征在于,所述药物为线粒体生物发生调节剂。
7.根据权利要求6所述应用,其特征在于,所述药物为线粒体DNA片段修复剂。
8.根据权利要求6所述应用,其特征在于,所述药物为PGC-1α激动剂、NRF1激动剂、Tfam激动剂、脂肪细胞分裂蛋白Drp1拮抗剂中的任意一种。
9.原花青素类化合物作为胰岛素增敏剂和/或AKT激动剂的应用,所述原花青素类化合物包括以下结构的化合物:
10.原花青素类化合物作为PGC-1α激动剂、NRF1激动剂、Tfam激动剂、脂肪细胞分裂蛋白Drp1拮抗剂中的任意一种的应用,所述原花青素类化合物包括以下结构的化合物:
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