CN109662962B - 低聚茋类化合物的用途 - Google Patents

低聚茋类化合物的用途 Download PDF

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Abstract

本发明提供低聚茋类化合物在制备预防和/或治疗糖脂代谢紊乱的药物中的应用，通过对从马蔺种子中提取9种低聚茋类化合物进行进行活性研究，验证了所述化合物能够抑制脂肪细胞分化，改善胰岛素抵抗，提高脂肪细胞对胰岛素的敏感性，从而用于制备预防或治疗肥胖、II型糖尿病等代谢紊乱疾病的药物。

Description

低聚茋类化合物的用途
技术领域
本发明涉及低聚茋类化合物的医药用途领域，特别是涉及低聚茋类化合物在制备与糖脂代谢紊乱相关疾病药物中的用途。
背景技术
马蔺(Iris lactea Pall.var.Chinensis(Fisch.)Koidz)是被子植物门(Angiospermae) 鸢尾科(Iridaceae)鸢尾属(Iris)的多年生草本宿根植物。目前为止，已经从马蔺 的种子中分离得到多种化学成分，包括黄酮类、苯醌类、低聚茋类等。现代药理学对马蔺中的主要活性成分进行了研究，发现马蔺具有多种药理活性，如放射增敏作 用、抗辐射作用、增强免疫力、抗生育、抗着床作用等。但是近年来对马蔺的化学 成分和药理作用研究多局限于马蔺子甲素的射增敏作用，而对其他化学成分及活性 作用研究尚不深入。因此，需要在现有的研究基础上对马蔺的其他化学成分及药理 作用进行更加深入、细微的研究与活性机制探讨。
肥胖、糖尿病、高血压、高血脂、心血管疾病等糖脂代谢紊乱疾病正逐渐侵害 着人们的健康，而长期服用传统治疗药物会对患者的身体产生副作用影响，因此， 急需开发出更安全有效的天然植物来源的药物。
发明内容
本发明提供从马蔺中提取得到低聚茋类化合物在制备预防和/或治疗糖脂代谢紊乱相关疾病药物中的用途，所述化合物具有抑制脂肪细胞分化、改善胰岛素抵抗 的功效。
本发明提供低聚茋类化合物的用途，所述低聚茋类化合物包括以下结构式的化合物，各化合物的结构式和命名如下：
Figure BDA0001843779570000021
本发明提供上述低聚茋类化合物在制备预防和/或治疗糖脂代谢紊乱的产品中的应用。所述糖脂代谢紊乱的产品包括抑制脂肪细胞分化的产品和改善胰岛素抵抗 的产品；所述产品可以是药物、保健品或其他具有抑制脂肪细胞分化和/或改善胰岛 素抵抗的产品。其中，上述F类(命名中的首字母)和T类低聚茋类化合物均具有 改善胰岛素抵抗和线粒体功能的效果，其中T类化合物同时具有抑制脂肪细胞分化 的作用。
所述产品为药物时，药物包括预防和/或治疗肥胖、糖尿病、高血压、高血脂、 心血管疾病、代谢综合征相关疾病中至少一种；进一步地，所述糖尿病为II型糖尿 病。
根据脂肪细胞分化成熟前后，所述药物分可分为抑制脂肪细胞分化和改善成熟的脂肪细胞的胰岛素抵抵抗两大类。
本发明提供的上述T类化合物在制备抑制脂肪细胞分化的药物中的应用。
所述脂肪细胞分化抑制剂为抑制脂肪细胞分化的药物。
进一步地，所述药物为降脂药物和/或降糖药物。
所述降脂降糖药物为抑制脂肪细胞胞浆内脂滴的产生及减少甘油三脂含量的药物。
进一步地，所述药物为脂肪细胞G1/S期进程抑制剂或阻滞剂。
所述脂肪细胞G1/S期抑制剂为阻滞脂肪细胞G1/S期的进程的药物。
进一步地，所述药物为PPARγ拮抗剂、C/EBPα拮抗剂、SREBP-1c拮抗剂、 FABP4拮抗剂中的至少一种。
所述PPARγ拮抗剂、C/EBPα拮抗剂、SREBP-1c拮抗剂或FABP4拮抗剂为 降低脂肪细胞转录因子PPARγ、C/EBPα、SREBP-1c、FABP4的基因表达和蛋白表 达水平的药物。
成为脂肪细胞的过程主要包括脂肪细胞形态的改变、生长期阻滞及脂质积累等。因此抑制脂肪细胞分化的药物，可以是抑制脂肪细胞胞浆内脂滴的产生及减少甘油 三脂含量的药物，也可以是阻滞脂肪细胞G1/S期的进程的药物，也可以是降低脂 肪细胞转录因子PPARγ、C/EBPα、SREBP-1c、FABP4的基因表达和蛋白表达水平 的药物，或者具有以上作用中的两种或三种的药物。
前脂肪细胞分化为成熟脂肪细胞需要一系列复杂精细的转录因子调控。PPARγ是脂肪细胞形成的必不可少的调控因子，在成脂过程的早期高度表达。C/EBPα也就 是所谓的CCAAT/增强子结合蛋白α，在脂肪细胞分化的中期阶段大量表达，与 PPARγ共同调控下游的转录因子如SREBP-1c和FABP4等表达。通常SREBP-1c和 FABP4在分化过程的末期表达，这些基因主要参与形成和保持脂肪细胞的形态。本 发明所述原花青素类化合物能降低脂肪细胞转录因子PPARγ、C/EBPα、SREBP-1c、 FABP4的基因表达和蛋白表达水平，从而能够有效抑制脂肪细胞分化。
本发明提供的上述化合物在制备预防和/或治疗胰岛素抵抗的药物中的应用。
进一步地，所述药物为胰岛素增敏剂。
所述胰岛素增敏剂为促进胰岛素靶组织对葡萄糖的摄取的药物。该药物能提高胰岛素刺激下胰岛素靶组织细胞(如脂肪细胞)对葡萄糖的摄取，提高胰岛素靶组 织对胰岛素的敏感性。
根据胰岛素抵抗的病理，所述改善胰岛素抵抗的药物进一步为促进胰岛素靶组织对葡萄糖的摄取的药物。该药物能提高胰岛素刺激下胰岛素靶组织细胞(如脂肪 细胞)对葡萄糖的摄取，提高胰岛素靶组织对胰岛素的敏感性。
进一步地，所述药物为AKT激动剂。
所述AKT激动剂为提高脂肪细胞胰岛素信号通路中AKT蛋白磷酸化水平的药 物。
AKT又称为蛋白激酶B(PKB)，是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，该蛋白在细 胞进程中扮演着重要的角色，如葡萄糖代谢、细胞凋亡、细胞增殖、细胞转运等多 方面。在葡萄糖代谢过程中活化的AKT通过磷酸化途径而激活胰岛素信号通路中的 多种酶、激酶和转录因子等下游因子，进而调节细胞功能和胰岛素信号的传递。通 常活化的AKT通过激活其下游的磷脂酰肌醇激酶3(PI3K)而促使葡萄糖转运蛋白 从胞浆转位到细胞膜上，加快葡萄糖的吸收利用，从而发挥胰岛素信号传递的作用。
磷酸化后的AKT有调节细胞多种功能的作用，如AKT激活AS160，进而促进 葡萄糖转运蛋白-4(GLUT-4)转座和肌肉细胞对葡萄糖的摄取；AKT也磷酸化GSK3β 而抑制其活性，促进葡萄糖的代谢和调节细胞周期等。
进一步地，所述药物为线粒体损伤修复药物和/或线粒体功能紊乱调节药物。
所述线粒体损伤修复药物为修复线粒体损伤的药物，所述线粒体功能紊乱调节药物为调节线粒体功能紊乱的药物。进一步地，所述药物为线粒体靶向抗氧化剂、 线粒体合成激动剂、线粒体ATP合成激动剂或线粒体膜电位调节剂。
所述线粒体靶向抗氧化剂为降低线粒体活性氧水平的药物，所述线粒体合成激动剂为增加线粒体数目的药物，所述线粒体ATP合成激动剂为提高线粒体ATP合 成速率的药物，所述线粒体膜电位调节剂为维持线粒体正常的膜电势的药物。
越来越多的研究发现线粒体功能紊乱是诱发胰岛素抵抗的主要因素。线粒体是机体能量供应中心，也是糖脂类化合物代谢的主要场所，当线粒体功能发生障碍时， 会导致一系列的代谢疾病如糖尿病、神经退行性病、心肌缺血再灌注损伤及老化退 行性疾病等。胰岛素抵抗下脂肪细胞中线粒体已遭受损伤，功能紊乱，表现为线粒 体内源性活性氧水平升高，线粒体膜电位降低，ATP含量减少，线粒体数目减少， 从而导致线粒体功能紊乱。因此，本发明所述药物进一步可以是通过降低线粒体活 性氧水平、增加线粒体数目、提高线粒体ATP合成速率、维持线粒体正常的膜电势 等途径改善线粒体功能的药物。
进一步地，所述药物为线粒体生物发生调节剂。
所述线粒体生物发生调节剂为调节线粒体生物发生的药物。
线粒体生物发生是线粒体自我更新和损伤修复的机制之一，与线粒体功能及能量代谢密切相关。线粒体生物发生是由PGC-1α激发引发的，其主要辅助NRF和 Tfam因子表达。只有线粒体生物发生保持稳定，线粒体才能正常行使功能，而当线 粒体生物发生这个源头出现障碍时，其下游的生物事件如线粒体DNA复制，转录 和翻译、线粒体质量控制(分裂/融合)及氧化磷酸化过程都会受到损伤，最终引起 线粒体内环境紊乱，功能发生障碍。在IR(胰岛素抵抗)、肥胖和II型糖尿病动物 模型的肌肉组织中发现线粒体数量减少、线粒体呼吸能力减弱，线粒体生物合成减 少。因此，所述药物可以是通过调节线粒体生物发生从而改善线粒体功能的药物。
进一步地，所述药物为线粒体DNA片段修复剂。
所述线粒体DNA片段修复剂是修复胰岛素抵抗下已受损的线粒体DNA片 段的药物。
本发明通过实验表明，胰岛素抵抗状态下中线粒体DNA是损伤的，因此所述 药物可以是通过修复受损的线粒体DNA片段的药物，从而恢复线粒体功能。
进一步地，所述药物为PGC-1α激动剂、NRF1激动剂、Tfam激动剂、脂肪细 胞分裂蛋白Drp1拮抗剂中的任意一种。
所述PGC-1α激动剂、NRF1激动剂和Tfam激动剂分别为提高肪细胞中线粒体 生物发生相关基因PGC-1α、NRF1和Tfam mRNA表达水平的药物，所述脂肪细胞 分裂蛋白Drp1拮抗剂为能降低脂肪细胞分裂蛋白Drp1的表达水平的药物。
线粒体生物发生是由PGC-1α激发引发的，其主要辅助NRF和Tfam因子表达。 线粒体是一种动态细胞器，不断的进行着分裂和融合所形成的的形态学变化，两者 相互依存，共同构成快速循环的网络，调节线粒体质量控制。在不同的能量需求下， 融合提高线粒体对物质的利用，满足高能需求；当能量需求降低时，分裂加快。提 高肪细胞中线粒体生物发生相关基因PGC-1α、NRF1和Tfam mRNA表达水平的药 物，和/或降低脂肪细胞分裂蛋白Drp1的表达水平都有利于线粒体生物发生。
本发明还提供了上述T类低聚茋类化合物在制备降脂药物和/或降糖药物中的 应用。
本发明还提供了上述T类低聚茋类化合物在制备脂肪细胞G1/S期进程抑制剂 或阻滞剂、PPARγ拮抗剂、C/EBPα拮抗剂、SREBP-1c拮抗剂、FABP4拮抗剂中 任意一种的用途。
本发明还提供了上述低聚茋类化合物在制备胰岛素增敏剂中的用途。
本发明还提供了上述低聚茋类化合物在制备AKT激动剂中的用途。
本发明还提供了上述低聚茋类化合物在制备线粒体修复药物和/或线粒体功能紊乱调节药物中的用途。
本发明还提供了上述低聚茋类化合物在制备线粒体靶向抗氧化剂、线粒体合成激动剂、线粒体ATP合成激动剂或线粒体膜电位调节剂中的用途。
本发明还提供了上述低聚茋类化合物在制备线粒体生物发生调节剂中的用途。
本发明还提供了上述低聚茋类化合物在制备线粒体DNA片段修复剂中的用 途。
本发明还提供了上述低聚茋类化合物在制备PGC-1α激动剂、NRF1激动剂、脂 肪细胞分裂蛋白Drpl拮抗剂中的用途。
所述PGC-1α激动剂、NRF1激动剂或Tfam激动剂分别为提高肪细胞中线粒体 生物发生相关基因PGC-1α、NRF1和Tfam mRNA表达水平的药物。
本发明的有益效果是：
(1)本发明对从马蔺种子中提取低聚茋类化合物进行活性研究，利用3T3-L1 细胞建立胰岛素抵抗(IR)模型，进一步从线粒体功能紊乱的层面对化合物降血糖活 性进行深入的研究，探讨了低聚茋类化合物对糖尿病的预防和治疗机制。结果表明， 本发明所述化合物能够抑制脂滴积累，降低TG含量，并通过相关信号通路调节脂 肪细胞转录因子的基因表达水平和相关蛋白表达水平，从而抑制脂肪细胞的分化。 同时，所述化合物还通过降低细胞中ROS的水平，恢复3T3-L1细胞线粒体膜电势， 促进细胞中ATP的产生，修复线粒体DNA损伤，促进线粒体的生物发生，从而改 善胰岛素抵抗。本发明所述化合物通过抑制脂肪细胞分化和改善胰岛素抵抗(调节 线粒体功能紊乱)，从而为研究用于肥胖、糖尿病、心血管类疾病等代谢紊乱疾病提 供有力方向。
(2)本发明为从马蔺种子中提取的低聚茋类化合物提供了新的用途。
附图说明
图1是低聚茋类-4对3T3-L1前脂肪细胞活力的影响；
图2是低聚茋类-2对3T3-L1前脂肪细胞活力的影响；
图3是3T3-L1前脂肪细胞(左)和成熟脂肪细胞(右)(200×)；
图4是低聚茋类-4对3T3-L1脂肪细胞分化的影响：(a)3T3-L1脂肪细胞脂滴 的产生(200×)；(b)TG含量测定；
图5是低聚茋类-2对3T3-L1脂肪细胞分化的影响：(a)3T3-L1脂肪细胞脂滴 的产生(200×)；(b)TG含量测定；
图6是低聚茋类-4处理后3T3-L1脂肪细胞细胞周期分布；
图7是低聚茋类-2处理后3T3-L1脂肪细胞细胞周期分布；
图8是低聚茋类-4对3T3-L1脂肪细胞脂代谢相关蛋白表达影响；
图9是低聚茋类-2对3T3-L1脂肪细胞脂代谢相关蛋白表达影响；
图10是低聚茋类-4对3T3-L1脂肪细胞转录因子mRNA表达水平的影响：通过 实时荧光定量PCR检测(a)PPARγ，(b)C/EBPα，(c)SREBP-1c，(d)FABP4 mRNA 的表达水平；
图11是低聚茋类-2对3T3-L1脂肪细胞转录因子mRNA表达水平的影响：(a) PPARγ，(b)C/EBPα，(c)SREBP-1c，(d)FABP4 mRNA的表达水平；
图12是低聚茋类-4处理后3T3-L1脂肪细胞2-NBDG摄取的影响；
图13是低聚茋类-2处理后3T3-L1脂肪细胞2-NBDG摄取的影响；
图14是低聚茋类-4对3T3-L1脂肪细胞中p-AKT表达的影响；
图15是低聚茋类-2对3T3-L1脂肪细胞中p-AKT表达的影响；
图16是低聚茋类对3T3-L1脂肪细胞线粒体内源性活性氧的影响；
图17是低聚茋类对3T3-L1脂肪细胞线粒体膜电势的影响；
图18是低聚茋类对3T3-L1脂肪细胞ATP合成的影响；
图19是低聚茋类对3T3-L1脂肪细胞线粒体质量数的影响；
图20是低聚茋类对3T3-L1脂肪细胞线粒体DNA损伤的影响；
图21是低聚茋类对3T3-L1脂肪细胞线粒体分裂融合蛋白表达的影响；
图22是低聚茋类对3T3-L1脂肪细胞线粒体生物发生相关mRNA表达水平的影 响：(a)PGC-1α，(b)NRF1，(c)Tfam mRNA的表达水平。
具体实施方式
下面通过具体实施例和具体实验对本发明所述应用做进一步说明，对所述原花青素抑制细胞分化的作用进行验证和说明。
实验材料和实验准备
受试样品：包括9个低聚茋类化合物：Vitisin A(F-1)、Vitisin B(F-2)、VitisinC(F-3)、Vitisin D(F-4)、Cis-vitisinA(F-5)、Resveratrol(T-1)、ε-viniferin(T-2)、Ampelopsin B(T-3)、Hydroxyvitisin D(T-4)，均是从马蔺种子中分离纯化制得，经 HPLC检测纯度均在95％以上，其化学结构式如下：
Figure BDA0001843779570000081
Figure BDA0001843779570000091
实验方法：本发明使用统计学软件SPSS 17.0进行实验数据的分析和整理，统 计结果用平均值±标准值
Figure BDA0001843779570000092
表示，两组间均数的比较采用独立样本t检验，*表 示P＜0.5说明具有统计学意义，**表示P＜0.01说明其差异具有极显著统计学意义。
一、3T3-L1前脂肪细胞活力的检测
将3T3-L1前脂肪细胞接种至96孔培养板，每孔的铺板密度为1×104个细胞， 用含10％FBS的高糖DMEM培养液培养24h至细胞完全长满到80％左右；将96孔 板放入培养箱中，在37℃、5％CO2及饱和湿度的条件下培养24h，加入受试单体化 合物。每个受试单体化合物分别设6组浓度梯度(0、0.1μM、1μM、10μM、50μM 及100μM，每个浓度设置4个重复，药物浓度处理细胞48h后，采用酶标仪在490nm 处读取吸收值。按下列公式计算细胞存活率：细胞存活率(％)＝(药物组OD/空白 组OD)×100％。
本发明通过MTT法检测本发明9个低聚茋类单体化合物对3T3-L1前脂肪细胞 活力的影响，结果如图1和2所示。
从图1和2两图可以看出，低聚茋类-4和低聚茋类-2化合物在浓度0，0.1，1，10μM之间时对细胞的存活率影响不明显，各浓度处理后细胞的相对存活率均在 85％以上。低聚茋类-4和低聚茋类-2化合物的浓度高于50μM时，化合物随着药物 处理浓度的增加，细胞的相对存活率明显下降，其中化合物T-2随着作用浓度的增 加，细胞的存活率明显降低。
实验结果表明，所测试化合物在高浓度(50μM以上)时低聚茋类化合物F-2 和T-2对3T3-L1前脂肪细胞表现出一定的毒性，其余受试化合物对细胞的毒性较弱。 因此，对于后续有关3T3-L1前脂肪细胞的活性试验，选用10μM作为处理浓度。
二、3T3-L1前脂肪细胞的诱导分化
采用“鸡尾酒法”对3T3-L1前脂肪细胞进行诱导：将3T3-L1前脂肪细胞接种于 培养板上，铺板密度5×104个/mL，用含10％FBS的高糖DMEM培养液培养至细胞 完全长满到80％左右时，进行2天的接触抑制。随后进行诱导分化，加诱导液I诱 导2天，随后用诱导液II诱导2天，再用完全培养液继续培养4天，在诱导的第8 天，观察细胞内可见85％以上的细胞呈现出成熟脂肪细胞形态，即通过显微镜发现 细胞内具有大小不一的脂滴。诱导液I：0.5mM IBMX+0.1μM Dex+10μg/mL Insulin，诱导液II：10μg/mL Insulin。
3T3-L1前脂肪细胞的形态与成纤维细胞相似，胞浆中未见脂滴，如图3左图所 示的3T3-L1前脂肪细胞。当细胞完全融合处于生长停滞期，加入诱导I和诱导液II 各培养2天后，细胞开始由前脂肪细胞向成熟细胞转变，细胞形态由梭型开始逐渐 转变为圆形，并且胞体变大，胞浆内逐渐出现脂滴。随着培养时间的增加，胞浆的 脂滴显著增多。直到第8天，胞浆内90％的前脂肪细胞分化为成熟脂肪细胞，呈“戎 环”样的结构，为典型的3T3-L成熟脂肪细胞，如图3右图所示。
三、3T3-L1细胞脂滴积累和TG含量测定
将无菌盖玻片置于24孔板中，加入1mL DMEM，置于培养箱中温浴30min后。 吸走培养基，将细胞以5×104个/mL接种于玻片上，每孔中加1mL细胞悬液，用针 头按压玻片排除下面的气泡，置于培养箱中培养，待细胞完全汇合2天后进行诱导 分化。诱导分化过程同实施例2，在诱导的第0天和第2天加受试化合物进行处理。 诱导结束后，进行固定并加入提前配制的油红O工作液染于细胞表面，避光静置60 min。用70％乙醇洗涤细胞，取出多余的染料双蒸水洗涤3～4次，置于显微镜下观 察并拍照。
将3T3-L1脂肪细胞以5×104个/孔的密度接种于24孔板中，待细胞完全长满至80％左右时进行诱导分化，诱导过程同实施例2，在诱导的第0天和第2天分别加受 试单体化合物进行处理。在诱导的第8天进行TG含量的测定，其具体方法如下：(1) 细胞收集：在诱导的第8天，将细胞培养液吸走，PBS洗两次后用胰蛋白酶消化液 消化脂肪细胞2min使其成为单个细胞，并加入PBS 3mL吹打均匀，快速转移至离 心管中，在1000rpm/min的条件下离心6min，弃上清，留细胞沉淀。(2)细胞破碎： 加入0.3mL的匀浆介质进行匀浆，冰浴条件下进行超声破碎(功率：300W，3～5s/ 次，间隔30s，重复3～5次)，制备好的匀浆液不离心直接测定。(3)在96孔板中 每孔加入2.5μL待测样品，空白孔中加入2.5μL蒸馏水，标准孔中加入2.5μL标准 品，然后每孔中加入250μL工作液，510nm波长条件下用酶标仪测定各孔吸光值。借助BCA法测定待测样品中蛋白浓度，进行校正。
TG含量＝(OD样品-OD空白)/(OD校样-OD空白)×校准品浓度(mM)/ 待测样品蛋白浓度(gprot/L)
从图4(a)油红O染色结果可见，化合物F-1、F-2和F-5能明显降低胞内脂滴 的积累，抑制脂肪细胞的分化；而化合物F-3和F-4却能增加细胞内脂滴的积累， 促进脂肪细胞的分化。TG含量测定结果如图4(b)所示，化合物F-1、F-2和F-3 能明显降低胞内TG含量；而化合物F-3和F-4却能增加胞内TG含量，促进脂肪细 胞的分化。从图5(a)染色结果可知，低聚茋类-2化合物中T-1和T-3处理脂肪细 胞后，胞内脂滴数量明显减少，其具有抑制脂肪细胞分化的作用；而化合物T-2和 T-4却能增加胞内脂滴数量，促进脂肪细胞的分化。胞内甘油三酯含量测定结果如图 5(b)所示，其结果趋势与油红O染色结果大致相同。
四、细胞周期测定
将3T3-L细胞以5×104个/孔密度接种于6孔板中，待完全汇合2天后进行诱导 分化，诱导过程同实施例2，在诱导的第0天和第2天加受试化合物进行处理。在 诱导的第4天收集细胞进行周期的测定，其具体方法如下：(1)细胞样品的准备： 在诱导的第4天，将细胞培养液吸走，PBS洗两次，用胰蛋白酶消化液消化2min 成单细胞，加入提前预冷的PBS吹打均匀，吸至离心管中，1000rpm/min，离心3min， 弃上清，留细胞沉淀，用PBS洗1～2遍，弃上清，留细胞沉淀；(2)细胞固定：每 管中加入1mL提前冰浴预冷的70％乙醇，4℃固定12h；(3)染色：每管细胞样品 中加入500μL提前配制的碘化丙啶染色液，缓慢并充分重悬细胞沉淀，37℃避光温 浴30min；(4)流式检测。
图6和图7为不同低聚茋类化合物对3T3-L1脂肪细胞细胞周期影响结果。从两 图可以得出，低聚茋类-4和低聚茋类-2化合物中F-1、F-2、F-5、T-1能阻滞G1期 及S期细胞减少，DNA合成速率减缓，细胞分化过程阻滞。而化合物F-3、F-4、T-2、 T-4却能促进脂肪细胞的分化，其表现为G1所占的比例小，S和G2/M期细胞增多， 细胞活跃，大量合成细胞分化所需的DNA和蛋白质等物质。
五、3T3-L1脂肪细胞代谢相关蛋白表达的检测
将3T3-L1细胞以5×104个/孔接种于6孔板中，待细胞完全长满至80％左右时 进行诱导分化，诱导过程同实施例2，在诱导的第0天和第2天分别加入受试单体 化合物进行处理。在诱导的第8天收集细胞，提取胞浆蛋白，采用BCA法测定蛋白 质含量法，定量后进行SDS-PAGE电泳，研究本发明低聚茋类化合物对3T3-L1前 脂肪细胞分化过程中脂肪因子PPARγ，C/EBPα和FAS的表达的影响，实验结果如 图8和图9所示。
从图8和图9两图可以看出，undiff组细胞内PPARγ、C/EBPα、SREBP-1c和 FABP4这四个蛋白的表达水平极低，处于本底的低水平。而diff组细胞中的PPARγ、 C/EBPα和FABP4蛋白表现出较高的表达水平。低聚茋类中的各个单体化合物处理 脂肪细胞后却表现出两种不同的作用效果，化合物F-1、F-2和F-5能显著降低蛋白 表达水平，其中F-1和F-5作用最强烈，显著抑制脂肪细胞的分化。而化合物F-2、 F-3、T-2和T-4却表现出相反的作用，即能显著增加PPARγ、C/EBPα和FABP4蛋 白的表达水平，促进脂肪细胞分化。
六、3T3-L1脂肪细胞转录因子mRNA表达的检测
将3T3-L1脂肪细胞以5×104个/孔密度接种于6孔板中，待细胞完全长满至80％左右时，进行诱导分化，诱导过程同实施例2，在诱导的第0天和第2天加马蔺受 试化合物进行处理。在诱导的第8天收集细胞，Trizol法抽提总RNA，然后进行逆 转录合成cDNA，最后利用实时荧光定量PCR法检测3T3-L1细胞中线粒体相关基 因转录水平的变化，实时荧光定量PCR具体方法如下：
a.目的基因的引物序列如表1所示：
表1实时荧光定量PCR引物序列
Figure BDA0001843779570000121
Figure BDA0001843779570000131
b.配制PCR扩增反应体系，如表2所示：
表2实时荧光定量PCR反应体系组分
Figure BDA0001843779570000132
c.将上述反应液放入荧光定量PCR仪中进行扩增，PCR反应条件如表3所 示：
表3实时荧光定量PCR反应程序
Figure BDA0001843779570000133
每个循环结束后采集荧光信号，最后绘制溶解曲线以确定反应产物有无引物二聚体及非特异性扩增。在实时荧光定量PCR中，Ct值被认为与扩增基因的初始浓 度紧密相关。
相对定量分析：目的基因的表达采用比较Ct值，用内参基因β-actin来校正差 异，变化的倍数量为2-ΔΔCt。计算公式为：变化倍数＝2-ΔΔCt，其中ΔΔCt＝(Ct目的基 因-Ct内参基因)药物处理组-(Ct目的基因-Ct内参基因)Control。
脂肪细胞分化过程中受一系列转录因子的调控如PPARγ、C/EBPa、SREBP-1c 和FABP4，这些因子主要参与形成和保持成熟脂肪细胞的形态与功能。本发明通过 实时荧光定量PCR的方法检测了本发明低聚茋类类化合物对3T3-L1脂肪细胞细胞 转录因子mRNA表达水平的影响，结果见图10和图11。
从两图可以看出，undiff组细胞内PPARγ、C/EBPα、SREBP-1c和FABP4这四 个转录因子mRNA表达水平极低。而diff组细胞中的PPARγ、C/EBPα、SREBP-1c 和FABP4基因表现出较高的表达水平。低聚茋类化合物处理脂肪细胞后表现出两种 不同的作用效果，化合物F-1、F-2、F-5、T-1和T-3能显著降低转录因子mRNA表 达水平，其中F-1和F-5作用最强烈，显著抑制脂肪细胞的分化。而化合物F-2、 F-3、T-2和T-4却表现出相反的作用，即能显著增加PPARγ、C/EBPα、SREBP-1c 和FABP4基因的表达水平，其增加的程度高于分化组细胞中转录因子的表达水平， 促进脂肪细胞分化。
胰岛素抵抗(IR)模型的建立
IR模型的建立和验证：参考专利CN107898779A中所述方法。
一、3T3-L1细胞2-NBDG摄取的检测
细胞处理：将3T3-L1前脂肪细胞以5×104个/mL的密度接种至12孔板中，待 细胞密度长到80％以上时，进行诱导分化，在诱导分化成熟后的第8天，向细胞液 加入1μM Dex建立IR模型。分别设置正常组、模型组、阳性药物组和药物处理组， 除正常组用完全培养基培养之外，其余各组用1μM Dex培养，阳性药物组并在其 中加入1μM Rosi(罗格列酮)；药物处理组中各加入10μM单体化合物培养48h后， 空白组和模型组内部分别分为两组，一组用100nM的胰岛素刺激15min，另一组用 高糖DMEM培养15min；阳性药物组和药物处理组也同样用100nM的胰岛素刺激 15min，之后所用的处理组吸走培养液。
处理完成后将所有实验组用DPBS洗1次，加入500μL胰酶37℃消化1min， 加入2mLDPBS吹打均匀，1000g离心6min。弃去上清液，每孔加入1mL含有 10μM2-NBDG的无糖培养基37℃孵育30min，用流式在波长488nm，515～545nm 检测荧光强度。
荧光探针2-NBDG(2-[N-(7-nitrobenz-2-oxa-1，3-diaxol-4-ylamino] -2-deoxyglucose)是一种2-脱氧葡萄糖荧光类似物，能特异性结合胞内的葡萄糖， 检测时有较高的灵敏性。采用荧光标记的葡萄糖类似物2-NBDG检测3T3-L1脂肪 细胞对葡萄糖的摄取。如图12所示，通常胰岛素抵抗的细胞或机体中2-NBDG的 荧光强度极弱，处于本底值，说明细胞或机体对葡萄糖的摄取能力弱。实验结果显 示，正常组中2-NBDG的摄取能力高于胰岛素抵抗模型组中的葡萄糖摄取能力；当 正常组中加胰岛素刺激后细胞对2-NBDG的摄取能力明显增强。模型组中细胞对葡 萄糖的摄取能力较弱，而当模型组中加入胰岛素刺激后细胞对2-NBDG的摄取能力 并没有发生明显的变化，荧光值增加的幅度很低，与正常组中胰岛素刺激后的细胞 的葡萄糖摄取能力差异较明显。阳性药物Rosi中胰岛素刺激后细胞对2-NBDG的摄 取能力也明显上升。
从图12和图13中可以看出，低聚茋类化合物也能不同程度促进细胞对葡萄糖 类似物的摄取，其中化合物F-3、F-4、F-5、T-2和T-4作用效果最佳，具有改善胰 岛素抵抗的潜力。
二、3T3-L1细胞AKT磷酸化的检测
细胞处理同实施例8，最后收集细胞，并用Western blotting检测AKT蛋白的表 达水平。本实施例通过检测受试化合物对细胞中p-AKT表达的影响，考察受试化合 物是否具有促进细胞吸收利用葡萄糖，增强胰岛素信号传递过程，改善胰岛素抵抗 的作用。
其实验结果如图14和图15所示，正常组中无AKT的磷酸化表达，而正常组中 胰岛素刺激后AKT的磷酸化表达水平明显升高；模型组也无AKT的磷酸化表达， 而模型组中的脂肪细胞给予胰岛素刺激后AKT蛋白的磷酸化表达水平有微弱地上 升，而相比于正常组中的胰岛素刺激后AKT蛋白的磷酸化表达水平是极低的；阳 性药物Rosi中胰岛素刺激后细胞AKT的磷酸化表达水平升高。低聚茋类化合物能 提高3T3-L1脂肪细胞中p-AKT表达水平，促进3T3-L1脂肪细胞细胞对葡萄糖摄取、 增强胰岛素敏感性。
三、IR的3T3-L1脂肪细胞线粒体内源性活性氧的检测
细胞处理：3T3-L1前脂肪细胞以5×104个/mL接种至12孔板中，培养液培养 至细胞完全汇合2天后，进行诱导分化。在诱导分化成熟后的第8天，分别设置正 常组(Con)、模型组(Mod)、阳性药物组(mitotempo)、药物处理组，用1μM Dex 处理细胞48h建立模型。其中阳性药物组中加入1μM Rosi；药物处理组中各加入 10μM单体化合物。
处理完成后用PBS洗1次，加入500μL胰酶37℃消化1min，加入2mL PBS 吹打均匀，1000g离心6min。弃去上清液，每孔加入1mL含有5μM MitoSox TM的 无酚蓝培养基37℃孵育30min，用流式细胞仪在激发波长495nm处检测荧光强度。
活性氧(ROS)是一类含氧单电子还原产物，具有多种形式如超氧阴离子、过 氧化氢等，其作为机体的一种活性小分子，具有一定的生物学功能如信号传递、细 胞增殖、细胞凋亡等。通常线粒体是机体细胞内产生活性氧的主要场所，正常情况 下，线粒体产生的ROS是机体所必须的，用来维持正常的信号传递等作用；而当线 粒体功能发生障碍或者外界的因素如氧化应激、内质网应激等诱发机体产生大量的 活性氧，此时这些过剩的活性氧会反过来损伤线粒体生物发生蛋白、线粒体DNA 及细胞膜上的脂类及相关蛋白，从而引起线粒体功能紊乱等其他疾病。本发明采用 特异性检测线粒体内源性活性氧的荧光探针MitoSox，通过流式细胞仪检测低聚茋 类化合物对脂肪细胞线粒体内源性活性氧的影响。
如图16所示，Con组内探针的荧光强度较弱；Mod(IR)组中的荧光强度处 于很高的水平，说明Mod中细胞内含有大量的线粒体活性氧。阳性对照mitotempo 是一种靶向线粒体抗氧化剂，能快速高效清除超氧自由基和烷基自由基，其作用后 细胞线粒体活性氧水平明显降低。低聚茋类化合物各单体作用后细胞线粒体活性氧 水平均有所下降，其中F-1能极显著降低细胞线粒体活性氧的产生，且与Mod组相 比具有差异显著性，具有极好的清除线粒体活性氧能力。
四、IR的3T3-L1脂肪细胞线粒体膜电势的检测
细胞处理同实施例10，其中阳性药物组所加药物为Cccp，处理完成后将所有实 验组用PBS洗1次，加入500μL胰酶37℃消化1min，加入2mL PBS吹打均匀， 1000g离心6min。弃去上清液，每孔加入1mL含有10μM JC-1的无酚蓝培养基37℃ 孵育30min，用流式细胞仪在激发波长495nm、529/590nm处检测荧光强度。
正常的线粒体膜电势对于维持线粒体进行氧化磷酸化和维持线粒体功能所必需的。因此，线粒体膜电势的高低是评价线粒体功能的重要指标之一。本实验中采用 可特异性检测线粒体膜电势的荧光探针JC-1，此荧光探针可特异性检测线粒体膜电 势，其根据线粒体膜电势的高低而表现出红色和绿色荧光形式，通过流式细胞仪检 测低聚茋类化合物对脂肪细胞线粒体膜电势的影响。
如图17所示，Con组内线粒体膜电势处于较高的水平；Mod(IR)组中膜电势 降低，说明Mod中细胞膜电势损伤严重。阴性对照Cccp是一种强有效的线粒体氧 化磷酸化解偶联剂，促使线粒体内膜对H+产生通透性，导致线粒体内膜两侧膜电 位丧失。低聚茋类化合物各单体作用后细胞线粒体膜电势水平均有所升高，其中F-1、 F-3及F-4能显著升高线粒体膜电势，恢复线粒体膜电位。
五、对IR的3T3-L1脂肪细胞ATP含量的检测
细胞处理同实施例10，其中阳性药物组所加药物为Rosi，处理结束后，参照 ATP检测试剂盒的说明书，进行样品处理、ATP标准曲线的配制、ATP检测工作液 的配制及浓度的测定。
线粒体负责的最终氧化磷酸化的结果是产生ATP，ATP担任着机体能量的快速 供应。当机体中的能量ATP供应不足，无法满足机体正常代谢所需要的能量时，此 时线粒体会代偿性的产生ATP，但是长时间的这种代偿性条件下，会更加快速的损 伤线粒体，从而影响产生ATP的速率。本实验中采用ATP含量测定试剂盒测定低聚 茋类化合物对3T3-L1脂肪细胞中ATP产生的影响。
实验结果如图18所示，正常成熟脂肪细胞(Con)中ATP的含量较高；Mod 组中的ATP的含量显著低于Con组，说明胰岛素抵抗的脂肪细胞中线粒体产生ATP 过程受阻，ATP合成下降；Rosi处理后线粒体合成ATP的速率加快，ATP含量增 加。低聚茋类化合物各单体作用后细胞线粒体ATP含量均有所增加，其中F-1、F-5 及F-2能显著增加线粒体ATP含量。
六、对IR的3T3-L1脂肪细胞线粒体质量数的影响
细胞处理同实施例10，其中阳性药物组所加药物为Rosi，处理完成后用PBS 洗1次，加入500μL胰酶37℃消化1min，加入2mLPBS吹打均匀，1000g离心6min。 弃去上清液，每孔加入1mL含有10nM Mito
Figure BDA0001843779570000171
Green FM的无酚蓝培养基37℃ 孵育30min，用流式细胞仪在激发波长488nm处检测荧光强度。
线粒体质量是评价线粒体功能的重要指标，受损的线粒体内可明显观察到线粒体的数量减少，生物合成降低。本实验中采用用于特异性检测线粒体质量数的荧光 探针MitoTracker Green，该荧光探针是具有carbocyanine结构的一种细胞渗透型的 试剂，通过标记线粒体的弱巯基的氯甲基官能团而显示出绿色荧光，其定位于线粒 体的能力不受线粒体膜电位的影响，可作为定性检测线粒体质量数的一种方法。通 过激光共聚焦定性分析低聚茋类化合物对脂肪细胞线粒体质量的影响。
其结果如图19所示，Con组内探针的荧光强度较高，说明所含的线粒体数量 多；Mod(IR)组中的荧光强度极低，几乎处于本底的荧光值，说明Mod中细胞 内含有线粒体数量较少，线粒体合成遭受损伤。低聚茋类化合物各单体作用后细胞 线粒体质量数均有所增加，其中F-1、F-5和F-4能明显增加线粒体数量，提高线粒 体质量，促进线粒体生物发生。
七、对IR的3T3-L1脂肪细胞线粒体DNA损伤的影响
细胞处理同实施例10，处理后收集细胞，按照常规方法提取细胞基因组DNA， 将电泳完的胶放到紫外成像系统中进行观察，若条带清晰且无拖尾现象，表明DNA 完整性较好。
Long PCR检测3T3-L1细胞线粒体DNA的损伤：
a.根据文献提供的基因序列，引物由上海生物工程有限公司合成，线粒体DNA 基因的引物序列如表4所示。
表4线粒体Long PCR引物序列
Figure RE-GDA0001961007670000181
b.配制长短片段PCR扩增反应体系，如表5和6所示：
表5短片段PCR反应体系组分
Figure RE-GDA0001961007670000182
表6长片段PCR反应体系组分
Figure RE-GDA0001961007670000191
c.将上述反应溶液放PCR仪中进行扩增，长短片段PCR反应条件如表7和8 所示：
表7短片段实时荧光定量PCR反应程序
Figure RE-GDA0001961007670000192
表8长片段实时荧光定量PCR反应程序
Figure RE-GDA0001961007670000193
d.PCR反应完成后立即进行DNA电泳，长片段用1％的琼脂糖凝胶120V电泳 60min；短片段用0.5％的琼脂糖凝胶120V电泳50min，随后立即于凝胶成像系统 中进行观察，拍照。
线粒体DNA损伤的程度采用PCR扩增出的长片段目的基因与短片段目的基因 的比值来表示。本发明采用Long PCR的方法研究马蔺化合物对3T3-L1脂肪细胞中 线粒体DNA损伤的影响。
结果如图20所示，正常组中长片段扩增出的基因较多；而Mod组中扩增出的 长片段明显少于Con组，表明IR模型中线粒体DNA是损伤的；Rosi处理后线粒体 DNA扩增出的长片段显著增多。低聚茋类合物处理后，都能不同程度恢复已受损的 线粒体DNA片段，其中化合物F-5和F-4作用效果更佳。
八、IR的3T3-L1脂肪细胞线粒体分裂融合蛋白的检测
将3T3-L1前脂肪细胞以5×104个/mL接种至6孔板中，培养液培养至细胞完全 汇合2天后，进行诱导分化，在诱导分化成熟后的第8天，用1μM Dex建立IR模 型。分别设置正常组、模型组、阳性药物组和药物处理组，除正常组用完全培养基 培养之外，其余各组用1μM Dex培养，阳性药物组并在其中加入1μM Rosi(罗格列 酮)；药物处理组中各加入10μM单体化合物培养48h后，收集细胞，并用Western blotting检测蛋白的表达水平，具体方法同实施例5。
线粒体是一种动态细胞器，不断的进行着分裂和融合所形成的的形态学变化， 两者相互依存，共同构成快速循环的网络，调节线粒体质量控制。在不同的能量需 求下，融合提高线粒体对物质的利用，满足高能需求；当能量需求降低时，分裂加 快。本实验采用Western blotting的方法研究马蔺化合物对3T3-L1脂肪细胞线粒体 分裂和融合蛋白表达的影响。
结果如图21所示，各组中融合蛋白Mfn1和Mfn2表达水平几乎相同，而在Mod 组中分裂蛋白Drp1高度表达，具有较高的表达水平，由此可以说明Mod组中分裂 蛋白Drp1的高度表达加剧了线粒体的片段化，打破了线粒体的动态平衡；Rosi处 理后分裂蛋白Drpl表达量有所下降。低聚茋类化合物处理后，对融合蛋白Mfn1和 Mfn2表达影响不明显，而分裂蛋白Drp1相比于Mod都能不同程度地降低，其中化 合物F-1和F-3作用较明显。
九、IR的3T3-L1脂肪细胞线粒体生物发生相关基因表达的检测
细胞处理同实施例10，处理后收集细胞，Trizol法抽提总RNA，然后进行逆转 录合成cDNA，最后利用实时荧光定量PCR法检测3T3-L1细胞中线粒体相关基因 转录水平的变化，实时荧光定量PCR具体方法如下：
a.目的基因的引物序列如表9所示：
表9实时荧光定量PCR引物序列
Figure BDA0001843779570000201
b.配制PCR扩增反应体系同实施例6。
c.PCR反应条件方法同实施例6。
相对定量分析方法同实施例6。
本发明采用实时荧光定量PCR方法探究低聚茋类化合物对3T3-L1脂肪细胞中 线粒体生物发生相关基因如PGC-1α、NRF1和Tfam mRNA表达水平的影响。
线粒体生物发生是由PGC-1α激发引发的，其主要辅助NRF和Tfam因子表达。 只有线粒体生物发生保持稳定，线粒体才能正常行使功能，而当线粒体生物发生这 个源头出现障碍时，其下游的生物事件如线粒体DNA复制，转录和翻译、线粒体 质量控制(分裂/融合)及氧化磷酸化过程都会受到损伤，最终引起线粒体内环境紊 乱，功能发生障碍。
实验结果如图22所示，Mod组中PGC-1α、NRF1和Tfam这三个基因的表达水 平都较低，与Con组相比具有明显的差异，由此可以说明在胰岛素抵抗状态下线粒 体的生物发生过程已遭受损伤，不能行使正常的生理功能，从而表现出线粒体功能 紊乱。Rosi处理后PGC-1α、NRF1和Tfam基因表达水平均有所提高，并与Mod组 相比差异较明显。低聚茋类均能不同程度增加PGC-1α、NRF1和Tfam这三个基因 的表达水平，其中化合物F-4和F-3在提高基因PGC-1α、NRF1和Tfam mRNA表 达水平方面表现出最佳的效果。
综上所述，低聚茋类化合物都能改善胰岛素抵抗和线粒体功能紊乱，化合物F-1、F-5、T-1和T-3可有效抑制脂肪细胞分化，为开发治疗糖脂代谢紊乱相关疾病的潜 在植物来源的药物提供更多的参考依据。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本 发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他 相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (2)

1.低聚茋类化合物在体外细胞修复线粒体中的应用，所述低聚茋类化合物为以下结构式的化合物：
Figure DEST_PATH_IMAGE002
。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：具体操作如下：
3T3-L1前脂肪细胞以5×104个/mL接种至12孔板中，培养液培养至细胞完全汇合2天后，进行诱导分化；在诱导分化成熟后的第8天，加入低聚茋类化合物T-4处理，用1μM Dex 处理细胞48h建立模型。
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