CN110590881B - 马蔺子种仁中的低聚茋类化合物及其提取方法和用途 - Google Patents

马蔺子种仁中的低聚茋类化合物及其提取方法和用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开了马蔺子种仁中的新低聚茋类化合物及其提取方法和用途，对马蔺子种仁的碱提酸沉物进行放大制备，采用乙腈水溶液做流动相，通过两次制备即可得到本发明新低聚茋类化合物S11(VitisinA‑13b‑o‑glucoside)。本发明还提供了新化合物S11在制备预防和/或治疗脂代谢紊乱的药物中的应用，通过对化合物S11进行进行活性研究，验证了化合物S11能够抑制细胞成脂分化和脂质生成，从而用于制备预防或治疗肥胖症、高血脂等脂代谢紊乱疾病的药物。

Description

马蔺子种仁中的低聚茋类化合物及其提取方法和用途
技术领域
本发明涉及马蔺子种仁中低聚茋类化合物及其医药用途领域，特别是涉及马蔺子种仁中的新低聚茋类化合物及其提取方法和用途。
背景技术
茋类化合物是具有1,2-二苯乙烯骨架以及其组成的聚合物的一类化合物的总称。主要存在于植物的木质部，最早是从蓼科植物大黄中发现，包括二苯乙烯、二苯乙基、菲类单体及其聚合物。低聚茋类化合物属于非黄酮的多酚类化合物，存在于龙胆香科、芍药科、买麻藤科、蔷薇科、莎草科、豆科、桑科、蝶形花科、鸢尾科、葡萄科等。近年来研究报道茋类化合物具有多种生物活性，如神经保护、抗病毒、抗菌、抗炎、抗肿瘤、抗氧化，抗艾滋病及保肝等作用。
马蔺(Iris lacteal Pall.var.chinensis(Fisch.)Koidz.)，别名马莲、马兰、兰花草等，是被子植物门(Angiospermae)鸢尾科(Iridaceae)鸢尾属(Iris)的多年生草本宿根植物。马蔺广泛分布于我国的西北、华北、华东和东北等地，同时中西亚、俄罗斯、蒙古及朝鲜也有分布。马蔺是一种传统的中草药，据《中华本草》中记载，马蔺为植物马蔺的全草，其性味苦、微甘，性微寒。归肾、膀胱、肝经。其具有清热解毒，利尿通淋，活血消肿的功能，用于治疗喉痹，淋浊，关节痛，痈疽恶疮等症，且马蔺的叶、花、根和种子也均可入药。马蔺花晒干后即可入药，性咸，味酸、苦，微凉，有清热凉血的功能，用于咽喉肿疼、吐血等症的治疗；马蔺根性平、味甘，具有清热解毒等功效，用于治疗牙痛、急性传染性肝炎、咽炎等症；其种子有清热解毒、利湿止血的功效，可用于黄疸、白带、泻痢、吐血等疾病的治疗。现代药理学表明马蔺具有多种药理作用，如放射增敏性、抗生物、增强免疫、抗癌、改善糖脂代谢等作用。
到目前为止，已经从马蔺中分离得到多种化学成分，包括黄酮类、类黄酮类、苯醌类、茋类、甾醇和挥发油等。
茋类，是二苯乙烯类化合物或者其寡聚体。但从马蔺中分离得到的茋类化合物微乎其微，数量极少。目前关于茋类化合物的提取分离方法及相关含量测定研究报道较少，其相关成分的活性研究也比较少。如候微采用95％乙醇回流提取法和半制备型液相色谱法从马蔺子中分离出r-2-viniferin和trans-ε-viniferin；吕欢欢等人采用高速逆流色谱从马蔺子中分离纯化得到VitisinA，VitisinB和VitisinC。因此，需要在现有的研究基础上对马蔺的其他新的化学成分及药理作用进行更加深入、细微的研究与活性机制探讨。
肥胖、高血压、高血脂、心血管疾病等脂代谢紊乱疾病正逐渐侵害着人们的健康，而长期服用传统治疗药物会对患者的身体产生副作用影响，因此，急需开发出更安全有效的天然植物来源的药物。
发明内容
本发明提供从马蔺中提取得到新的低聚茋类化合物及其在制备预防和/或治疗脂代谢紊乱相关疾病药物中的用途，所述化合物具有抑制细胞成脂分化、抑制细胞脂质生成的功效。
本发明提供一种马蔺中的新的低聚茋类化合物，所述化合物结构式如式S11：
现有的对马蔺中活性物质的提取分离方法多需要大量的有机溶剂如甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯等，然而有机溶剂价格较高，易挥发，生产安全性差。茋类化合物结构上具有酚羟基，具有一定的弱酸性，可以与碱结合，提高水溶解能力，但是难溶于酸性溶液。本发明对马蔺采用碱提酸沉提取分离，经过一维、二维核磁鉴定，意外地得到新的茋类化合物S11，命名为VitisinA-13b-O-葡萄糖苷(VitisinA-13b-o-glucoside)。
本发明还提供了化合物S11的制备方法，包括如下内容：
(1)将马蔺子种仁提取物通过制备色谱制备，得到组分S1；
其中，所述制备色谱条件包括：
色谱柱：C18色谱柱；优选为规格为20mm*250mm，10μm；
流动相：5～30％乙腈水溶液；采用如下程序进行梯度洗脱：0min，5～10％乙腈水溶液；35～45min，20～30％乙腈水溶液；进一步地，采用如下程序进行梯度洗脱：0min，5％乙腈水溶液；40min，30％乙腈水溶液；
以色谱图中峰高最高的特征峰为参照峰(如图1中为40.593min)，相对于该参照峰，所述组分S1的相对保留时间为0.71～0.77，优选相对保留时间为0.74～0.75；
所述S1的相对保留时间是指：将组分S4作为参考组分，并以组分S4的保留时间作分母，将组分S1的保留时间作分子，与组分S4的保留时间的比值即为组分S1的相对保留时间，即：S1的相对保留时间＝S1的保留时间/S4的保留时间。
在本发明的一个具体实施方式中，所述组分S1为保留时间为29～31min对应的组分，更具体地，所述组分S1为保留时间为30.333min对应的组分。
(2)将组分S1进行半制备分离，得到化合物S11；
其中，所述半制备分离的条件包括：
色谱柱：C18色谱柱；优选为规格为20mm*250mm，10μm；
流动相：20～30％乙腈水溶液；等度洗脱。
S11为制备色谱中的最强峰。
在本发明的具体实施方式中，所述制备色谱或半制备分离还包括以下条件中的至少一种：
检测波长：210nm；
柱温：25～35℃；
流速：40～50mL/min。
在本发明的具体实施方式中，所述马蔺子种仁提取物为马蔺子种仁碱提酸沉物。
进一步地，所述马蔺子种仁碱提酸沉物的制备方法包括如下内容：
①马蔺子种仁用碱溶液提取，得到碱提取液；
②向碱提取液中加酸至沉淀产生完全，收集沉淀物；
③将沉淀物溶于醇后，除去溶剂，即得马蔺子种仁碱提酸沉物；所述醇选自甲醇和/或乙醇。
进一步地，所述碱溶液为质量分数为1～10％的NaOH溶液，优选质量分数为5％的NaOH溶液。
进一步地，所述加酸至沉淀产生完全是加酸调节溶液pH值不大于3。
进一步地，所述酸选自稀硫酸和/或盐酸。
所述稀硫酸是指溶质质量分数小于或等于70％的硫酸的水溶液，本发明中不再进一步限定其浓度，只要能满足实验条件均可，所述盐酸同理。
进一步地，所述乙醇为体积浓度为95～100％的乙醇水溶液。
所述乙醇为体积浓度为95～100％的乙醇水溶液，是指，所述乙醇可以为体积浓度大于等于95％的乙醇水溶液，也可以是纯乙醇。在实践中，常用的是95乙醇，即体积浓度为95％的乙醇水溶液。
进一步地，步骤(1)中，将马蔺子种仁碱提酸沉物溶于甲醇后，将得到的甲醇提取液上样。
马蔺子种仁碱提酸沉物的甲醇提取液，可参考现有技术中溶剂溶解浸提的多种方式获得。在本发明的具体实施方式中，是将马蔺子种仁碱提酸沉物溶于甲醇后，再通过有机膜过滤得到的过滤上清液即为其甲醇提取液。
进一步地，所述马蔺子种仁碱提酸沉物与甲醇的料液比为0.2～1g/ml；更进一步地，所述马蔺子种仁碱提酸沉物与甲醇的料液比为0.4g/ml。
本发明提供上述低聚茋类化合物在制备预防和/或治疗脂代谢紊乱的产品中的应用。
C2C12细胞是一种鼠源肌前体细胞系，是研究肌肉生长发育、肌细胞分化和脂代谢的理想细胞模型。由于脂肪细胞和肌肉细胞都起源于胚胎干细胞，在特定条件下肌细胞可以转分化为脂肪细胞或者脂肪细胞样细胞(adipocyte-like cell)。如在受到药物刺激或者环境改变的情况下，C2C12细胞会失去肌细胞的生肌特性而转分化为脂肪细胞，细胞内产生大量脂滴并表达脂肪细胞特异性基因。本发明研究VitisinA-13b-o-glucoside对C2C12成脂转分化的影响，为其改善脂代谢提供一定的实验依据。
本发明中所述产品包括但不限于药物、保健品、食品等。
进一步地，所述产品为具有降脂作用的产品，比如降脂药物等。
所述具有降脂作用的产品或降脂药物，为抑制脂肪细胞胞浆内脂滴的产生及减少甘油三脂含量的产品或药物。
根据细胞分化成熟前后，所述产品可分为抑制细胞成脂转分化和抑制成熟的脂肪细胞脂质生成两大类。
进一步地，所述预防和/或治疗脂代谢紊乱的产品包括抑制细胞成脂分化的产品和/或抑制细胞脂质生成的产品；所述产品可以是药物、保健品或其他具有抑制细胞成脂转分化的产品和/或抑制细胞脂质生成的产品。
所述产品为药物时，药物包括预防和/或治疗肥胖症、高血压、高血脂、心血管疾病、代谢综合征相关疾病中至少一种。
肥胖症、高血压、高血脂、心血管疾病、代谢综合征等疾病都与血浆脂质如甘油三脂(TG)、游离胆固醇(FC)、胆固醇脂(CE)和磷脂的含量息息相关，当体内血浆脂质减少至一定的浓度范围内，可有效控制或治疗这些疾病。本发明通过试验证明本发明化合物S11可有效抑制脂滴积累，降低TG含量，并通过相关信号通路调节脂肪细胞转录因子的基因表达水平和相关蛋白表达水平，从而抑制细胞的成脂分化和脂质生成，可用于制备预防和/或治疗肥胖症、高血压、高血脂、心血管疾病、代谢综合征相关疾病的产品。
本发明还提供上述低聚茋类化合物在制备PPARγ拮抗剂、C/EBPα拮抗剂、FAS抑制剂、ACC抑制剂中的至少一种的应用。
所述PPARγ拮抗剂、C/EBPα拮抗剂、FAS抑制剂、ACC抑制剂为降低脂肪细胞转录因子PPARγ、C/EBPα的基因表达和FAS、ACC的蛋白表达水平的药物。
未分化的细胞分化为成熟脂肪细胞需要一系列复杂精细的转录因子调控，PPARγ是脂肪细胞形成的必不可少的调控因子，在成脂过程的早期高度表达；C/EBPα也就是所谓的CCAAT/增强子结合蛋白α，在脂肪细胞分化的中期阶段大量表达。
FAS是脂肪酸合成酶，在脂质生成中起着重要的作用；ACC是乙酰辅酶A羧化酶，是脂肪酸重头合成的限速酶。
本发明所述化合物S11能降低细胞转录因子PPARγ、C/EBPα的基因表达和FAS、ACC的蛋白表达水平，从而能够有效抑制细胞成脂分化的产品和抑制细胞脂质生成，进而可用于制备预防和/或治疗与脂代谢紊乱的相关疾病，比如肥胖症、高血压高血脂、心血管疾病等。
本发明还提供了一种降脂产品，包括上述化合物S11。
本发明的有益效果是：
(1)本发明采用碱提酸沉结合半制备型液相色谱仪快速高效分离制备出一个全新的低聚茋类化合物S11，更加全面开发了马蔺的活性物质。
(2)本发明对从马蔺种子中提取了新的低聚茋类化合物，并对其进行活性研究，结果表明，本发明化合物S11能够抑制脂滴积累，降低TG含量，并通过相关信号通路调节脂肪细胞转录因子的基因表达水平和相关蛋白表达水平，从而抑制细胞的成脂分化和脂质生成，从而为研究用于肥胖症、心血管类疾病等脂代谢紊乱疾病提供有力方向。
(3)本发明更加全面挖掘了马蔺的药用价值、拓展了其临床应用，为开发治疗脂代谢紊乱相关疾病的潜在植物来源的药物提供更多的参考依据。
附图说明
图1是组分S1在制备色谱柱上分离色谱图；
图2是组分S11在制备色谱柱上制备图；
图3是组分S11纯度分析图；
图4是新化合物S11的核磁H谱图；
图5是新化合物S11的核磁C谱图；
图6是新化合物S11的HSQC图；
图7是新化合物S11的HMBC图；
图8是新化合物S11的HHCOSY图；
图9是新化合物S11的NOESY图；
图10是不同浓度VitisinA-13b-o-glucoside对细胞活力的影响；
图11是不同时间诱导成脂过程中C2C12细胞胞内脂滴积累的情况(100×)；
图12是不同时间诱导成脂过程中C2C12细胞胞内甘油三酯含量；
图13是VitisinA-13b-o-glucoside对C2C12细胞脂滴生成的影响；
图14是VitisinA-13b-o-glucoside对C2C12细胞甘油三酯含量的影响；
图15是不同时间诱导成脂过程中C2C12细胞脂质生成相关蛋白的表达水平；
图16是不同时间诱导成脂过程中C2C12细胞脂质降解相关蛋白的表达水平；
图17是VitisinA-13b-o-glucoside对C2C12细胞转录因子表达的影响；
图18是VitisinA-13b-o-glucoside对C2C12细胞脂质生成相关蛋白表达的影响。
具体实施方式
下面通过具体实施例和具体实验对本发明所述低聚茋类新化合物的制备及应用做进一步说明，并对所述低聚茋类新化合物抑制细胞脂质分化和脂质生成的作用进行验证和说明。
仪器：安捷伦1260系列高效液相色谱仪，配备G1311C四元梯度泵、G1329B自动进样器、G1316A柱温箱、G1315D检测器；汉邦NP7000C高效液相制备色谱仪、RE52-98旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)。
试剂：分析和制备级乙腈均来自云南新蓝景化学工业有限公司，色谱用水为娃哈哈纯净水，应用于HPLC的有机溶剂为色谱纯。
本发明实施例中，检测化合物纯度所用方法为利用HPLC通过面积归一化法得到，计算方式为：目标化合物纯度％＝目标化合物峰面积/总峰面积*100％
实施例1低聚茋类新化合物的制备
(1)将挑选除杂质后的马蔺种子用纯水清洗、阴干、脱皮，粉碎至30目，得到马蔺子种仁原料；
(2)将22kg马蔺子种仁用5％NaOH在常温浸泡提取12h，其中5％NaOH溶液为3kgNaOH溶于60L超纯水，提取液过滤收集；
(3)向步骤(2)所得提取液中滴加稀H2SO4溶液，调PH＝3，室温静置1h，使其产生沉淀；
(4)将步骤(3)产生的沉淀液收集室温离心，其离心条件为：4500rpm，10min，收集所得的沉淀物；
(5)将步骤(4)收集的酸沉物用12L的95％乙醇溶解，使其全部充分溶解；
(6)将步骤(5)所得乙醇溶物进行减压浓缩蒸发，分离压力为1.0MPa；分离温度为25-30℃；干燥温度65℃，其得到马蔺子种仁碱提酸沉物；
(7)将步骤(6)得到的20g马蔺子种仁碱提酸沉物溶解于50mL甲醇溶液中，采用有机膜进行过滤，得到澄清的过滤上样液；
(8)将步骤(7)所得到的澄清的过滤上样液，在DAC50制备柱上放大制备，流动相：5～30％乙腈水溶液；采用如下程序进行梯度洗脱：0min，5％乙腈水溶液；40min，30％乙腈水溶液；上样量为1mL，色谱柱：Hedera C18，20*250mm，10μm的填料，流速：40mL/min；柱温：35℃；检测波长：210nm。得到组分S1，S2，S3，S4四个组分，如图1所示。
(9)将步骤(8)得到的S1组分(保留时间为29～31min对应的组分；更具体地，为峰值为30.333min对应的组分)，用甲醇溶解后，通过制备条件的优化，最终选择30％的乙腈进行等度洗脱，色谱柱为20*250mm的C18半制备色谱柱，10μm的填料，流速：40mL/min；柱温：35℃；检测波长：210nm，进而得到样品S11(保留时间为26.609min)，如图2所示。
(10)将步骤(9)得到样品S11进行高效液相色谱检测以确定纯度，其检测条件：流动性：10～50％乙腈水，检测时间：0～40min，KromasilC18，5μm，4.6*250mm，检测波长210nm。
经HPLC检测，上述方法制备得到的化合物S11(VitisinA-13b-O-葡萄糖苷)的纯度达到91.11％，如图3所示。S11的结构如下：
化合物S11的结构(核磁数据)确认结果如表1和图4～9所示：
表1.1H and 13C NMR spectroscopic data for S11(CD3OD,δH:3.30ppm,δC:49.0ppm)
实施例2低聚茋类新化合物的制备
(1)将挑选除杂质后的马蔺种子用纯水清洗、阴干、脱皮，粉碎至30目，得到马蔺子种仁原料；
(2)将22kg马蔺子种仁用质量浓度10％NaOH在常温浸泡提取8h，其中10％NaOH溶液为6kg NaOH溶于60L超纯水，提取液过滤收集；
(3)向步骤(2)所得提取液中滴加盐酸，调PH＝3，室温静置1h，使其产生沉淀；
(4)将步骤(3)产生的沉淀液收集室温离心，其离心条件为：4500rpm，10min，收集所得的沉淀物；
(5)将步骤(4)收集的酸沉物用12L的甲醇溶解，使其全部充分溶解；
(6)将步骤(5)所得乙醇溶物进行减压浓缩蒸发，分离压力为1.0MPa；分离温度为25-30℃；干燥温度65℃，其得到马蔺子种仁碱提酸沉物；
(7)将步骤(6)得到的20g马蔺子种仁碱提酸沉物溶解于50mL甲醇溶液中，采用有机膜进行过滤，得到澄清的过滤上样液；
(8)将步骤(7)所得到的澄清的过滤上样液，在DAC50制备柱上放大制备，流动相：10～30％乙腈水溶液；采用如下程序进行梯度洗脱：0min，10％乙腈水溶液；35min，30％乙腈水溶液；上样量为1mL，色谱柱：Hedera C18，20*250mm，10μm的填料，流速：50mL/min；柱温：25℃；检测波长：210nm。得到组分S1，S2，S3，S4四个组分。
(9)将步骤(8)得到的S1组分，用甲醇溶解后，通过制备条件的优化，最终选择30％的乙腈进行等度洗脱，色谱柱为20*250mm的C18半制备色谱柱，10μm的填料，流速：50mL/min；柱温：25℃；检测波长：210nm，进而得到样品S11。
经HPLC检测，上述方法制备得到的化合物S11(VitisinA-13b-O-葡萄糖苷)的纯度达到92.05％。
实施例3低聚茋类新化合物的制备
(1)将挑选除杂质后的马蔺种子用纯水清洗、阴干、脱皮，粉碎至30目，得到马蔺子种仁原料；
(2)将22kg马蔺子种仁用1％NaOH在常温浸泡提取18h，其中1％NaOH溶液为0.6kgNaOH溶于60L超纯水，提取液过滤收集；
(3)向步骤(2)所得提取液中滴加稀H2SO4溶液，调PH＝3，室温静置1h，使其产生沉淀；
(4)将步骤(3)产生的沉淀液收集室温离心，其离心条件为：4500rpm，10min，收集所得的沉淀物；
(5)将步骤(4)收集的酸沉物用12L的95％乙醇溶解，使其全部充分溶解；
(6)将步骤(5)所得乙醇溶物进行减压浓缩蒸发，分离压力为1.0MPa；分离温度为25-30℃；干燥温度65℃，其得到马蔺子种仁碱提酸沉物；
(7)将步骤(6)得到的20g马蔺子种仁碱提酸沉物溶解于50mL甲醇溶液中，采用有机膜进行过滤，得到澄清的过滤上样液；
(8)将步骤(7)所得到的澄清的过滤上样液，在DAC50制备柱上放大制备，流动相：5～20％乙腈水溶液；采用如下程序进行梯度洗脱：0min，5％乙腈水溶液；45min，20％乙腈水溶液；上样量为1mL，色谱柱：Hedera C18，20*250mm，10μm的填料，流速：45mL/min；柱温：30℃；检测波长：210nm。得到组分S1，S2，S3，S4四个组分。
(9)将步骤(8)得到的S1组分，用甲醇溶解后，通过制备条件的优化，最终选择30％的乙腈进行等度洗脱，色谱柱为20*250mm的C18半制备色谱柱，10μm的填料，流速：45mL/min；柱温：30℃；检测波长：210nm，进而得到样品S11。
经HPLC检测，上述方法制备得到的化合物S11(VitisinA-13b-O-葡萄糖苷)的纯度达到91.08％。
下面通过试验例证明本发明化合物S11的有益效果：
试验例1
实验材料和实验准备
成肌细胞C2C12购自中国科学院上海生命科学研究院。化合物VitisinA-13b-o-glucoside通过实施例1方法分离纯化得到。
肽牛血清购自美国Gibco公司；DMEM高糖培养基、胰蛋白酶和PBS均购自美国Hyclone公司；胰岛素、地塞米松、罗格列酮、甲基异丁基黄嘌呤和油红O粉剂均购自美国Sigma公司。用于蛋白质印迹分析的一抗和二抗均购自Cell Signaling Technology(CST)公司。
统计分析：本试验数据采用“平均值±标准差”表示，实验结果采用Graphid7.0分析软件进行单因素方差分析，P<0.05作为显著性差异，P<0.01作为极显著性差异。
一、C2C12细胞诱导成脂转分化
C2C12成肌细胞生长到融合后会自动向肌细胞分化。为了模拟体内机内脂肪沉积的过程，本试验用胰岛素、地塞米松和甲基异丁基黄嘌呤组成的经典的三联诱导剂诱导融合后的C2C12细胞进行处理。
采用“鸡尾酒法”对C2C12细胞进行诱导分化，按如下步骤进行：将细胞状态良好的C2C12细胞接种于培养板上，铺板密度5×104个/mL，用含10％FBS的高糖DMEM培养液培养至细胞密度达到80％左右时，弃去完全培养液，加入含有10μg/mL胰岛素、0.5mM 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、1μM地塞米松和10μM罗格列酮的成脂分化诱导剂I的培养液培养两天，随后换成含有10μg/mL胰岛素和10μM罗格列酮的诱导剂II的培养液继续培养两天，随后换成正常培养培养，隔天换液。在诱导的第8天时，可观察细胞内85％以上的细胞呈现出成熟脂肪细胞形态，即通过显微镜发现细胞内具有大小不一的脂滴。分别在诱导的0、2、6和8天收集细胞。
二、细胞活力测定
细胞活力测定采用SRB法测定，其具体步骤如下：(1)细胞以5×104的密度接种于96孔板，用含10％FBS的高糖DMEM培养液培养至细胞长到50-60％左右时，加入受试单体化合物待细胞密度50～60％加化合物(每个化合物5个浓度梯度)孵育48h；(2)药物处理后，弃除原液，每孔加入100μL新鲜DMEM，之后加入25μL50％TCA(避光，可用排枪加)，室温放置5min，4℃放置1h；(3)弃除原液，用流动的ddH2O冲洗每个孔5遍，每一遍冲洗后用力甩出。在超净工作台倒置15min吹干(高风)；(4)每孔加入70μL 0.4％的SRB，振荡30min(避光)。(5)弃除SRB染液，每孔加1％的冰乙酸洗4遍，每一遍冲洗后用力甩出。在超净工作台倒置15min吹干(高风)；(6)每孔加入100μL100mM Tribase溶解，37℃振荡孵育20min。(7)用酶标仪于540nm波长检测OD值。按公式计算细胞存活率：
细胞存活率(％)＝(药物组OD/空白组OD)×100％
结果如图10所示。VitisinA-13b-o-glucoside的浓度是1μM时，对细胞的活力没有任何影响，细胞的活力接近100％。当浓度是10μM或者大于10μM时，细胞的活力随着化合物浓度的增加而逐渐下降。因此在后续的试验中，我们选用5μM作为化合物的最佳作用浓度。
三、不同诱导时间C2C12细胞胞内脂滴积累情况和甘油三脂的含量
将无菌盖玻片置于24孔板中，加入1mL DMEM，置于培养箱中温浴30min后。吸走培养基，将细胞以5×104个/mL接种于玻片上，每孔中加入1mL细胞悬液，用针头按压玻片，排除玻片下面的气泡，置于培养箱中培养，待细胞细胞密度达到80％左右时进行诱导分化，诱导过程如1.3所述，诱导结束后，进行固定并加入提前配制的油红O工作液染于细胞表面，避光静置60min。用70％乙醇洗涤细胞，取出多余的染料，双蒸水洗涤3-4次，置于显微镜下观察并拍照。
将C2C12细胞以5×104个/孔的密度接种于24孔板中，待细胞密度达到80％左右进行诱导分化，诱导过程如1.3所述，在诱导的第8天进行TG含量的测定，其具体方法如下：(1)细胞处理：在诱导的第8天，将细胞培养液吸走，冷PBS洗两次后加入细胞裂解液PIPA进行5min裂解(此操作在冰上进行)(2)细胞收集：细胞裂解后，用细胞刮子将细胞从孔板底部刮解转移到1.5mL离心管，制备好的匀浆液不离心直接测定。(3)在96孔板中每孔加入2μL待测样品，空白孔中加入2μL蒸馏水，标准孔中加入2μL标准品，然后每孔中加入160μL试剂R1，混匀，37℃孵育5min，在546nm波长条件下用酶标仪测定A1值；随后立即在每个样品中加入40μL试剂R2，混匀，37℃孵育5min后读取第二点吸光值A2。各管的吸光度变化△A＝A2-A1。最后借助BCA法测定待测样品中蛋白浓度，进行校正。
TG含量＝(OD样品-OD空白)/(OD校样-OD空白)×校准品浓度(mM)/待测样品蛋白浓度(gprot/L)
C2C12成肌细胞生长到融合后会自动向肌细胞分化。为了模拟体内机内脂肪沉积的过程，本试验用胰岛素、地塞米松和甲基异丁基黄嘌呤组成的经典的三联诱导剂诱导融合后的C2C12细胞，分别在处理的第0、2、4和8天收集细胞进行油红O染色和甘油三酯含量的测定。结果表明，从第4天开始有肌管出现，部分肌管内含有脂滴(图11)；随着诱导时间的增长，细胞内脂滴逐渐增加，直到第8天时，细胞内脂滴累积最多，含有丰富的脂滴(图11)。甘油三酯含量测定结果如图12所示，不同诱导时间，细胞内甘油三酯含量也不同，在第0天甘油三酯含量较低，但从诱导的第二天开始，随着诱导时间的增长，细胞内甘油三酯含量逐渐增多，直到第8天时，细胞内甘油三酯含量达到最高。
1、VitisinA-13b-o-glucoside对C2C12细胞脂滴生成的影响
将C2C12细胞根据本试验例“一、C2C12细胞诱导成脂转分化”的方法进行诱导成脂，并在加诱导液的同时加入5mM的Vitisin-13b-o-glucoside。到诱导分化的第8天油红O染色发现，未分化组内没有脂滴生成，分化组细胞内出现大量的脂滴。而分化组加Vitisin-13b-o-glucoside处理后相比分化组，Vitisin-13b-o-glucoside组能抑制脂滴的生成，如图13所示。
2、VitisinA-13b-o-glucoside对C2C12细胞甘油三酯含量的影响
将C2C12细胞根据1.3的方法进行诱导成脂，并在加诱导液的同时加入5mM的Vitisin-13b-o-glucoside。到诱导分化的第8天收集细胞，根据试剂盒的说明书进行甘油三酯含量的测定。结果发现，未分化组内甘油三酯含量极低，分化组细胞内甘油三酯含量较高。而分化组加Vitisin-13b-o-glucoside处理后相比分化组，Vitisin-13b-o-glucoside组甘油三酯含量下降，如图14所示。
四、C2C12细胞脂代谢相关蛋白表达的影响
将C2C12细胞以5×104个/孔接种于6孔板中，待细胞完全长满至80％左右时进行诱导分化，诱导过程如1.3所述，在诱导的第8天收集细胞，提取胞浆蛋白，进行蛋白电泳，其具体方法如下：
(1)细胞总蛋白的抽提
细胞经药物处理结束后，收集细胞并抽提总蛋白，实验操作具体方法参考文献，最后将提取的总蛋白置于-80℃保存。
(2)BCA法测定蛋白质含量
取出冻存的蛋白样品，根据BCA蛋白定量试剂盒说明书的要求，将蛋白标准品用PBS缓冲液稀释为0.5mg/mL，按50:1的比例将试剂A：试剂B混匀配制成工作液。按表2所示将标准品和PBS加入96孔板中，每孔20μL，一般每个浓度设3个复孔，用来绘制标准曲线。蛋白样品1μL加到96孔板中，加PBS补到20μL。每孔加入200μLBCA工作液充分混匀，上述样品在微孔板孵育振荡器37℃振荡孵育30min，于酶标仪562nm处测光度值，根据标准曲线计算出样品的蛋白浓度。测定完蛋白浓度后，计算30μg蛋白样品中加入SDS-PAGE上样缓冲液，充分混匀，沸水中煮沸10min，使蛋白完全变性。蛋白上样前，样品离心混合均匀后使用。
表2BCA法蛋白定量表
①SDS-PAGE电泳
蛋白电泳具体操作方法同现有技术中已有的常规方法，并根据目的蛋白的分子量按照表4选择合适的分离胶浓度，根据配胶说明表3，配置合适的溶液体系，最后按照表5配制上层5％的浓缩胶，配胶结束后尽快进行电泳，电泳条件：S1阶段，80V，30min；S2阶段，120V，大约2h，直至缓冲液中溴酚蓝跑到分离胶最下端时结束电泳。
表3不同浓度的SDS-PAGE分离胶的最佳分离范围
Table 1.2The separation ranges of SDS-PAGE gel with differentconcentration
表4配制不同体积10％SDS-PAGE分离胶所需各成分体积
表5配制不同体积5％SDS-PAGE浓缩胶所需各成分体
②转膜
待到蛋白电泳结束后立即进行转膜，其具体实验操作方法同现有技术中的常规方法。
③封闭
转膜结束后，将PVDF膜快速从转膜板中用镊子轻轻拿出，放于TBST缓冲液中漂洗5min，随后立刻用含5％脱脂奶粉的TBST室温摇床1h进行封闭。
④一抗孵育
封闭结束后，将PVDF膜放入稀释好的一抗溶液中，在4℃条件下置于水平摇床上慢摇进行过夜孵育。
⑤二抗孵育
一抗孵育结束并完成洗膜后，将PVDF膜置于含有HRP标记的鼠二抗或兔二抗溶液中室温摇床孵育1h。
⑥显影
所有抗体孵育结束后，采用ECL法检测，按1:1比例配制显影液，将混合好的ECL加在PVDF膜上进行发光，并用凝胶成像系统进行拍照。
1、不同诱导时间C2C12细胞脂质生成相关蛋白的表达水平
不同诱导时间第0、2、4和8天时C2C12细胞脂质生成相关蛋白的表达变化水平如图15所示。未诱导的C2C12细胞中ACC、FAS、PPARγ和C/EBPα蛋白表达水平较低，其中PPARγ几乎不表达。而在诱导的第2、4和8天时，C2C12细胞中ACC、FAS、PPARγ和C/EBPα蛋白表达水平逐渐增加，并在第8天时达到最高的表达值。
2、不同诱导时间C2C12细胞脂质降解相关蛋白的表达水平
不同诱导时间第0、2、4和8天时C2C12细胞脂质降解相关蛋白的表达变化水平如图16所示。未诱导的C2C12细胞中ACOX表达水平最高，而CPT1A、HSL和ATGL蛋白表达水平较低，其中HSL和ATGL几乎不表达。而在诱导的第2、4和8天时，C2C12细胞中CPT1A、HSL和ATGLA蛋白表达水平逐渐增加，并在第8天时达到最高的表达水平，从而加速了甘油三酯的水解速率及脂肪酸的氧化。
3、VitisinA-13b-o-glucoside对C2C12细胞脂质分化过程中转录因子表达的影响
如图17所示，未分化的细胞内成脂分化相关的转录因子PPARγ几乎不表达，表达含量极低；分化组的细胞中PPARγ蛋白高度表达，而在分化的C2C12细胞中同时给予化合物vitisin A-13b-o-glucoside处理8天后，细胞内转录因子PPARγ表达含量下降。转录因子C/EBPα在未分化细胞中也有所表达，在分化组细胞中表达含量达到最高，而化合物vitisinA-13b-o-glucoside处理后，细胞内转录因子C/EBPα表达含量下降。其结果表明化合物vitisin A-13b-o-glucoside有抑制C2C12细胞成脂转分化的能力。
4、VitisinA-13b-o-glucoside对C2C12细胞脂质生成相关蛋白表达的影响
FAS是脂肪酸合成酶，在脂质生成中起着重要的作用；ACC是乙酰辅酶A羧化酶，是脂肪酸重头合成的限速酶。如图18所示，未分化的细胞内FAS和ACC几乎不表达，表达含量较低；分化组内出现大量的脂滴，脂质合成加速，为此FAS和ACC蛋白高度表达，表达量达到最高值。而在分化的C2C12细胞中同时给予化合物vitisin A-13b-o-glucoside处理8天后，细胞内FAS和ACC蛋白表达含量下降。其结果表明化合物vitisin A-13b-o-glucoside有抑制C2C12细胞脂质生成的能力。
综上所述，本发明提取得到的新低聚茋类化合物可有效抑制细胞成脂分化和脂质生成，为开发治疗脂代谢紊乱相关疾病的潜在植物来源的药物提供更多的参考依据。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (1)

1.一种低聚茋类化合物的制备方法，其特征在于，所述低聚茋类化合物结构如式S11所示：
所述制备方法包括如下内容：
(1)将马蔺子种仁提取物通过制备色谱制备，得到组分S1；
其中，制备色谱的条件包括：
色谱柱：C18色谱柱；规格为20mm*250mm，10μm；
流动相：5～30％乙腈水溶液；采用如下程序进行梯度洗脱：0min，5～10％乙腈水溶液；35～45min，20～30％乙腈水溶液；
以色谱图中峰高最高的特征峰为参照峰，相对于该参照峰，所述组分S1的相对保留时间为0.74～0.75；
(2)将组分S1进行半制备分离，得到化合物S11；
其中，所述半制备分离的条件包括：
色谱柱：C18色谱柱；规格为20mm*250mm，10μm；
流动相：30％乙腈水溶液；等度洗脱；检测波长：210nm；
柱温：25～35℃；
流速：40～50mL/min；
所述步骤(1)中的马蔺子种仁提取物为马蔺子种仁碱提酸沉物；所述马蔺子种仁碱提酸沉物的制备方法包括如下内容：
①将挑选除杂质后的马蔺种子用纯水清洗、阴干、脱皮，粉碎至30目，得到马蔺子种仁原料，将22kg马蔺子种仁用60L碱溶液提取，得到碱提取液；
②向碱提取液中加酸至沉淀产生完全，产生的沉淀液收集室温离心，其离心条件为：4500rpm，10min，收集沉淀物；
③将沉淀物溶于12L醇后，进行减压浓缩蒸发，分离压力为1.0MPa；分离温度为25-30℃；干燥温度65℃，即得马蔺子种仁碱提酸沉物；所述醇选自甲醇或乙醇；
所述碱溶液为质量分数为1～10％的NaOH溶液；
所述加酸至沉淀产生完全是加酸调节溶液pH值等于3，室温静置一小时；所述酸选自稀硫酸或盐酸；
所述乙醇为体积浓度为95％的乙醇水溶液；
所述步骤(1)中，将所述马蔺子种仁碱提酸沉物溶于甲醇后，将得到的甲醇提取液上样；
所述马蔺子种仁碱提酸沉物与甲醇的料液比为0.4g/mL。
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