CN111166731A - 来源于粘委陵菜的贝壳杉烷型二萜类化合物在抑制脂肪蓄积中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种来源于粘委陵菜的贝壳杉烷型二萜类化合物在抑制脂肪蓄积中的应用。该化合物的结构式如式Ⅰ所示。本发明化合物来源于天然植物，具有毒性小的特点，对3T3‑L1细胞的分化及脂肪的积蓄都有较强的抑制作用，可用于脂肪蓄积症的预防/和治疗。

Description

来源于粘委陵菜的贝壳杉烷型二萜类化合物在抑制脂肪蓄积 中的应用
技术领域
本发明属于医药领域，涉及用于预防/治疗脂肪蓄积病症的来源于粘委陵菜的单体化合物贝壳杉烷型二萜类化合物的制备方法及其应用。
背景技术
过多的脂肪蓄积引发了人类的诸多健康问题，如肥胖、脂肪肝疾病、高脂血症、高血压和糖尿病等等，给现代人带来了越来越严重的困扰。预防和治疗脂肪蓄积是解决这些健康问题的关键。
以肥胖症为例，半个世纪以前，世界上的肥胖者不到1亿。伴随着经济发展的脚步越来越快，人类健康面临的威胁也越来越严重，其中肥胖及其并发症正作为一个“无情的杀手”，严重危害着人类的健康。目前，在全球范围内，肥胖患者人数日益增加。
在欧美等西方国家，近几年肥胖成为全球第4大医学社会问题，排在前三位的是吸毒、酒精中毒及艾滋病。特别在美国，统计共有7800万名肥胖人士，占全球肥胖者总数的13％，有研究表明，每年有高达520亿美元的直接消费用于肥胖方面，间接使用的费用也会达到470亿美元，这些消费大约会占美国国民生产经济总值的4％，中国的肥胖人口排全球第二，而且人数在不断增加。
肥胖已经成为严重威胁人们生命安全的危险因素。随着社会的发展，人们的饮食结构产生了变化，逐渐以高脂肪、高能量、低纤维的食物为主，这使得肥胖的人数逐步增加，到2016年为止，最新调查显示，全球如今全球约70亿人中有百分之十以上的人口正在遭受着肥胖带来的各种苦恼和困扰。同时，肥胖也是引起各种慢性代谢疾病的重要原因，例如糖尿病、脂肪肝、心脑血管疾病、动脉粥样硬化、肌肉骨骼疾病和某些癌症等。众所周知，引起肥胖的关键因素是脂肪组织的蓄积。
目前，有多种治疗肥胖的方式，例如，减少食物或能量的摄入，通过脂质的代谢刺激能量产生，抑制胰脂肪酶及脂肪细胞分化，其中抑制脂肪细胞分化是最为常用的方式。脂肪组织的大量堆积主要是由脂肪细胞数目的增多和脂肪细胞体积增大引起，而脂肪细胞数目的多少在很大程度上是通过脂肪细胞分化来实现，并且脂肪细胞分化的增加会导致脂肪因子分泌过多，这些因子在肥胖及相关疾病的发展过程中，都起到至关重要的作用，因此调节脂肪细胞的分化可以为有效的控制肥胖提供帮助。
许多传统药物被用来治疗脂肪蓄积。其中药用植物粘萎陵菜(Potentillalongifolia Willd.ex Schlecht)为蔷薇科委陵菜属多年生草本植物，在朝药(朝鲜民族药)中称为肝炎草，是一味朝鲜族特色药材。医药典籍中记载肝炎草可以全草入药，在夏、秋之时采集，鲜用或干燥入药，用于治疗肝炎。
发明内容
本发明的目的在于提供来源于天然植物的具有抑制脂肪蓄积作用的有效成分及其制备方法和用途。本发明从粘委陵菜中成功分离得到单体化合物如式Ⅰ所示的贝壳杉烷型二萜化合物，该化合物具有良好的抗脂肪蓄积作用，可应用于脂肪蓄积症的预防/和治疗。
本发明的一方面提供一种如式Ⅰ所示的化合物在制备预防/和治疗脂肪蓄积症制剂中的用途：
Figure BDA0002366672550000021
在上述技术方案中，如式Ⅰ所示的化合物可直接或制成药学可接受的盐后包含于所述预防/和治疗脂肪蓄积症制剂中。所述药学可接受的盐包括无机盐或有机盐。所述无机盐例如盐酸盐、硫酸盐、磷酸盐、二磷酸盐等，但并不限于此。所述有机盐例如盐、琥珀酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐、乳酸盐等，但并不限于此。对于如式Ⅰ所示的化合物以及其在药学上可接受的盐在所述预防/和治疗脂肪蓄积症制剂中的含量并不特别限定，根据具体应用病症以及给予对象的具体情况，可适当选择，优选地，本发明化合物的量至少占制剂质量的0.001％。
在上述技术方案中，所述的脂肪蓄积症，是指起因于脂肪的蓄积病症，如肥胖症、高脂血症、高血压和糖尿病等。
本发明的第二方面，提供一种用于治疗脂肪蓄积症的药物组合物，该药物组合物由所述如式Ⅰ所示的化合物和药学上可接受的辅料组成。所述药学上可接受的辅料选自稀释剂、粘合剂、崩解剂、表面活性剂、包衣材料、胶囊材料和成膜材料中的至少一种。所述药物组合物可以为颗粒剂、丸剂、胶囊剂、片剂、口服液体制剂或冻干粉制剂。对于如式Ⅰ所示的化合物在所述药物组合物中的含量并不特别限定，根据具体应用病症以及给予对象的具体情况，可适当选择，优选地，本发明化合物的量至少占所述药物组合物质量的0.001％。
本发明的第三方面，提供一种上述如式Ⅰ所示化合物在抑制脂肪蓄积的饮食品中的应用。本发明的如式Ⅰ所示化合物或其在药学上可接受的盐可以作为抑制脂肪蓄积的有效成分含有于饮食品中。只要是不破坏化合物作为有效成分的效果，对于饮食品的形状或性状并不具体限定，除了包含本发明化合物外，可以包含通常饮食品中使用的原料，并按照常规方法进行制备。对于如式Ⅰ所示的化合物在所述饮食品中的含量并不特别限定，可适当选择。所述饮食品可用于预防或改善起因于脂肪蓄积的症状，如肥胖、高脂血症、高血压和糖尿病等。
本发明的第四方面，提供一种上述如式Ⅰ所示化合物的制备方法，包括如下步骤：
(1)将粘委陵菜的水提取物，采用D101型大孔吸附树脂进行分离，在分离过程中，依次用水、25％乙醇、50％乙醇、75％乙醇、95％乙醇作为洗脱液，进行梯度洗脱，每一梯度均洗脱至洗脱液无色为止，将各梯度的洗脱液减压浓缩并干燥，得水洗脱浸膏、25％乙醇洗脱浸膏、50％乙醇洗脱浸膏、75％乙醇洗脱浸膏以及95％乙醇洗脱浸膏；
(2)对95％乙醇洗脱浸膏用正相硅胶柱层析进行分离，在分离过程中，依次用体积比为20:1、10:1、5:1、3:1的石油醚-乙酸乙酯系统和体积比为20:1、10:1、5:1、100％甲醇的二氯甲烷-甲醇系统作为流动相，进行梯度洗脱，根据薄层层析结果，合并相同馏分，得到23个馏分，即馏分1～23；
(3)对馏分14用反相硅胶柱层析进行分离，在分离过程中，依次用体积比为1:1、3:2、2:1、5:2、3:1、100％甲醇的甲醇-水系统作为流动相，进行梯度洗脱，根据薄层层析结果，合并相同馏分，得到18个馏分14-1～18；
(4)对馏分14-2用HPLC进行分离纯化，依次用体积比为2:3、1:1、2:1、100％甲醇的甲醇-水系统作为流动相，进行梯度洗脱，根据薄层层析结果，得到式Ⅰ所示化合物。
在上述技术方案中，所述的粘委陵菜为干燥或新鲜采集的粘委陵菜的地上部分或根。
本发明的如式Ⅰ所示化合物来源于天然植物，具有毒性小的特点，对3T3-L1细胞的分化及脂肪的积蓄都有较强的抑制作用，可用于脂肪蓄积症的预防/和治疗。
附图说明
图1表示化合物6对3T3-L1小鼠前脂肪细胞生存率的影响。
图2表示处理化合物6后诱导分化的3T3-L1小鼠前脂肪细胞的油红O染色结果照片。
图3表示处理化合物6后诱导分化的3T3-L1小鼠前脂肪细胞，经油红O染色后，再经异丙醇脱色后在540nm处测定吸光度的结果。
图4表示处理化合物6后诱导分化的3T3-L1前脂肪细胞中甘油三酯含量的测定结果。
图5表示化合物6与AMPK和SCD1的对接作用。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例详述本发明，但不限制本发明的保护范围。如无特殊说明，本发明所采用的实验方法均为常规方法，所用实验器材、材料、试剂等均可从化学公司购买。
下述实施例所用材料：
将采集于吉林省延边地区的粘委陵菜(Potentilla longifolia Willd.exSchlecht)(俗称肝炎草)地上部分以及根进行避阳、风干，备用。
实施例1粘委陵菜根中化合物6的分离及纯化
(1)称取粘委陵菜干燥根10kg，将其粉碎后均分为四份，先后对每一等份用蒸馏水浸泡2小时，然后用真空浓缩煎药机煎煮2小时，重复提取3次，脱脂棉趁热过滤后合并滤液，减压浓缩(45r/min)滤液至浸膏状，得到粗提物浸膏1633g，取出55g做药理实验，剩余1578g用于分离及纯化；
(2)将浸膏(1578g)加热超声溶解在3L蒸馏水中，再均分为三份，固定相为D101型大孔吸附树脂，依次用H2O、25％、50％、75％、95％乙醇进行洗脱，每一梯度均洗脱至洗脱液无色为止，然后将各梯度的洗脱液减压浓缩并干燥，得H2O洗脱部分434g、25％乙醇洗脱部分526g、50％乙醇洗脱部分139g、75％乙醇洗脱部分8g、95％乙醇洗脱部分2.8g；
(3)对95％乙醇洗脱部分2.8g用正相硅胶柱层析进行分离纯化，所用硅胶的粒度为200～300目，湿法装柱，干法上样后，依次用体积比为20:1、10:1、5:1、3:1的石油醚-乙酸乙酯系统，按体积比为20:1、10:1、5:1、100％MeOH的二氯甲烷-甲醇系统作为流动相，进行梯度洗脱，得到23个馏分，即馏分1～23；
(4)对馏分14(84.8mg)用反相硅胶柱层析进行分离，湿法填柱，湿法上样后，依次用体积比为1:1、3:2、2:1、5:2、3:1、100％甲醇的甲醇-水系统作为流动相，进行梯度洗脱，根据薄层层析结果，合并相同馏分，得到18个馏分14-1～18；
(5)对馏分14-2(7.3mg)用HPLC进行分离纯化，依次用体积比为2:3、1:1、2:1、100％甲醇的甲醇-水系统作为流动相，进行梯度洗脱，根据薄层层析结果，得到单体化合物6(1.6mg)，其结构如式Ⅰ所示：
Figure BDA0002366672550000051
实施例2化合物6的化学性质及化学结构鉴定
化合物6的结构解析：分子式为C20 H34 O2，分子量为306；白色粉末，溶于甲醇。1H-NMR(500MHz,CD3OD)δH 3.72(1H,s)，3.70(1H,s)为19位连羟基的亚甲基上2个氢质子信号峰；0.92～1.90之间的峰为各个环上的甲基，亚甲基上的氢质子信号峰。13C-NMR(125MHz,CD3OD)δC79.8为16位季碳信号峰；65.2是结构中19位亚甲基上的碳信号峰；27.8,24.3,19.3分别是结构中18位，17位，20位上的角甲基碳信号峰；其余58.7,58.3,55.6,49.7,46.4,43.7,41.8,40.5,39.8,38.4,36.8,27.8,21.6,19.2和18.9是结构的不饱和碳信号峰。以上数据与参考文献(Pacheco,A.G.等,Molecules.2009,14,1245-1262)基本一致，故鉴定为16β,19-dihydroxy-ent-kaurane，中文化学名为16β,19-二羟基-贝壳杉烷。
实施例3化合物6对3T3-L1小鼠前脂肪细胞生存率的影响
用MTT法检测化合物6的细胞毒性：
(1)3T3-L1细胞培养
用含有10％小牛血清(FCS)、1％的青霉素-链霉素双抗混合液的DMEM培养基在含有一定湿度和5％二氧化碳的37℃培养箱中培养3T3-L1小鼠前脂肪细胞。
(2)细胞毒性实验(MTT)
本实验对单体化合物6进行细胞毒性实验，在96孔板中加入100μL含有3T3-L1细胞的培养液，待细胞贴壁后，每孔加入100μL相应浓度的化合物6，处理细胞的化合物6的浓度分别为0、10、20、40、80μM。每个浓度梯度设3个平行孔，将处理后的3T3-L1细胞放置后37℃和5％的二氧化碳条件下继续培养。96h后，弃去培养液，每孔加入10μL MTT溶液，在避光、37℃温度下放置4h后，再加入100μL二甲基亚砜，并用摇床震荡10min后，在540nm波长下测定吸光度A值，计算3T3-L1细胞的细胞生存率(Cell viability)，结果如图1，图1中***表示和0μM组相比，p<0.001，有显著差异。
如图1可见，化合物6在0～40μM范围内没有毒性。在接下来的研究中化合物6选用浓度为20μM。
实施例4化合物对3T3-L1小鼠前脂肪细胞分化的影响
(1)3T3-L1细胞分化及药物处理
将3T3-L1前脂肪细胞传代接种于6孔板内，用含10％小牛血清(FCS)的培养液进行培养，待3T3-L1细胞长满时(定义为第0天)进行诱导分化，分别设正常组(CON组，加入10％FCS培养液)；单独给诱导分化液的对照组(DM组(differentiation medium)，加入诱导分化剂Ⅰ(5％FBS+DMEM+1μM地塞米松+500μM 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤+10μg/ml胰岛素))；吡格列酮对照组：(PIO组(pioglitazone)，加入诱导分化剂Ⅰ+10μM吡格列酮)；化合物6给药组(诱导分化剂Ⅰ+化合物6：20μM)；培养2天后，按上述方法更换同样的诱导分化剂。培养4天后，更换培养液，CON组更换新鲜的10％FCS培养液，DM组、PIO组、各个给药组均换用诱导分化剂Ⅱ：10μg/ml胰岛素+5％FBS+DMEM。2天后，CON组更换新鲜的10％FCS培养液，其余组换用诱导分化剂Ⅲ：5％FBS+DMEM。每2日换液一次，持续培养到第8天，完成诱导过程。
(2)油红O染色
细胞诱导分化完成后，弃去6孔板内的培养基，用PBS清洗3次。在室温下用10％的多聚甲醛固定1h后，PBS清洗2次，每孔加入1ml提前配好的油红O染料试剂，常温染色2h后，再用蒸馏水洗净板中的染料，并在倒置显微镜中观察3T3-L1细胞分化情况，拍摄照片，结果如图2。染色后的6孔板在室温下隔夜晾干后，用异丙醇(IPA)脱色，并在540nm处测定吸光度，结果如图3。
油红O是很强的脂溶剂和染脂剂，与甘油三酯结合呈小脂滴状，细胞或组织中的脂滴用其染色后呈橘红色，为了筛选能够抑制3T3-L1前脂肪细胞分化的单体，3T3-L1细胞处理相应浓度的药物的同时进行分化，分化完成后，用油红O进行染色，根据染色情况判断3T3-L1细胞的分化情况，染色后的细胞用异丙醇脱色，测定其吸光度，吸光度值的大小亦可说明3T3-L1细胞的分化情况。从油红O染色结果(图2)可以看出，与CON组相比较，DM组中的3T3-L1细胞从长梭形的细胞分化成为成熟的脂肪细胞，脂滴大量聚集，形成“戒环”样结构；DM组与PIO组相比较，细胞分化情况并无显著性差异，由此说明3T3-L1细胞分化完全。与DM组相比，化合物6给药组的中油滴累积显著减少，3T3-L1细胞的分化都受到了显著抑制。油红O染色的细胞用异丙醇脱色后测定吸光度，吸光度值的测定结果表明(图3)，与DM组相比，化合物6给药组的吸光度值到58％，可以初步判断化合物6对脂肪蓄积有着较强的抑制作用。
图3中，###表示与正常对照组相比较p<0.001；***表示与模型(DM)组相比较p<0.001。
(3)TG含量测定
甘油三酯(TG)是人体中脂质的组成成分，是人体内含量最多的脂质，更是临床中脂质相关疾病的检查指标。采用如下方法检测化合物6对3T3-L1中TG含量的影响：
按照步骤(1)诱导分化完成的6孔板样品中，每孔加入120μl的细胞裂解液[(25mM蔗糖，20mM三氨基甲烷，1mM乙二胺四乙酸，1mM乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸]，将细胞刮下，放入1.5ml试管中，置于冷冻离心机中，4℃，13000rpm，离心20min。离心完毕后，取上清液进行蛋白质的定量，绘制标准曲线(做三次平行实验)，测定样品浓度。取80μg蛋白质定量至30μl；按试剂盒说明操作后，510nm条件下测定校准孔及各孔样品吸光度值。根据吸光度值计算了样品的TG含量，结果如图5。
图4结果显示，与DM组相比与DM组相比，化合物6给药组与DM组出现了显著性差异，降低到63％，说明化合物6对甘油三酯的蓄积有着较强的抑制作用。
图4中，###表示与正常对照组相比较p<0.001；***表示与模型(DM)组相比较p<0.001。
综合上述的实验结果表明，单体化合物6对甘油三酯等蓄积有着较强的抑制作用，化合物6对3T3-L1细胞的分化及脂肪的积蓄都有着显著的抑制作用。
实施例5通过分子对接研究化合物6的作用机制
AMP活化蛋白激酶(AMPK)与脂肪和碳水化合物的代谢密切相关。活化后，AMPK可抑制固醇调节元件结合蛋白(sREBP1c)、过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)、CCAAT/增强子结合蛋白(C/EBPα)及其下游蛋白如硬脂酰辅酶A脱氢酶-1(SCD1)和脂肪酸合成酶(FAS)的表达。这些蛋白参与甘油三酯(TGs)和脂肪酸的生物合成和脂肪细胞成熟，从而抑制脂肪生成。同时，分子对接研究通常用于检查化合物在蛋白质结合位点的位置，是一种计算机模拟方法，可以看作是一个优化选择，可以自动确定蛋白质-配体复合物的构象。
因此，本实施例采用分子对接的方法进一步阐明化合物6与AMPK(或SCD1)之间是否存在相互作用，具体为：
SCD1(PDB ID:4YMK)和AMPK(PDB ID:5T5T)蛋白质的晶体结构是从RCSB蛋白质数据库下载，化合物6的3D结构由Chem3D 14.0.0.117转化而成。然后，以Discovery Studio4.0准备化合物和蛋白质，并以其中的Libdock进行分子对接研究。
结果如图5所示，其中，图5A表示化合物6与AMPK的相互作用，图5B表示化合物6与AMPK相互作用的二维视图，图5C表示化合物6与SCD1的相互作用，图5D表示化合物6和SCD1之间相互作用的二维视图。图5A、5B所示，化合物6与AMPK对接时与残基Asn-144、Asp-157和Met-93形成常规氢键，与残基Ala-156、Ala-43、Leu-146和Val-30形成烷基。此外，图5C、5D所示，化合物6与SCD1对接时，与残基Asn-144形成常规氢键，与残基Phe-233、Phe-142、Try-250、Leu-78、Leu-74、Met-75、Leu-181和Leu-254形成pi-alkyl或烷基。
上述实施例所涉及的数据统计与分析方法如下：所有的数据以“平均值±标准差”(MEAN±SE)表示，选用Sigma plot 12.5统计软件对数据进行处理，多组间比较分析采用单因素方差分析(one-way anova-student’s t-test)。当P<0.05时，组间存在差异，P<0.01时，组间差异显著，P<0.001时，组间差异极显著。
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和应用本发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于这里的实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.如式Ⅰ所示的化合物在制备预防/和治疗脂肪蓄积症制剂中的应用。
Figure FDA0002366672540000011
2.用于预防/和治疗脂肪蓄积症的药物组合物，其特征在于，该药物组合物由权利要求1所述的式Ⅰ所示化合物和药学上可接受的辅料组成。
3.根据权利要求2所述的药物组合物，其特征在于，所述药学上可接受的辅料选自稀释剂、粘合剂、崩解剂、表面活性剂、包衣材料、胶囊材料和成膜材料中的至少一种。
4.根据权利要求2或3所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物为颗粒剂、丸剂、胶囊剂、片剂、口服液体制剂或冻干粉制剂。
5.如式Ⅰ所示的化合物在抑制脂肪蓄积的饮食品中的应用。
Figure FDA0002366672540000012
6.如权利要求1所述的式Ⅰ所示化合物的制备方法，包括如下步骤：
(1)将粘委陵菜的水提取物，采用D101型大孔吸附树脂进行分离，在分离过程中，依次用水、25％乙醇、50％乙醇、75％乙醇、95％乙醇作为洗脱液，进行梯度洗脱，每一梯度均洗脱至洗脱液无色为止，将各梯度的洗脱液减压浓缩并干燥，得水洗脱浸膏、25％乙醇洗脱浸膏、50％乙醇洗脱浸膏、75％乙醇洗脱浸膏以及95％乙醇洗脱浸膏；
(2)对95％乙醇洗脱浸膏用正相硅胶柱层析进行分离，在分离过程中，依次用体积比为20:1、10:1、5:1、3:1的石油醚-乙酸乙酯系统和体积比为20:1、10:1、5:1、100％甲醇的二氯甲烷-甲醇系统作为流动相，进行梯度洗脱，根据薄层层析结果，合并相同馏分，得到23个馏分，即馏分1～23；
(3)对馏分14用反相硅胶柱层析进行分离，在分离过程中，依次用体积比为1:1、3:2、2:1、5:2、3:1、100％甲醇的甲醇-水系统作为流动相，进行梯度洗脱，根据薄层层析结果，合并相同馏分，得到18个馏分14-1～18；
(4)对馏分14-2用HPLC进行分离纯化，依次用体积比为2:3、1:1、2:1、100％甲醇的甲醇-水系统作为流动相，进行梯度洗脱，根据薄层层析结果，得到式Ⅰ所示化合物。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述的粘委陵菜为干燥或新鲜采集的粘委陵菜的地上部分或根。
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