CN113666804A - 一种具有抗抑郁活性酵素化天麻提取物及其制备和应用 - Google Patents

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CN113666804A CN202111022906.XA CN202111022906A CN113666804A CN 113666804 A CN113666804 A CN 113666804A CN 202111022906 A CN202111022906 A CN 202111022906A CN 113666804 A CN113666804 A CN 113666804A
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Abstract

本发明涉及一种具有抗抑郁活性酵素化天麻提取物及其制备和应用，酵素化天麻通过将新鲜天麻洗净打浆，溶化，发酵等工艺制备而成。本发明通过对运用薄层色谱、柱色谱等手段进一步对酵素化天麻分离纯化，得到了化合物4，4'‑Dihydroxyd iphenyl methane(1)、bungeinA(2)、2‑diol(3)等14个化合物，药理学实验研究表明化合物1、2和3对NMDA诱导的PC‑12细胞损伤具有保护活力，提示经微生物发酵后所得酵素化天麻中化合物1及新出现的化合物2，3是其抗抑郁作用的有效功能物质。为后期新型抗抑郁药物的研究提供科学依据和技术支撑。

Description

一种具有抗抑郁活性酵素化天麻提取物及其制备和应用
技术领域
本发明属于天然药物化学领域，具体涉及一种具有抗抑郁活性酵素化天麻提取物及其制备和应用。
背景技术
天麻(Gastrodia elata Bl.)，兰科天麻属多年生草本植物天麻的干燥块茎，是我国常见且较为名贵的传统中药材，最初记录在《神农本草经》。其性平、味甘，具有息风止痉、平肝潜阳、祛风通络的功效；临床上广泛用于治疗头痛、癫痫、头晕、风湿病、神经痛、抽筋、高血压等神经性疾病的治疗[1-3]。其主要化学成分包含有酚类、有机酸类、甾体类及多糖类以及人体必须的氨基酸、多肽类和微量元素[4-5]。药理学研究表明天麻提取物或单体成分在抗氧化、镇痛、抗抑郁、益智、抗焦虑以及对中枢神经系统和心血管系统方面的保护和治疗具有一定的作用[6-7]。研究证实发现天麻提取物对于脑缺血引起的神经细胞损伤、皮质神经元损伤、PC12神经细胞损伤等具有明显的保护作用及抗抑郁作用[8-10]。
微生物发酵是一种比较古老的生产方法，在人类文明的发展过程起到至关重要的作用，被认为是最有价值的技术之一[11]。中药现代发酵技术以中医药理论为基础，继承传统中药炮制的方法，结合现代微生态学、生物工程、发酵工程技术等学科发展起来的一种新型中药制药技术。现代中药发酵是中药与现代生物技术的完美结合，在中药的现代化发展中发挥着越来越重要的作用。
韩春超教授团队等通过探讨苦参发酵前后的抗炎作用证明了发酵能够增强苦参的抗炎作用[12]。前期梁建东团队公布了一种抗抑郁天麻发酵提取物的制备方法和应用，其方法是通过蛹虫草发酵天麻得到其提取物，具体如下：取土豆200g，煮汁去渣后加入可溶性淀粉20g、蛋白胨1g、天麻40g，水定容至1000ml，依此比例进行配置，装入500ml三角瓶，每瓶200ml，121℃灭菌30min后冷却备用；在摇床上，温度25℃，200r/min条件下培养12天，得发酵产物；取全部发酵产物，加入等量的水，煮开后接着煮30min，过滤后，再加入水煮30min，共提取3次，将获得的滤液减压浓缩成固体物质，即得天麻发酵提取物；研究结果证实其有明显的抗抑郁作用[13]。但是其团队未对天麻发酵提取物做进一步分析，其中的功效物质不明确。
贵州省地处中国西南内陆地区腹地，得益于自然条件的得天独后塑造出多个知名中国酱香白酒品牌；酿酒的过程自然少不了特有酒曲的参与，酒曲顾名思义亦指混合微生物，其在与粮食混合发酵过程中可以转化粮食中的功效组分于更易于人体吸收的小分子物质。故本实验通过运用贵州商业酒曲(混合微生物)对新鲜天麻进行发酵，对所得的酵素化天麻进行小鼠体内及体外细胞抗抑郁实验；并挖掘出其抗抑郁功效物质，为后期新型抗抑郁药物的研制提供技术支撑。
本发明通过对运用薄层色谱、柱色谱等手段进一步对酵素化天麻分离纯化，得到了化合物4，4'-Dihydroxyd iphenyl methane(1)、bungeinA(2)、2-diol(3)等14个化合物，药理学实验研究表明化合物1、2和3对NMDA诱导的PC-12细胞损伤具有保护活力，提示经微生物发酵后所得酵素化天麻中化合物1及新出现的化合物2，3是其抗抑郁作用的有效功能物质。为后期新型抗抑郁药物的研究提供科学依据和技术支撑。
发明内容
本发明的目的是提供一种具有抗抑郁活性酵素化天麻提取物。
本发明的另一目的是提供一种具有抗抑郁活性酵素化天麻提取物的提取方法。
本发明的另一目的是提供一种酵素化天麻制备方法。
本发明的另一目的是提供一种酵素化天麻及其提取物或组合物在制备抗抑郁药物中的应用。
本发明所述的一种具有抗抑郁活性酵素化天麻提取物为：4，4'-Dihydroxydiphenyl methane(1)、bungeinA(2)、2-diol(3)，其化学结构式为：
1)4，4'-Dihydroxyd iphenyl methane(1)
Figure BDA0003242227140000021
2)bungeinA(2)
Figure BDA0003242227140000031
3)2-diol(3)
Figure BDA0003242227140000032
本发明所述酵素化天麻制备方法为：新鲜天麻洗净打浆，装入发酵坛内按照其重量1：10加入沸水搅拌熟化，按其总重量的5-15％添加白糖，搅拌使白糖完全溶化；待温度降至30-40℃时，按其总重量的0.01-0.03％和0.02-0.05％分别添加纤维素酶、酵素发酵剂(高效酒曲、酵母等)；采用保鲜膜密封发酵坛无氧条件下发酵8-12天后，去掉保鲜膜换成纱布进行有氧发酵到25-35天，完成酵素化天麻制备。
优选的，本发明所述酵素化天麻制备方法为：新鲜天麻洗净打浆，装入发酵坛内按照其重量1：10加入沸水搅拌熟化，按其总重量的10％添加白糖，搅拌使白糖完全溶化；待温度降至30-40℃时，按其总重量的0.02％和0.03％分别添加纤维素酶、酵素发酵剂(高效酒曲、酵母等)；采用保鲜膜密封发酵坛无氧条件下发酵10天后，去掉保鲜膜换成纱布进行有氧发酵到30天，完成酵素化天麻制备。
本发明所述的酵素化天麻提取物的提取方法为：酵素化天麻80L经过D-101型大孔树脂洗脱，得到水、95％乙醇和乙酸乙酯三个流份；将水部分用MCI洗脱，得到水和90％乙醇两个流份；合并90％和95％乙醇部分，得浸膏250g，硅胶柱层析洗脱分离，得4部分A～D。
B部分用石油醚：醋酸乙酯＝10∶1→1∶1洗脱，得12.1mg化合物1；C部分用二氯甲烷：甲醇＝20∶1→5∶1梯度洗脱，得到16.0mg化合物2、33.0mg化合物3。A和D部分分离得到化合物4-14。
本发明所述酵素化天麻和其提取物可以直接或者以药物组合物的形式使用。
本发明所述的酵素化天麻及其提取物或组合物在制备抗抑郁药物中的应用。
本发明所述药物组合物含有0.1-99.0％的酵素化天麻及提取物，其余为药用载体或赋形剂。
优选的，本发明所述药物组合物含有70％的酵素化天麻及提取物，其余为药用载体或赋形剂。
本发明所述的药用载体或赋形剂是一种或多种固体、半固体和液体稀释剂、填料以及药物制品辅剂。
本发明所述的药物组合物的剂型有：冻干粉，片剂、胶囊剂、颗粒剂、口服液、注射剂、乳剂。
有益效果：
本发明与现有技术相比，具有以下有益效果：
1、现有技术存在的问题：现有技术未对天麻发酵提取物做进一步分析，其中的功效物质不明确，不能更好的在制备抗抑郁药物中应用。
2、本发明有益效果：本发明依靠微生物发酵技术对天麻处理后所获得的酵素化天麻对CUMS抑郁模型小鼠具有明显的抑制其抑郁状态效果，对抑郁症患者具有治疗作用；并且提取物1、2(首次发现分离)和3(新化合物)对NMDA诱导的PC-12细胞损伤具有保护活力。由此说明经微生物发酵后所产生的首次发现分离化合物2、新化合物3和已知化合物1是此酵素化天麻的功效物质，并可在制备抗抑郁药物中应用，且可为后期研制抗抑郁药物提供技术支撑。将该酵素化天麻和提取物开发成抗抑郁的药物，具有重要的应用前景。
附图说明
图1 1H NMR data of compound 1(600MHz,CD3OD)
图2 13C NMR data of compound 1(150MHz,CD3OD)
图3 1H NMR data of compound 2(600MHz,CD3OD)
图4 13C NMR data of compound 2(150MHz,CD3OD)
图5 1H NMR data of compound 3(600MHz,CD3OD)
图6 13C NMR data of compound 3(150MHz,CD3OD)
图7 1H-13C HSQC NMR data of compound 3(600MHz,CD3OD)
图8 1H-13C HMBC NMR data of compound 3(600MHz,CD3OD)
图9 13C DEPT NMR data of compound 3(150MHz,CD3OD)
图10化合物3的HR-ESI-MS谱
图11化合物3的IR谱图
图12各组小鼠糖水偏好度的比较(*P＜0.05；**P＜0.01)
图13各组小鼠矿场实验结果(*P＜0.05)
图14各组小鼠悬尾不动时间结果(*P＜0.05；***P＜0.001)
图15各组小鼠海马CA1区神经元细胞染色(HE染色，×20)
注：C：空白组；M：模型组；A：阿米替林组；GEF+400：酵素化天麻低剂量组；GEF+800：酵素化天麻中剂量组；GEF+1200：酵素化天麻高剂量组。
图16各组小鼠海马CA1区神经元细胞染色(尼氏染色，×20)
图17酵素化天麻对小鼠海马CA1区域NMDAR1的蛋白表达情况(×200)
图18酵素化天麻对小鼠海马CA3区域NMDAR1的蛋白表达情况(×200)
图19酵素化天麻对小鼠前额叶区域NMDAR1的蛋白表达情况(×200)
图20各组小鼠血清中钙含量(**P＜0.01，***P＜0.001)
图21各组小鼠血清中MAO活力(*P＜0.05，**P＜0.01)
图22小鼠脑组织中5-HT浓度(*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001)
图23小鼠脑组织中DA浓度(*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001)
图24小鼠海马BDNF、NMDAR1、NMDAR2A及NMDAR2B蛋白表达水平注：C：空白组；M：模型组；A：阿米替林组；GEF+400：酵素化天麻低剂量组；GEF+800：酵素化天麻中剂量组；GEF+1200：酵素化天麻高剂量组
图25提取物对NDMDA诱导的PC-12细胞损伤保护活力(*P＜0.05，**P＜0.01).注：TM：天麻甲醇提取物；FJTM：酵素化天麻
具体实施方式
下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步地具体说明。
实施例1酵素化天麻提取物化学结构式
4，4'-Dihydroxyd iphenyl methane(1)、bungeinA(2)、2-diol(3)，其化学结构式为：
1)4，4'-Dihydroxyd iphenyl methane(1)
Figure BDA0003242227140000051
2)bungeinA(2)
Figure BDA0003242227140000061
3)2-diol(3)
Figure BDA0003242227140000062
实施例2酵素化天麻制备方法
新鲜天麻洗净打浆，装入发酵坛内按照其重量1：10加入沸水搅拌熟化，按其总重量的5％添加白糖，搅拌使白糖完全溶化；待温度降至30-40℃时，按其总重量的0.01％和0.02％分别添加纤维素酶、酵素发酵剂(高效酒曲、酵母等)；采用保鲜膜密封发酵坛无氧条件下发酵8-12天后，去掉保鲜膜换成纱布进行有氧发酵到25-35天，完成酵素化天麻制备。
实施例3酵素化天麻制备方法
新鲜天麻洗净打浆，装入发酵坛内按照其重量1：10加入沸水搅拌熟化，按其总重量的15％添加白糖，搅拌使白糖完全溶化；待温度降至30-40℃时，按其总重量的0.03％和0.05％分别添加纤维素酶、酵素发酵剂(高效酒曲、酵母等)；采用保鲜膜密封发酵坛无氧条件下发酵8-12天后，去掉保鲜膜换成纱布进行有氧发酵到25-35天，完成酵素化天麻制备。
实施例4酵素化天麻制备方法
新鲜天麻洗净打浆，装入发酵坛内按照其重量1：10加入沸水搅拌熟化，按其总重量的10％添加白糖，搅拌使白糖完全溶化；待温度降至30-40℃时，按其总重量的0.02％和0.03％分别添加纤维素酶、酵素发酵剂(高效酒曲、酵母等)；采用保鲜膜密封发酵坛无氧条件下发酵10天后，去掉保鲜膜换成纱布进行有氧发酵到30天，完成酵素化天麻制备。
实施例5酵素化天麻提取物的提取方法
酵素化天麻80L经过D-101型大孔树脂洗脱，得到水、95％乙醇和乙酸乙酯三个流份；将水部分用MCI洗脱，得到水和90％乙醇两个流份；合并90％和95％乙醇部分，得浸膏250g，硅胶柱层析洗脱分离，得4部分A～D。
B部分用石油醚：醋酸乙酯＝10∶1→1∶1洗脱，得12.1mg化合物1；C部分用二氯甲烷：甲醇＝20∶1→5∶1梯度洗脱，得到16.0mg化合物2、33.0mg化合物3。
实施例6酵素化天麻冻干粉的制备：
称取一定量的酵素化天麻于低温冷冻干燥专用圆底烧瓶中，放入-80℃冰箱冻存至凝固；用低温冷冻干燥机干燥至粉末状态为止。
实施例7酵素化天麻片剂：
酵素化天麻冻干粉20mg，乳糖160mg，淀粉60mg，硬脂酸镁20mg；
制备方法：将酵素化天麻冻干粉、乳糖和淀粉混合，用水均匀湿润，把湿润的混合物过筛并干燥，再过筛，加入硬脂酸镁，然后将混合物压片，每片重260mg，酵素化天麻冻干粉含量为20mg。
实施例8
将化合物4，4'-Dihydroxyd iphenyl methane(1)、bungeinA(2)、2-diol(3)任一种作为原料药，加入7倍量的淀粉，混匀，装入胶囊，得胶囊剂。
实施例9
将化合物4，4'-Dihydroxyd iphenyl methane(1)、bungeinA(2)、2-diol(3)任一种作为原料药，加入6倍量的淀粉，混匀，干燥，制成丸剂。
实施例10
将化合物4，4'-Dihydroxyd iphenyl methane(1)、bungeinA(2)、2-diol(3)任一种作为原料药，加入18倍量的注射用水，静置60分钟，过滤，灭菌，得注射剂。
实施例11
将化合物4，4'-Dihydroxyd iphenyl methane(1)、bungeinA(2)、2-diol(3)任一种作为原料药，加入22倍量纯净水，混合均匀，过滤，灭菌，得口服液。
实施例12
将化合物4，4'-Dihydroxyd iphenyl methane(1)、bungeinA(2)、2-diol(3)任一种作为原料药，加入48％微晶纤维素、50％可压性淀粉、1％硬脂酸镁、1％滑石粉，按常规方法制备成乳剂。
实施例13
以上实施例所述的酵素化天麻及其提取物或组合物应用于抗抑郁药物的制备。
实施例14化合物1,2,3结构解析及理化性质
化合物1：白色结晶；易溶于甲醇。ESI-MS m/z：200.0[M+Na]+。1H NMR(600MHz,CD3OD)在δH 6.93(d,4H,J＝8.4Hz,H-2,6,2',6'),6.65(4H,d,J＝8.5Hz,H-3,5,3',5'),3.71(2H,s,CH2)；13C NMR(151MHz,CD3OD)在δC 156.28(C-4,4'),134.31(C-1,1'),130.69(C-3,5,3',5'),116.08(C-2,6,2',6'),41.05(C-α)，经与文献[14]报道比对，其化学位移一致，鉴定为4，4'-Dihydroxydiphenyl methane。谱图见图1、图2。
化合物2：白色结晶；易溶于甲醇。ESI-MS m/z：274.0[M+Na]+。1H NMR(600MHz,CD3OD)在δH 7.01(4H,dd,J＝8.5Hz,H-3,5,3',5'),6.73(4H,dd,J＝8.5Hz,H-2,6,2',6'),3.67(4H,t,J＝7.2Hz,H-β，β'),2.70(4H,t,J＝7.2Hz,H-α,α')；13C NMR(150MHz,CD3OD)在δC156.68(C-1,1'),131.00(C-4,4'),130.86(C-3,5,3',5'),116.11(C-2,6,2',6'),64.56(C-β,β'),39.35(C-α,α')。经与文献[15]报道比对，其化学位移一致，鉴定为bungeinA。谱图见图3、图4。
化合物3：无色油状物，易溶于甲醇。HR-ESI-MS m/z：198.0783[M+Na]+，结合分析1D-NMR 数据，确定其分子式为C10H14O4，不饱和度为3。IR(溴化钾压片)显示含羟基(3367.63cm-1)、苯环(1614.47cm-1,1515.97cm-1)等官能团。13C-NMR谱显示有8个碳信号；DEPT谱显示，3个亚甲基信号[δC 74.21(C-7),72.30(C-8),64.61(C-10)]和1个次甲基信号[δC 72.26(C-9)]。根据1H-NMR谱判断，在相对低场区域有1组比较明显的1,4-二取代的苯环信号[δH 7.16(d,J＝8.5Hz,2H,H-2,6)，6.75(d,J＝8.5Hz,2H,H-3,5)。在HMBC谱中，H-2/6(δH 7.16)与C-7(δC 74.21)相关，H-7(δH 4.42)与C-1(δC 130.33)、C-2/6(δC 130.70)相关推断C-1与C-7相连；H-8(δH 3.42,3.56)与C-10(δC 64.61)相关，H-10(δH 3.50)与C-8(δC72.30)相关，推断C-7、C-8、C-9、C-10相连，最终经查Scifinder数据库确认该化合物为一个新化合物。谱图见图5、图6、图7、图8、图9、图10、图11。
为了分析酵素化天麻对CUMS抑郁模型小鼠有逆转其抑郁状态效果及提取物
对NMDA诱导的PC-12细胞损伤具有保护活力，采用以下实验进行验证：
一、实验方法：
1.慢性不可预见(CUMS)法建立抑郁小鼠模型
刺激方法主要有以下9种：45°鼠笼倾斜(12h)、禁食(12h)、禁水(12h)、45℃热环境(5min)、闪光刺激(5min·d-1)、电击(6次·d-1，0.9*100V 30s/次，间隔10s)、噪声(60Hz，30min·d-1)、常温水游泳(5min·d-1)、昼夜颠倒(24h)。1周9种刺激方法随机安排，但同一应激方式不连续使用，最多不使用三次。
2.动物给药
根据相关文献及预实验确定小鼠给药浓度，各组药物采用羧甲基纤维素钠水溶液进行溶解。造模3周后，空白组作为空白对照，除灌胃生理盐水外，不做其余任何处理。CUMS模型组作为阴性对照，每日给予0.1mL/10g灌服生理盐水；CUMS+阿米替林组灌服阿米替林溶液(15mg/kg)，CUMS+酵素化天麻冻干粉组灌服低剂量(400mg/kg)、中剂量(800mg/kg)、高剂量(1200mg/kg)。所有药物均以0.1mL/10g/d灌胃给药，分别在每天早上10点给药，给药时间为21天，连续不间断。给药结束当天进行糖水偏好测试正式实验，第22日进行旷场实验，第23日进行悬尾实验，行为学结束后处死小鼠。
3.行为学实验
3.1糖水偏爱实验：在灌胃第0天、7天、14天分别进行糖水测试预实验，灌胃第21天进行小鼠糖水偏好正式实验。实验具体方法如下：小鼠单笼饲养并给予1％蔗糖水48h进行适应性训练，同时，为了避免小鼠对饮水位置的偏爱，糖水瓶的位置每天进行交换一次。正式测试时，先对小鼠剥夺饮水24小时，然后在鼠笼上同时给予两瓶饮水，其中一瓶为150ml自来水，一瓶为150ml的1％蔗糖水，2h后交换两瓶水的位置，24h后计算小鼠的糖水偏好百分比。蔗糖偏爱百分比(％)＝蔗糖溶液摄入量/(蔗糖溶液摄入量+总摄入量)×100％。
3.2旷场实验：在连续给药的第22日于灌胃结束后进行旷场实验，实验装置由四个长为40cm的黑色方笼组成。实验具体方法如下：实验开始之前，将老鼠放置于旷场装置箱子内，待小鼠适应十几秒钟后，用摄像机记录其运动轨迹，时间为3min。结果以小鼠运动的总路程作为指标进行计算。每次测量后，用低浓度酒精擦拭干净，以防止干扰素残留气味。
3.3悬尾试验：于旷场实验结束后一天进行悬尾实验，实验装置背景为长40cm，宽40cm，高60cm的黑色箱子。实验具体方法如下：实验开始前，将小鼠尾巴用夹子固定起来悬挂在实验架上，呈倒立状态，刚开始小鼠会因悬挂的不适应呈挣扎状态，一段时间后放弃挣扎，呈静止状态。待小鼠适应十几秒钟后，通过摄像机记录小鼠在整个过程中的不动时间，实验持续3min。结果以小鼠的不动时间作为指标进行计算。不动时间为小鼠被悬挂后停止挣扎，完全不动的时间。
4.海马病理形态及生化指标检测
4.1脑组织及血清样本制备
行为学结束后，小鼠进行眼眶取血，离心取上清液置于-80℃冰箱冷冻保存备用。然后断头取脑，开颅取出脑组织，每组取3只全脑进行病理切片，用4％水合氯醛固定24小时，在4℃的PBS中加入30％蔗糖溶液孵育2天。其余进行试剂盒检测以及Western Blot实验，所有样品保存在-80℃冰箱备用。
4.2小鼠海马组织HE及尼氏染色
将保存的全脑制成含有完整海马组织的石蜡切片，将石蜡切片用二甲苯溶液脱蜡，梯度程序为：清洗液Ⅰ10min，清洗液Ⅱ10min，清洗液Ⅲ10min；梯度酒精脱蜡水化：100％乙醇脱水15min，95％乙醇脱水5min，80％乙醇脱水5min，双蒸水冲洗2次，5min/次，苏木素染色6min，纯净水冲洗干净，分化液分化30s，纯净水返蓝10min；伊红染色2min，纯净水冲洗10min，乙醇脱水，二甲苯透明，封片，显微镜下观察。同时将石蜡切片用二甲苯溶液和梯度酒精脱蜡水化后，按照尼氏染色步骤进行染色后，乙醇脱水，二甲苯透明，封片，显微镜下观察。
4.3免疫组织化学检测海马及前额叶区域NMDAR1蛋白表达
取出石蜡切片65℃烤1h，置于二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ工作液脱蜡各10min，100％乙醇中洗涤15min，95％乙醇5min，80％乙醇5min，自来水洗涤5min；200mL抗原修复液于微波炉中高火5min，放入玻片，低火20min后室温冷却；PBS溶液清洗3次，每次3min；擦干水，滴加内源性过氧化物酶，室温孵育10min；PBS溶液清洗3次，每次3min；5％牛血清蛋白封闭1h，倾斜掉，勿洗；加入一抗，一抗为抗NMDAR1抗体，37℃水浴1h，4℃孵育过夜。第二天从4℃冰箱取出玻片，PBS溶液清洗3次，每次3min；擦干水，加入二抗，室温孵育15min；PBS溶液清洗3次，每次3min；DAB室温反应6min，PBS溶液清洗3次，每次3min；加入苏木素3-4min，自来水清洗，盐酸酒精分化1～3s，自来水清洗，PBS返蓝2h以上；95％乙醇洗涤10min，二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ工作液各5min，晾干，封片，显微镜采图。
4.4钙含量以及MAO活力检测
取出-80℃下保存的血清，根据钙测试盒说明书将去离子水、1mmol/L钙标准液、待测血清样本以及工作液Ⅰ加入到96孔板中，混匀，静置5min，波长610nm，酶标仪比色，测定各孔吸光度(OD)值；根据说明书给定公式对血清中钙含量进行计算。
根据MAO测试盒说明书将双蒸水、待测血清样本、试剂一及试剂二加入试管中，混匀，37℃水浴3h，加入试剂三及试剂四，混匀，连续抽提2min，3500转/分，离心10min，取上清液，紫外分光光度计，测吸光度值。根据公式计算血清中MAO活力：MAO活力(∪/mL)＝测定管吸光度/0.01/3h/取样量(mL)；每1mL血清在37℃，1小时内产生0.01个光密度为1个活力单位(∪)。
4.5ELISA试剂盒检测5-HT的含量
取100mg小鼠的大脑组织，装入新的2mL EP管内，加入1mL 1×PBS溶液，使用匀浆机制成匀浆，放置于-20℃冰箱过夜。经过反复冻融2次处理，以破坏细胞膜为目的，将组织匀浆于2-8℃5000rpm离心5min，取上清液。
根据试剂盒说明书，将所有试剂从冰箱取出，放置室温环境下，平衡半小时以上，按照说明书指导步骤将试剂按顺序加入96孔板内，置于37℃培养箱，温育40min；反应结束后，采用手工模式进行洗板，每孔加入200μL洗涤液，浸泡2min，洗5次。洗板结束进行显色程序，避光状态显色20min，时间结束立即加入终止溶液终止所有反应。5min内检测样本吸光度值，检测波长为450nm。
4.6ELISA试剂盒检测DA的含量
取100mg小鼠的大脑组织，装入新的2mL EP管内，加入1mL 1×PBS溶液，制成匀浆，放置于-20℃冰箱过夜。经过反复冻融2次处理，以破坏细胞膜为目的，将组织匀浆于2-8℃5000rpm离心5min，取上清液。
根据试剂盒说明书，将所有试剂从冰箱取出，放置室温环境下，平衡半小时以上，按照说明书指导步骤将试剂按顺序加入96孔板内，置于37℃培养箱，温育60min；反应结束后，采用手工模式进行洗板，每孔加入200μL洗涤液，浸泡2min，洗5次。洗板结束进行显色程序，避光状态显色15min，时间结束立即加入终止溶液终止所有反应。5min内检测样本吸光度值，检测波长为450nm。
4.7Western Blot
将待测脑组织块称取100mg于1.5mL新的EP管中，用剪刀将组织块尽量剪碎，加入1mL RIPA裂解液(含PMSF)[RIPA裂解液：PMSF＝100：1]匀浆捣碎组织后，在冰上静置30min后，于离心机中4℃，12000rpm，离心5min。取蛋白上清液于新的1.5mL EP管内，保存，备用。将蛋白标准品BSA5 mg/mL加0.9％NaCl稀释成0.5mg/mL的蛋白标准溶液，-20℃保存，备用。
根据BCA蛋白浓度测定试剂盒说明书，按样品个数计算好BCA检测试剂的用量，将BCA试剂盒中A液和B液按49:1配制好BCA工作液；将标准品按0，5，10，20，40，60，80，100μL加到0.5mL EP管中，加0.9％NaCl补足100μL。在96孔板中加入蛋白标准品和稀释后的样本各孔20μL，加入BCA工作液各孔200μL，置于37℃烘箱中，反应30min，用酶标仪检测各样品吸光度值，波长570nm，绘制标准曲线，通过标准曲线计算待测蛋白浓度。
5.提取物对NMDA诱导的PC-12细胞损伤保护活力检测：
取对数生长期的PC12细胞,以5×105/mL的密度接种于96孔板中，每孔100μL，于5％CO2培养箱中孵育48h后，分为对照组、模型组、损伤加药处理组，每组5个复孔。对照组和模型组只加DMEM培养基，损伤加药处理组加入浓度为20μM的TM(天麻甲醇提取物)、FJTM(酵素化天麻)、化合物1、2、3，各组放培养箱继续培养24h。24h后，模型组和损伤加药处理组加入20mM NMDA，放培养箱继续培养6h。6h后，加入MTT孵育4h，MTT法检测细胞存活率。利用酶标仪在490nm出测定各组细胞吸光值。计算公式为：细胞存活率＝处理组/正常细胞组)×100％。
二、试验结果
1.糖水偏爱实验：
实验结果如图12所示，与空白对照组比较，模型组小鼠糖水的摄入量明显减少(P＜0.01)，差异有统计学意义；与模型组小鼠相比，酵素化天麻给药组提高小鼠对糖水的摄入(P＜0.01)，说明酵素化天麻能改善小鼠的快感缺乏，缓解抑郁状态。酵素化天麻组的糖水偏爱数与阿米替林相当(P＜0.01)，说明酵素化天麻能达到与阿米替林相似的抗抑郁作用效果，差异有统计学意义。
2.旷场实验：
通过统计每组小鼠在旷场实验中运动的总路程，结果如图13所示，结果表明，在旷场实验过程中，模型组小鼠运动的总路程相比空白组小鼠，明显减少，存在显著差异(P＜0.05)，说明慢性应激可以引起小鼠的行为绝望，产生抑郁症状；经过21天给药后，与模型组相比，酵素化天麻各剂量给药组小鼠运动的总路程显著增加(P＜0.05)，说明酵素化天麻能改善抑郁症状引起的行为绝望，具有抗抑郁作用。
3.悬尾实验：
通过统计每组小鼠实验过程中的不动时间，结果见图14，结果表明，与空白组比较，模型组小鼠悬尾实验的不动时间都有显著增加(P＜0.001)；经过21天给药后，与模型组比较，酵素化天麻高剂量在悬尾实验中的不动时间显著降低(P＜0.001)，说明酵素化天麻能够改善慢性应激引起的行为绝望，缓解抑郁症状。
4.小鼠海马组织HE染色：
通过HE染色观察小鼠海马CA1区神经细胞的状态，凋亡细胞会被染成紫红色。染色如图15所示，光学显微镜下发现空白对照组小鼠海马CA1区域神经元数量多且排列整齐，基质丰富，细胞保持有原有的生长形态，细胞核完整，染色均匀；而模型组海马CA1区域出现大量神经炎症细胞，神经元细胞减少且排列疏松，细胞间隙增大，细胞核固缩，被染成紫红色，存在大量细胞凋亡；阳性药组及酵素化天麻各剂量给药组通过药物干预治疗后，细胞损伤状态与模型组对比明显改善，可见细胞核完整，细胞恢复原有生长状态。结果表明酵素化天麻对慢性应激诱导的抑郁小鼠海马中神经细胞的损伤具有保护作用，能够促进细胞的正常生长。
5.小鼠海马组织尼氏染色：
通过尼氏染色法观察小鼠海马CA1区神经元及尼氏小体的情况，图片中染成蓝色的细小颗粒即为尼氏小体。结果如图16所示，空白组小鼠尼氏染色海马神经元呈颗粒状，排列紧密、整齐，存在较少凋亡的神经元细胞；相对空白组而言，观察模型组小鼠尼氏染色发现，海马神经元分散稀疏、排列散乱、凋亡神经元细胞数较多，存活细胞数显著减少染色颜色明显加深，尼氏体大量流失(P＜0.001)；阳性药及酵素化天麻各剂量给药组小鼠海马神经元排列尚整齐，凋亡神经元细胞数较少，尼氏小体数量增加(P＜0.001)；表明酵素化天麻对小鼠海马神经元具有保护作用。
6.小鼠海马CA1区域神经细胞NMDAR1的蛋白表达
本研究采用免疫组织化学方法观察发酵天麻对抑郁小鼠海马CA1区域NMDAR1蛋白表达的影响。结果如图17所示，NMDAR1在神经元细胞膜上表达，阳性表达细胞为棕色或深棕色颗粒沉淀的细胞。与空白对照组相比，模型组小鼠海马CA1区域的NMDAR1的表达显著增多，阳性细胞积分光密度增加(P＜0.001)；与模型组相比，阿米替林组、酵素化天麻各剂量给药组小鼠海马CA1区域的NMDAR1的表达显著减少，阳性细胞积分光密度减少(P＜0.001)；与阿米替林组相比，酵素化天麻各剂量给药组小鼠海马CA1区域的NMDAR1的蛋白表达相当，说明酵素化天麻显示出与阿米替林相当的作用效果。
7.小鼠海马CA3区域神经细胞NMDAR1的蛋白表达
本研究采用免疫组织化学方法观察发酵天麻对抑郁小鼠海马CA3区域NMDAR1蛋白表达的影响。结果如图18所示，NMDAR1在神经元细胞膜上表达，阳性表达细胞为棕色或深棕色颗粒沉淀的细胞。与空白对照组相比，模型组小鼠海马CA3区域的NMDAR1的表达显著增多，阳性细胞积分光密度增加(P＜0.001)；与模型组相比，阿米替林组、酵素化天麻各剂量给药组小鼠海马CA3区域的NMDAR1的表达显著减少，阳性细胞积分光密度减少(P＜0.001)；与阿米替林组相比，酵素化天麻各剂量给药组小鼠海马CA3区域的NMDAR1的蛋白表达相当，说明酵素化天麻显示出与阿米替林相当的作用效果。
8.小鼠前额叶区域神经细胞NMDAR1的蛋白表达
本研究采用免疫组织化学方法观察酵素化天麻对抑郁小鼠海马前额叶区域NMDAR1蛋白表达的影响。结果如图19所示：与空白对照组相比，模型组小鼠海马前额叶区域的NMDAR1的表达显著增多，阳性细胞积分光密度增加(P＜0.001)；与模型组相比，阿米替林组、酵素化天麻各剂量给药组小鼠前额叶区域的NMDAR1的表达显著减少，阳性细胞积分光密度减少(P＜0.001)；与阿米替林组相比，酵素化天麻各剂量给药组小鼠前额叶区域的NMDAR1的的蛋白表达相当，说明酵素化天麻显示出与阿米替林相当的作用效果。
9.小鼠血清中钙含量
本研究通过钙测试盒检测小鼠血清中钙含量，结果如图20所示，与空白对照组相比，模型组小鼠血清中钙含量明显增加，结果具有显著性差异(P＜0.01)，说明慢性应激可以导致小鼠血清中钙含量增加；与模型组相比，阿米替林组、酵素化天麻各剂量给药组小鼠血清中钙含量显著减少(P＜0.01)；与阿米替林组相比，酵素化天麻高剂量组表现出更为显著差异(P＜0.01)，说明酵素化天麻能够逆转抑郁引起的小鼠血清中钙含量增加。
10.小鼠血清中MAO活力
本研究通过MAO测试盒检测小鼠血清中MAO活力，结果如图21所示，与空白对照组相比，模型组小鼠血清中MAO活力明显增加，结果具有显著性差异(P＜0.01)；与模型组相比，阿米替林组与酵素化天麻高剂量给药组小鼠血清中MAO活力无显著性差异(P＞0.05)；酵素化天麻中剂量和高剂量组MAO活力明显降低，实验结果具有显著性差异(P＜0.01)。
11.小鼠脑组织中5-HT和DA含量测定结果
本研究采用ELISA法检测小鼠组织中5-HT含量，结果如图22所示，与空白组比较，模型组小鼠脑组织中5-HT浓度显著降低(P＜0.05)，说明抑郁能是小鼠脑组织内5-HT含量减少；与模型组比较，阳性对照阿米替林组和酵素化天麻各给药组小鼠脑组织中5-HT含量明显增加(P＜0.05)，并且酵素化天麻组表现出比阿米替林更好的作用效果(P＜0.01，P＜0.001)，结果说明酵素化天麻可能通过增加小鼠组织内5-HT含量发挥抗抑郁作用。
本研究采用ELISA法检测小鼠组织中DA含量，结果如图23所示，空白组比较，模型组小鼠脑组织中DA浓度显著降低(P＜0.05)，说明抑郁能是小鼠脑组织内DA含量减少；与模型组比较，阳性对照阿米替林组和酵素化天麻各给药组小鼠脑组织中DA含量明显增加(P＜0.05，P＜0.01)，结果具有统计学意义，结果说明酵素化天麻可能通过增加小鼠组织内DA含量发挥抗抑郁作用。
12.小鼠海马BDNF、NMDAR1、NMDAR2A及NMDAR2B蛋白表达水平
12.1小鼠海马BDNF蛋白表达水平
结果如图24显示，与空白组相比，模型组小鼠条带颜色浅，说明模型组小鼠海马BDNF蛋白表达水平降低(P＜0.001)，结果表明抑郁会使小鼠海马内BDNF蛋白减少；与模型组相比，阿米替林组和酵素化天麻组小鼠海马条带颜色更深，BDNF水平呈现明显上调趋势(P＜0.001)，说明酵素化天麻的干预治疗能够逆转慢性应激引起的BDNF蛋白表达减少，可能通过上调海马BDNF蛋白水平发挥抗抑郁作用。
12.2小鼠海马NMDAR1蛋白表达水平
结果如图24显示，与空白组相比，模型组小鼠条带颜色深，说明模型组小鼠海马NMDAR1蛋白表达水平增高(P＜0.05)，结果表明抑郁会使小鼠海马内NMDAR1蛋白增加；与模型组相比，阿米替林组和酵素化天麻组小鼠海马条带颜色更深，NMDAR1水平呈现明显下调趋势(P＜0.05，P＜0.01)，说明酵素化天麻的干预治疗能够逆转慢性应激引起的NMDAR1蛋白表达升高，可能通过下调海马NMDAR1蛋白水平发挥抗抑郁作用。
12.3小鼠海马NMDAR2A蛋白表达水平
结果如图24显示，与空白组相比，模型组小鼠条带颜色浅，说明模型组小鼠海马NMDAR2A蛋白表达水平降低(P＜0.01)，结果表明抑郁会使小鼠海马内NMDAR2A蛋白减少；与模型组相比，阿米替林组和酵素化天麻组小鼠海马条带颜色更深，NMDAR2A水平呈现明显上调趋势(P＜0.05)，说明酵素化天麻的干预治疗能够逆转慢性应激引起的NMDAR2A蛋白表达减少，可能通过上调海马NMDAR2A蛋白水平发挥抗抑郁作用。
12.4小鼠海马NMDAR2B蛋白表达水平
结果如图24显示，与空白组相比，模型组小鼠条带颜色浅，说明模型组小鼠海马NMDAR2B蛋白表达水平降低(P＜0.01)，结果表明抑郁会使小鼠海马内NMDAR2B蛋白减少；与模型组相比，阿米替林组和酵素化天麻组小鼠海马条带颜色更深，NMDAR2B水平呈现明显上调趋势(P＜0.01，P＜0.001)，说明酵素化天麻的干预治疗能够逆转慢性应激引起的NMDAR2B蛋白表达减少，可能通过上调海马NMDAR2B蛋白水平发挥抗抑郁作用。
13.提取物对NMDA诱导的PC-12细胞损伤保护活力检测
结果如表1及图25显示，化合物1、2(首次发现分离)和3(新化合物)对NMDA诱导的PC-12细胞损伤具有保护活力。
表1各组对NMDA诱导的PC-12细胞损伤保护活力检测结果
组别 用药浓度 MTT Reduction(％)
空白组 - 100.00±1.20
模型组 NMDA(15mM) 65.07±0.46###
天麻甲醇提取物组(TM) 20mg/L 62.07±0.85
酵素化天麻组(FJTM) 20mg/L 56.15±0.59
化合物1 20μM 70.32±1.70*
化合物2 20μM 72.04±1.13**
化合物3 20μM 72.59±1.47**
注：与空白组相比，###P<0.001；与模型组相比，*P<0.05，**P<0.01.运用GraphPadPrism 6.01对实验结果进行One-Way ANOVA统计学分析。样本均数间的比较行方差分析，统计显著设定为P值，P﹤0.05为有统计学意义，P﹤0.01为有显著统计学意义，P﹤0.001为有极显著统计学意义。
结论：
酵素化天麻能改善CUMS模型小鼠的抑郁行为，对脑区神经细胞具有保护作用。通过运用薄层色谱、柱色谱等手段进一步对酵素化天麻分离纯化，得到的化合物3为新化合物，化合物2为首次从天麻中分离得到。药理学实验研究表明化合物1、2和3对NMDA诱导的PC-12细胞损伤具有保护活力，提示经微生物发酵后所得酵素化天麻中化合物1及新出现的化合物2，3是其抗抑郁作用的有效功能物质。为后期新型抗抑郁药物的研究提供科学依据和技术支撑。
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Claims (10)

1.一种具有抗抑郁活性酵素化天麻提取物，其特征在于，从酵素化天麻提取物中共分离纯化出14个单体化合物，其中具有抗抑郁活性的化合物为：4，4'-Dihydroxyd iphenylmethane(1)、bungeinA(2)、2-diol(3)，其化合物化学结构式为：
1)4，4'-Dihydroxyd iphenyl methane(1)
Figure FDA0003242227130000011
2)bungeinA(2)
Figure FDA0003242227130000012
3)2-diol(3)
Figure FDA0003242227130000013
2.根据权利要求1所述的酵素化天麻提取物，其特征在于，所述酵素化天麻制备方法为：新鲜天麻洗净打浆，装入发酵坛内按照其重量1：10加入沸水搅拌熟化，按其总重量的5-15％添加白糖，搅拌使白糖完全溶化；待温度降至30-40℃时，按其总重量的0.01-0.03％和0.02-0.05％分别添加纤维素酶、酵素发酵剂；采用保鲜膜密封发酵坛无氧条件下发酵8-12天后，去掉保鲜膜换成纱布进行有氧发酵到25-35天，完成酵素化天麻制备。
3.根据权利要求2所述的酵素化天麻提取物，其特征在于，所述酵素化天麻制备方法为：新鲜天麻洗净打浆，装入发酵坛内按照其重量1：10加入沸水搅拌熟化，按其总重量的10％添加白糖，搅拌使白糖完全溶化；待温度降至30-40℃时，按其总重量的0.02％和0.03％分别添加纤维素酶、酵素发酵剂；采用保鲜膜密封发酵坛无氧条件下发酵10天后，去掉保鲜膜换成纱布进行有氧发酵到30天，完成酵素化天麻制备。
4.根据权利要求1所述的酵素化天麻提取物的提取方法，其特征在于，所述提取方法为：酵素化天麻80L经过D-101型大孔树脂洗脱，得到水、95％乙醇和乙酸乙酯三个流份；将水部分用MCI洗脱，得到水和90％乙醇两个流份；合并90％和95％乙醇部分，得浸膏，硅胶柱层析洗脱分离，得4部分A～D。
B部分用石油醚：醋酸乙酯＝10∶1→1∶1洗脱，得化合物1；C部分用二氯甲烷：甲醇＝20∶1→5∶1梯度洗脱，得到化合物2、化合物3；A和D部分分离得到化合物4-14。
5.根据权利要求1或2或3所述的酵素化天麻提取物，其特征在于，所述酵素化天麻和其提取物可以直接或者以药物组合物的形式使用。
6.如权利要求5所述的酵素化天麻提取物，其特征在于，酵素化天麻及其提取物或组合物在制备抗抑郁药物中的应用。
7.根据权利要求6所述的酵素化天麻提取物，其特征在于，所述药物组合物含有0.1-99.0％的酵素化天麻及提取物，其余为药用载体或赋形剂。
8.根据权利要求7所述的酵素化天麻提取物，其特征在于，所述药物组合物含有70％的酵素化天麻及提取物，其余为药用载体或赋形剂。
9.根据权利要求8所述的酵素化天麻提取物，其特征在于，所述的药用载体或赋形剂是一种或多种固体、半固体和液体稀释剂、填料以及药物制品辅剂。
10.根据权利要求9所述的酵素化天麻提取物，其特征在于，所述的药物组合物的剂型有：冻干粉，片剂、胶囊剂、颗粒剂、口服液、注射剂、乳剂。
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