CN103788058B - 一种木脂素类化合物及其在防治阿尔茨海默症中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于医药技术领域，涉及木脂素类化合物，具体提供了一种由金山五味子提取的木脂素类化合物，该化合物对神经细胞具有保护作用，对阿尔茨海默症具有预防和治疗作用，可用于制备神经细胞保护剂和防治阿尔茨海默症的药物。

Description

一种木脂素类化合物及其在防治阿尔茨海默症中的应用

技术领域

本发明属于医药技术领域，涉及木脂素类化合物，具体涉及由金山五味子提取的木脂素类化合物，并涉及对神经细胞具有保护作用的药物和对阿尔茨海默症具有防治作用的药物。

背景技术

阿尔茨海默症(Alzheimer’s Disease，AD)是一种常见的神经退行性疾病，主要发生于老年人。随着社会人口的老龄化，该病的患病率呈急剧上升趋势，目前全世界已有超过2500万人罹患此症。中国现有AD患者约800万人，每年在治疗及家庭护理等方面的花费超过200亿人民币，且患病人数和治疗费用还将随着老年人口的逐年增多而增长。寻找和发现新型抗AD药物已成为全球研究的热点。

AD受累的神经元包括大脑皮层，海马以及前脑胆碱能神经元。在病理上，病人的认知功能降低伴随着神经元的死亡以及神经突触的减少，神经元肿胀，和含有Tau蛋白的神经纤维缠结。除这些细胞病理改变外，AD的典型病理改变还有细胞外淀粉样变的形成，通常淀粉样变周围包围着变性的神经纤维，并且在淀粉样变周围有激活的神经胶质细胞和星形胶质细胞，目前倾向认为淀粉样变是AD的形成原因。

淀粉样变的主要成分是含有39-43个氨基酸的短肽-Aβ(β-amyloid)。Aβ产生的关键前体物质是淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein，APP)，该蛋白有两种酶解加工途径，分别是“Aβ产生途径”和“非Aβ产生途径”。在“Aβ产生途径”中，APP首先由β分泌酶(β-scretase，BACE1)剪切生成可溶性的胞外片段β-APPs和留在质膜上的C99，C99进一步通过γ-分泌酶的作用，产生40-42个氨基酸组成的Aβ和APP胞内结构域(APP intracellular domain，AICD)。其中由42个氨基酸构成的Aβ肽(Aβ42)最容易聚合，形成寡聚体，对神经元和突触有较大毒性。Aβ42继而纤维化甚至斑块化，构成老年斑的核心成分。在“非Aβ产生途径”中，APP由α分泌酶(α-scretase，TACE)切断产生可溶性APP片段(sAPPα)和膜上片段C83。C83在γ分泌酶的作用下，生成P3和AICD，此途径并无Aβ产生。

正常情况下，Aβ的产生和降解是平衡的，Aβ主要通过“非Aβ产生途径”降解为sAPPα等对神经细胞具有保护作用的因子。而在AD发生的病理情况下，APP代谢失衡，通过“Aβ产生途径”生成大量Aβ，进一步聚集成为老年斑。由于Aβ在AD的发病进程中起着至关重要的作用，因此减少Aβ的产生或加快其清除已成为AD治疗新策略。

天然药物具有多靶点、多环节、多方式的作用机制，能够改善AD患者的症状，调理脑功能，在AD治疗和预防中，起到越来越重要的作用。许多具有抗痴呆、抗炎症、抗氧化作用的天然药物都具有治疗AD的潜力，且天然药物多经过长期临床使用，其疗效已被肯定，使用安全性较高。如人参皂苷、远志皂苷、姜黄素、白藜芦醇等已被证实具有不同程度的抗AD活性。基于天然植物药基础上的新型抗AD药物的研究和开发正显示出巨大的应用前景。

发明内容

本发明的目的在于提供一种木脂素类化合物，使其具有神经保护及防治阿尔茨海默症的作用。

本发明还提供这种木脂素类化合物的制备方法。

本发明进一步还提供了以这种木脂素类化合物为活性成分的用于神经细胞保护或防治阿兹海默症的药物。

实现本发明的技术方案是：

本发明提供的这种木脂素类化合物具有以下式(I)所示化学结构：

式(I)

其中：R₁+R₂＝CH₂，R₃＝R₄＝CH₃

或

R₁＝R₂＝CH₃，R₃+R₄＝CH₂。

在本专利申请中，将R₁+R₂＝CH₂，R₃＝R₄＝CH₃对应的式(I)化合物称为金山五味子素C；将R₁＝R₂＝CH₃，R₃+R₄＝CH₂对应的式(I)化合物称为金山五味子素D，即

金山五味子素C

金山五味子素D

式(I)化合物可从金山五味子或者其他植物中提取、分离纯化得到，也可以是经化学合成的方法制备得到。本发明提供的从金山五味子中提取式(I)化合物的方法，包括以下步骤：

步骤一：用10％-100％丙酮或10％-100％含1至4个碳原子的低级醇中的1种或1种以上的醇作溶剂提取金山五味子Schisandraglaucescens Diels.的干燥藤茎，提取液减压浓缩得浸膏；

步骤二：将所得浸膏均匀分散于水中，依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取，得到各部位萃取物；

步骤三：将所得石油醚部位萃取物经反复硅胶柱层析及反向色谱层析得到本发明提供的式(I)化合物。

上述步骤三所述的将所得石油醚部位萃取物经反复硅胶柱层析及反向色谱层析得到权利要求1所述化合物的具体方法是：取石油醚部位，经硅胶柱层析粗分，以石油醚∶乙酸乙酯的混合溶剂按体积比1∶0，19∶1，9∶1，4∶1，1.5∶1依次洗脱、洗脱液经薄层层析板TLC检测后，按薄层板上的色谱行为合并洗脱液，得若干部位。将混合溶剂石油醚∶乙酸乙酯4∶1洗脱下部位利用重结晶技术除去其中含有的大量安五酸晶体，剩余母液进行常压硅胶柱层析分离，以石油醚与丙酮的体积比在10∶1至3∶1之间的混合溶液作为洗脱剂洗脱，洗脱液经薄层层析检测后，合并硫酸乙醇显色呈天蓝色的无色油状液体。将上述无色油状液体进行反相半制备高效液相柱层析分离、以甲醇水的体积比在6∶4至9∶1之间的混合溶剂作为洗脱剂，利用UV检测并收集洗脱液，在保留时间为21.5分钟时得到一个无色油状液体，经UV、IR、NMR、MS、CD等光波谱数据分析鉴定定为一新颖的木脂素类，命名为金山五味子素C，即R₁+R₂＝CH₂，R₃＝R₄＝CH₃对应的式(I)化合物金山五味子素C；继续洗脱在保留时间为23.8分钟时得到另外一个无色油状液体，经UV、IR、NMR、MS、CD等光波谱数据分析鉴定定为另一新颖的木脂素类，命名为金山五味子素D，即R₁＝R₂＝CH₃，R₃+R₄＝CH₂对应的式(I)化合物金山五味子素D。利用上述方法所获得的金山五味子素C与金山五味子素D的质量比约在0.8-1.2之间。详细提取分离步骤见附图1。

本发明专利申请的实施例提供了从金山五味子中提取上述木脂素类化合物的具体方法实例，所得产物包括金山五味子素C和金山五味子素D。

金山五味子素C：无色油状液体，易溶于氯仿、四氢呋喃、DMSO；：-72.96°(c1.46，CH₂Cl₂)；UVλmax(CH₂Cl₂)：276nm；IR(KBr)：v_max3422.85，2963，2921，1714，1595，1513，1443，1366，1259，1158，1106，1068，1033，806，763，679cm^-1；CD(c8.65×10^-3，MeOH)[θ](nm)：-10817(220，tr)，730(240，pk)，-1415(265，tr)，-167(281，pk)，-1183(298，tr)；¹H-and¹³C-NMR(CDCl₃)见图2-3；HRESIMS：m/z409.1256[M+Na]⁺，(calcd for409.1263)。

金山五味子素D：无色油状液体，易溶于氯仿、四氢呋喃、DMSO；：-38.85°(c0.86，CH₂Cl₂)；UVλmax(CH₂Cl₂)：263，290nm；IR(KBr)：v_max3433，2922，1713，1598，1512，1446，1416，1270，1248，1221，1175，1137，1100，1037，814，764，678cm^-1；CD(c9.48×10^-3，MeOH)[θ](nm)：-5231(208，tr)，3957(234，pk)，-1864(259，tr)，697(281，pk)，-550(294，tr)；¹H-and¹³C-NMR(CDCl₃)见图4-5；HRESIMS：m/z409.1258[M+Na]⁺，(calcd for409.1263)。

本发明提出的神经细胞保护剂或防治阿兹海默症药物的组合物含有治疗有效量的金山五味子素C和金山五味子素D中的一种或两种，以及一种或多种药学上可以接受的载体。

所述药学上可接受的载体是指药学领域常规的药物载体，例如：稀释剂、赋形剂如水等，填充剂如淀粉、蔗糖等；粘合剂如纤维素衍生物、藻酸盐、明胶和聚乙烯吡咯烷酮；湿润剂如甘油；崩解剂如琼脂、碳酸钙和碳酸氢钠；吸收促进剂如季铵化合物；表面活性剂如十六烷醇；吸附载体如高岭土和皂粘土；润滑剂如滑石粉、硬脂酸钙和镁、聚乙二醇等。另外还可以在组合物中加入其它辅剂如香味剂、甜味剂等。

本发明可以以组合物的形式通过口服，鼻吸入、直肠或者肠胃外给药的方式施用于需要这种治疗的患者。用于口服时，可将其制成常规的固体制剂如片剂、粉剂、粒剂、胶囊等。制成液体制剂如水或油悬浮剂或者其它液体制剂如糖浆剂等；用于肠胃外给药时，可将其制成注射用的溶液、水或油性悬浮剂等。

本发明药物组合物的各种剂型可以按照药学领域的常规生产方法制备。例如使活性成分与一种或多种载体混合，然后将其制成所需的剂型。

附图说明

图1金山五味子素C-D提取分离流程图；

图2金山五味子素C的¹H-NMR图(用实施例1所获样品检测)；

图3金山五味子素C的¹³C-NMR图(用实施例1所获样品检测)；

图4金山五味子素D的¹H-NMR图(用实施例1所获样品检测)；

图5金山五味子素D的¹³C-NMR图(用实施例1所获样品检测)。

具体实施方式

下面的实施例可以使本专业技术人员更加全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

实施例1金山五味子素C和金山五味子素D的制备方法1

金山五味子Schisandra glaucescens Diels.的干燥藤茎10kg粉碎，70％丙酮水溶液室温浸泡4次(每次5天)，提取液合并(约30L)，减压蒸馏除去大部分丙酮后，静置过夜，滤除沉积的色素，滤液依次用石油醚、乙酸乙酯正丁醇萃取，回收溶剂后得石油醚部位180g，乙酸乙酯部位127g，正丁醇部位530g。

石油醚部位(180g)，150g硅胶拌样，1.5kg硅胶柱层析，石油醚∶乙酸乙酯(1∶0→6∶4)梯度洗脱，薄层层析检测合并相同流分，共得到10个部分。部位VII为石油醚∶乙酸乙酯(8∶2)冲下部分，浓缩合并后析出大量安五酸(2.3g)，重结晶除掉大部分安五酸后，经柱层析(石油醚∶丙酮5∶1)得金山五味子素C-D的油状混合物，再经HPLC柱层析(甲醇∶水80∶20)纯化，得金山五味子素C(21.31mg)和金山五味子素D(20.29mg)。所得金山五味子素C的¹H-NMR图见图2；所得金山五味子素C的¹³C-NMR图见图3。所得金山五味子素D的¹H-NMR图见图4；所得金山五味子素D的¹³C-NMR图见图5。

实施例2金山五味子素C和金山五味子素D的制备方法2

金山五味子Schisandra glaucescens Diels.的干燥藤茎5kg粉碎，95％乙醇溶液室温浸泡3次(每次3天)，提取液合并(约25L)，减压蒸馏除去大部分乙醇后，静置过夜，滤除沉积的色素，滤液依次用石油醚、乙酸乙酯正丁醇萃取，回收溶剂后得石油醚部位167g，乙酸乙酯部位122g，正丁醇部位300g。

石油醚部位(167g)，150g硅胶拌样，1.5kg硅胶柱层析，石油醚∶乙酸乙酯(1∶0→6∶4)梯度洗脱，薄层层析检测合并相同流分，共得到10个部分。部位VII为石油醚∶乙酸乙酯(8∶2)冲下部分，浓缩合并后析出大量安五酸(1.8g)，重结晶除掉大部分安五酸后，经柱层析(石油醚∶丙酮5∶1)得金山五味子素C-D的油状混合物，再经HPLC柱层析(甲醇∶水80∶20)纯化，得化合物金山五味子素C(20.32mg)和金山五味子素D(18.59mg)。

实施例3金山五味子素C和金山五味子素D对H₂O₂诱导的神经细胞损伤的保护作用

1.实验材料

1.1受试样品

金山五味子素C和金山五味子素D用DMSO(sigma)溶解并配置成10000μM的储备液，然后用DMEM培养基稀释成所需的浓度。

1.2细胞株

SH-SY5Y(人神经母瘤细胞)

1.3培养液

DMEM+10％NBS+双抗

1.4其他仪器材料

BioTek-Synergy2多功能酶标仪、细胞培养箱、超净工作台、96孔培养板、细胞培养瓶等。30％H₂O₂购于sigma，使用时配置成浓度为300μM，每次使用前新鲜配置。

2.实验方法

MTT法：96孔板每孔加入浓度为3～4×10⁴个/ml的细胞悬液90μL，置于37℃，5％CO₂培养箱内。细胞贴壁22h后，加入待测样品，每孔11μL，3复孔，37℃，5％CO₂作用2h。随后每孔加入11μLH₂O₂溶液(300μM)，继续培养20h。加入5mg/μL的MTT溶液，作用4h后离心，吸去上清。加入DMSO，每孔100μL，置于摇床上振摇10min，溶解后用全自动酶标仪测570nmOD值。

3.实验结果

结果见表1。

结果显示，金山五味子素C和金山五味子素D对H₂O₂诱导的SH-SY5Y神经细胞损伤具有保护作用，给药组细胞存活率与模型组存在统计学上的显著性差异。

表1金山五味子素C和金山五味子素D对H₂O₂诱导SH-SY5Y神经细胞损伤的保护作用

实施例4金山五味子素C和金山五味子素D对CoCl₂诱导的神经细胞损伤的保护作用

1.实验材料

1.1受试样品

同上

1.2细胞株

同上

1.3培养液

同上

1.4其他仪器材料

同上。CoCl₂购于sigma，使用时配置成浓度为300μM，每次使用前新鲜配置。

2.实验方法

MTT法：96孔板每孔加入浓度为3～4×10⁴个/ml的细胞悬液90μL，置于37℃，5％CO₂培养箱内。细胞贴壁22h后，加入待测样品，每孔11μL，3复孔，37℃，5％CO₂作用2h。随后每孔加入11μL CoCl₂溶液(300μM)，继续培养20h。加入5mg/μL的MTT溶液，作用4h后离心，吸去上清。加入DMSO，每孔100μL，置于摇床上振摇10min，溶解后用全自动酶标仪测570nmOD值。

3.实验结果

结果见表2。

结果显示，金山五味子素C和金山五味子素D对CoCl₂诱导的SH-SY5Y神经细胞损伤具有保护作用，给药组细胞存活率与模型组存在统计学上的显著性差异。

表2金山五味子素C和金山五味子素D对CoCl₂诱导SH-SY5Y神经细胞损伤的保护作用

实施例5金山五味子素C和金山五味子素D对Aβ_25-35诱导的神经细胞损伤的保护作用

1.实验材料

1.1受试样品

同上

1.2细胞株

同上

1.3培养液

同上

1.4其他仪器材料

同上。Aβ_25-35蛋白购于阿拉丁试剂公司，使用时配置成浓度1μM。

2.实验方法

MTT法：96孔板每孔加入浓度为3～4×10⁴个/ml的细胞悬液90μL，置于37℃，5％CO₂培养箱内。细胞贴壁22h后，加入待测样品，每孔11μL，3复孔，37℃，5％CO₂作用2h。随后每孔加入11μL Aβ_25-35溶液(1μM)，继续培养20h。加入5mg/μL的MTT溶液，作用4h后离心，吸去上清。加入DMSO，每孔100μL，置于摇床上振摇10min，溶解后用全自动酶标仪测570nmOD值。

3.实验结果

结果见表3。

结果显示，金山五味子素C和金山五味子素D对Aβ_25-35诱导的SH-SY5Y神经细胞损伤具有保护作用，给药组细胞存活率与模型组存在统计学上的显著性差异。

表3金山五味子素C-D对Aβ_25-35诱导SH-SY5Y神经细胞损伤的保护作用

实施例6

制备方法：将活性成分、乳糖和淀粉混合物，用水均匀湿润制成软材，把湿润后的混合物制粒，过20目筛，80℃烘干，加入硬脂酸镁，再过筛，然后将混合物压片，每片重140mg，活性成分含量为10mg。

实施例7

取活性成分(本发明两个化合物或组合物)2.5g，加入丙二醇和乙醇各200ml，搅拌使溶解，加注射用水稀释至10000ml，0.22μm微孔滤膜过滤，灌封，20ml/支，流通蒸汽灭菌30min，检验、包装，得注射液。

Claims (2)

1.具有以下式(Ⅰ)所示结构的化合物在制备用于保护神经细胞的药物中的应用：

其中：R₁+R₂＝CH₂,R₃＝R₄＝CH₃

或

R₁＝R₂＝CH₃,R₃+R₄＝CH₂。

2.具有以下式(Ⅰ)所示结构的化合物在制备用于预防和治疗阿尔茨海默症的药物中的应用：

其中：R₁+R₂＝CH₂,R₃＝R₄＝CH₃

或

R₁＝R₂＝CH₃,R₃+R₄＝CH₂。