CN115317477A - 研究蓝萼庚素对非酒精性脂肪肝的治疗作用和机制的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了研究蓝萼庚素对非酒精性脂肪肝的治疗作用和机制的方法，包括以下步骤：将小鼠随机分成对照组和高脂组；将高脂组进一步分为生理盐水组、蓝萼庚素低剂量和蓝萼庚素高剂量组，每组6只；建立非酒精性脂肪性肝炎模型，同时利用蓝萼庚素进行灌胃。本发明通过从传统治疗肝炎的草药香茶菜中分离获得高活性成分蓝萼庚素，并通过建立NASH小鼠模型，研究蓝萼庚素对NASH导致的氧化应激及一系列炎症因子的上调的影响，并通过hepa1‑6细胞系进一步说明，同时阐述其通过抑制NF‑κB通路的上游基因NIK的表达发挥抑制非酒精性脂肪性肝炎的作用，从而能够为非酒精性脂肪性肝炎的药物治疗寻找新的靶点。

Description

研究蓝萼庚素对非酒精性脂肪肝的治疗作用和机制的方法
技术领域
本发明属于非酒精性脂肪肝治疗技术领域，具体为研究蓝萼庚素对非酒 精性脂肪肝的治疗作用和机制的方法。
背景技术
现有生活中，非酒精性脂肪性肝炎是非酒精性脂肪肝的侵蚀性形式，是 非酒精性脂肪肝病发展到严重阶段的临床病理综合征。在肝脏脂肪变性的基 础上表现为炎症和纤维化病理特征，如果不加干预可发展为肝硬化和肝细胞 癌。治疗上除了体育锻炼和节食以外，尚无针对性有效治疗NASH的临床药物， 寻找和开发缓解非酒精性脂肪性肝炎的特效药物具有重大社会意义。
发明内容：
本发明的目的就在于为了解决上述问题而提供研究蓝萼庚素对非酒精性 脂肪肝的治疗作用和机制的方法，解决了背景技术中提到的问题。
为了解决上述问题，本发明提供了一种技术方案：
研究蓝萼庚素对非酒精性脂肪肝的治疗作用和机制的方法，包括以下步 骤：
S1、将小鼠随机分成对照组和高脂组；
S2、将高脂组进一步分为生理盐水组、蓝萼庚素低剂量和蓝萼庚素高剂 量组，每组6只；
S3、建立非酒精性脂肪性肝炎模型，同时利用蓝萼庚素进行灌胃；
S4、灌胃后检测血清中的肝损指标，同时解剖肝脏，用于H&E染色、qPCR 和免疫印迹检；
S5、培养肝癌细胞系Hepa1-6，同时给予TNFα/棕榈酸/H2O2模拟非酒精 性脂肪性肝炎内环境，并分为六组；
S6、设立一组为对照组，其余分别加入蓝萼庚素，并检测其荧光强度；
S7、将NIK和p100表达质粒共转Hepa1-6细胞，并加入蓝萼庚素，同时 免疫印迹检测NIK、p100、p52蛋白水平。
作为优选，所述步骤S1中的小鼠选用7周龄C57小鼠。
作为优选，所述步骤S1中高脂组中的小鼠均为通过CDAHFD饲料进行喂 食的小鼠。
作为优选，所述步骤S2中蓝萼庚素低剂量组的规格为10mg/kg，所述步 骤S2中蓝萼庚素高剂量组的规格为50mg/kg。
作为优选，所述步骤S3中建立非酒精性脂肪性肝炎模型的时间为进行高 脂组喂养8周后。
作为优选，所述步骤S3中利用蓝萼庚素进行灌胃的时间为4周。
作为优选，所述步骤S5中给予TNFα/棕榈酸/H2O2中TNFα、棕榈酸和H2O2的规格分别为10ng/ml、100uM和1uM。
作为优选，所述步骤S6中加入蓝萼庚素的量分别为0.5μM、1μM、2μM、 5μM和10uM。
作为优选，所述步骤S7中加入蓝萼庚素的量为1μM和5uM。
本发明的有益效果是：本发明通过从传统治疗肝炎的草药香茶菜中分离 获得高活性成分蓝萼庚素，并通过建立NASH小鼠模型，研究蓝萼庚素对NASH 导致的氧化应激及一系列炎症因子的上调的影响，并通过hepa1-6细胞系进 一步说明，同时阐述其通过抑制NF-κB通路的上游基因NIK的表达发挥抑制 非酒精性脂肪性肝炎的作用，从而能够为非酒精性脂肪性肝炎的药物治疗寻 找新的靶点。
附图说明：
为了易于说明，本发明由下述的具体实施及附图作以详细描述。
图1是本发明蓝萼庚素缓解NASH小鼠肝损和肝脏氧化应激示意图；
图2是本发明蓝萼庚素缓解NASH小鼠肝脏炎症基因的表达示意图；
图3是本发明蓝萼庚素缓解NASH小鼠的肝纤维化示意图；
图4是本发明蓝萼庚素下调NIK表达抑制NF-κB示意图。
具体实施方式：
如图1-4所示，本具体实施方式采用以下技术方案：
实施例：
研究蓝萼庚素对非酒精性脂肪肝的治疗作用和机制的方法，包括以下步 骤：
S1、将7周龄C57小鼠小鼠随机分成对照组和高脂组，高脂组中的小鼠 均为通过CDAHFD饲料进行喂食的小鼠；
S2、将高脂组进一步分为生理盐水组、蓝萼庚素低剂量和蓝萼庚素高剂 量组，每组6只，蓝萼庚素低剂量组的规格为10mg/kg，所述步骤S2中蓝萼 庚素高剂量组的规格为50mg/kg；
S3、进行高脂组喂养8周后，建立非酒精性脂肪性肝炎模型，同时利用 蓝萼庚素进行灌胃4周；
S4、灌胃后检测血清中的肝损指标，同时解剖肝脏，用于H&E染色、qPCR 和免疫印迹检；
S5、培养肝癌细胞系Hepa1-6，同时给予TNFα/棕榈酸/H2O2模拟非酒精 性脂肪性肝炎内环境，并分为六组，TNFα/棕榈酸/H2O2中TNFα、棕榈酸和 H2O2的规格分别为10ng/ml、100uM和1uM；
S6、设立一组为对照组，其余分别加入蓝萼庚素0.5μM、1μM、2μM、5 μM、10uM，并检测其荧光强度；
S7、将NIK和p100表达质粒共转Hepa1-6细胞，并加入蓝萼庚素1μM、 5uM，同时免疫印迹检测NIK、p100、p52蛋白水平。
以下通过具体实施例来说明本发明的有益效果：
药品与试剂
蓝萼庚素图(1A)：传统中药治疗肝炎常用草药香茶菜中分离获得的高 活性成分。
细胞株
小鼠肝癌细胞系Hepa1-6细胞系(ATCC，美国)
方法：
细胞培养以及溶液制备：
小鼠肝癌细胞系Hepa1-6细胞系在含有10％FBS和1％青霉素/链霉素的 DMEM培养基中，置于含有5％CO2的潮湿气氛的37℃培养箱中进行培养。
蓝萼庚素对肝损伤及氧化因子指标的影响考察：
将7周龄C57小鼠随机分成对照组和高脂组，后者进一步分为生理盐水 组、蓝萼庚素低剂量(10mg/kg)和高剂量组(50mg/kg)，每组6只，高脂 饲料喂养8周建立非酒精性脂肪性肝炎模型后蓝萼庚素灌胃4周。检测血清 中肝损伤指标，解剖肝脏用于H&E染色。
蓝萼庚素对肝脏内炎症因子相关基因mRNA的影响考察：
将7周龄C57小鼠随机分成对照组和高脂组，后者进一步分为生理盐水 组、蓝萼庚素低剂量(10mg/kg)和高剂量组(50mg/kg)，每组6只，高脂 饲料喂养8周建立非酒精性脂肪性肝炎模型后蓝萼庚素灌胃4周。解剖将肝 脏用于qPCR检测蓝萼庚素对炎症相关基因CCL2、CCL5、CXCL5、TNFα、IL-1 β、IL-6、iNOS和MCP-1的影响。
蓝萼庚素对肝脏纤维化相关基因蛋白表达的影响考察：
将7周龄C57小鼠随机分成对照组和高脂组，后者进一步分为生理盐水 组、蓝萼庚素低剂量(10mg/kg)和高剂量组(50mg/kg)，每组6只，高脂 饲料喂养8周建立非酒精性脂肪性肝炎模型后蓝萼庚素灌胃4周。4周后解剖 肝脏用于免疫印迹检测肝脏α-SMA蛋白，试剂盒检测肝脏羟脯氨酸水平，α -SMA蛋白、羟脯氨酸为肝脏纤维化的重要指标。并用qPCR对其抑制纤维化相 关基因TGFβ、α-SMA和Collagen1a1)mRNA水平进行检测。
蓝萼庚素对相关通路各环节的影响考察：
小鼠肝癌细胞系Hepa1-6细胞经转染携带NF-κB结合位点的荧光报告基 因系统质粒后，采用TNFα(10ng/ml)/棕榈酸(100uM)/H2O2(1uM)处 理Hepa1-6细胞，以模拟非酒精性脂肪性肝炎内环境，分别加入蓝萼庚素(0、 0.5、1、2、5、10uM)，检测荧光强度。
将NIK和p100表达质粒共转染Hepa1-6细胞，加入蓝萼庚素(1、5uM)， 采用免疫印迹对NIK、p100、p52的蛋白水平进行检测。
结果
蓝萼庚素对肝损伤及氧化因子指标的影响：
ALT、AST和ALP为肝脏损伤指标，活性氧ROS)代表肝脏氧化应激，CDAHFD 喂饲引发血清ALT、AST和ALP和肝脏ROS水平的上调，蓝萼庚素治疗后则均 有缓解(图1B，P<0.05)。H&E染色显示，CDAHFD喂饲诱导高脂对照组小 鼠肝脏脂肪沉积、炎性细胞浸润，空白对照组比较小鼠肝脏显示肝小叶排列 整齐，无坏死和脂肪空泡，蓝萼庚素肽干预治疗后肝小叶结构趋于恢复正常， 坏死细胞明显减少，脂肪空泡缩小。(图1C)说明蓝萼庚素具有缓解肝损伤和肝氧化应激。
蓝萼庚素对肝脏内炎症因子相关基因mRNA的影响：
CCL2、CCL5、CXCL5、TNFα、IL-1β、IL-6、iNOS和MCP-1是一系列炎 症相关的基因。qPCR检测发现，与空白对照相比高脂喂饲诱导肝脏内这一系 列炎症相关基因的上调。与高脂组生理盐水组相比，该上调趋势可被蓝萼庚 素逆转，且逆转具有浓度依赖性(图2，P<0.05)说明蓝萼庚素具有很强的 抗炎作用。
蓝萼庚素对肝脏纤维化相关基因蛋白表达的影响：
α-SMA蛋白和羟脯氨酸都是肝脏纤维化的重要指标，TGFβ、α-SMA和 Collagen1a1是抑制肝脏纤维化的相关基因。免疫印迹对肝纤维化指标进行检 测。结果显示，与空白对照相比，高脂喂饲可上调肝脏α-SMA和羟脯氨酸水 平(P<0.05)，与高脂组生理盐水对照相比，蓝萼庚素可下调其上调水平 (图3A-B)，并具有明显浓度依赖性(P<0.05)。qPCR对抑制纤维化相关 基因的mRNA水平进行检测。结果显示，与空白对照相比，高脂喂饲可上调TGFβ、α-SMA和Collagen1a1的基因表达水平(P<0.05)。与高脂组生理盐 水对照相比，蓝萼庚素可逆转其上调(图3C，P<0.05)。说明蓝萼庚素具 有抗纤维化作用。
蓝萼庚素对相关通路各环节的影响：
NF-κB参与细胞中诸多刺激的响应，可调控一系列与免疫和炎症反应的 不同过程相关的基因。以携带NF-κB结合位点的荧光报告基因系统进行表征， 结果显示，蓝萼庚素组荧光强度成浓度依赖性下降，表明蓝萼庚素能够抑制 NF-κB的活性(图4A，P<0.05)。
NIK为NF-κB通路的上游激酶，调控NF-κB通路的激活，在调节免疫和 炎症中发挥重要作用。NIK使IKKα磷酸化从而被激活，导致p100被磷酸化。 磷酸化的p100降解生成活化的p52从而启动NF-κB下游基因的转录。将NIK 和p100表达质粒共转染Hepa1-6细胞，免疫印迹检测结果显示，蓝萼庚素能 够显著下调NIK、p100和p52的蛋白表达水平图4B)。表明蓝萼庚素通过下 调NF-κB通路的上游基因NIK的表达，抑制NF-κB信号通路从而发挥抑制 非酒精性脂肪性肝炎的作用。
同时图1为蓝萼庚素缓解NASH小鼠肝损和肝脏氧化应激示意图。(A) 蓝萼庚素的化学结构式；(B)小鼠血清ALT、AST和ALP和肝脏ROS水平， 数据分析采用平均值±SD，n＝6；*，P<0.05vs.空白对照组；#，P <0.05vs.高脂组生理盐水组；(C)H&E染色；
图2为蓝萼庚素缓解NASH小鼠肝脏炎症基因的表达示意图。小鼠肝脏 CCL2、CCL5、CXCL5、TNFα、IL-1β、IL-6、iNOS和MCP-1的mRNA表达水平， 数据分析采用平均值±SD，n＝6；*，P<0.05vs.空白对照组；#，P <0.05vs.高脂组生理盐水组；
图3为蓝萼庚素缓解NASH小鼠的肝纤维化示意图。(A)小鼠肝脏肝脏 α-SMA的蛋白表达水平；(B)小鼠肝脏羟脯氨酸的蛋白表达水平；(C)小 鼠肝脏TGFβ、α-SMA和Collagen1a1的mRNA表达水平。数据分析采用平均 值±SD，n＝6；*，P<0.05vs.空白对照组；#，P<0.05vs.高脂组 生理盐水组；
图4为蓝萼庚素下调NIK表达抑制NF-κB示意图。(A)荧光报告基因 系统检测NF-κB的活性，数据分析采用平均值±SD，n＝6，#，P<0.05 vs.空白对照组；(B)NIK和p100表达质粒共转染Hepa1-6细胞的NIK、p100 和p52的蛋白表达水平。
结论：
非酒精性脂肪性肝炎(NASH)显著提高患者发展成肝硬化、肝衰竭以及 肝癌的风险，是一种潜在的致命性疾病。目前临床上尚未有针对NASH疾病确 切且有效的治疗措施，本研究旨在寻找缓解非酒精性脂肪性肝炎的特效药物， 并阐述其作用机制，为非酒精性脂肪性肝炎的治疗提供理论依据。
香茶菜为我国传统的治疗肝炎的中草药，从中分离得到的蓝萼庚素为其 重要活性成分。本发明通过考察蓝萼庚素在小鼠NASH模型上的作用，评价蓝 萼庚素对NASH的作用效果。并且通过Hepa1-6细胞系进一步阐述其作用机制。 实验结果表明，蓝萼庚素可有效减轻高脂小鼠肝脏的脂肪沉积和炎症，显著 缓解肝损伤、肝氧化应激水平。同时，蓝萼庚素可有效降低肝脏纤维化水平， 具有强烈的抗炎、抗纤维化作用。通过对炎症相关信号通路各环节的研究， 发现蓝萼庚素通过下调NF-κB通路的上游基因NIK的表达，抑制NF-κB信 号通路从而发挥抑制非酒精性脂肪性肝炎的作用。综上所述，蓝萼庚素能够 有效缓解NASH的有关症状，减轻NASH患者肝脏的炎症和纤维化水平，降低 其发展为肝硬化、肝癌的风险，具有很大潜力作为缓解非酒精性脂肪性肝炎 的特效药物。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而 言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行 多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限 定。

Claims (9)

1.研究蓝萼庚素对非酒精性脂肪肝的治疗作用和机制的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、将小鼠随机分成对照组和高脂组；
S2、将高脂组进一步分为生理盐水组、蓝萼庚素低剂量和蓝萼庚素高剂量组，每组6只；
S3、建立非酒精性脂肪性肝炎模型，同时利用蓝萼庚素进行灌胃；
S4、灌胃后检测血清中的肝损指标，同时解剖肝脏，用于H&E染色、qPCR和免疫印迹检；
S5、培养肝癌细胞系Hepa1-6，同时给予TNFα/棕榈酸/H2O2模拟非酒精性脂肪性肝炎内环境，并分为六组；
S6、设立一组为对照组，其余分别加入蓝萼庚素，并检测其荧光强度；
S7、将NIK和p100表达质粒共转Hepa1-6细胞，并加入蓝萼庚素，同时免疫印迹检测NIK、p100、p52蛋白水平。
2.根据权利要求1所述的研究蓝萼庚素对非酒精性脂肪肝的治疗作用和机制的方法，其特征在于，所述步骤S1中的小鼠选用7周龄C57小鼠。
3.根据权利要求1所述的研究蓝萼庚素对非酒精性脂肪肝的治疗作用和机制的方法，其特征在于，所述步骤S1中高脂组中的小鼠均为通过CDAHFD饲料进行喂食的小鼠。
4.根据权利要求1所述的研究蓝萼庚素对非酒精性脂肪肝的治疗作用和机制的方法，其特征在于，所述步骤S2中蓝萼庚素低剂量组的规格为10mg/kg，所述步骤S2中蓝萼庚素高剂量组的规格为50mg/kg。
5.根据权利要求1所述的研究蓝萼庚素对非酒精性脂肪肝的治疗作用和机制的方法，其特征在于，所述步骤S3中建立非酒精性脂肪性肝炎模型的时间为进行高脂组喂养8周后。
6.根据权利要求1所述的研究蓝萼庚素对非酒精性脂肪肝的治疗作用和机制的方法，其特征在于，所述步骤S3中利用蓝萼庚素进行灌胃的时间为4周。
7.根据权利要求1所述的研究蓝萼庚素对非酒精性脂肪肝的治疗作用和机制的方法，其特征在于，所述步骤S5中给予TNFα/棕榈酸/H2O2中TNFα、棕榈酸和H2O2的规格分别为10ng/ml、100uM和1uM。
8.根据权利要求1所述的研究蓝萼庚素对非酒精性脂肪肝的治疗作用和机制的方法，其特征在于，所述步骤S6中加入蓝萼庚素的量分别为0.5μM、1μM、2μM、5μM和10uM。
9.根据权利要求1所述的研究蓝萼庚素对非酒精性脂肪肝的治疗作用和机制的方法，其特征在于，所述步骤S7中加入蓝萼庚素的量为1μM和5uM。
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