CN109172633A - 一种秦艽提取物及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及医药技术领域，具体而言，涉及一种秦艽提取物及其制备方法与应用。所述提取方法包括以下步骤：将料液比为1g：(5～10)mL的秦艽和90～98％乙醇混合提取，收集提取液，浓缩后干燥即得。所述秦艽提取物在制备保肝制剂中的应用。

Description

一种秦艽提取物及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及医药技术领域，具体而言，涉及一种秦艽提取物及其制备方法与应用。
背景技术
大叶秦艽(Gentiana Macrophylla)是一味传统中药，广泛分布于中欧亚等地区。该药材已被列入中国药典，主治低血压、风湿病、疼痛、高烧、过敏性炎症。其根入药已有上千年用药历史。研究表明，秦艽主要化学成分为环烯醚萜苷、木质素、黄酮和三萜等。近几年研究表明，龙胆苦苷和獐牙菜苦苷是该药材发挥抗炎和抗肿瘤的主要化学成分，因此，这两个化合物已经作为该药材的指标性成分。
酒作为一种消耗品广泛在世界各国使用，而且还被赋予了文化内涵有上千年之久。然而长时间过度饮酒将会引发疾病乃至死亡。最近一项研究表明，在欧洲因酒精直接或间接引发的人身损伤逐年增长，数据显示，仅2012年一年的时间，接近5.9％的全球死亡原因是和过度饮酒有关。这不但会对个人的身心造成严重的影响，更给社会带来巨大的医疗压力。
在人体的肝细胞中，乙醛是酒精的一级代谢产物，如果乙醛脱氢酶产生缺陷或不足将会引起乙醛在体内过度的蓄积，该过程将会引发两个结果：(1)严重累积的乙醛将在体内产生大量的活性氧(ROS)，因此会导致氧化应激的产生从而对肝细胞产生损伤，而损伤的肝细胞会释放内源性损伤相关的分子模块(DAMPs)，该模块将会激活干扰素调控因子3(IRF3)凋亡信号通路以及无菌性炎症信号通通路。(2)过度蓄积的乙醛将会形成大量的蛋白和核酸复合物，该类复合物将会以外源性抗原的形式激活机体内的免疫系统从而进一步加重炎症的进行。综合以上信息，炎症在酒精性肝病中起到非常重要的因素。在酒精性肝病中，炎症的过度发生发展是直接或间接引发肝损伤的一个重要因素。在过去几十年的实验或者临床研究中发现，许许多多的炎症因子(如：TNF-α,IL-6,IL-8,CCL2/MCP-1等)是引发酒精性肝病的主要病理因素。因此，将炎症作为治疗靶标是当今研究酒精性肝病的一大热点。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种秦艽的提取方法，所述的方法具有操作简便、提取得到的提取物活性高、无毒性等优点。
本发明的第二目的在于提供一种所述的秦艽的提取方法提取得到的秦艽提取物。
本发明的第三目的在于提供一种所述的秦艽提取物在抑制炎症信号通路相关蛋白磷酸化中的应用。
本发明的第四目的在于提供一种促进肝细胞MCP-1和/或TNF-α转录和翻译水平增加的方法。
本发明的第五目的在于提供一种抑制肝细胞炎症因子转录和/或翻译水平降低的方法。
本发明的第六目的在于提供一种所述的秦艽提取物在制备修复肝损伤或保肝的药物中的应用。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
一种秦艽的提取方法，包括以下步骤：将料液比为1g：(5～10)mL的秦艽和90～98％乙醇混合提取，收集提取液，浓缩后干燥即得。
所述的秦艽的提取方法提取得到的秦艽提取物。
本发明制备得到的秦艽醇提取物(GME)对于酒精诱导的小鼠肝损伤的保护作用，构建50％(V/V)的酒精水溶液用来构建动物酒精性肝病模型用于评估保肝活性以及作用机制探讨，发现：
(1)GME可以明显改善酒精诱导的模型组小鼠的体重随着食物摄入的减少逐渐降低的病变程度；提高小鼠存活率达75％；
(2)GME以剂量依赖性的方式明显减轻酒精对肝脏细胞的损伤；
(3)GME可缓解酒精引起的肝组织巨大损伤；
(4)GME对RAW264.7无毒副作用；
(5)肝细胞与15～25μg/mL的GME接触可使促炎因子MCP-1和/或TNF-α转录和翻译水平增加；
(6)肝细胞与35～85μg/mL的GME接触可抑制肝细胞炎症因子转录和/或翻译水平降低的方法；
(7)通过抑制炎症信号通路MAPK中JNK和P38的磷酸化作用从而来间接发挥保肝作用，在抑制JNK的磷酸化时，所述秦艽提取物的浓度为55～85μg/mL。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实验例2中的小鼠模型灌胃秦艽水提取物和醇提取物后的肝组织苏木精-伊红染色；
图2为本发明实验例2中的小鼠模型灌胃秦艽水提取物和醇提取物后的肝组织炎症打分；
图3为本发明实验例3中的秦艽醇提物对酒精性肝病小鼠的体重、食物和水的摄入以及存活率的影响；
图4为本发明实验例4中的小鼠模型灌胃秦艽水提取物和醇提取物后的肝组织Masson染色；
图5为本发明实验例4中的小鼠模型灌胃秦艽水提取物和醇提取物后的肝组织纤维化打分；
图6为本发明实验例5中秦艽醇提物对各器官指数影响的检测结果；
图7为本发明实验例5中秦艽醇提物对肝损伤病理生化指标(MDA,AST和ALT)检测结果；
图8为本发明实验例6中秦艽醇提物对RAW264.7细胞毒性评价；
图9为本发明实验例7中RT-PCR检测秦艽醇提物对炎症因子MCP-1、TNF-α、IL-6和IL-1的影响；
图10为本发明实验例7中ELISA检测秦艽醇提物对炎症因子MCP-1、TNF-α、IL-6和IL-1的影响；
图11为本发明实验例8中秦艽醇提物对炎症信号通路MAPK的影响。
具体实施方式
一种秦艽的提取方法，包括以下步骤：将料液比为1g：(5～10)mL的秦艽和90～98％乙醇混合提取，收集提取液，浓缩后干燥即得。
本发明提供了一种秦艽的醇提取方法，将得到醇提取物用于评估保肝活性以及作用机制探讨。并对比了秦艽醇提取物和水提取物在改善酒精引起的肝组织病变的作用，发现秦艽水提物并没有显著改善酒精引起的肝组织病变程度，而醇提取物具有较好的作用。
在一些实施例中，所述料液比还可以为1g：6mL、1g：7mL、1g：8mL、1g：9mL等，优选为1g：8mL(此范围内结果基本一致)。
在一些实施例中，所述乙醇的体积比还可以为92％、95％、97％等，优选为95％(此范围内结果基本一致)。
在一些实施方式中，所述提取的条件为在40～60℃条件下水浴50～120min。
在一些实施例中，所述提取的条件为在40℃条件下水浴50min、在50℃条件下水浴120min、在60℃条件下水浴100min等，优选为在50℃条件下水浴60min(此范围内结果基本一致)。
在一些实施方式中，所述提取的次数为2～4次。
在一些实施例中，所述提取的次数为3次。(此范围内结果基本一致)。
在一些实施方式中，所述干燥的方法为冷冻干燥。
在一些实施例中，所述的秦艽的提取方法提取得到的秦艽提取物为粉剂。
本发明的另一方面在于提供一种所述的秦艽的提取方法提取得到的秦艽提取物。
在一些实施方式中，本发明构建了动物酒精性肝病模型以研究上述秦艽提取物在保肝中的作用。
在一些实施方式中，所述动物酒精性肝病模型为酒精诱导的肝损伤小鼠模型。
在一些实施方式中，所述动物酒精性肝病模型的建立，包括：将实验小鼠分为模型组与空白组，模型组小鼠每天灌胃给50％乙醇(200μL)，空白组灌胃给与相同体积的水，给药组用50％乙醇溶液配制成不同浓度的待测药物同样进行灌胃(200μL)，连续灌胃19天，第20天处死小鼠进行后续实验。
在一些实施方式中，所述实验小鼠为7周龄小鼠。
实验效果与模型并无直接关系，模型只要建立成功，然后给药进行评价看恢复或治疗程度即可。
本发明的另一方面在于提供一种所述的秦艽提取物在抑制炎症信号通路相关蛋白磷酸化中的应用。
在一些实施方式中，所述炎症信号通路包括MAPK信号通路。
在一些实施方式中，所述相关蛋白包括JNK和/或P38。
在一些实施方式中，在抑制JNK的磷酸化时，所述秦艽提取物的浓度为55～85μg/mL。
在一些实施例中，所述秦艽提取物的浓度还可以为60μg/mL、70μg/mL、75μg/mL、80μg/mL等。
本发明的另一方面在于提供一种促进肝细胞MCP-1和/或TNF-α转录和翻译水平增加的方法，将肝细胞与15～25μg/mL的秦艽提取物接触。
在一些实施例中，所述将肝细胞与15～25μg/mL的秦艽提取物接触的秦艽提取物的浓度还可以为18μg/mL、20μg/mL、22μg/mL等。
本发明的另一方面在于提供一种抑制肝细胞炎症因子转录和/或翻译水平降低的方法，将肝细胞与35～85μg/mL的秦艽提取物接触。
在一些实施例中，所述将肝细胞与35～85μg/mL的秦艽提取物接触的秦艽提取物的浓度还可以为40μg/mL、45μg/mL、50μg/mL、55μg/mL、60μg/mL、65μg/mL、70μg/mL、80μg/mL等。
在一些实施方式中，所述炎症因子选自TNF-α,IL-6和IL-1中的一种或多种。
在一些实施方式中，所述肝细胞炎症因子转录和/或翻译水平降低由酒精引发。
酒精可以通过促进转录和翻译作用从而明显促使TNF-α,IL-6和IL-1的表达量上升，秦艽提取物可使它们的表达量下降。
本发明的另一方面在于提供一种所述的秦艽提取物在制备修复肝损伤或保肝的药物中的应用。
在一些实施方式中，所述肝损伤为酒精性肝病。
从丙二醛(MDA)、谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)等生化指标来看，秦艽提取物可修复酒精引起的肝组织的巨大损伤。
从肝脏组织结构来看，秦艽提取物以剂量依赖性的方式明显减轻酒精对肝脏细胞的损伤。
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1
取阴干秦艽2千克，用95％乙醇进行加热提取(料液比：1：8；温度：50℃；时间：60min)，共提取三次，收集三次得到的提取液浓缩至粘稠状，最后进行冷冻干燥成粉。
实施例2
取阴干秦艽1千克，用95％乙醇进行加热提取(料液比：1：9；温度：40℃；时间：120min)，共提取三次，提取液进行浓缩至粘稠状，最后进行冷冻干燥成粉。
实施例3
取阴干秦艽2千克，用95％乙醇进行加热提取(料液比：1：6；温度：60℃；时间：50min)，共提取三次，提取液进行浓缩至粘稠状，最后进行冷冻干燥成粉。
实验例1动物酒精性肝病模型的构建
将实验小鼠分为模型组和空白组，模型组小鼠每天灌胃给50％乙醇(200μL)，空白组灌胃给与相同体积的水，给药组用50％乙醇溶液配制成不同浓度的待测药物同样进行灌胃(200μL)，连续灌胃19天，第20天处死小鼠进行后续实验。
实验例2秦艽提取方式的比较
取7周龄的模型组和空白组小鼠分别灌胃给20mg/kg/day、40mg/kg/day、100mg/kg/day实施例1制备得到的和水提取方法得到的秦艽提取物，第20天处死小鼠，取肝组织进行HE染色。每组10个平行实验。水提取方法如下：
取阴干秦艽2千克，用蒸馏水进行加热提取(料液比：1：6；温度：50℃；时间：60min)，共提取三次，提取液进行浓缩至粘稠状，最后进行冷冻干燥成粉。
苏木精-伊红染色表明正常组小鼠的肝小叶结构正常，肝脏细胞沿中央静脉呈放射状排列。但是模型组小鼠的肝组织呈现严重的疾病状态，肝细胞气球样变性，脂肪空泡增加，由于小叶炎症细胞的浸润，细胞与细胞之间的空间明显扩大。Mallory-Denk小体和个别凋亡的肝细胞也可在小叶中发现。
结果显示，秦艽水提物在20mg/kg/day、40mg/kg/day、100mg/kg/day的浓度时均没有显著改善酒精引起的肝组织病变程度(图1，A)。实施例1制备得到的秦艽醇提物GME以剂量依赖性的方式明显减轻酒精对肝脏细胞的损伤(图1，B)。炎症打分显示在给药40和100mg/kg/day时，GME可以明显改善酒精对肝组织的损伤(图2)。
实验例3秦艽醇提物对酒精性肝病小鼠的体重、食物和水的摄入以及存活率的影响
按照实验例2的方法进行实验，测定不同时间模型小鼠的体重、食物和水的摄入以及存活率。
结果如图3所示，正常组小鼠的体重随着食物和饮水的增加而呈现缓慢增长的趋势。然而酒精诱导的模型组小鼠的体重随着食物摄入的减少逐渐降低。灌胃给药GME可以明显改善该病变程度，给药组小鼠体重呈现增长趋势伴随着增加的食物和饮水摄取。模型组的小鼠存活率约20％，然而给药后可以明显提高小鼠存活率达75％。
实验例4秦艽醇提物肝组织Masson染色
按照实验例2的方法进行实验，Masson染色后观察肝组织变化。Masson染色结果表明，与正常组相比，模型组小鼠肝组织呈现大量胶原沉积，明显的中央-中央桥纤维以及中央-肝门桥纤维已经在肝小叶形成，然而在给药40和100mg/kg/day的GME时，这一系列的病理症状均得以改善(图4和图5)。
实验例5秦艽醇提物对各器官指数以及肝损伤病理生化指标(MDA,AST和ALT)检测结果
按照实验例2的方法进行实验，检测各器官指数以及肝损伤病理生化指标(MDA,AST和ALT)。
如图6所示，与正常组比较，各器官指数(肝指数除外)均未发生明显变化，模型组肝指数明显升高，给药GME后，肝指数明显下降并恢复至正常水平。如图7所示，模型组的丙二醛(MDA)、谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)含量分别是正常组各指标含量的6、6和9倍之多。以上病理生化指标表明酒精可引起肝组织的巨大损伤，给药GME后，该损伤得以缓解。
实验例6秦艽醇提物的细胞毒性评价
使用常规方法检测GME对RAW264.7的细胞毒性影响。
结果如图8所示，评估了秦艽醇提物四个不同剂量的GME(30、60、90、120μg/mL)在4个时间段内对RAW264.7的毒性，结果表明，在该评估体系内，GME对RAW264.7无毒副作用。
实验例7秦艽醇提物对炎症因子MCP-1、TNF-α、IL-6和IL-1的影响
使用常规RT-PCR和ELISA方法检测秦艽醇提物对炎症因子MCP-1、TNF-α、IL-6和IL-1的影响。
结果如图9和图10所示，酒精可以通过促进转录和翻译作用从而明显促使TNF-α,IL-6和IL-1的表达量上升。但是对MCP-1无影响。但是我们发现当给药20μg/mL时MCP-1和TNF-α的转录和翻译水平明显增加，这个结果表明较低剂量的GME作为一个促炎因子而非抑制作用在发挥药效。但是随着GME给药剂量的增加，TNF-α,IL-6和IL-1的表达量明显降低。
实验例8秦艽醇提物对炎症信号通路MAPK的影响
使用常规Western Blot方法检测秦艽醇提物对炎症信号通路MAPK的影响。
为了揭示GME抑制炎症的作用机理，本发明探究了GME对MAPK信号通路上的三个关键蛋白磷酸化(ERK,JNK和P38)的影响。从图11中可以看出，与正常组相比，酒精模型组可以明显上调ERK,JNK和P38的磷酸化水平。GME可以明显以剂量依赖的方式来抑制P38的磷酸化水平，但是对ERK的磷酸化水平却没有影响。在20μg/mL给药剂量下，GME对JNK的磷酸化没有作用，而在40μg/mL给药剂量下，GME对JNK的磷酸化具有促进作用，但是在60μg/mL和80μg/mL给药剂量下，GME对JNK的磷酸化有明显的抑制作用。
综合以上研究结果表明，GME缓解酒精引发的肝脏损伤是通过抑制炎症信号通路MAPK中JNK和P38的磷酸化作用从而来间接发挥保肝作用。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (10)

1.一种秦艽的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：将料液比为1g：(5～10)mL的秦艽和90～98％乙醇混合提取，收集提取液，浓缩后干燥即得。
2.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述提取的条件为在40～60℃条件下水浴50～120min。
3.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述提取的次数为2～4次。
4.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述干燥的方法为冷冻干燥。
5.权利要求1～4任一项所述的秦艽的提取方法提取得到的秦艽提取物。
6.权利要求5所述的秦艽提取物在抑制炎症信号通路相关蛋白磷酸化中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述炎症信号通路包括MAPK信号通路；
优选地，所述相关蛋白包括JNK和/或P38；
优选地，在抑制JNK的磷酸化时，所述秦艽提取物的浓度为55～85μg/mL。
8.一种促进肝细胞MCP-1和/或TNF-α转录和翻译水平增加的方法，其特征在于，将肝细胞与15～25μg/mL的秦艽提取物接触。
9.一种抑制肝细胞炎症因子转录和/或翻译水平降低的方法，其特征在于，将肝细胞与35～85μg/mL的秦艽提取物接触；
所述炎症因子选自TNF-α,IL-6和IL-1中的一种或多种；
优选地，所述肝细胞炎症因子转录和/或翻译水平降低由酒精引发。
10.权利要求5所述的秦艽提取物在制备修复肝损伤或保肝的药物中的应用；
优选的，所述肝损伤为酒精性肝病。
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