CN111297941A - 一种用于防治酒精性肝病的药物、提取方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于肝病药物技术领域，公开了一种用于防治酒精性肝病的药物、提取方法，药物为秦艽。提取方法为：将秦艽打成粗粉，用70％乙醇超声提取3次，每次20min，减压滤过，合并滤液，浓缩蒸干得醇提物，冷冻干燥；将小鼠分为正常组、模型组、阳性组、酒精+秦艽组和秦艽组，56％酒精灌胃造模，试验周期2周；指标检测：HE染色，油红染色，试剂盒检测血清ALT、AST等肝功能指标以及肝组织脂质含量和氧化应激相关指标。本发明采用的超声提取、旋蒸和冷冻干燥等过程都使药物处理过程在45℃以下；实验表明，秦艽醇提物对酒精引起的肝病有一定的缓解作用，而对其他脏器无明显损伤。

Description

一种用于防治酒精性肝病的药物、提取方法

技术领域

本发明属于肝病药物技术领域，尤其涉及一种用于防治酒精性肝病的药物、提取方法。

背景技术

目前，酒精性肝病(ALD)是一种世界范围的慢性病，也是慢性肝病死亡的主要因素之一。ALD是由于长期过量饮酒导致的肝脏疾病，初期通常表现为脂肪肝，进而可发展成酒精性肝炎、肝纤维化和肝硬化，甚至肝癌。戒酒是最基础的治疗措施，药物治疗一般在不晚于肝炎阶段比较有意义，而目前还没有被认可的特效药治疗肝纤维化，更不用说肝硬化或肝癌了，其最佳治疗选择为肝移植。因此，如何开发出更安全有效的防治ALD的药物是必要的。从天然植物中寻找新药物已成为当今新药开发的重要途径，而传统医学应用的民族药物具有安全有效的优势和特点。秦艽是中国传统的药物之一，《本草纲目》记载秦艽单用可治疗酒精性黄疸，且以秦艽的酒浸出液治疗黄疸(并非中药普遍采用的沸水提取)。过量饮酒可造成酒精性肝病，疾病进程包括单纯性脂肪变性，脂肪性肝炎，肝纤维化，肝硬化，甚至肝细胞癌。目前，尽管治疗酒精性肝病的临床药物较多，包括抗氧化类、抗炎类等，但尚无公认的特效药。《本草纲目》记载秦艽性味苦、平，归胃、肝、胆经，具有祛风湿、清湿热、止痹痛等功效，可单用治疗湿热黄疸，与酒精引起的湿热肝病相符，具有防治酒精性肝病的可能性。

综上所述，现有技术存在的问题是：目前，尽管治疗酒精性肝病的临床药物较多，包括抗氧化类、抗炎类等，但尚无公认的特效药。

解决上述技术问题的难度：酒精性肝病发病机制的长期性和复杂性使得该疾病成为世界难治性疾病的一种，中药多成分、多靶点的特点在治疗复杂疾病方面有着优势，从天然植物中筛选可能的药物成为当今防治酒精性肝病的重要途径。

解决上述技术问题的意义：本发明发现秦艽醇提物能够很好地改善酒精诱导的肝脏病变，有成为防治酒精性肝病新药的可能性，从而给酒精性肝病患者带来健康。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种用于防治酒精性肝病的药物。

本发明是这样实现的，一种用于防治酒精性肝病的药物，所述用于防治酒精性肝病的药物为秦艽。

本发明的另一目的在于提供一种用于防治酒精性肝病的药物的提取方法，所述用于防治酒精性肝病的药物的提取方法包括以下步骤：

步骤一，将秦艽打成粗粉，用70％乙醇超声提取3次，每次20min，减压滤过，合并滤液，浓缩蒸干得醇提物，冷冻干燥。

步骤二，将小鼠分为正常组、模型组、阳性组(水飞蓟素)、酒精+秦艽组和秦艽组，56％酒精灌胃造模，试验周期2周。

步骤三，指标检测：HE染色肝、心、脾、肺、肾、脑组织；油红染色和Masson染色，并只做肝组织；试剂盒检测肝功能指标。

进一步，步骤一中，所述秦艽和乙醇的料液比为1:10。

进一步，步骤二中，所述56％酒精灌胃体积均为10ml/kg。

进一步，步骤三中，所述指标检测的方法如下：

(1)多聚甲醛固定的肝组织(还有心、脾、肺、肾、脑)做石蜡切片，行HE染色。

(2)试剂盒检测血清谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)、γ－谷氨酰转移酶(γ－GT)、碱性磷酸酶(ALP)。

(3)肝组织氧化应激相关指标。具体包括：各组均做肝组织HE和油红染色；正常组和秦艽组还要做心、脾、肺、肾、脑的HE染色；

血清肝功能生化指标：谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)、碱性磷酸酶(ALP)、γ－谷氨酰转移酶(γ－GT)；

肝组织脂质含量指标：总胆固醇(TC)和总甘油三酯(TG)。

肝组织氧化应激指标：丙二醛(MDA)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽(GSH)。

进一步，所述秦艽打成粗粉使用打粉机，打粉机2800转/分，粉碎程度50～300目；将500g秦艽放入打粉机，分次打粉，最终混匀，得到408.6g。

进一步，所述70％乙醇的提取方法包括：

(1)取2份秦艽粉末，每份150.0g；

(2)取1-12L的无水乙醇，加480mL的纯净水混合后得70％乙醇。

进一步，150g的秦艽粉末加70％乙醇1500mL放入2L烧杯中，提取条件为40℃，300W，40KHZ，每次20min，共提取3次，纱布3层过滤，收集提取液；

进一步，所述浓缩醇提物的方法包括：

(1)抽滤，将纱布过滤后的70％乙醇提取液用布氏漏斗抽滤3次；

(2)浓缩，水浴40℃～44℃，压力设定0～100bar，冷凝媒介-5℃，转速40～70RPM。

综上所述，本发明的优点及积极效果为：本发明采用的超声提取、旋蒸和冷冻干燥等过程都使药物处理过程在45℃以下。实验表明，秦艽醇提对酒精引起的肝病可能有一定的缓解作用，对其他脏器无明显损伤。

附图说明

图1是本发明实施例提供的用于防治酒精性肝病的药物的提取方法流程图。

图2是本发明实施例提供的秦艽醇提物超高效液相图谱；

图中：S1马钱苷酸标准品；S2獐牙菜苦苷；S36'-O-β-D-葡萄糖基龙胆苦苷；S4龙胆苦苷；S5獐芽菜苷；S6异荭草苷；S7异牡荆苷；S8秦艽醇提物；S97种标准品和秦艽醇提物的混合物；S107种标准品混合物。

图3是本发明实施例提供的秦艽醇提物对ALD小鼠肝组织病变的影响(200倍)示意图。

图4是本发明实施例提供的秦艽醇提物对小鼠主要脏器的影响(200倍)示意图。

图5是本发明实施例提供的秦艽醇提物对ALD小鼠血清肝功能指标的影响示意图。

图6是本发明实施例提供的秦艽醇提物对ALD小鼠肝组织脂质含量的影响示意图。

图7是本发明实施例提供的秦艽醇提物对ALD小鼠肝组织氧化应激的影响示意图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种用于防治酒精性肝病的药物，下面结合附图对本发明作详细的描述。

本发明实施例提供的用于防治酒精性肝病的药物为秦艽。

如图1所示，本发明实施例提供的用于防治酒精性肝病的药物的提取方法包括以下步骤：

S101，将秦艽打成粗粉，用70％乙醇超声提取3次，每次20min，减压滤过，合并滤液，浓缩蒸干得醇提物，冷冻干燥。

S102，将小鼠分为正常组、模型组、阳性组(水飞蓟素)、酒精+秦艽组和秦艽组，56％酒精灌胃造模，试验周期2周。

S103，指标检测：HE染色肝、心、脾、肺、肾、脑组织；油红染色并只做肝组织；试剂盒检测肝功能指标。

本发明实施例提供的S101中，秦艽和乙醇的料液比为1:10。

本发明实施例提供的S102中，56％酒精灌胃体积均为10ml/kg。

在本发明的优选实施例中，秦艽打成粗粉使用打粉机，打粉机2800转/分，粉碎程度50～300目；将500g秦艽放入打粉机，分次打粉，最终混匀，得到408.6g。

在本发明的优选实施例中，70％乙醇的提取方法包括：

(1)取2份秦艽粉末，每份150.0g；

(2)取1-12L的无水乙醇，加480mL的纯净水混合后得70％乙醇。

在本发明的优选实施例中，150g的秦艽粉末加70％乙醇1500mL放入2L烧杯中，提取条件为40℃，300W，40KHZ，每次20min，共提取3次，纱布3层过滤，收集提取液；

在本发明的优选实施例中，浓缩醇提物的方法包括：

(1)抽滤，将纱布过滤后的70％乙醇提取液用布氏漏斗抽滤3次；

(2)浓缩，水浴40℃～44℃，压力设定0～100bar，冷凝媒介-5℃，转速40～70RPM。

本发明实施例提供的S103中，指标检测的方法如下：

(1)多聚甲醛固定的肝组织(还有心、脾、肺、肾、脑、)做石蜡切片，行HE染色。以肝组织观察为主，其他组织次要，但也要评价。

(2)试剂盒检测血清谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)、γ－谷氨酰转移酶(γ－GT)、碱性磷酸酶(ALP)。

(3)肝组织脂质含量和氧化应激相关指标。

下面结合实施例对本发明的技术方案作进一步的描述。

实施例1

1、材料

1.1试剂

雄性昆明种小鼠75只(18-22g，4周龄)；水飞蓟素(5g装，大连美仑公司，批号50707A)；红星二锅头(56度)；秦艽饮片(兰州安泰堂中药饮片有限公司，批号18112604)；ALT、AST试剂盒等。

1.2仪器

打粉机；超声仪；旋转蒸发仪；冷冻干燥机；冰箱；移液枪、酶标仪等。

2、预试验方法

(1)药物提取

将秦艽饮片打成粗粉(300g)，用70％乙醇超声提取3次(料液比1:10)，每次30min，减压滤过，合并滤液，浓缩蒸干得醇提物，冷冻干燥得107.36g粉末，提取率为35.79％。

(2)56％酒精灌胃体积均为10ml/kg(相当于酒精剂量4.8g/kg)，各组处理情况如下：

1)正常组(K，共10只)：饲养于同一个鼠笼，正常饲养。每天下午16:00开始灌胃蒸馏水。标记为K1～K10号，持续2周。

2)模型组(M，共15只)：每天下午16:00开始灌胃酒精。标记为M1～M15号，持续2周。

3)阳性组(Y，共5只)：标记为Y1～Y10号，每天下午16:00开始灌胃浓酒精+水飞蓟素(200mg/kg)，水飞蓟素溶解在酒精中，持续2周。

4)酒精+秦艽组(G(400mg/kg)，Z(200mg/kg)，D(100mg/kg)共30只)：标记为G1～J10号，Z1～Z10，DG1～D10号，每天下午16:30开始灌胃酒精+秦艽醇提物，秦艽醇提物溶解在酒精中，持续2周。

5)秦艽组：(Q(400mg/kg))：标记为Q1～Q10号，每天下午16:00开始灌胃秦艽醇提物水溶液，持续2周。

3、预试验取材与指标检测

3.1取材

取材前一天晚上20:00开始禁食不禁水，早上8:30开始摘除眼球取血(离心后血清冻存于-20度)，脱颈处死小鼠后，采集肝组织和胃组织(心、肾和脾脏正式试验再收集)，部分肝组织和全部胃组织洗净后浸泡于4％多聚甲醛溶液中固定；剩余肝组织迅速放于液氮中，随后转移到-80度冰箱中保存。

3.2指标检测

(1)多聚甲醛固定的肝组织(还有心、脾、肺、肾、脑)做石蜡切片，行HE染色。

(2)试剂盒检测血清谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)、γ－谷氨酰转移酶(γ－GT)、碱性磷酸酶(ALP)。

(3)肝组织脂质含量和氧化应激相关指标。

实施例2

本发明实施例提供的用于防治酒精性肝病的药物的提取方法包括：

(1)将秦艽打成粗粉，用70％乙醇超声提取3次(料液比1:10)，每次20min，减压滤过，合并滤液，浓缩蒸干得醇提物，冷冻干燥。

(2)将小鼠分为正常组、模型组、阳性组(水飞蓟素)和秦艽组(高中低剂量组)，56％酒精灌胃(10ml/kg)造模，试验周期2周。

(3)指标检测：

1)HE染色(肝，心、脾、肺、肾、脑组织)；

2)油红染色(肝组织)；

3)试剂盒检测血清ALT、AST等肝功能指标，以及肝组织脂质含量和氧化应激相关指标。

下面结合实验对本发明的技术效果作进一步的描述。

本实验秦艽醇提物缓解ALD作用及机制前期具体研究工作基础如下：

(1)超高效液相定量秦艽醇提物7种指标性成分，本发明采用单标、混标和内标几种方法，测定了秦艽醇提物中马钱苷酸、獐牙菜苦苷、6'-O-β-D-葡萄糖基龙胆苦苷、龙胆苦苷、獐芽菜苷、异荭草苷和异牡荆苷7种指标成分的含量，结果表明秦艽醇提物中马钱苷酸、獐牙菜苦苷、6'-O-β-D-葡萄糖基龙胆苦苷、龙胆苦苷和獐芽菜苷的含量分别为4.68％、2.81％、1.24％、39.34％和1.27％，但未检测出异荭草苷和异牡荆苷，如图2所示。

(2)秦艽醇提物对ALD小鼠肝组织病理学变化的影响肝组织HE和油红O染色结果显示，秦艽醇提物对小鼠肝组织病理特征无明显影响，而酒精可导致小鼠肝组织出现明显的脂肪变性、水肿和细胞坏死等病变，表明酒精诱导小鼠出现ALD，而采用秦艽醇提物干预后，ALD小鼠肝组织病变明显改善。同时，HE染色观察肾、脾、心、肺和脑组织结果显示，与正常小鼠比较，秦艽醇提物对小鼠主要脏器无明显影响。病理观察结果表明，秦艽醇提物能够显著改善ALD小鼠肝组织病变，并无明显毒副作用，如图3和图4所示。

(3)秦艽醇提物对ALD小鼠血清肝功能指标的影响小鼠血清肝功能检测结果表明，与正常小鼠比较，秦艽醇提物未引起小鼠血清肝功能生化指标变化，而酒精干预可使血清ALT、AST、ALP和γ-GT活性升高，表明酒精导致ALD小鼠肝组织出现损伤。秦艽醇提物干预可降低ALD小鼠血清ALT、AST、ALP和γ-GT活性，表明其可改善ALD小鼠肝功能，如图5所示，与正常组比较，^##P<0.01；与酒精组比较，*P<0.05，**P<0.01；下同。

(4)秦艽醇提物对ALD小鼠肝组织TG和TC含量的影响小鼠肝组织脂质含量结果表明，秦艽醇提物未引起小鼠肝组织脂质含量明显改变，而酒精可导致ALD小鼠肝组织TG和TC含量显著增加，而秦艽醇提物干预可降低ALD小鼠肝组织脂质含量，如图6所示。

(5)秦艽醇提物对ALD小鼠肝组织氧化应激的影响小鼠肝组织氧化应激结果表明，秦艽醇提物未引起小鼠肝组织氧化应激指标变化，而酒精可导致ALD小鼠肝组织MDA含量明显增加，并且抗氧化能力指标SOD、GSH和GSH-PX明显降低，表明酒精可导致ALD小鼠肝组织发生氧化应激，而秦艽醇提物干预可明显抑制ALD小鼠肝组织氧化应激，提示这可能是秦艽醇提物缓解小鼠ALD的重要机制，如图7所示。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种用于防治酒精性肝病的药物，其特征在于，所述用于防治酒精性肝病的药物为秦艽。

2.一种如权利要求1所述的用于防治酒精性肝病的药物的提取方法，其特征在于，所述用于防治酒精性肝病的药物的提取方法包括以下步骤：

步骤一，将秦艽打成粗粉，用70％乙醇超声提取3次，每次20min，减压滤过，合并滤液，浓缩蒸干得醇提物，冷冻干燥；

步骤二，将小鼠分为正常组、模型组、阳性组、酒精+秦艽组和秦艽组，56％酒精灌胃造模，试验周期2周；

步骤三，指标检测：HE染色肝、心、脾、肺、肾、脑组织；油红染色只做肝组织；试剂盒检测肝功能指标。

3.如权利要求2所述的用于防治酒精性肝病的药物的提取方法，其特征在于，步骤一中，所述秦艽和乙醇的料液比为1:10。

4.如权利要求2所述的用于防治酒精性肝病的药物的提取方法，其特征在于，步骤二中，所述56％酒精灌胃体积均为10ml/kg。

5.如权利要求2所述的用于防治酒精性肝病的药物的提取方法，其特征在于，步骤三中，所述指标检测的方法如下：

(1)多聚甲醛固定的肝组织以及心、脾、肺、肾、脑组织做石蜡切片，进行HE染色；

(2)试剂盒检测血清谷草转氨酶AST、谷丙转氨酶ALT、γ－谷氨酰转移酶γ－GT、碱性磷酸酶ALP；

(3)肝组织脂质含量和氧化应激相关指标。

6.如权利要求2所述的用于防治酒精性肝病的药物的提取方法，其特征在于，所述秦艽打成粗粉使用打粉机，打粉机2800转/分，粉碎程度50～300目；将500g秦艽放入打粉机，分次打粉，最终混匀，得到408.6g。

7.如权利要求2所述的用于防治酒精性肝病的药物的提取方法，其特征在于，所述70％乙醇的提取方法包括：

(1)取2份秦艽粉末，每份150.0g；

(2)取1-12L的无水乙醇，加480mL的纯净水混合后得70％乙醇。

8.如权利要求2所述的用于防治酒精性肝病的药物的提取方法，其特征在于，150g的秦艽粉末加70％乙醇1500mL放入2L烧杯中，提取条件为40℃，300W，40KHZ，每次20min，共提取3次，纱布3层过滤，收集提取液。

9.如权利要求2所述的用于防治酒精性肝病的药物的提取方法，其特征在于，所述浓缩醇提物的方法包括：

(1)抽滤，将纱布过滤后的70％乙醇提取液用布氏漏斗抽滤2次；

(2)浓缩，水浴40℃～44℃，压力设定0～100bar，冷凝媒介-5℃，转速40～70RPM。

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