CN101912433A - 杜仲抗骨质疏松有效组分的提取方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种杜仲抗骨质疏松有效组分的提取方法，其具体提取步骤为：把中药杜仲的干燥树皮切成小块，于3％盐水中浸泡4个小时；捞出浸泡物置120℃烘箱中烘干，粉碎机中研磨，制成粉末；加入10倍体积/重量的60％乙醇浸泡过夜，10000转/分离心20分钟，取上清液，弃沉淀，定量滤纸过滤，进一步去除不容物；上清液加至SP型大孔树脂层析柱，用30％、50％、75％、90％乙醇分别洗脱，紫外检测仪监测，分离获得不同峰物质。本发明解决了不能从杜仲中分离抗骨质疏松的有效组分的问题，同时提供了一套大规模分离有效组分的工艺路线，提高了回收率和纯度，更加有利于对于骨质疏松的预防和治疗。

Description

杜仲抗骨质疏松有效组分的提取方法

技术领域

本发明涉及一种杜仲抗骨质疏松有效组分的提取方法，属于生物技术领域。

背景技术

骨质疏松(Osteoporosis，OP)是一种以骨密度下降和骨微结构破坏为主要特征的骨病，中老年人群中居多，全世界发生率为7％左右，男女比例为1∶4。中国目前约有9700万OP患者，女性占三分之二，居老年病之首，被誉为是“悄无声息”的流行病。随着人类进入老龄社会步伐的加快，OP患者呈现急剧增加的态势，已经成为卫生管理部门和医学界高度重视的公共健康问题。

从细胞学的角度来看，成骨细胞(osteoblast，OB)和破骨细胞(osteoclast，OC)平衡失调是骨质疏松发生的重要原因之一。由于OB的优势下降和OC的优势上升，导致了骨重建(remodeling)的不足和骨重吸收(resorption)的过强，而OB优势下降的同时往往又与脂肪细胞(adipocyte)优势上升相偶联。成骨细胞和脂肪细胞均由骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)分化而来，MSCs的成骨/成脂分化表现出一定的“此消彼长”规律，因此MSCs成骨/成脂分化的分子机制就成为了学术界研究的重点。

目前临床上治疗OP药物普遍存在着毒副作用，如雌激素的长期使用将增加乳腺癌或子宫内膜增生发生的风险，二磷酸盐的使用容易导致骨残、骨关节或肌肉疼痛等，因而近年来中药及中药提取物对OP的防治作用引起了广泛的关注。

杜仲(Eucommia ulmoids Oliv)是我国名贵滋补药材，作为中药的使用已有近千年的历史。中医学认为杜仲味甘，微辛，归肝、肾经，有补肝肾、强筋骨、降血压、安胎等诸多功效。近年来的研究证实，杜仲具有显著抗骨质疏松，改善骨代谢的功能，但杜仲中的有效成分或组分目前还不太清楚，药效的分子机制还有待进一步研究。

众所周知，中药的成分及其复杂，在含有效成分或组份的同时，还含有大量的非有效成分，即无生物活性的成分，甚至还可能含有一定的反效成分或毒性成分。因此分离有效组分，明确化学结构和药学分子机制就成为中药发展的重要方向。目前应用杜仲来治疗骨质疏松仍停留在原始的汤剂、蜜丸及稍微改进的胶囊给药的方式上，这几种用药方式，用药量大、时间较长，给患者带来极大的不便，问题就在于没有去处无效部分萃取精华，因此需要一种能从杜仲中提取抗骨质疏松有效组分的方法，提取精华去其糙粕，缩短治疗时间，提高治疗效果。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种杜仲抗骨质疏松有效组分的提取方法，将杜仲中抗骨质疏松的有效组分进行提取，更方便、有效的应用在临床治疗及预防骨质疏松上。

为了解决以上技术问题，本发明所采取的技术方案是：一种杜仲抗骨质疏松有效组分的提取方法，其特征在于其提取方法分为以下步骤：

1)、把中药杜仲的干燥树皮切成小块，于3％盐水中浸泡4个小时；

2)、捞出浸泡物置120℃烘箱中烘干，粉碎机中研磨，制成粉末；

3)、加入10倍体积/重量的60％乙醇浸泡过夜，10000转/分离心20分钟，取上清液，弃沉淀，定量滤纸过滤，进一步去除不容物；

4)、上清液加至SP型大孔树脂层析柱，用30％、50％、75％、90％乙醇分别洗脱，紫外检测仪监测，分离获得不同峰物质。

本发明解决了不能从杜仲中分离抗骨质疏松的有效组分的问题，同时提供了一套大规模分离有效组分的工艺路线，提供了回收率和纯度，更加有利于对于骨质疏松的预防和治疗。

具体实施方式：

一、以下用实施例对本发明作更详细的描述。这些实施例仅仅是对本发明最佳实施方式的描述，并不对本发明的范围有任何限制。具体提取方法如下：

1、把中药杜仲的干燥树皮切成小块，于3％盐水中浸泡4个小时；

2、捞出浸泡物置120℃烘箱中烘干，粉碎机中研磨，制成粉末；

3、加入10倍体积/重量的60％乙醇浸泡过夜，10000转/分离心20分钟，取上清液，弃沉淀，定量滤纸过滤，进一步去除不容物；

4、上清液加至SP型大孔树脂层析柱，用30％、50％、75％、90％乙醇分别洗脱，紫外检测仪监测，分离获得不同峰物质。(峰物质：随着不同的填充材料和不同的洗脱溶液的使用，柱层析技术可将中药混合物中的成分进行初分，即不同物质从柱中流出的时间不同，或不同洗脱方法可将不同物质先后洗脱出，使用检测仪以曲线的形式记录流出物质的时间和浓度，曲线形态类似高低不等的山峰，每一个峰则代表了某种、某类或某些物质，当这些物质还未确定为何种物质时，暂称峰物质。)

二、分析、鉴定及实验

将分离的峰物质进行高效液相色谱分析(解释：高效液相色谱的技术原理类似于柱层析，但它的分辨率和灵敏度更高，速度更快，自动化程度高，参数设定范围广，因此分析、分离和鉴定的效果更好，当然成本也较高，不适合大量的物质分离收集)，通过指纹图谱的比较和峰积分面积计算，鉴定组分的含量和纯度。将分离物进行细胞培养(详见“附1：细胞培养方法”)与动物实验(详见“附2：动物实验方法”)证实其活性作用。将含有有效组分或含量较高的峰物质进行多步硅胶层析，以去除杂质，将纯度提高到90％以上，减压蒸发法干燥、结晶，获得目标物质。

附1：细胞培养方法

1.取100克左右的SD大鼠(雌雄不拘)，颈椎脱臼法处死，70％乙醇浸泡5分钟，灭菌消毒；

2.在超净台中解剖大鼠，取股骨，分离骨髓；

3.将骨髓细胞接种于细胞培养瓶中，加入DMEM/F12(1∶1)+15％胎牛血清培养基；

4.37℃，5％CO₂，饱和湿度下培养；

5.培养至第三天换液，去除非贴壁细胞，继续培养；

6.根据细胞生长状况，实时换液；

7.细胞生长近90％融合状态时，1∶3比例传代，根据细胞生长状况，实时换液；

8.培养细胞传代至第三代后，进行下述诱导实验：

1)将细胞接种于6孔细胞培养板中，设定不同杜仲提取物的浓度(自10^-2至10^-5)进行诱导，并将培养基中的胎牛血清浓度下降到7.5％，同时设非诱导对照组，根据细胞生长状况，实时换液；

2)诱导培养至一周后，进行成骨、成脂相关基因表达检测，成骨相关基因取Runx2、OPG、Osx、OCN、ALP，成脂相关基因取PPARγ、Adipoq、aP2，当基因表达差别达到2倍以上时，判断有效。

3)诱导培养至一周后，进行细胞原位ALP活力检测(ALP活力测定试剂盒法)，以细胞显色比例为判断指标，诱导细胞的显色比例比非诱导细胞高3倍时，判断有效；

4)诱导培养至两周后，1％茜素S染色法进行钙化结节检测，当诱导细胞出现显著钙化结节而非诱导细胞基本无钙化结节时，判断有效。

附2：动物实验方法

(一)有效组分药效观察

1.取雌性成年(250克左右)SD大鼠，戊巴比妥那腹腔注射麻醉，手术去除双侧卵巢，缝合后正常饲养10天；

2.将大鼠分实验组和对照组，对照组不做任何处理，仅正常饲养，实验组进行杜仲有效组分灌胃处理，每次灌胃量以相当于0.1克杜仲中有效组分含量计，每日一次，共进行3个月；

3.解剖大鼠，取股骨骨骺，4％多聚甲醛固定3天，EDTA溶液中进行脱钙处理一周；

4.冰冻切片，常规HE染色，显微镜检查骨小梁结构和脂滴数量，以实验组骨小梁基本完整，脂滴基本不可见判断有效；

5.解剖大鼠，取完整股骨，置IMADA(依梦达)DPS-0.5型数显推拉力计上测定股骨抗弯曲力实验，实验组抗弯曲力大于对照组并具统计学差异(p＜0.05)为判断有效。

(二)有效组分安全性实验

1.取小鼠，分为5组，每组10只，其中对照组以生理盐水为灌胃试剂，其他组均以不同浓度的有效组分进行灌胃，灌胃后观察3天，记录每组死亡小鼠的数量，以最高浓度组(10×浓度组)小鼠死亡比例＜10％为判断安全。

动物分组：

分组	对照组	1×实验组	2×实验组	5×实验组	10×实验组
						灌胃浓度	0	1×	2×	5×	10×

注：将有效组分药效观察实验的大鼠灌胃量按照体重折算成小鼠灌胃量设定为1×浓度。

Claims (1)

1.一种杜仲抗骨质疏松有效组分的提取方法，其特征在于其提取方法分为以下步骤：

1)、把中药杜仲的干燥树皮切成小块，于3％盐水中浸泡4个小时；

2)、捞出浸泡物置120℃烘箱中烘干，粉碎机中研磨，制成粉末；

3)、加入10倍体积/重量的60％乙醇浸泡过夜，10000转/分离心20分钟，取上清液，弃沉淀，定量滤纸过滤，进一步去除不容物；

4)、上清液加至SP型大孔树脂层析柱，用30％、50％、75％、90％乙醇分别洗脱，紫外检测仪监测，分离获得不同峰物质。