CN101380359B - 健骨胶囊及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种具有益肾、壮骨、活血、止痛等作用的健骨胶囊，由硬胶囊壳和内容物组成，其内容物由下列重量份的原料药和药用辅料制成：淫羊藿2～15份、珍珠1～5份、丹参3～12份、乌梢蛇1～9份、女贞子3～12份和药用辅料0.2～0.5份，主要用于治疗原发性骨质疏松症。本发明还公开了该健骨胶囊的制备方法，操作工艺简单、安全、成本低。

Description

健骨胶囊及其制备方法

技术领域

本发明涉及中药领域，具体涉及一种具有益肾、壮骨、活血、镇痛作用的健骨胶囊及其制备方法。

背景技术

近年来，各种多发病已经逐渐从胃肠道疾病、营养不良等转移到心血管疾病及骨、骨关节方面。骨质增生、原发性骨质疏松症、腰间盘突出、颈椎病、腰椎病、风湿病等疾病很难根除且发病频繁，会时常给患者带来病痛。在现代医疗中，各种药物的治疗效果尚不明显，中医认为对于这类疑难杂症，通过中药的舒筋活络、强筋健骨及镇痛消肿等功效可使病症减轻或痊愈。

原发性骨质疏松症是老年人的一种常见全身性骨病，主要是由于骨量低及骨的微细结构有破坏，招致骨的脆性增加，容易发生骨折。该病症女性较男性多见，常见于绝经后妇女和老年人，在轻微外伤或无外伤的情况下都容易发生骨折，尤其75岁以上的妇女骨折发生率高达80％以上。

治疗原发性骨质疏松症的药物众多，有骨吸收抑制剂如雌激素、降钙素、双磷酸盐等；骨形成促进剂如氟化物、雄性激素、甲状腺素、依普拉芬等；以及骨矿化促进剂如维生素D、钙制剂。由于骨质疏松症的疗程长，长期用药会产生不同程度的副作用，如雌激素替代疗法潜在的致癌危险及其它禁忌症，所以抗骨质疏松中药制剂已成为研究热点。中医认为，人到老年后肝、肾逐渐不能生髓长骨，致使骨枯髓虚，因而确定治则多以滋补肝肾、强筋壮骨为主。目前，从“肾”论治骨质疏松症已被中、西医学者普遍接受，国内主要从淫羊藿、蛇床子、葛根等中药中提取异黄酮类来治疗骨质疏松症。

发明内容

本发明提供了一种具有益肾、壮骨、活血、镇痛等作用的健骨胶囊及其制备方法，该胶囊主要用于治疗原发性骨质疏松症。

一种健骨胶囊，由硬胶囊壳和内容物组成，所述的内容物由下列重量份的原料药和药用辅料制成：淫羊藿2～15份、珍珠1～5份、丹参3～12份、乌梢蛇1～9份、女贞子3～12份和药用辅料0.2～0.5份。

所述的药用辅料为胶囊剂常规的药用辅料，作为黏合剂，如食用油、硬脂酸镁等，本发明优选硬脂酸镁。

所述的内容物优选由下列重量份的原料药和药用辅料制成:淫羊藿13份、珍珠2份、丹参10份、乌梢蛇3份、女贞子7份和硬脂酸镁0.35份。

本发明所使用的原料药淫羊藿、珍珠、丹参、乌梢蛇和女贞子，以及药用辅料硬脂酸镁，各项指标均应符合2005版《中华人民共和国药典》记载。其中五味原料药主要有效成分及药理活性如下：

1、淫羊藿  具有补肝肾、强筋骨、祛风湿的功效，有助阳作用。淫羊藿主要含黄酮类成分，其中主要为淫羊藿苷，能明显促进幼年小鼠附睾及精囊腺的发育，能明显促进睾酮的基础分泌和cAMP的生成，具有雄性激素样作用。淫羊藿能增强下丘脑-垂体-性腺轴及肾上腺上腺皮质轴、胸腺轴等分泌系统功能。

2、丹参  为活血化瘀药，丹参煎剂有改善骨组织作用，对骨组织细胞有明显的修复作用，能促进骨细胞样细胞成熟、分泌胶原性物质和AIP，并使钙盐在胶原基质上沉积，形成骨力结节。丹参的活血化瘀作用，可促进组织的修复和再生，包括骨折愈合与其改善微循环障碍和血液流变学等作用有关。

丹参中的有效成分确认为两部分，即脂溶性成分丹参酮、隐丹参酮等，代表性成分为丹参酮IIA；另一部分为水浴性成分，主要为酚性成分，如丹参酚，丹参酸甲、乙、丙，丹酚酸A，丹酚酸B，丹参素，熊果酸，异汉魏酸等。

3、女贞子  为滋补肝肾药，主含有机酸，主要为齐墩果酸，还含磷脂类及多糖等，齐墩果酸具有保肝、抗衰老作用，能清除自由基、改善免疫功能状态。女贞子的有机溶剂提取物中有雄、雌性激素样互相调节作用。

4、珍珠  具安神定惊、明目消翳、解毒生肌之效，主含碳酸钙，含蛋白氨基酸和活性物质等有机物质，内服均用珍珠粉。

5、乌梢蛇  具祛风、通络、止痉之效，主要成分含蛋白质、脂肪、果糖1，6-二磷酸脂酶、骨胶原及17种氨基酸。

所述硬胶囊壳选用药用明胶硬胶囊，根据中华人民共和国国家标准药用明胶硬胶囊GB13731-92(国家技术监督局1992-09-28批准)制备，以满足安全用药的标准。

所述的健骨胶囊的制备方法，包括以下步骤：

(1)珍珠、乌梢蛇分别进行超细粉碎，制成珍珠超细粉和乌梢蛇超细粉，其中，珍珠超细粉中颗粒粒径小于10μm的超细粉占珍珠超细粉总重量的80％以上，乌梢蛇超细粉中颗粒粒径小于10μm的超细粉占乌梢蛇超细粉总重量的90％以上；

(2)淫羊藿、丹参和女贞子，用水提取后过滤，得到药渣和滤液；

(3)将步骤(2)中的滤液浓缩成清膏，加乙醇静置后过滤，得醇沉滤液；

(4)将步骤(2)中的药渣用乙醇回流提取，得乙醇回流滤液；

(5)将醇沉滤液与乙醇回流滤液合并，减压浓缩同时回收乙醇，将合并的滤液浓缩成稠浸膏，趁热加入步骤(1)制备的珍珠超细粉与乌梢蛇超细粉，混合均匀，干燥后得干膏粉，粉碎至80目细粉，加硬脂酸镁混匀，填充入硬胶囊壳，封口，即得健骨胶囊。

所述制备方法的步骤(1)中，珍珠、乌梢蛇可先经炮制、粗粉碎，再进行超细粉碎，以达到好的粉碎效果。因为经炮制烘干的珍珠质地变松脆，易于粉碎；生乌梢蛇质韧难干粉碎，须经炮制后方可改变其质地，便于粉碎。

淫羊藿、丹参、女贞子三味原料药的提取方法，在研究中以淫羊藿苷、丹参酮IIA、丹参素作为指标成分，考察水提取、水提加醇提、乙醇回流提取三种方法的提取效果，结果水提加醇提的提取效果最好，提得指标成分除丹参素的提得含量与提得率与水提取接近外，其余均明显高于水提取和乙醇回流提取，因此，选用水提加醇提的提取方法作为淫羊藿、丹参、女贞子三味原料药的提取方法。所述水提加醇提的提取方法是将淫羊藿、丹参、女贞子三味原料药用水提取后，得到药渣和滤液，再用乙醇回流提取药渣。

淫羊藿、丹参、女贞子用水提取过程中水用量、水浸渍时间、煎煮时间这三个因素对提取效果没有显著影响。药渣用乙醇回流过程中乙醇浓度、提取时间、提取次数、乙醇用量这四个因素，乙醇用量、提取次数对提取效果有显著影响，其余因素均无显著影响。通过大量试验发现，优选用10倍原料量(淫羊藿、丹参和女贞子三种原料药的重量)的水浸渍1小时，煎煮1.5小时，药渣再用12倍原料量(淫羊藿、丹参和女贞子三种原料药的重量)、体积百分比浓度80％的乙醇，回流提取1次，提取时间1.5小时的工艺条件，具有效果好、省时、节能、成本低等优点。

步骤(2)中的滤液优选浓缩至20℃时相对密度(以水为标准物质)1.10～1.14的清膏，加乙醇使含醇量达70％，静置24小时过滤，得醇沉滤液，含醇量为乙醇占清膏和乙醇总重量的重量百分比。

步骤(3)中对水提取滤液作浓缩醇沉处理，以减少服用剂量，增强抗吸湿作用，通过进行大量不同浸膏浓度与含醇量的浓缩醇沉处理工艺试验，结果发现对水提取滤液作浓缩醇沉处理后，对指标成分淫羊藿苷、丹参酮IIA、丹参素的含量并无显著影响，同时还可以有效减少药物的服用剂量，增强抗吸湿作用。

步骤(5)中合并的滤液优选浓缩至60℃相对密度(以水为标准物质)1.30～1.38的稠浸膏后，趁热加入珍珠超细粉与乌梢蛇超细粉，混合均匀，80℃真空干燥制备干膏粉。

步骤(5)中采用80℃真空干燥，可大幅度减少烘干时间，节约能源，且干浸膏质地疏松，易粉碎至80目成干膏粉。采用干膏粉加硬脂酸镁混匀后灌装胶囊，即可克服干膏粉流动性差的问题，又不会增加堆密度，采用1号胶囊，每粒平均装量即可达到0.4g，因此优选用干膏粉加硬脂酸镁混匀后直接灌装胶囊，这样服用的胶囊较小，服用方便，且可省去用乙醇做药用辅料时制粒、烘干、整粒等工序，节省工时和成本，同时可避免用乙醇制粒后在烘干过程中的安全隐患。

本发明制备的健骨胶囊具有益肾、壮骨、活血、止痛等作用，选用蛇类药乌梢蛇，不仅能加强祛风通络、健骨壮筋的作用，而且由于蛇类药含有大量氨基酸，具有促胶原蛋白的合成、促骨质形成和提高骨密度的作用。该健骨胶囊中配以珍珠及补肾活血止痛中药丹参和淫羊藿，能较好地改善患者疼痛等的临床症状，有别于目前中医药治疗原发性骨质疏松多以补肾为主且均用植物性药物的方法和思路。

具体实施方式

实施例1

淫羊藿520g、珍珠80g、丹参400g、乌梢蛇120g、女贞子280g和硬脂酸镁14g。

按上述配方制备健骨胶囊，制备方法包括以下步骤：

(1)珍珠超细粉的制备：将珍珠洗净，加等重量的水，煮沸0.5小时，取出，滤干，置于不锈钢盘内，于150～160℃烘箱中烘干并具爆裂声即炮制好。取炮制好的珍珠，用中药粉碎机粉碎2次，第一次粉碎至30目细粉，再进行第二次粉碎，粉碎至60目细粉。将60目细粉缓缓加入气流磨中进行超细粉碎，收集超细粉，颗粒粒径小于10μm的超细粉占珍珠超细粉总重量的80％以上。

乌梢蛇超细粉的制备：取乌梢蛇去头、尾、鳞片，切成段，加黄酒拌匀闷涧至黄酒吸尽(每100kg，加黄酒20kg)晾干，按砂烫法将乌梢蛇段不断翻炒至外表呈浅棕黄色，筛尽油砂，放凉即炮制好。将炮制好的乌梢蛇用中药粉碎机粉碎至60目细粉。将60目细粉缓缓加入气流磨中进行超细粉碎，收集超细粉，颗粒粒径小于10μm的超细粉占乌梢蛇超细粉总重量的90％以上。

(2)淫羊藿、丹参和女贞子，加原料重量10倍量水浸渍1小时，加热煮沸1.5小时后过滤，得到药渣和滤液；

(3)将步骤(2)中的滤液浓缩至相对密度1.10(20℃)的清膏，加乙醇使含醇量达70％，静置24小时过滤，得醇沉滤液；

(4)将步骤(2)中的药渣用原料重量12倍量、体积百分比浓度80％的乙醇，加热回流1.5小时后过滤，得乙醇回流滤液；

(5)将醇沉滤液与乙醇回流滤液合并，减压浓缩同时回收乙醇，滤液浓缩至相对密度1.30(60℃)的稠浸膏，趁热加入步骤(1)制备的珍珠超细粉与乌梢蛇超细粉，混合均匀，80℃真空干燥得干膏粉，粉碎至80目细粉，加硬脂酸镁混匀，填充入硬胶囊壳，封口，制成1000粒健骨胶囊。

实施例2

淫羊藿80g、珍珠160g、丹参320g、乌梢蛇360g、女贞子480g和硬脂酸镁14g。按照实施例1的制备方法，步骤(2)中滤液浓缩至相对密度1.14(20℃)的清膏，步骤(4)中滤液浓缩至相对密度1.38(60℃)的稠浸膏，制成1000粒健骨胶囊。

实施例3

淫羊藿200g、珍珠200g、丹参120g、乌梢蛇120g、女贞子400g和硬脂酸镁10.4g。按照实施例1的制备方法，步骤(2)中滤液浓缩至相对密度1.10(20℃)的清膏，步骤(4)中滤液浓缩至相对密度1.35(60℃)的稠浸膏，制1000粒健骨胶囊。

实施例4

淫羊藿320g、珍珠40g、丹参200g、乌梢蛇40g、女贞子200g和硬脂酸镁8g。按照实施例1的制备方法，步骤(2)中滤液浓缩至相对密度1.13(20℃)的清膏，步骤(4)中滤液浓缩至相对密度1.33(60℃)的稠浸膏，制1000粒健骨胶囊。

实施例5

淫羊藿600g、珍珠120g、丹参480g、乌梢蛇240g、女贞子120g和硬脂酸镁15.6g。按照实施例1的制备方法，步骤(2)中滤液浓缩至相对密度1.10(20℃)的清膏，步骤(4)中滤液浓缩至相对密度1.33(60℃)的稠浸膏，制1000粒健骨胶囊。

一、健骨胶囊稳定性试验

1.质量标准

1.1性状：本品为硬胶囊剂，内容物为棕色或黄棕色粉末或细小颗粒，气微香，略腥，味微苦。

1.2鉴别：丹参TLC，荧光灯(254nm)下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。

女贞子TLC，供试品色谱中，在与齐墩果酸对照品色谱相应的位置上显相同紫红色斑点。

1.3检查：重量差异，不得过±10％；崩解时限，应不得过30min；水分含量，应不得过9.0％；细菌，不得过10000个/g；霉菌与酵母菌，应不得过100个/g；大肠杆菌，不得检出；沙门氏菌，不得检出；活螨，不得检出。

1.4含量测定：淫羊藿苷，每粒含淫羊藿苷(C₃₃H₄₀O₁₅)计，不得少于2.2mg；总钙，每粒含总钙(Ca²⁺)不得少于30mg。

2.实验方法与结果

实施例1、2、3、4、5制备的健骨胶囊，包装为铝塑泡罩12粒/板，外封铝塑袋密封，2板/袋，室温下放置12个月，分别在0月、1月、2月、3月、6月、12月进行检测，结果表明样品均符合上述质量标准的规定(即临床研究用药品质量标准草案检测中本品质量标准草案的规定)，质量稳定。

二、健骨胶囊急性毒性试验

1.受试药物

实施例1制备的健骨胶囊，杭州华东医药集团有限公司加工，批号051109。

ICR小鼠20只，体重18±2g，♀♂各半，浙江省中医药研究院实验动物中心提供，动物合格证号为第SYXK(浙)2004-0034号。分每笼6只饲养，饲养室温度为25±1℃，相对湿度为65±10％，饲以固体饲料(浙江省医学科学院实验动物中心制)，自由饮水。

2.实验方法

取小鼠，标记，称重，按性别随机分成2组，每组10只：用药组和对照组，每组雌、雄分开。禁食不禁水12h后，一次灌胃给药0.40ml/10g，一天2次。剂量为含健骨胶囊16g/kg，对照组给予等容积的蒸馏水。给药后自由饮食，每天上、下午各观察一次，连续一周。

3.观察指标

3.1体重：每天称量一次，见表1。

3.2进食量及饮水量：每天称加入量和剩余量，计算差值即得，见表2、表3。

3.3症状观察

3.3.1神经系统

(1)行为及反应：不正常叫声、烦燥不安、易怒、感觉过敏、少动、嗜睡或昏迷等；

(2)运动：包括肌肉抽搐、僵硬、强迫运动、松弛、麻痹等；

(3)瞳孔及分泌物：瞳孔放大或缩小、流泪、鼻分泌、流涎等。

3.3.2胃肠：腹部胀气或收缩，大便坚硬，较湿，不成形或黑便、土色便。

3.3.3泌尿生殖系统：尿颜色、阴唇、乳腺肿胀、会阴部是否肮脏。

3.3.4皮肤和毛：颜色、完整性、有否充血、紫绀、苍白、皮疹、毛松散等。

3.3.5眼：眼睑下垂、眼球突出、震颤等。

上述症状指标采用肉眼直接观察，连续观察7天。

4.统计方法

所有计量数据均表示为X±SD，采用SPSS12.0软件进行方差分析及组间检验。

5.指标观察结果

5.1健骨胶囊对小鼠体重的影响

给药前小鼠禁食12小时，各组体重均有下降；给药后恢复正常进食进水，则开始增长，增长趋势基本接近，连续7天，用药组与对照组相比无显著差异。结果表明，健骨胶囊对小鼠体重增长无影响，见表1。

表1 健骨胶囊对体重的影响(单位：g，X±SD)

5.2健骨胶囊对小鼠进食量的影响

因给药前小鼠禁食12小时，给药后当天撤销禁食，各组小鼠进食量增加，之后稳定。连续7天，用药组与对照组相比无显著差异。结果表明，健骨胶囊对小鼠进食量无明显影响，见表2。

表2 健骨胶囊对小鼠进食量的影响(单位：g/只，X±SD)

5.3健骨胶囊对小鼠饮水量的影响

因给药前小鼠禁食12小时，给药后当天撤销禁食，随着各组小鼠进食量增加，饮水量也增加，后下降至一定水平，基本比较稳定。连续7天，用药组与对照组相比无显著差异。结果表明，健骨胶囊对小鼠饮水量无明显影响，见表3。

表3 健骨胶囊对小鼠饮水量的影响(单位：ml/只，X±SD)

5.4健骨胶囊急毒试验对小鼠神经、胃肠、泌尿生殖、皮肤、毛及眼等的影响

实验结果显示，以上各方面均未见异常现象。

6.结果

健骨胶囊给药后连续观察7天，各项指标均未见异常。最大给药量为含健骨胶囊16g/kg，相当于临床剂量的635倍，未引起小鼠死亡，表明该药急性毒性甚小，口服安全，可以提供临床用药。

三、健骨胶囊长期毒性试验

1.试验材料

1.1实施例1制备的健骨胶囊：棕黄色干膏粉，杭州华东医药集团有限公司生产，(我院委托加工)，每克含3.2克生药，批号：051109。

1.2动物：SD大鼠，清洁级，120只，雌雄各半，体重180-220g，由浙江省中医药研究院实验动物室提供。许可证：SYXK(浙)2004-0034。

2.仪器

日立7060型全自动生化分析仪，日本日立公司生产；KX21全自动血细胞分析仪，日本东亚公司生产；德国Leica组织切片机；赛多利斯电子天平BS210S。

本试验采用SD大鼠，每组30只，雌雄各半，健骨胶囊剂量分别为1.8g/kg(5.76g生药/kg)、0.9g/kg(2.88g生药/kg)、0.45g/kg(1.44g生药/kg)组(分别相当于临床用量的20倍、10倍、5倍)。另设常水对照组，连续灌胃给药13周。实验结果显示：各组大鼠的活动、外表、毛色和大便等均未发现明显异常现象。各剂量组给药3月、6月、13周及停药二周血常规与水对照组比较均无明显差异(P>0.05)。各剂量组给药3月、6月、13周及停药二周的生化指标与水对照组比较均无明显差异(P>0.05)。组织局检显示各组大鼠的心、肝、肾、脾、大脑、垂体、甲状腺、胃、脊髓(颈、胸、腰段)、小肠和大肠、胸腺、肾上腺、膀胱、视神经、淋巴结、卵巢、子宫、前列腺、睾丸、附睾外形与大小均正常，表面光滑，切面未见异常。病理镜检显示对照组及给药组个别大鼠有肺充血，其他脏器未见明显异常。结果显示，大鼠口服健骨胶囊3个月，一般状况、血常规、血液生化、脏器系数、组织巨检与病理检查均未发现与用药有关的变化，因此健骨胶囊以0.45g/kg、0.9g/kg、1.8g/kg连续灌胃给药6个月，对大鼠无明显的毒副作用，故临床用药是安全的。

四、健骨胶囊主要药效学研究

通过去势术建立骨质疏松大鼠模型，观察健骨胶囊对雌激素缺乏引起的骨质疏松模型大鼠的骨质、骨代谢及血流变的影响，观察健骨胶囊的药效作用。结果如下：

1.试验对象

实施例1制备的健骨胶囊，为棕黄色干膏粉，杭州华东医药集团有限公司加工，批号051109。

仙灵骨葆胶囊，为棕黄色干膏粉，贵州同济堂制药股份有限公司生产，批号030901。

戊巴比妥钠，中国医药(集团)上海化学制药公司，批号F20030816。

2.仪器

多利斯电子天平BS210S，Leica高级荧光生物显微镜，徕卡-DMLB图象分析软件；病理组织漂烘仪ZMN-6802、全自动组织包埋机ZMN-7803、德国莱卡切片机RM2235、GE双能窄角扇形骨密度仪。

3.动物模型与分组

4.月龄未交配的SD大鼠，雌雄各半120只，体重230±20g。由浙江省中医药研究院动物中心提供，合格证号：SYXK(浙)2004-0034。将大鼠随机分为6组，每组10只，分别为高、中、低剂量组，阳性药组、模型组和空白组，高、中、低剂量组、阳性药组、及模型组大鼠去势，空白组大鼠假切除。适应性饲养7d，开始实验时平均体重240±12g。分笼饲养，饲养于室温23℃～25℃，相对湿度50％～70％的清洁环境中，自由摄食和摄水。去势以2％戊巴比妥钠(2g/100ml)，40mg/kg剂量，(0.2ml/100g)，腹腔注射麻醉。2％碘酒消毒，75％酒精消毒消毒，雌性于背部躯干下1/3处脊柱两侧旁开1cm作纵形切口，长约1-2cm，分离肌肉层。取卵巢在卵巢下用0号丝线，打结，剪去卵巢和多余丝线，放回腹腔缝合伤口。雄性取仰卧式，碘酒、酒精消毒阴囊皮肤，纵隔旁相距1cm各开一纵行切口，剪开鞘膜后，分别将双侧睾丸与附睾分离(不切除)，切除睾丸，然后放回阴囊，缝合切口。术后均给予青霉素5万单位/只，腹腔注射3天。第4后大鼠以常规饲料喂养，第7天拆线。

造模后每月测体重1次，四个月后测骨密度，并开始给药干预。用当天蒸馏水配制，健骨胶囊低、中、高剂量组分别以健骨胶囊0.45g/kg、0.9g/kg、1.8g/kg(相当于临床成人剂量的5倍、10倍、20倍)灌胃给药。阳性药对照组，选用仙灵骨葆胶囊0.5g/kg(相当于临床成人剂量的10倍)灌胃给药。模型组及空白组灌以蒸馏水2ml/100g灌胃给药。灌胃六个月后各组动物以2％戊巴比妥钠按40mg/kg剂量，腹腔注射麻醉，检测骨密度；静脉抽血处死，取全血做血流变检测，血清分别检测碱性磷酸酶(AKP)、血钙Ca²⁺、骨特异性碱性磷酸酶(BAP)、血清抗酒石酸酸性磷酸酶TRAP，取动物双侧后肢骨福尔马林固定，组织学分析。

4.1骨代谢全血肝素抗凝后即送血液粘稠度的检测，血清进行抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)、骨特异性碱性磷酸酶(BAP)、血清碱性磷酸酶(AKP)、血钙的检测。取0.2ml血清，稀释5倍，37℃温育1h，以灭活红细胞释放出的TRAP，取孔酶标板，每孔加入50μl稀释血清，再加入等体积反应混合液，温箱孵育1h，氢氧化钠接线片终止反应。在酶标仪410nm波长比色。每样标本同时作2管，取均值。TRAP活力单位：在37℃，pH5.0，5.40mmol/L酒石酸钠存在下，水解1mmol对硝基苯磷酸盐，产生1mmol对硝基苯酚为1U/L。

4.2骨组织双下肢股骨用10％福尔马林固定，固定24小时后在股骨中段锯断股骨，弃去远端，近端用EDTA进行脱钙60天，完成脱钙后于断端取0.3cm长股骨一段，将剩下的股骨沿股骨头正中作一纵切面，二块骨组织均作常规石蜡切片，HE染色，光镜观察。进行常规病理形态学观察。测量股骨横断面骨皮质厚度，以股骨断面的嵴部为测量的第一点，第二、第三个测量点为另二个1/3的等分处，最后求出平均值。测量骨小梁的直径，在股骨头的切面上随机测量5处骨小梁的直径，并求出平均值。

4.3统计学处理：所有数据输入计算机，用SPSS11.0 for windows版本软件进行t检验和方差分析，计量资料结果以均值±标准差(X±SD)表示。

5.结果

5.1对SD去势大鼠骨质疏松模型骨密度的影响

SD大鼠去势造模后4月，各组骨密度较正常对照略有降低，但不明显P>0.05，经过6个月的治疗后，各组骨密度较模型组有上升趋势，以中剂量、低剂量明显，脊椎骨密度分别比模型组上升，差异有显著意义，分别P<0.05、与P<0.01。右躯干阳性药与中剂量骨密度分别比模型组上升差异有显著意义P<0.05。

5.2健骨胶囊对去势大鼠骨质疏松模型骨质病理改变的影响

所有实验大鼠骨组织中未见炎症反应，亦未见明显的骨小梁断裂等病变。模型组骨皮质普遍变薄，骨小梁直径变小，与正常组对比有显著意义P<0.05，给药各组骨皮质厚度及小梁直径均有不同程度回升，以高剂量组最为明显其股骨头骨小梁径0.073±0.007，与模型组对比差异有显著意义P<0.05见表4。显示中药健骨胶囊可促进去势大鼠骨组织生长。

表4 健骨胶囊对去势大鼠骨质疏松模型骨质病理改变的影响(X±SD)(单位：mm)

注：^*表示与正常对照组比较，^▲表示与模型组比较

^*表示P<0.05，^**表示P<0.01；^▲表示P<0.05，^▲▲表示P<0.01

5.3对SD去势大鼠骨质疏松模型AKP、Ca²⁺、BAKP、TRAP的影响

各组间碱性磷酸酶活性无显著差异(P>0.05)，而抗酒石酸酸性磷酸酶活性、AKP均阳性对照组和健骨胶囊治疗组明显低于骨质疏松模型组，差异有显著意义(P<0.05)，说明健骨胶囊能抑制抗酒石酸酸性磷酸酶的活性。结果见表5、表6。

表5 健骨胶囊对去势大鼠骨质疏松模型血BAP、TRAP的影响

注：^*表示与正常对照组比较，^▲表示与模型组比较

^*表示P<0.05，^**表示P<0.01；^▲表示P<0.05，^▲▲表示P<0.01

表6 健骨胶囊对大鼠血清碱性磷酸酶、钙、磷的影响(X±SD)

注：^*表示与正常对照组比较，^▲表示与模型组比较

^*表示P<0.05，^**表示P<0.01；^▲表示P<0.05，^▲▲表示P<0.01

5.4对SD去势大鼠骨质疏松模型血流变的影响

由表7可见模型组全血粘度低切、全血粘度中切、全血粘度高切均较正常对照组升高P<0.01，健骨胶囊高剂量组的全血粘度低切、全血粘度中切、全血粘度高切明显低于模型组均P<0.01。

表7 健骨胶囊对大鼠血流变的影响(X±SD)

注：^*表示与正常对照组比较，^▲表示与模型组比较

^*表示P<0.05，^**表示P<0.01；^▲表示P<0.05，^▲▲表示P<0.01

6.结论

健骨胶囊主要由淫羊藿、珍珠、丹参、乌梢蛇、女贞子组成，体外试验研究表明健骨胶囊含药血清对成骨细胞体外增殖、分化与矿化具有刺激作用，可抑制体外培养破骨细胞的成熟及其骨吸收能力。对脊椎和躯干骨密度较模型组有上升趋势，以中剂量、低剂量明显，P<0.05、P<0.01。血清血检测表示其能抑制抗酒石酸酸性磷酸酶的活性，骨密度检测治疗各组骨密度较模型组有上升趋势，以健骨胶囊中剂量、低剂量明显，脊椎骨密度分别比模型组上升，右阳性药与中剂量骨密度分别比模型组上升P<0.05。健骨胶囊对去势大鼠骨质疏松模型骨质病理改变也表现出模型组骨皮质普遍变薄，骨小梁直径变小，给药各组骨皮质厚度及小梁直径均有不同程度回升，显示中药健骨胶囊可促进去势大鼠骨组织生长，促进骨形成，防治原发性骨质疏松的作用。

五、健骨胶囊镇痛实验

1.实验对象

实施例1制备的健骨胶囊，委托杭州华东医药集团有限公司加工，批号051109。

仙灵骨葆胶囊，为棕黄色干膏粉，贵州同济堂制药股份有限公司生产，批号030901。

巴米尔(乙酰水杨酸水溶片)，白色片剂，阿斯特拉(无锡)制药有限公司生产，批号343401。

戊巴比妥钠，中国医药(集团)上海化学制药公司，批号F20030816。

2.实验方法

ICR小鼠，体重20～24g。由浙江省中医药研究院实验动物研究中心提供。实验动物合格证号：SYXK(浙)2004-0034。

小鼠热板法镇痛实验前对ICR小鼠进行筛选，将其置于(55±1)℃的热板上，以放置于热板上至出现小鼠舔后足所需的时间(S)为该鼠的正常痛阈值。每组按不同浓度单次灌胃给药连续3天(0.2ml/10g鼠)，第三天灌胃后半小时进行铁板实验(直径18cm，高15cm的不锈钢圆筒放置于55±0.5℃的水浴内，将小白鼠放入，以舔后足作为疼痛反应指标)每半小时进行一次，记录每次小白鼠痛阈时间。共观察至150分钟(5次)。

3.分组及给药

选择正常瘤阈值在5～30s内的合格小鼠120只，雌雄各半，随机分为12组，雌性小白鼠分6组，雄性小白鼠分6组，每组10只，设空白对照组，健骨胶囊3个剂量组，仙灵骨葆胶囊阳性组，模型巴米尔对照组。合格小鼠于实验前禁食12h，供饮水。灌胃药物配制及给药量：当天用蒸馏水配制，健骨胶囊低、中、高剂量组分别相当于成人临床剂量的10、20、30倍，阳性组灌以仙灵骨葆胶囊，模型组灌以巴米尔人的20倍剂量为灌胃量，空白组灌以蒸馏水。灌胃量以0.2ml/10g计。

4.数据处理

所有实验数据以X±SD表示，计量资料由SPSS12.0统计软件进行方差分析及组间检验。

5.结果

对小鼠热刺激痛阈值的影响：在各测定时间内，空白对照组痛阈值均无明显变化(P<0.05)。给药后30min，各给药组效果明显，在药后30～120min时热板法测得健骨胶囊镇痛作用随剂量的加大而增强，健骨胶囊组小鼠的痛阈值随给药时间延长比模型组而逐渐增大，痛阈明显提高P<0.05。但该药的早期作用(药后30min)弱于阳性对照药巴米尔。健骨胶囊对雌性、雄性小鼠镇痛作用的影响数据，见表8、表9。本实验的结果为健骨胶囊组小鼠的痛阈值随给药时间延长，明显提高小鼠痛阈，较模型组明显增大P<0.05。

表8 健骨胶囊对雌性小鼠镇痛作用的影响(X±SD)

注：^**＂表示与空白组相比较，P<0.05用＂^*＂表示，P<0.01用＂^**＂表示

＂^▲＂表示与模型组相比较，P<0.05用＂^▲＂表示，P<0.01用＂^▲▲＂表示

表9 健骨胶囊对雄性小鼠镇痛作用的影响(X±SD)

注：^**＂表示与空白组相比较，P<0.05用＂^*＂表示，P<0.01用＂^**＂表示

＂^▲＂表示与模型组相比较，P<0.05用＂^▲＂表示，P<0.01用＂^▲▲＂表示

六、健骨胶囊体外药效学研究

1.中药含药血清的制备

1.1实验药物

实施例1制备的健骨胶囊：杭州华东医药集团有限公司生产，批号051109。

仙灵骨葆胶囊：贵州同济堂制药股份有限公司生产，批号061038040。

1.2主要仪器

台式低温高速离心机SIGMA 3K18，sigma公司。

升降恒温水浴箱W501，上海申胜生物技术有限公司。

1.3实验动物及分组

实验SD大鼠60只，雌雄各半，体重240～260g。由浙江省中医药研究院动物中心提供。实验动物合格证号：SYXK(浙)2004-0034。共分5组(正常组、健骨胶囊高、中、低三个剂量组、阳性药对照组)，每组12只。正常组，灌服生理盐水。健骨胶囊低、中、高剂量组，分别以健骨胶囊0.45g/kg、0.9g/kg、1.8g/kg(相当于临床成人剂量的5倍、10倍、20倍)灌胃给药。阳性药对照组，选用仙灵骨葆胶囊0.5g/kg(相当于临床成人剂量的10倍)灌胃给药。

1.4实验方法

各组大鼠分别灌胃给药，给药体积为1.5ml/100g，2次/d，间隔6h，连续2天，第3天首次给药2h后再次给药。末次给药1h后，麻醉，心脏采血。低温-4℃，离心2500rmp×25min，吸取上清。56℃水浴30min灭活，微孔滤膜过滤除菌，分装后-20℃保存备用。

2.健骨胶囊含药血清对成骨细胞(OB)骨形成促进作用药效研究

2.1含药血清

由浙江省中医药研究院制备提供，采集自4月龄雄性SD大鼠(260g)，包括正常对照组(CN)、健骨胶囊低剂量组(L)、健骨胶囊中剂量组(M)、健骨胶囊高剂量组(H)和阳性药对照组(CP)。

2.2成骨细胞培养

由新生大鼠头盖骨分离培养成骨细胞，经碱性磷酸酶染色鉴定后取第二继代细胞用于研究。

2.3评价指标

①体外增殖：细胞以2000/孔接种于96孔板，次日更换含药血清培培养液，3天后用MTT方法检测细胞量，结果以OD(A570)值表示。

②体外分化：细胞以2000/孔接种于96孔板，次日更换含药血清培培养液，3天后用PNPP法检测细胞碱性磷酸酶(ALP)活性，结果以OD(A405)值表示。

③体外矿化：细胞以10⁴/孔接种于48孔培养板，次日更换含药血清培养液，以后2天换液一次至矿化结节形成，茜素红染色，40倍光镜下观察\摄影，IPP形态计量软件分析矿化结节形成面积，结果以μm²/结节表示。

2.4统计分析

数据表示为X±S，采用Benferroni方差分析，设p<0.05有统计学意义。

2.5试验结果

①成骨细胞鉴定培养细胞ALP组化染色，结果显示胞浆内ALP兰色阳性颗粒。

②对OB体外增殖的影响

表10 健骨胶囊对OB增殖的影响(X±S)

与CN组比较：^*P<0.05；^**P<0.01；^***P<0.001

表10中可见三批实验结果显示健骨胶囊含药血清对体外培养成骨细胞均具有增殖刺激作用。与空白对照组比较，除实验一的低剂量组的增加未显示统计学意义，其它各剂量组均显示显著的OB增殖刺激作用(P<0.05-0.001)，其中二批实验结果显示中剂量组的作用最强；阳性对照组也显示对体外培养成骨细胞的显著增殖刺激作用(P<0.05-0.001)。

③对OB体外分化的影响

表11三批实验结果显示，健骨胶囊含药血清各剂量对体外培养成骨细胞均具有分化刺激作用。与空白对照组比较，中、低剂量组二批实验的作用具有统计学意义(P<0.05-0.001)，高剂量组一批实验的作用具有统计学意义(P<0.01)；阳性对照组也显示分化刺激作用，其中实验一的作用具有显著性(P<0.05)。

表11 健骨胶囊对OB分化的影响(X±S)

与CN组比较：^*P<0.05；^**P<0.01；^***P<0.001

④对OB体外矿化的影响表12显示，健骨胶囊含药血清各剂量均显示对体外培养成骨细胞矿化刺激作用。与空白对照组比较，低、中、高三个剂量分别增加1.1％、6.1％与16.0％；阳性对照组增加14.8％。各组间均未显示统计学意义。

表12 健骨胶囊对OB体外矿化的影响

2.6结论

健骨胶囊含药血清对成骨细胞体外增殖、分化与矿化具有刺激作用。

3.健骨胶囊含药血清对破骨细胞(OC)骨吸收抑制作用药效研究

3.1含药血清

由浙江省中医药研究院制备提供，采集自4月龄雄性SD大鼠(260g)，包括阴性对照组(CN)、健骨胶囊低剂量组(L)、健骨胶囊中剂量组(M)、健骨胶囊高剂量组(H)和阳性药对照组(CP)。

3.2破骨细胞培养

由2-3日龄SD大鼠四肢长骨分离获得OC，培养于含10％FBS的MEM培养液。

3.3评价指标

①TRAP阳性细胞数(培养3天，计数TRAP阳性多核细胞，结果以个/孔)。

②吸收陷窝分析(骨片培养7天，计量吸收陷窝面积，结果以μm²/骨片)。

3.4统计分析

数据表示为x±S，采用Benferroni方差分析，设p<0.05有统计学意义。

3.5试验结果

①TRAP阳性细胞数表13结果显示健骨胶囊含药血清各剂量组对体外培养TRAP阳性破骨细胞数的抑制作用，其中中、高剂量组的作用具有统计学意义(P<0.001，P<0.001)；阳性对照组也显示显著抑制作用(P<0.001)。

表13 体外培养3天TRAP阳性破骨细胞数(n＝8)

注：与CN比较，^***p<0.001

②吸收陷窝面积表14结果显示健骨胶囊含药血清各剂量组对体外培养破骨细胞骨吸收的抑制作用，高剂量组骨片吸收陷窝面积减少具有统计学意义(P<0.01)；阳性对照组的骨片吸收陷窝面积也显著减少(P<0.05)。

表14 骨片吸收陷窝面积(n＝8)

注：与CN比较，^*p<0.05^**p<0.01

3.6结论

健骨胶囊含药血清可抑制体外培养破骨细胞的成熟及其骨吸收能力。

Claims (3)

1.一种健骨胶囊，由硬胶囊壳和内容物组成，其特征在于：所述的内容物由下列重量份的原料药和药用辅料制成：淫羊藿2～15份、珍珠1～5份、丹参3～12份、乌梢蛇1～9份、女贞子3～12份和药用辅料0.2～0.5份；

所述的药用辅料为硬脂酸镁；

所述的健骨胶囊的制备方法，包括以下步骤：

(1)珍珠、乌梢蛇分别进行超细粉碎，制成珍珠超细粉和乌梢蛇超细粉，其中，珍珠超细粉中颗粒粒径小于10μm的超细粉占珍珠超细粉总重量的80％以上，乌梢蛇超细粉中颗粒粒径小于10μm的超细粉占乌梢蛇超细粉总重量的90％以上；

(2)淫羊藿、丹参和女贞子，用水提取后过滤，得到药渣和滤液；

(3)将步骤(2)中的滤液浓缩成清膏，加乙醇静置后过滤，得醇沉滤液；

(4)将步骤(2)中的药渣用乙醇回流提取，得乙醇回流滤液；

(5)将醇沉滤液与乙醇回流滤液合并，减压浓缩同时回收乙醇，滤液浓缩成稠浸膏，趁热加入步骤(1)制备的珍珠超细粉与乌梢蛇超细粉，混合均匀，干燥后得干膏粉，粉碎至80目细粉，加硬脂酸镁混匀，填充入硬胶囊壳，封口，即得健骨胶囊。

2.如权利要求1所述的健骨胶囊，其特征在于：所述的内容物由下列重量份的原料药和药用辅料制成：淫羊藿13份、珍珠2份、丹参10份、乌梢蛇3份、女贞子7份和硬脂酸镁0.35份。

3.如权利要求1所述的健骨胶囊，其特征在于：所述的健骨胶囊的制备方法，包括以下步骤：

(1)珍珠、乌梢蛇分别进行超细粉碎，制成珍珠超细粉和乌梢蛇超细粉，

其中，珍珠超细粉中颗粒粒径小于10μm的超细粉占珍珠超细粉总重量的80％以上，乌梢蛇超细粉中颗粒粒径小于10μm的超细粉占乌梢蛇超细粉总重量的90％以上；

(2)淫羊藿、丹参和女贞子，用原料重量10倍量的水浸渍1小时，煎煮沸1.5小时后过滤，得到药渣和滤液；

(3)将步骤(2)中的滤液浓缩至20℃相对密度1.10～1.14的清膏，加乙醇使含醇量为70％，静置24小时过滤，得醇沉滤液；

(4)将步骤(2)中的药渣用原料重量12倍量、体积百分比浓度80％的乙醇加热回流1.5小时后过滤，得乙醇回流滤液；

(5)将醇沉滤液与乙醇回流滤液合并，减压浓缩同时回收乙醇，滤液浓缩至60℃相对密度1.30～1.38的稠浸膏，趁热加入步骤(1)制备的珍珠超细粉与乌梢蛇超细粉，混合均匀，80℃真空干燥得干膏粉，粉碎至80目细粉，加硬脂酸镁混匀，填充入硬胶囊壳，封口，即得健骨胶囊。