CN101239083A - 女贞子的医药新用途及其药物制剂 - Google Patents

Abstract

本发明公开了女贞子以及女贞子提取物在制备用于预防或治疗骨质疏松症的药物中的医药新用途，还公开了一种预防或治疗骨质疏松症的颗粒剂，所述颗粒剂含有25％－35％的女贞子提取物和65％－75％的赋形剂，赋形剂选用蔗糖、糊精，或者是制成胶囊剂，所述胶囊剂含有女贞子提取物，本发明的女贞子单味药在预防或治疗骨质疏松症上的应用以及相应的药物制剂具有疗效确切、毒副作用低、用药更安全、制备工艺简便、成本较低的优点。

Description

女贞子的医药新用途及其药物制剂

技术领域：

本发明涉及调控骨代谢、维护骨骼健康以及预防和治疗骨质疏松症的药物，具体的说是涉及女贞子及女贞子提取物的医药新用途及其药物制剂。

背景技术：

骨质疏松症是以骨量减少、骨组织微结构退化，以至骨脆性增加及骨折危险增加为特征的代谢性骨病。骨质疏松症被国际医学界排放在同高血压、动脉硬化、糖尿病、肿瘤并列的位置上，是当前的五大疾病之一。目前全世界约2亿人患有骨质疏松症，我国骨质疏松症患者已近9000万人，其中2000万人发生过骨折。随着老龄化社会的到来，其发病率逐年上升，不论是给个人、家庭，还是给政府、社会都带来了严重的后果。目前，临床上主要使用能够促进骨形成或抑制骨吸收的药物防治骨质疏松症，然而，这些药物的长期使用，会给患者带来很多副作用，包括子宫出血，增加患者子宫肌瘤和乳腺癌的危险，消化道反应，恶心、腹泻，腿部痉挛痛等。因此，中医药防治骨质疏松症的研究日益受到重视，且中药因其天然药源和疗效肯定等优点，在我国具有独特的优势，这引起医学界的极大关注。

从已发表过的学术论著、公告的专利以及市售的成药来看，在中药防治骨质疏松症领域中，多采用几种或十几种不同中药按照一定的比例配伍组成的复方制剂，如专利号为：01133645.5、200310119213.8、200410043635.6的中国专利，分别公开了一种用于骨质疏松症的药物组合物、一种治疗骨质疏松症的中药组合物及其制备方法、骨松停胶囊及其制作方法，尽管能够更有效的发挥中药多环节、多靶点的整体调节作用，但是无疑也增加了制备方法的复杂性及成本费用，更重要的是，复方药物成分将更加复杂，很难制定质量控制指标体系及确定作用物质基础，而且，对于复方及各组方的体内作用靶点也研究的不够清楚。

中医理论认为，女子属阴，血为本，阴常不足，是由于妇女特有的经、孕、产、乳四大生理特点。周期性的耗血伤阴，致肾精日衰，渐至天癸竭，乃肾之精气衰竭。此外，“形不动则精不流”，绝经后妇女活动量日渐减少，致使“精不流”，骨失所养而骨质疏松。女贞子系木犀科植物女贞的干燥成熟果实，在我国作为补肾中药有着悠久且广泛的民间药用，并被收载于中国药典一部。主要分布于华南地区，具有滋补肝肾、强腰膝的功能，主治肝肾阴虚、头晕目眩、头发早白、风湿性疼痛、腰膝酸软等。现代药理研究表明，女贞子可防止癌症病人化疗后骨髓丢失^[1]；郝泗城发现女贞子水煎液可通过调节大鼠垂体促肾上腺激素皮质细胞形态来调控垂体-性腺内分泌系统，从形态学角度探讨了女贞子对内分泌系统滋补功能的机制^[2]；蔡晶的动物研究结果显示，女贞子水提液通过上调杏仁核ERβ的表达而保护神经细胞^[3]。另外，女贞子还具有改善免疫功能活性^[4]，并能够延缓衰老^[5]。另外，我们前期的研究结果显示，女贞子能够改善去卵巢所致骨质疏松大鼠体内钙平衡，能够调节矿物质-钙的代谢^[6，7]。由于体内所含钙的99％都贮存于骨骼，骨组织是钙代谢的重要器官，我们推出假设，女贞子对钙代谢的调节作用可能会直接影响骨骼健康。

从现有的专业出版物和专利文献来看，尚无女贞子单味药或者其提取物用于预防和治疗骨质疏松症、调控骨代谢、维护骨骼健康的医药新用途及其药物制剂的记载。

发明内容

本发明的目的在于提出女贞子单味药或者其提取物用于预防和治疗骨质疏松症、调控骨代谢、维护骨骼健康的医药新用途。

本发明的另一个目的在于提供一种用于预防和治疗骨质疏松症、调控骨代谢、维护骨骼健康的含有女贞子提取物的药物制剂。

上述发明目的是通过如下途径实现的：取木犀科植物女贞Ligustrum lucidum Ait的干燥成熟果实女贞子(Fructus Ligustri Lucidi)的生药材经粉碎后，与6倍体积的70％乙醇混合，回流提取2次，每次5小时，收集提取液，粗滤后，滤液经旋转蒸发浓缩，再经冷冻干燥，得干粉，备用。

为研究女贞的抗骨质疏松作用，我们分别采用了体内动物模型和体外细胞模型。在动物实验中，选用老年雌性大鼠，并通过去卵巢处理模拟绝经后妇女骨质疏松症(美国FDA指定研究、开发抗骨质疏松药物时必须要使用的啮齿类动物模型)^[8]；饮食钙水平直接影响体内钙代谢状况，而作为体内钙最主要的贮存部位-骨骼，直接参与并调控着体内钙代谢平衡，在这个过程中，骨组织本身的矿物含量、骨密度也都发生着相应变化^[9]。在本实施例1动物实验中，分别采用去卵巢处理和控制大鼠饮食钙水平作为影响骨骼健康的两个外界因素。细胞实验中，选用大鼠成骨肉瘤细胞株UMR106细胞，它从形态和性质上都保留了成骨细胞独有特征，并且具有稳定、均一、纯度高的优点^[10]，是近年来国内外学者研究抗骨质疏松药物体外活性时经常采用的细胞株。

本发明的用于预防和治疗骨质疏松症、调控骨代谢、维护骨骼健康的含有女贞子提取物的药物制剂是这样制备的：女贞子生药材经粉碎后，加70％乙醇煎煮三次，每次2小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩至相对密度为1.30～1.35(60℃)的稠膏，取稠膏，加蔗糖、糊精，混匀，制成颗粒，干燥，过筛，整粒，得到颗粒。

也可以将女贞子生药材经粉碎后，加70％乙醇煎煮三次，每次2小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩至稠膏状，干燥，粉碎成细粉，装入胶囊，即得胶囊剂。

在本发明的研究中，我们发现女贞子醇提物能够明显提高大鼠四肢骨皮质骨的骨量以及腰椎骨骨量，增强皮质骨的生物力学强度，与高钙饮食合用，能够显著增加四肢骨远端松质骨骨量。体外培养大鼠成骨样细胞，发现女贞子醇提物对成骨样细胞没有细胞毒作用，并且促进成骨细胞的分化和矿化以及胞外基质成熟，从而加速骨形成。因此，本发明表明女贞单味药的使用，即可有效防治骨质疏松症的发生和发展，并可开发作为老年健康妇女维护骨骼健康的保健品。

本发明的女贞子单味药在预防或治疗骨质疏松症上的应用以及相应的药物制剂与现有技术中的同类药物及其应用相比，具有疗效确切、毒副作用低、用药更安全、制备工艺更简便、成本较低的优点。

附图说明：

图1为pQCT检测长骨部位示意图。

图2为女贞子醇提物对大鼠第二腰椎骨密度的影响的柱状图

图3为给予女贞子醇提物后大鼠皮质骨最大载荷对比柱状图

图4为给予女贞子醇提物后大鼠皮质骨硬度对比柱状图

图5为女贞子醇提物对UMR106细胞ALP活性的影响柱状图

图6为女贞子醇提物对矿化结节形成的影响。

图7为女贞子醇提物对矿化结节钙含量的影响

图8为女贞子醇提物对矿化结节磷含量的影响

具体实施方式：

下面所列实施例有助于本领域技术人员更好地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

实施例1动物实验

1材料与方法

1.1动物与材料

动物：120只11月龄SPF级雌性SD大鼠(平均体重389g)，购自广东省医学实验动物中心(动物合格证号：SCXK(粤)2003-0002)。

药材：女贞药材采自江苏吁眙。

饲料：低钙饲料、中钙饲料、高钙饲料均购自美国(Harlan Teklad Inc.，Madison，WI)，其营养成分组成如表1：

表1大鼠饲料营养成分组成

1.2仪器

骨密度测定仪(pQCT，XCT2000，德国Stratec Medizintechnik GmbH公司)

生物力学测定仪(H10KM，英国Hounsfield实验设备公司)

2实验方法

2.1女贞子提取物制备：粉碎的女贞子与6倍体积的70％乙醇混合，回流提取2次，每次5小时，收集提取液，粗滤后，滤液经旋转蒸发浓缩，再经冷冻干燥，得干粉，备用。

2.2模型制备及药物处理：动物适应环境两周后，其中60只做假手术处理，60只行双侧去卵巢术。术后恢复期所有动物喂商用动物饲料，2周后，按表2所示分组并开始灌胃给药，持续12周，女贞子给药剂量700mg/kg体重，对照组按照1ml蒸馏水/100g体重灌服大鼠。整个实验期间自由饮用蒸馏水，每天清晨给大鼠喂食，食物量按照大鼠适应期摄食量最少一组折算。饲养环境12小时光照/黑暗交替，室温(23～25)℃。

表2动物分组

组别     动物数    手术因素    药物因素    饮食因素

SVL      10        Sham        Vehicle     LCD

SVM      10        Sham        Vehicle     MCD

SVH      10        Sham        Vehicle     HCD

SNL      10        Sham        Nvzhenzi    LCD

SNM    10    Sham    Nvzhenzi     MCD

SNH    10    Sham    Nvzhenzi     HCD

OVL    10    OVX     Vehicle      LCD

OVM    10    OVX     Vehicle      MCD

OVH    10    OVX     Vehicle      HCD

ONL    10    OVX     Nvzhenzi     LCD

ONM    10    OVX     Nvzhenzi     MCD

ONH    10    OVX     Nvzhenzi     HCD

2.3样本收集及保存：取下肢股骨、胫骨以及腰椎，小心剔尽肌肉及筋膜。用生理盐水沾湿纱布包裹骨组织，置-20℃保存。

2.4样本测定

2.4.1骨量测定：检测胫骨、股骨的近端、中段、远端，如图1所示；扫描整个腰椎部分，测定第二节腰椎。图1为pQCT检测长骨部位示意图。

2.4.2生物力学强度测定：对径骨中段进行三点弯曲力学实验。加力点下降速度2mm/min，直至骨骼断裂，实验过程中骨变形曲线由电脑绘出。系统软件分析得到骨结构力学指标：最大载荷，硬度。

2.5统计学处理：实验结果以均值±标准误表示。使用统计分析软件Prism 4对数据进行单因素方差分析(One-way ANOVA)，当p＜0.05时，接着使用Turkey检验来比较各组间差异，认为p＜0.05有统计学差异。本实验为多因素多水平设计，在固定饮食因素条件下，对数据进行双因素方差分析(Two-way ANOVA)，考察手术因素、药物因素对目标参数的影响，认为p＜0.05有统计学意义。

3结果

3.1女贞子醇提物对大鼠胫骨不同部位骨量的影响

双因素方差分析显示，在各种饮食条件下，女贞子醇提物对大鼠胫骨近端、远端的松质骨密度(BMD)都没有显著影响，然而，在低钙饮食条件下，大鼠经女贞子醇提物治疗后，胫骨中段皮质骨BMD(p＜0.05)以及骨矿含量(BMC)(p＜0.05)显著提高；在中钙饮食条件下，皮质骨BMC(p＜0.01)显著提高。组间差异比较显示，在低钙饮食(p＜0.05)、中钙饮食条件下(p＜0.01)，女贞子醇提物明显提高正常大鼠胫骨中段BMC。另外，单纯高钙饮食或女贞子醇提物配合高钙饮食能够防止低钙饮食造成去卵巢大鼠胫骨中段及远端的骨质流失。

表3女贞子醇提物对大鼠胫骨不同部位骨量的影响

           近端            中段            中段           远端

           BMD(mg/ccm)     BMD(mg/ccm)/    BMC            BMD(mg/ccm)

低钙饮食

SVL        602.8±45.4^c    1152±17        5.63±0.15^a    875.6±44.5^c

OVL        435.2±35.9^d    1132±7         5.26±0.12     694.8±27.6^d

SNL        576.8±32.0^a    1190±13        6.09±0.13^b    850.0±19.9^a

ONL        460.1±21.3^b    1152±14        5.67±0.17     759.3±25.7^b

                           双因素方差分析

女贞子     0.9867          0.0355^*         0.0476^*        0.5305

去卵巢     0.0002^***       0.0361^*         0.0487^*        0.0001^***

中钙饮食

SVM       638.2±21.0^e     1181±16^a       5.72±0.12^c    850.5±27.8

OVM       459.9±34.9^f     1144±7^b        5.49±0.10     767.6±27.7

SNM       675.4±45.5^e     1205±13        6.68±0.18a^d   923.6±39.0^a

ONM       432.1±9.3^f      1163±18        5.63±0.27^b    777.0±39.6^b

                           双因素方差分析

女贞子    0.8775           0.1379          0.0047^**       0.2269

去卵巢    ＜0.0001^***      0.0086^**        0.0012^**       0.0020^**

高钙饮食

SVH       645.5±24.4^c     1216±14^c       6.61±0.19^a    879.2±37.7

OVH       496.0±23.2^d     1155±15^d       5.88±0.24^b$   823.3±36.7^$

SNH       587.1±38.2^a     1191±14        6.21±0.33     845.4±31.6

ONH       492.1±17.5^b     1158±11^$       5.88±0.25^$    836.1±14.3^$$$

                           双因素方差分析

女贞子    0.2570           0.4276          0.4330         0.7476

去卵巢    ＜0.0001^***      0.0019^**        0.0498^*        0.3235

1在各饮食水平条件下，不同上标字母间有显著性差异：a，b，p＜0.05；c，d，p＜0.01；e，f，p＜0.001

2与OVL组比较，$p＜0.05，$$$p＜0.001

3 双因素方差分析，^*p＜0.05，^**p＜0.01，^***p＜0.001

3.2女贞子醇提物对大鼠股骨不同部位骨量的影响

在各种饮食条件下，女贞子对大鼠股骨近端、远端的作用结果与胫骨一致，即对骨量没有表现出明显的改善作用。然而，双因素方差分析显示，大鼠在中、低钙饮食条件下，女贞子能够显著提高股骨中段矿物含量，具体表现在：(1)在饮食钙缺乏状态下，女贞子明显提高股骨中段BMC；(2)在饮食钙含量正常状态下，女贞子明显提高股骨中段BMD、BMC。在各饮食钙水平条件下，同相应的溶剂对照组相比，女贞子给药组的正常大鼠在低钙饮食条件下，股骨中段的BMC显著提高，而女贞子给药组的去卵巢大鼠在中钙饮食条件下，股骨中段的BMD显著提高。

表4女贞子醇提物对大鼠股骨不同部位骨量的影响

            近端             中段             中段            远端

            BMD(mg/ccm)      BMD(mg/ccm)/     BMC             BMD(mg/ccm)

低钙饮食

SVL         887.2±39.4      1204±20         8.62±0.27^ac    716.2±42.1^c

OVL         826.3±28.9      1152±18         7.59±0.18^d     560.3±9.7^d

SNL         947.8±13.7^a     1223±22^a        9.11±0.26^ba    651.8±33.0^a

ONL         860.9±11.6^b     1150±19^b        7.99±0.36^b     555.6±12.6^b

                             双因素方差分析

女贞子      0.0726           0.6681           0.0377^*         0.2062

去卵巢      0.0079^**         0.0052^**         0.0065^**        0.0001^***

中钙饮食

SVM         985.1±22.7^e     1202±10^c        8.54±0.27^a     736.2±31.0^a

OVM         853.7±16.3^f     1122±8^ad        7.10±0.33^b     574.3±24.9^b

SNM         997.0±19.8^e     1228±15^a        9.25±0.41^c     753.1±22.6^a

ONM         873.0±18.9^f     1176±17^b        7.74±0.35^d     606.7±47.2^b

                             双因素方差分析

女贞子      0.4402           0.0121^*          0.0418^*         0.4908

去卵巢      ＜0.0001^***      0.0002^***        0.0003^***       0.0003^***

高钙饮食

SVH        1042±23.3^e       1259±10^e        9.72±0.26      778.7±38.0^e

OVH        825.1±29.0^f      1150±21^f        7.69±0.51      599.5±18.4^f

SNH        947.2±17.0^a      1231±22^a        9.74±1.00^a     736.3±16.9^c

ONH        885.2±16.9^b      1161±16^b        7.50±0.36^b     613.0±22.4^d$

                             双因素方差分析

女贞子     0.4468            0.6229           0.8904          0.5753

去卵巢     ＜0.0001^***       ＜0.0001^***      0.0026^**        ＜0.0001^***

1在各饮食水平条件下，不同上标字母间有显著性差异：a，b，p＜0.05；c，d，p＜0.01；e，f，p＜0.001

2与OVL组比较，$p＜0.05

3双因素方差分析，*p＜0.05，  **p＜0.01，***p＜0.001

3.3女贞子醇提物对大鼠腰椎骨密度的影响

双因素方差分析表明，大鼠在低钙饮食、中钙饮食情况下，连续灌服女贞子醇提物3个月后，其第二腰椎骨密度明显升高(p＜0.05)。组间均数比较结果显示，给大鼠喂饲低钙饲料条件下，无论是假手术组，还是去卵巢组，女贞子醇提物治疗组都比相应的溶剂对照组大鼠的第二腰椎骨密度明显升高(p＜0.05)，而这种作用在中钙饮食、高钙饮食下，没有统计学意义。另外，给大鼠高钙饮食(p＜0.05)或是高钙饮食配合女贞子醇提物(p＜0.01)治疗，其腰椎骨密度都明显高于低钙饮食大鼠的溶剂对照组，并且这种作用不受体内雌激素水平的影响。

图2为女贞子醇提物对大鼠第二腰椎骨密度的影响的柱状图，图中*p＜0.05，与溶剂对照组比较(相同的饮食条件)；&p＜0.05，&&p＜0.01，与SVL组比较；$p＜0.05，$$p＜0.01，与OVL组比较

3.4女贞子醇提物对大鼠皮质骨生物力学强度的影响

双因素方差统计分析表明，大鼠在低钙饮食情况下，女贞子醇提物显著提高大鼠皮质骨硬度(p＜0.05)；大鼠在中钙饮食情况下，女贞子醇提物显著提高大鼠皮质骨所能承受最大载荷(p＜0.05)以及外在硬度(p＜0.01)。两组间均数比较结果显示，去卵巢大鼠低钙饮食时，经灌服女贞子醇提物后，相对于溶剂对照组，其皮质骨最大载荷、硬度分别提高了20.3％(p＜0.05)、22.2％(p＜0.05)；正常大鼠中钙饮食时，经灌服女贞子醇提物后，相对于溶剂对照组，其皮质骨最大载荷、硬度分别提高了12.0％(p＜0.05)、32.6％(p＜0.01)。

图3为结给予女贞子醇提物后大鼠皮质骨最大载荷对比柱状图，其中，*p＜0.05，**p＜0.01，与溶剂对照组比较(相同的饮食条件)；#p＜0.05，与假手术组比较(相同的给药处理)。

图4为给予女贞子醇提物后大鼠皮质骨硬度对比柱状图，其中，*p＜0.05，  **p＜0.01，与溶剂对照组比较(相同的饮食条件)；#p＜0.05，与假手术组比较(相同的给药处理)。

实施例2细胞实验

实施例2-1细胞常规培养

1材料

UMR 106细胞                                ATCC(No CRL-1661)

DMEM培养液(Cat.NO.12430-054)               GIBCO公司

抗生素(10X，含penicillin，streptomycin)    GIBCO公司

DMSO(Cat.NO.0231-500ml)                    美国Amresco公司

PBS(Cat.No：20012-027)                     GIBCO公司

17β-雌二醇(Cat.NO：E-8875)                Sigma公司

胎牛血清(Cat.NO：16000-044)                美国Life Technologies公司

胰蛋白酶(Cat.NO：15400-054)                加拿大Life Technologies公司

2主要仪器

细胞培养箱(型号：2323)                     美国SHELDON公司

超净工作台(型号：LAB/04-EBC-2A)            新加坡ESCO公司

倒置显微镜(型号：090-135-002)              德国Leica公司

3方法

细胞培养于DMEM培养液(含5％FBS+1×抗生素)，培养皿置于恒温培养箱(37℃，5％CO2)。当贴壁细胞融合度达到80％～90％，即可传代。先吸除废液，后用PBS淋洗。加入胰蛋白酶(1×)1ml，混匀，置入培养箱1～2min，取出，轻轻拍打，使细胞离壁。加入含血清的培养液终止消化，轻轻吹打。分装至培养皿继续培养。

实施例2-2细胞毒性实验

1材料及主要仪器

MTS/PMS                          美国Promega公司

酶标仪(型号：550)                美国Bio-Rad公司

2方法

2.1吸取消化掉的细胞悬液1滴于血球计数板上计数，用多通道移液枪以6000cell/well的密度接种于96孔板。

2.2细胞贴壁培养24小时后，换以不含血清的DMEM培养液，饥饿24小时。

2.3女贞子醇提物(已用蒸馏水配成10mg/ml)用DMEM培养液配成四个浓度，分别为0.1μg/ml、1μg/ml、10μg/ml、100μg/ml，每个受试浓度做四孔。每孔加药100μl。并同时做溶剂对照、空白对照(DMEM，无血清)。重复实验三次。

2.4弃去培养液。于900μlPBS中加入100μl MTS/PMS混合液，混匀后，分别加至各孔(100μl/孔)。在培养箱中孵育1小时后，将96孔板放于酶标仪检测，测定波长490nm。

3结果

大鼠成骨样细胞UMR106细胞在加药处理24小时、48小时后，各女贞子醇提物受试浓度对细胞增殖没有明显作用，同时，也不抑制细胞增殖。各受试浓度的增殖率基本与溶剂对照组相当，没有统计学差别，说明女贞子醇提物对大鼠成骨样细胞不产生毒性作用。

实施例2-3细胞碱性磷酸酶(ALP)活性测定

1材料及主要仪器

ALP检测试剂(Cat.NO：0900-151)      美国STANBIO公司

紫外分光光度计(型号：Lambda 35)    美国PerkinElmerr公司

可见光分光光度计(型号：4001/4)     美国Thermo Spectronic公司

2方法

2.1选融合度在80％，生长良好的UMR106细胞，接种于6孔板，每孔10⁵个细胞，培养48小时。

2.2换为无血清培养液，继续培养24小时。

2.3加入已配置好的女贞子醇提物，终浓度分别为0.1μg/ml、1μg/ml、10μg/ml、100μg/ml。

2.4弃去培养液，冷PBS润洗后，再加入 1000μl冷PBS，用细胞铲刮下细胞，并收集于离心管。离心后，弃去上清，加入细胞裂解液。冰浴15分钟，再次离心，取上清，保存于-80℃。

2.5将蒸馏水加入ALP检测测试剂(干粉)，充分溶解。吸取10μl待测液至1300μl的检测试剂中，于比色杯中混匀，并在490nm波长下测定3分钟内的吸光度变化值ΔA(U/min)。

2.6采用Bradford方法测定待测液的蛋白浓度。

2.7 ALP活性绝对数值采用ΔA/蛋白浓度表示。本结果中采用相对数值表示，即以溶剂对照为1，其他各组数值与溶剂对照组相比。

3结果

UMR106细胞经女贞子醇提物处理24小时后，各受试浓度组的ALP活性与溶剂对照组没有明显差别；处理48小时后，各受试浓度组的ALP活性比对照组显著升高(p＜0.01)，并具有一定的浓度依赖性。两个时间点的数据结合分析，表明女贞子醇提物提高ALP活性的作用具有时间依赖性。

图5为女贞子醇提物对UMR106细胞ALP活性的影响柱状图，其中，**p＜0.01，***p＜0.001，与溶剂对照组比较。

实施例2-4细胞矿化结节实验

1材料及主要仪器

维生素C                     国药集团化学试剂有限公司

β-甘油磷酸钠                         北京经科宏达生物技术有限公司

茜素红                                国药集团化学试剂有限公司

钙、磷检测试剂盒                      北京中生北控生物科技股份有限公司

全自动生化分析仪(

300i)      美国Abbott Laboratories公司

光学显微镜(Olympus AH-2)              日本Olympus公司

2方法

2.1细胞培养

细胞按5×10⁴个/孔密度接种于12孔板，36小时后换液(其中含5％胎牛血清、50μg/ml维生素C和10nmol/Lβ-甘油磷酸钠)，同时分别加入女贞子醇提物(终浓度同上)，并设溶剂对照组。每个浓度重复2孔，实验重复三次。每3天换液1次，于第3天、第6天镜下观察矿化结节并检测结节钙、磷含量。

2.2检测矿化结节

弃去培养液，冷PBS淋洗1次。95％乙醇固定10分钟，0.1％茜素红染色30分钟。吸去染液，用水冲洗干净。在40倍光学显微镜下观察矿化结节。

2.3检测矿化结节钙、磷含量

弃去培养液，冷PBS淋洗1次。加入500μlHCl(1M)，静置10分钟。然后按照检测试剂盒说明，于全自动生化分析仪进行钙、磷含量测定。

3结果

3.1UMR106细胞在特定培养液中培养6天后，各药物处理组的矿化结节在镜下观察如图5所示。从图片中可清晰看到，相对于对照组，各女贞子醇提物受试浓度组的矿化结节形成都明显增多，说明女贞子醇提物对于增强成骨细胞基质矿化作用明显。

图6为女贞子醇提物对矿化结节形成的影响，其中A为对照组；B、C、D、E分别对应女贞子醇提物浓度在0.1μg/ml、1μg/ml、10μg/ml、100μg/ml。

3.2UMR106细胞在特定培养液中培养3天后，女贞子醇提物10μg/ml能够显著增加矿化结节钙(p＜0.05)、磷(p＜0.01)含量；UMR106细胞在特定培养液中培养6天后，女贞子醇提物在1μg/ml～100μg/ml浓度范围内，都非常显著增加矿化结节中钙(p＜0.05)、磷(p＜0.01)含量，同第3天结果一样，女贞子醇提物的最强作用浓度为10μg/ml。综合第3天、第6天的检测结果，发现女贞子增强矿化结节无机质含量的作用具有明显的时间依赖性，并且在0.1μg/ml～10μg/ml浓度范围内，其作用呈现良好的浓度依赖性。

图7为女贞子醇提物对矿化结节钙含量的影响柱状图，其中，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，与溶剂对照组比较，其中A为对照组；B、C、D、E分别对应女贞子醇提物浓度在0.1μg/ml、1μg/ml、10μg/ml、100μg/ml。

图8为女贞子醇提物对矿化结节磷含量的影响柱状图，其中，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，与溶剂对照组比较，其中A为对照组；  B、C、D、E分别对应女贞子醇提物浓度在0.1μg/ml、1μg/ml、10μg/ml、100μg/ml。

实施例3制备女贞子颗粒剂

处方    女贞子    1000g

        蔗糖      500g

        糊精      100g

                              

        制成      800g

制法及服用剂量：1000g女贞子生药材经粉碎后，加70％乙醇煎煮三次，每次2小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩至相对密度为1.30～1.35(60℃)的稠膏。取稠膏，加蔗糖、糊精，混匀，制成颗粒，干燥，过筛整粒，制得800g，分装，每袋装2.5g。温开水冲服，一次1袋，一日2次。

实施例4制备女贞子颗粒剂

处方    女贞子    800g

        蔗糖      560g

        糊精      80g

                          

        制成      800g

制法及服用剂量：女贞子生药材用量改成800g，其余参照实施例3的制备方法。温开水冲服，一次1袋，一日2次。

实施例5制备女贞子颗粒剂

处方    女贞子    1200g

        蔗糖      500g

        糊精      120g

                         

        制成      800g

制法及服用剂量：女贞子生药材用量改成1200g其余参照实施例3的制备方法。温开水冲服，一次1袋，一日2次。

实施例6制备女贞子胶囊剂

处方    女贞子    750g

                            

        制成      400粒

制法及服用剂量：750g女贞子生药材经粉碎后，加70％乙醇煎煮三次，每次2小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩至稠膏状，干燥，粉碎成细粉，装入胶囊，制成400粒，即得。每粒装0.3g。口服，一次2粒，一日3次。

实施例7制备女贞子胶囊剂

处方    女贞子    600g

                        

        制成      400粒

制法及服用剂量：女贞子生药材用量改成600g其余参照实施例6的制备方法。口服，一次2粒，一日3次。

实施例8制备女贞子胶囊剂

处方    女贞子    800g

                            

        制成      400粒

制法及服用剂量：女贞子生药材用量改成800g，其余参照实施例6的制备方法，即得。每粒装0.3g。口服，一次2粒，一日3次。

4讨论

本研究通过先进的周围骨定量CT(pQCT)技术、生物力学强度测定技术，对骨特性参数进行量化，首次靶向性地揭示女贞子醇提物对骨骼健康的保护作用，以及这种作用的选择性及特殊性。另外，通过体外细胞模型，采用确定的生物检测手段，明确的检测指标，进一步阐明女贞子醇提物维护骨骼健康的作用机制，为其临床应用提供了坚实的理论基础。

综合动物实验对骨特性参数，骨密度(BMD)、骨矿含量(BMC)、最大载荷、硬度等指标的统计分析结果显示，女贞子醇提物(FLL)对骨特性的体内作用具有四个特点：

1.双因素方差统计结果表明，大鼠在低钙饮食、中钙饮食时，FLL明显增加四肢骨和腰椎骨的骨量以及长骨生物力学强度，而在高钙饮食时的作用没有统计学意义，这是由于高钙饮食对骨骼健康的正向作用掩盖了FLL的作用。

2.FLL对四肢骨的作用具有部位选择性。FLL明显改善四肢骨骨干(皮质骨)的骨量以及生物力学强度，而对干垢端(松质骨)没有明显作用。

3.大鼠经灌服FLL并联合高钙饮食，能够显著增加四肢骨中段、远端以及腰椎骨的骨量，这种作用强于单独的高钙饮食，提示FLL与高钙饮食联合应用治疗骨质疏松症可收到良好效果。

4.FLL的体内作用与体内雌激素水平无关。这不同于以往所研究的含植物雌激素类中草药的体内作用特点。结合1、2、3，我们认为FLL是通过影响体内钙稳态，包括钙吸收、代谢、钙调激素的合成、分泌等，而发挥骨骼保健作用的。

成骨细胞是骨的形成、骨骼发育与生长的重要细胞，其主要作用为促进并调节骨的矿化。成骨细胞在含有维生素C和β-甘油磷酸钠的培养液内生长，能产生独特的矿化结节。这是因为维生素C能促进成骨细胞合成I型胶原，而β-甘油磷酸钠作为碱性磷酸酶(ALP)的底物，可在其作用下产生大量无机磷，从而促进磷灰石的合成及沉积，加速骨基质的矿化^[11，12]。本实验让成骨细胞在此培养液中培养，显微镜下可见生成大量矿化结节，因此所检测到的钙、磷主要来源于细胞外基质中形成的大量矿化结节。

细胞实验揭示，成骨细胞经FLL处理48小时后，ALP活性明显增强。ALP被认为是成骨细胞分化及细胞外基质成熟的早期标志，因此，说明FLL能够促进成骨细胞的分化、胞外基质成熟。同时，实验结果表明，FLL能够提高骨基质中的Ca²⁺与P^3-含量，从而促其合成磷灰石，并有序的沉积到胶原纤维形成的框架区间中，从而完成骨基质的矿化。

参考文献

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Claims (15)

1. 女贞子在制备预防或治疗骨质疏松症药物中的应用。

2. 如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的女贞子可以是其全草、药用有效部位或其提取物。

3. 如权利要求2所述的应用，其特征是：所述的提取物是醇提取物。

4. 如权利要求3所述的应用，其特征是：所述的醇提取物是指乙醇提取物。

5. 如权利要求1、2、3或4所述的应用，其特征在于：所述的女贞子经提取有效成份并加入药剂学接受的辅料制成颗粒剂、胶囊剂或片剂。

6. 女贞子在制备直接调控骨代谢、维护骨骼健康的药物中的应用。

7. 如权利要求6所述的应用，其特征在于：所述的女贞子可以是其全草、药用有效部位或其提取物。

8. 如权利要求7所述的应用，其特征是：所述的提取物是醇提取物。

9. 如权利要求8所述的应用，其特征是：所述的醇提取物是指乙醇提取物。

10. 如权利要求6至9任一项权利要求所述的应用，其特征在于：所述的女贞子经提取有效成份并加入药剂学接受的辅料制成颗粒剂、胶囊剂或片剂。

11. 一种预防或治疗骨质疏松症的颗粒剂，其特征在于：所述颗粒剂每g含有相当于1至1.5g女贞子药材的女贞子提取物和75％至80％的赋形剂。

12. 如权利要求11所述的预防或治疗骨质疏松症的颗粒剂，其特征在于：所述颗粒剂每g含有相当于1.25g女贞子药材的女贞子提取物。

13. 如权利要求11或12所述的预防或治疗骨质疏松症的颗粒剂，其特征在于：所述的赋形剂选用蔗糖、糊精。

14. 一种预防或治疗骨质疏松症的胶囊剂，其特征在于：所述的胶囊剂每粒含有相当于1.5g至2g女贞子药材的女贞子提取物。

15. 如权利要求14所述的预防或治疗骨质疏松症的胶囊剂，其特征在于：所述的胶囊剂每粒含有相当于1.875g女贞子药材的女贞子提取物。

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