CN105395771B - 一种新温肾生精饮及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种新肾生精饮及其制备方法，该新温肾生精饮由以下组分制备而成：鹿茸1g、人参6g、锁阳9g、黄芪12g、潼蒺藜9g、山药15g、白术6g、川芎3g、白芍6g、肉桂1g、木香1.5g、小茴香3g、淫羊藿6g、当归6g、肉苁蓉9g。本发明的新温肾生精饮完全符合临床治疗生精障碍的基本原则，且在临床上取得了显著的疗效。

Description

一种新温肾生精饮及其制备方法

技术领域

本发明涉及中药制剂领域，具体涉及一种新温肾生精饮及其制备方法。

背景技术

资料显示，从1940年到1990年50年间男性精子密度从1.113亿/ml下降到6600万/ml，生精障碍已成为男性不育的最常见病因之一。治疗男性不育常用的方法有药物治疗、手术治疗和辅助生殖技术治疗等。药物治疗方面，目前还没有特效药，手术治疗也只能解决一些由于解剖因素造成的不育，采用单精子显微注射技术治疗，费用高，技术难度大，还不能被大多数患者所接受。近几年中药在临床治疗男性不育方面已有明显疗效，其主要从修复性腺损伤、促进性腺发育和生殖细胞增殖、抑制生精细胞的凋亡、刺激间质细胞分泌、提高性激素水平和促进副性腺发育等方面对男性的睾丸生精系统进行调理修复，达到治愈的目的，为大多数患者所接受。

但目前大多中药治疗机制多基于中医辨证理论，缺乏对药物作用机制研究。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供了一种新温肾生精饮及其制备方法。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：

一种新温肾生精饮，由以下组分制备而成：

鹿茸1g、人参6g、锁阳9g、黄芪12g、潼蒺藜9g、山药15g、白术6g、川芎3g、白芍6g、肉桂1g、木香1.5g、小茴香3g、淫羊藿6g、当归6g、肉苁蓉9g。

上述新温肾生精饮的制备方法，包括如下步骤：

S1、按上述配方称取各组分后，置于砂锅中，加入蒸馏水，以刚浸没药材为准，浸泡半个小时，先大火加热，沸腾后，改为小火，煎煮30分钟后，将煎液与药渣分离；

S2、在步骤S1所得的药渣中加入80度的蒸馏水，以刚浸没药材为准，沸腾后，煎煮30分钟，将煎液与药渣分离；

S3、在步骤S2所得的药渣中加入80度的蒸馏水，以刚浸没药材为准，沸腾后，煎煮30分钟，将煎液与药渣分离；

S4、将3遍的煎液混合在一起，用4-5层纱布过滤，再将药渣整个包起来，把药液挤出来，一起将收集的药液放在大烧杯中，80度水浴浓缩至94ml，即得，这是成人1天的量。

本发明具有以下有益效果：

本发明含有鹿茸、人参、锁阳、苁蓉、黄芪、蒺藜、山药、白术、白芍、川芎、肉桂、木香、小茴香、淫羊藿和当归十五种药材成份，方中淫羊藿、苁蓉和锁阳是常用的补肾壮阳药，可生精益精；鹿茸具有性激素样作用，可补精髓，助肾阳；黄芪可促进睾丸支持细胞增殖，增加支持细胞的营养供给；人参和白术可补气、补脾，益气健脾；蒺藜、白芍和当归可调肝、补血养血；川芎可活血化瘀；肉桂、山药、木香和小茴香可协助以上药物共同发挥其温阳补肾生精，益气健脾、滋阴补血之功效，本发明的新温肾生精饮完全符合临床治疗生精障碍的基本原则，且在临床上取得了显著的疗效。

附图说明

图1为本发明实施例中温肾生精饮组和新温肾生精饮组小鼠血清睾酮和LH水平与西药组的对比示意图。

图中，Control表示对照组；DMSO表示溶剂组；CsA表示模型组；CC表示西药组；WSSJD表示温肾生精饮组；new WSSJD表示新温肾生精饮组。下同。

图2为本发明实施例中模型组、西药组、温肾生精饮组和新温肾生精饮组小鼠睾丸间质细胞中LHR水平对比示意图。

图3为本发明实施例中模型组、西药组、温肾生精饮组和新温肾生精饮组小鼠睾丸间质细胞中P450scc表达水平对比示意图。

图4为本发明实施例中模型组、西药组、温肾生精饮组和新温肾生精饮组小鼠睾生精细胞的凋亡数量柱形图。

图5为本发明实施例中模型组、西药组、温肾生精饮组和新温肾生精饮组小鼠精子存活率的柱形图。

图6为本发明实施例中小鼠附睾精子的早期凋亡情况示意图；

图中，A.对照组；B.溶剂组；C.模型组；D.西药组；E.温肾生精饮组组；F.新温肾生精饮组。

图7为本发明实施例中模型组、西药组、温肾生精饮组和新温肾生精饮组小鼠精子的早期凋亡率柱形图。

具体实施方式

为了使本发明的目的及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例

动物：清洁级8周龄的昆明种雄性小鼠，体重35～40g，由长春生物制品研究所提供；动物许可证号：SCXK(吉)2006-0001。饲养条件为温度(21±3)℃，湿度55％～65％，自由摄食和饮水，单笼饲养。

药品和试剂：称取鹿茸1g、人参6g、锁阳9g、黄芪12g、潼蒺藜9g、山药15g、白术6g、川芎3g、白芍6g、肉桂1g、木香1.5g、小茴香3g、淫羊藿6g、当归6g、肉苁蓉9g，置于砂锅内，按照中药煎煮法煎煮，最后将药汤煎制为1mL汤药含2g生药材。4℃冷藏，待用。新温肾生精饮是在温肾生精饮组方的基础上，对组方中的人参、锁阳、黄芪和淫羊藿等成分含量进行了适当调整，其制作方法同温肾生精饮。

注射用环孢霉素(山西普德药业有限公司生产)、克罗米芬(广州康和药业有限公司生产)、TUNEL凋亡检测试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)、兔源的LHR和P450scc的一抗、Hoechst33342、FITC标记的二抗、睾酮和LH的ELISA kit。

步骤一、选取8周龄的健康的昆明种雄性小鼠90只，随机分为对照组、溶剂组、模型组、西药组、温肾生精饮组和新温肾生精饮组，每组各15只。

步骤二、将模型组、西药组、温肾生精饮组和新温肾生精饮组的小鼠腹腔注射15mg/kg·d环孢霉素，连续30天；对照组小鼠注射等体积的生理盐水；溶剂组小鼠注射等体积的DMSO溶剂。在注射的同时，将西药组的小鼠灌胃21.6mg/(kg.d)的克罗米芬，温肾生精饮组和新温肾生精饮组小鼠按12g生药材/kg·d灌胃温肾生精饮或新温肾生精饮，模型组和对照组小鼠灌胃等体积的生理盐水，连续灌胃30天。

步骤三、观测指标与方法

睾丸组织HE染色

取雄鼠睾丸立即用4％多聚甲醛固定，酒精梯度脱水，二甲苯透明，常规石蜡包埋，制成5μm厚石蜡切片，HE染色，光镜下观察睾丸生精小管上皮的发育，且根据Johnsen评分标准对睾丸组织生精小管的发育进行评分。

血清睾酮和LH测定

将各组的雄鼠处理30天后，利用水合氯醛麻醉雄鼠，摘眼球取血。第二天收集析出的血清，-20℃保存。利用ELISA试剂盒，根据说明书操作，检测血清中睾酮和LH含量(上海Elisa生物技术有限公司)。采用Bio-Rad酶标仪测定每组血清中睾酮和LH的光密度值，绘制标准曲线，以计算出血清中睾酮和LH的含量。

睾丸间质细胞中LHR和P450scc蛋白的表达检测

对石蜡包埋的睾丸组织切片，二甲苯脱蜡，枸橼酸缓冲液进行抗原修复，在0.1％Triton X-100的PBS溶液中作用15min，封闭液封闭，将组织在LHR或P450scc的一抗(1∶200稀释)中4℃孵育过夜。PBS充分洗涤后，用FITC标记的二抗(1∶400稀释)作用1h。利用1μMHoechst33342对组织的细胞核DNA进行染色，甘油封片，激光扫描共聚焦显微镜观察，所有图片均在相同强度的激光照射下拍摄。利用NIH Image J专业图像分析软件对所拍摄的每张图片随机选取10个视野，分别计算间质细胞中LHR和P450scc蛋白的平均荧光强度。

睾丸组织TUNEL染色

将常规石蜡包埋后的睾丸组织切片，利用TUNEL试剂盒检测睾丸组织中生精细胞的凋亡情况，细胞核中有绿色荧光颗粒者为阳性细胞，即凋亡细胞。每张切片随机选择10个视野，计算各个视野细胞中凋亡的生精细胞数。

步骤四、制作附睾成熟精子悬液

试验鼠处死后，迅速剪下附睾尾部，放于盛有2mL 37℃ PBS的培养皿中剪碎，制成附睾悬液，在37℃培养箱中孵育10min，使精子充分游离出来，剔除精子团块，用PBS将精子悬液稀释成10⁶/mL。

步骤五、流式细胞仪检测附睾精子的存活和早期凋亡

PI法检测附睾精子的存活：取1mL的精子悬液，加10μL的PI染液混合，室温、避光，作用10min；加入5mL PBS，2000r/min离心5min，弃上清，重复洗涤2次；流式细胞仪进行观察和检测。

精子早期凋亡检测：将精子悬液2000r/min离心5min，加入500μL的BindingBuffer悬浮精子；加入5μL Annexin V-EGFP混匀后，加入5μL PI，混匀；室温、避光，反应10min；在1h内，进行流式细胞仪的观察和检测。

步骤六、将所得数据经SPSS 13.0软件处理，实验各个指标均用均数±标准差表示，以单因素方差分析(one-way ANOVA)进行多组间差异比较，P＜0.05为差异显著。

结果

模型组和西药组小鼠生精小管边缘皱缩，直径缩小，上皮细胞层数减少，生精细胞排列散乱，管腔内少见成熟的精子。溶剂组小鼠睾丸生精小管的Johnsen分值与对照组差异不显著，但模型组生精小管的Johnsen分值显著小于对照组；西药组生精小管的Johnsen分值与模型组差异不显著，但温肾生精饮组和新温肾生精饮组较西药组显著提高了小鼠睾丸生精小管的Johnsen评分(P＜0.05)，促进了生精上皮的发育，二者差异不显著，见表1。

表1新温肾生精饮对睾丸组织Johnsen评分的影响

注：与对照组比较，^*P＜0.05；与模型组比较，^#P＜0.05；与西药组比较，^ΔP＜0.05。

利用Elisa法检测了小鼠血清中的睾酮和LH水平。与对照组比较，溶剂组小鼠血清睾酮水平没有显著差异，但模型组小鼠血清睾酮水平显著降低；西药组、温肾生精饮组和新温肾生精饮组小鼠血清睾酮水平显著高于模型组；温肾生精饮组和西药组小鼠血清睾酮水平没有显著差异；但新温肾生精饮组小鼠血清睾酮水平显著高于西药组和温肾生精饮组(P＜0.05)。

与对照组比较，溶剂组小鼠血清LH水平没有显著差异，但模型组小鼠血清LH水平显著升高；西药组小鼠血清LH水平与模型组比较没有显著差异，但温肾生精饮组和新温肾生精饮组小鼠血清LH水平较模型组显著降低；温肾生精饮组和新温肾生精饮组小鼠血清LH水平与西药组没有显著差异，见图1。

新温肾生精饮对LHR在睾丸间质细胞中表达的影响

利用免疫组织化学染色技术检测睾丸间质细胞中LHR的表达。LHR的表达产物呈棕黄色，在睾丸生精小管之间的Leydig细胞的细胞膜上特异性地表达，与对照组比较，溶剂组小鼠睾丸Leydig细胞中LHR的表达水平没有显著差异，但模型组小鼠LHR表达水平显著降低；西药组、温肾生精饮组和新温肾生精饮组小鼠睾丸Leydig细胞中LHR水平较模型组显著升高；且温肾生精饮组和新温肾生精饮组小鼠睾丸中LHR的表达显著高于西药组；与温肾生精饮组比较，新温肾生精饮组小鼠睾丸中LHR表达水平显著升高，如图2所示。

新温肾生精饮对P450scc在睾丸间质细胞中表达的影响

利用免疫组织化学染色技术检测睾丸间质细胞中P450scc的表达。P450scc的表达产物呈棕黄色，在睾丸Leydig细胞的细胞质中特异性表达，与对照组比较，溶剂组小鼠睾丸Leydig细胞中P450scc的表达水平没有显著差异，但模型组小鼠P450scc表达水平显著降低；西药组、温肾生精饮组和新温肾生精饮组小鼠睾丸Leydig细胞中P450scc表达水平较模型组显著升高；且温肾生精饮组和新温肾生精饮组小鼠睾丸Leydig细胞中P450scc的表达显著高于西药组；与温肾生精饮组比较，新温肾生精饮组P450scc表达水平显著升高，见图3。

新温肾生精饮对小鼠睾丸组织中生精细胞凋亡的影响

利用TUNEL染色技术检测小鼠睾丸组织中生精细胞的凋亡情况。凋亡细胞核具有绿色荧光，发生凋亡的细胞主要是精原细胞和初级精母细胞，与对照组比较，溶剂组小鼠睾丸生精细胞的凋亡数量没有显著差异，但模型组小鼠睾丸生精细胞的凋亡数量显著升高；西药组、温肾生精饮组和新温肾生精饮组小鼠睾生精细胞的凋亡数量显著较模型组显著降低；温肾生精饮组和新温肾生精饮组小鼠睾丸生精细胞的凋亡显著低于西药组；与温肾生精饮组比较，新温肾生精饮组小鼠睾丸生精细胞凋亡显著降低，见图4。

新温肾生精饮对小鼠附睾成熟精子存活和早期凋亡的影响

利用流式细胞仪检测了小鼠附睾成熟精子的存活和早期凋亡情况。与对照组比较，溶剂组小鼠附睾成熟精子的存活率没有显著差异，但模型组小鼠附睾成熟精子的存活率显著降低；温肾生精饮组和新温肾生精饮组小鼠精子的存活率较模型组显著升高，西药组与模型组差异不显著；与西药组比较，温肾生精饮组小鼠附睾精子的存活率差异不显著，但新温肾生精饮组小鼠精子的存活率显著升高；温肾生精饮组和新温肾生精饮组小鼠附睾精子的存活率无显著差异，见图5。

小鼠附睾精子的早期凋亡情况如图6所示，与对照组比较，溶剂组小鼠附睾成熟精子的早期凋亡率没有显著差异，但模型组小鼠附睾成熟精子的早期凋亡率显著升高；西药组、温肾生精饮组和新温肾生精饮组小鼠精子的早期凋亡率较模型组显著降低；与西药组比较，新温肾生精饮组小鼠精子的早期凋亡率显著降低，温肾生精饮组差异不显著；且新温肾生精饮组小鼠附睾精子的早期凋亡率显著低于温肾生精饮组，见图7。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (2)

1.一种新温肾生精饮，其特征在于，由以下组分制备而成：

鹿茸1g、人参6g、锁阳9g、黄芪12g、潼蒺藜9g、山药15g、白术6g、川芎3g、白芍6g、肉桂1g、木香1.5g、小茴香3g、淫羊藿6g、当归6g、肉苁蓉9g。

2.如权利要求1所述的一种新温肾生精饮的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1、按权利要求1所述的配方称取各组分后，置于砂锅中，加入蒸馏水，以刚浸没药材为准，浸泡半个小时，先大火加热，沸腾后，改为小火，煎煮30分钟后，将煎液与药渣分离；

S2、在步骤S1所得的药渣中加入80度的蒸馏水，以刚浸没药材为准，沸腾后，煎煮30分钟，将煎液与药渣分离；

S3、在步骤S2所得的药渣中加入80度的蒸馏水，以刚浸没药材为准，沸腾后，煎煮30分钟，将煎液与药渣分离；

S4、将3遍的煎液混合在一起，用4-5层纱布过滤，再将药渣整个包起来，把药液挤出来，一起将收集的药液放在大烧杯中，80度水浴浓缩至94ml，即得。