CN113209210A - 新温肾生精饮作为调节H3K4me3表达水平药物的应用 - Google Patents
新温肾生精饮作为调节H3K4me3表达水平药物的应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN113209210A CN113209210A CN202110574138.2A CN202110574138A CN113209210A CN 113209210 A CN113209210 A CN 113209210A CN 202110574138 A CN202110574138 A CN 202110574138A CN 113209210 A CN113209210 A CN 113209210A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- parts
- h3k4me3
- drink
- kidney
- warming
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
- A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
- A61K36/185—Magnoliopsida (dicotyledons)
- A61K36/25—Araliaceae (Ginseng family), e.g. ivy, aralia, schefflera or tetrapanax
- A61K36/258—Panax (ginseng)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/32—Bones; Osteocytes; Osteoblasts; Tendons; Tenocytes; Teeth; Odontoblasts; Cartilage; Chondrocytes; Synovial membrane
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
- A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
- A61K36/185—Magnoliopsida (dicotyledons)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
- A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
- A61K36/185—Magnoliopsida (dicotyledons)
- A61K36/23—Apiaceae or Umbelliferae (Carrot family), e.g. dill, chervil, coriander or cumin
- A61K36/232—Angelica
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
- A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
- A61K36/185—Magnoliopsida (dicotyledons)
- A61K36/23—Apiaceae or Umbelliferae (Carrot family), e.g. dill, chervil, coriander or cumin
- A61K36/235—Foeniculum (fennel)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
- A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
- A61K36/185—Magnoliopsida (dicotyledons)
- A61K36/23—Apiaceae or Umbelliferae (Carrot family), e.g. dill, chervil, coriander or cumin
- A61K36/236—Ligusticum (licorice-root)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
- A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
- A61K36/185—Magnoliopsida (dicotyledons)
- A61K36/28—Asteraceae or Compositae (Aster or Sunflower family), e.g. chamomile, feverfew, yarrow or echinacea
- A61K36/284—Atractylodes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
- A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
- A61K36/185—Magnoliopsida (dicotyledons)
- A61K36/28—Asteraceae or Compositae (Aster or Sunflower family), e.g. chamomile, feverfew, yarrow or echinacea
- A61K36/285—Aucklandia
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
- A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
- A61K36/185—Magnoliopsida (dicotyledons)
- A61K36/29—Berberidaceae (Barberry family), e.g. barberry, cohosh or mayapple
- A61K36/296—Epimedium
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
- A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
- A61K36/185—Magnoliopsida (dicotyledons)
- A61K36/48—Fabaceae or Leguminosae (Pea or Legume family); Caesalpiniaceae; Mimosaceae; Papilionaceae
- A61K36/481—Astragalus (milkvetch)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
- A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
- A61K36/185—Magnoliopsida (dicotyledons)
- A61K36/54—Lauraceae (Laurel family), e.g. cinnamon or sassafras
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
- A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
- A61K36/185—Magnoliopsida (dicotyledons)
- A61K36/64—Orobanchaceae (Broom-rape family)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
- A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
- A61K36/185—Magnoliopsida (dicotyledons)
- A61K36/65—Paeoniaceae (Peony family), e.g. Chinese peony
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
- A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
- A61K36/185—Magnoliopsida (dicotyledons)
- A61K36/71—Ranunculaceae (Buttercup family), e.g. larkspur, hepatica, hydrastis, columbine or goldenseal
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
- A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
- A61K36/88—Liliopsida (monocotyledons)
- A61K36/894—Dioscoreaceae (Yam family)
- A61K36/8945—Dioscorea, e.g. yam, Chinese yam or water yam
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
- A61P15/08—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives for gonadal disorders or for enhancing fertility, e.g. inducers of ovulation or of spermatogenesis
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Natural Medicines & Medicinal Plants (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Public Health (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Botany (AREA)
- Mycology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Medical Informatics (AREA)
- Alternative & Traditional Medicine (AREA)
- Reproductive Health (AREA)
- Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Virology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Gynecology & Obstetrics (AREA)
- Pregnancy & Childbirth (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明属于生物技术领域,具体涉及一种新温肾生精饮(New Wenshen Shengjing Decoction,NWSSJD)通过维持精子中H3K4me3低水平而促进早期胚胎发育的应用。本发明将性成熟的雄性小鼠环磷酰胺造模后,灌服30天的新温肾生精饮,将处理后的雄鼠与超排处理的母鼠交配,统计各期胚胎的发育率,免疫荧光染色法检测精子和各期胚胎中H3K4me3的表达,Western blotting检测囊胚中甲基化酶SETD1B的表达,qRT‑PCR分析囊胚中发育相关基因(OCT‑4、NANOG、CDX2)和凋亡相关基因(BCL‑2、P53)的表达,并对上述据结果进行分析,发现了NWSSJD通过维持精子和早期胚胎中正常的H3K4me3修饰水平,抑制胚胎细胞凋亡而促进早期胚胎发育。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域,具体涉及一种新温肾生精饮作为调节H3K4me3表达水平药物的应用。
背景技术
新温肾生精饮是一味传统的复方中药,广泛用于治疗男性生精障碍。新温肾生精饮(New Wenshen Shengjing Decoction,NWSSJD)由15种中药组成,主要包括人参,鹿茸,锁阳,黄芪,淫羊藿和当归等。其可维持睾丸组织中高的雄激素浓度,促进各级生精细胞的发育,抑制生精细胞的凋亡,提高精子的发生率和成熟率。检验药物对男性生精障碍治疗的一个重要标准是可否产生正常的后代。因此,研究NWSSJD对早期胚胎发育的影响是证明其治疗效果的关键步骤。
H3K4me3在精子和早期胚胎发育过程中起了重要的调控作用,其参与基因的转录激活调控。精子的染色质高度浓缩,包含90%-99%的鱼精蛋白和1%-10%的组蛋白,其中H3K4me3是精子中存在的重要的组蛋白修饰方式,主要位于精子富含CpG的启动子区。研究发现组蛋白去甲基化酶KDM1A转基因小鼠的精子中H3K4me3发生了显著改变,且这些改变也出现在植入前胚胎的父系等位基因上,在后代上出现了非遗传物质的表型传递。一些环境物质,如除草剂阿特拉津(herbicide atrazine,ATZ),会引起精子H3K4me3的改变,会使得F1代和F3代的小鼠发生了相对应的H3K4me3水平的改变,扰乱了基因的转录水平和后代的精子发生。H3K4me3作为生物体发育的重要表观遗传调控修饰方式,也逐渐成为药物治疗的重要靶点。通过开发影响H3K4me3表达水平的药物可调控胚胎发育,甚至可达到治疗疾病的效果。
然而,现有技术只是用新温肾生精饮来治疗性功能障碍,提高精子的发生率和成熟率,并未发现其与H3K4me3表达水平之间的关系,也未发现新温肾生精饮在调控H3K4me3表达水平中的用途。
发明内容
为了解决上述技术问题,本发明提供了一种新温肾生精饮作为调节H3K4me3表达水平药物的应用。
本发明提供了一种新温肾生精饮作为调节H3K4me3表达水平药物的应用。
本发明还提供了一种新温肾生精饮作为降低精子中H3K4me3表达水平药物的应用,所述新温肾生精饮用于制备降低H3K4me3表达水平而提高精子质量、提高存活率的药物。
本发明还提供了一种新温肾生精饮作为调节胚胎中H3K4me3表达水平药物的应用,所述新温肾生精饮用于制备调节胚胎中H3K4me3表达水平而促进早期胚胎发育的药物。
优选的,上述应用中,所述早期胚胎为2-细胞胚胎、3-4细胞胚胎、8-16细胞胚胎和囊胚。
优选的,上述应用中,所述H3K4me3分别在所述2-细胞胚胎、3-4细胞胚胎、8-16细胞胚胎、囊胚和精子中表达。
优选的,上述应用中,所述新温肾生精饮用于制备提高甲基化酶SETD1B表达水平的药物。
优选的,上述应用中,所述新温肾生精饮用于制备提高BCL-2、OCT-4和CDX2表达水平的药物。
优选的,上述应用中,所述新温肾生精饮用于制备降低P53正常表达水平的药物。
优选的,上述应用中,所述新温肾生精饮包含以下重量份的物质:人参6-7份、锁阳9-10份、黄芪10-12份、淫羊藿4-6份、鹿茸1-3份、肉苁蓉9-10份、当归4-6份、沙苑子9-12份、山药13-15份、白术6-8份、川芎3-5份、白芍药4-6份、肉桂1-3份、木香1-3份和小茴香1-3份。
优选的,上述应用中,所述新温肾生精饮包含以下重量份的物质:人参6份、锁阳9份、黄芪12份、淫羊藿6份、鹿茸1份、肉苁蓉9份、当归6份、沙苑子9份、山药15份、白术6份、川芎3份、白芍药6份、肉桂1份、木香1.5份和小茴香3份。
与现有技术相比,本发明具有以下有益效果:
1、本发明以环磷酰胺制作动物生精障碍模型,一方面研究NWSSJD对早期胚胎发育的影响,另一方面探讨使用NWSSJD治疗后,对精子和早期胚胎中H3K4me3的表观遗传修饰的影响,为阐明NWSSJD对生精障碍的治疗机制提供一定的参考。本发明发现NWSSJD可通过维持精子中低的H3K4me3修饰水平,稳定胚胎细胞中H3K4me3正常的修饰模式,提高胚胎发育率。这项研究拓宽了我们对NWSSJD治疗机制的理解,首次强调了其对精子和早期胚胎中的表观遗传修饰的调控,对于开发影响H3K4me3表达水平的药物以达到调控胚胎发育的目的具有重要作用,甚至可达到治疗疾病的效果。
2、本发明发现环磷酰胺(cyclophosphamide,CPA)可异常升高精子中H3K4me3的修饰水平,扰乱了胚胎中甲基化酶SETD1B的表达和H3K4me3的修饰水平,显著降低了早期胚胎的发育率。
附图说明
图1为小鼠精子中H3K4me3的表达结果;
(A)免疫荧光标记小鼠精子中的H3K4me3,H3K4me3标记为绿色,精子核标记为蓝色;(B)使用Image J图像分析软件测定精子中H3K4me3的平均荧光强度(N=10);
图2为小鼠的早期胚胎发育图;
图A-E分别是2-细胞胚胎、3-4细胞胚胎、8-16细胞胚胎、囊胚和退化胚胎;
图3为2-细胞胚胎中H3K4me3的表达结果;
A.免疫荧光标记2-细胞胚胎中的H3K4me3,H3K4me3标记为绿色,胚胎细胞核标记为蓝色;
B.使用Image J图像分析软件测定胚胎细胞核中H3K4me3的平均荧光强度(N=10);
图4为4-细胞胚胎中H3K4me3的表达结果;
A.免疫荧光标记4-细胞胚胎中的H3K4me3,H3K4me3标记为绿色,胚胎细胞核标记为蓝色;
B.使用Image J图像分析软件测定胚胎细胞核中H3K4me3的平均荧光强度(N=10);
图5为8-16-细胞胚胎中H3K4me3的表达结果;
A.免疫荧光标记8-16-细胞胚胎中的H3K4me3,H3K4me3标记为绿色,胚胎细胞核标记为蓝色;
B.使用Image J图像分析软件测定胚胎细胞核中H3K4me3的平均荧光强度(N=10);
图6为囊胚中H3K4me3的表达结果;
A.免疫荧光标记囊胚中的H3K4me3,H3K4me3标记为绿色,胚胎细胞核标记为蓝色;
B.使用Image J图像分析软件测定胚胎细胞核中H3K4me3的平均荧光强度(N=10);
图7为胚胎中甲基化酶SETD1B的表达结果;
A.Western blotting检测2-细胞胚胎、8-细胞胚胎和囊胚中甲基化酶SETD1B的表达;
B.Image J图像分析软件分析SETD1B的相对表达水平;
图8为qRT-PCR检测囊胚中发育相关基因(OCT-4、NANOG、CDX2、BCL-2、P53)的表达。
具体实施方式
为了使本领域技术人员更好地理解本发明的技术方案能予以实施,下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步说明。
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法,所用试剂均为市售。
1材料与处理方法
1.1试验动物
试验采用性成熟的昆明品系10周龄雄性小鼠和8周龄雌性小鼠。小鼠生活在温控的房间,12h光照/12h黑暗的光照周期。小鼠自由饮水和采食。小鼠的处理方法经吉林医药学院伦理委员会同意。
1.2制备新温肾生精饮
复方中药新温肾生精饮(NWSSJD)包含人参6g、锁阳9g、黄芪12g、淫羊藿6g、鹿茸1g、肉苁蓉9g、当归6g、沙苑子9g、山药15g、白术6g、川芎3g、白芍药6g、肉桂1g、木香1.5g和小茴香3g(本发明的具体实施例中,1g相当于权利要求书所述一个重量份),所有的药材购自中国北京同仁堂。称取各中药药材置砂锅内,按照中药煎煮法煎煮,最后将药汤煎制浓缩,浓缩比例为每2g生药材制成1ml汤药。4℃冷藏备用。通过对NWSSJD中的有效成分进行HPLC分析,检测出NWSSJD的有效成分包括人参皂苷、淫羊藿苷、川穹嗪和鹿茸多肽等成分。
1.3药物处理
性成熟的10周龄雄性小鼠分为对照组、NWSSJD组和环磷酰胺组(CPA组),每组60只。NWSSJD组和CPA组小鼠腹腔注射80mg/(kg·d)环磷酰胺,连续注射5天(Feng B,ShenJH,Yuan BB,Qian ZY.Study on stability of oligozoospermia model established byintraperitoneal injection of cyclophosphamide in mice.Chinese Journal ofAndrology,2007,13(1):71-72),对照组小鼠注射等体积的生理盐水。然后将NWSSJD组的小鼠灌服NWSSJD,剂量为12g·kg-1·d-1,每天一次,连续灌服30天,对照组和CPA组灌服等体积的生理盐水。
其中,CPA是一种烷基化剂,被广泛应用于抗肿瘤和器官移植后的免疫抑制,但研究发现环磷酰胺在雄性上的使用,显著提高了胚胎的丢失率、畸形率和后代行为缺陷的发生率,并且这些异常可传递给后代。环磷酰胺会导致胚胎中的微核显著升高,2-细胞胚胎中乙酰化H4K5的表达模式发生了明显的改变,减少合子对DNA损伤的修复能力,使得异常的组蛋白表观遗传修饰持续存在,导致胚胎发生的异常。
1.4数据统计分析
采用SPSS 17.0软件对试验数据进行统计学分析,数据表示为平均值±标准差(SD)。采用单因素方差分析(one-way ANOVA)的LSD post hoc检测方法进行多组间差异比较,P<0.05为差异显著。
2新温肾生精饮对精子的影响
2.1精子采集
动物对象为上述对照组和CPA组、NWSSJD组的小鼠,颈椎脱臼法处死雄性小鼠。迅速取下附睾,将附睾置于盛有1ml 37℃生理盐水的培养皿中,使用26号针头划破附睾尾,37℃培养箱中孵育10min,使精子从附睾尾充分游离出来。
2.2精子的免疫荧光染色
将精子悬液稀释在蒸馏水中,然后将其涂抹到盖玻片上,室温干燥2h。在抹片上滴加精子去凝集液(25mM DTT、0.2%(v/v)Triton X-100和200IU/mL heparin),37℃培养箱孵育15min。弃去精子去凝集液,3.7%(v/v)的多聚甲醛溶液固定20min。PBS清洗,5%(v/v)BSA室温封闭2h。兔源抗H3K4me3(A2357,ABclonal)的一抗孵育抹片2h。PBS洗三遍后,羊抗兔FITC标记的二抗(AS011,ABclonal)孵育抹片1h。Hoechst 33342(14533,Sigma)对精子核进行染色,然后将抹片覆盖抗荧光淬灭封片液(AR1109,BOSTER),指甲油封片。每个实验组使用5只小鼠,每只小鼠制作5张精子抹片,Olympus IX-53的正置显微镜油镜下观察,利用显微图像采集系统(CellSens Dimension)对每张精子抹片随机选取5个高倍视野(×1000)进行拍摄,Image J专业图像分析软件对精子中H3K4me3的平均荧光强度值进行分析。
2.3结果
分别从对照组、NWSSJD组和CPA组小鼠的附睾尾获取成熟的精子,且对精子进行H3K4me3的免疫荧光染色(图1A)。H3K4me3存在于精子的细胞核中(图1A)。NWSSJD组精子H3K4me3的平均荧光强度与对照组之间没有显著差异(图1B),而CPA组精子H3K4me3的平均荧光强度显著高于NWSSJD组和对照组精子H3K4me3的平均荧光强度(P<0.05,图1B)。NWSSJD维持了精子中低的H3K4me3的表达水平。
3新温肾生精饮对胚胎的影响
3.1获取胚胎
雌性小鼠进行超排处理,腹腔注射10IU孕马血清促性腺激素(PMSG),48h后注射10IU人绒毛膜促性腺激素(HCG),然后与雄性小鼠(动物对象为上述对照组和CPA组、NWSSJD组的小鼠)1:1合笼。在HCG注射后42h、52h、70h和94h分别从小鼠输卵管和子宫中获取2-细胞胚胎、3-4细胞胚胎、8-16细胞胚胎和囊胚,放入PBS小滴中。
3.2胚胎的免疫荧光
将获取的胚胎在3.7%(v/v)的多聚甲醛溶液固定20min,0.1%Trion X-100的PBS溶液中作用15min,5%(v/v)BSA封闭液封闭1h。将胚胎在兔源抗H3K4me3(A2357,ABclonal)的一抗中孵育2h。PBS洗三遍后,羊抗兔FITC标记的二抗(AS011,ABclonal)孵育胚胎1h。Hoechst 33342(14533,Sigma)对胚胎细胞核进行染色,然后将胚胎放在抗荧光漂白的封片液滴(AR1109,BOSTER)中,封片。激光扫描共聚焦显微镜(奥林巴斯,FV1000)观察,所有图片均在相同强度的激光照射下拍摄。利用NIH Image J专业图像分析软件对每个实验组的10枚胚胎进行H3K4me3的平均荧光强度分析。
3.3 Western blotting
每次60个2-细胞期胚胎,40个3-4细胞期胚胎,20个8-16细胞期胚胎或10个囊胚,放入6.5μL蛋白裂解液(950μL Laemmli sample buffer+50μLβ-疏基乙醇+0.5μL蛋白酶抑制剂),室温充分裂解后,-20℃保存备用。将蛋白转移到PVDF膜上,5%(g/v)脱脂奶粉封闭1h,SETD1B和Lamin A/C一抗孵育膜,4℃过夜。PBST洗膜后,膜在山羊抗兔HRP标记的二抗中室温孵育2h,然后进行增强的化学发光显色,使用ChemiDOC XRS+imaging systems(Bio-Rad Laboratories,Hercules,CA,USA)对膜进行扫描。Image J图像分析软件分析SETD1B的相对表达水平。
3.4 qRT-PCR
每次60个2-细胞期胚胎,40个3-4细胞期胚胎,20个8-16细胞期胚胎或10个囊胚,进行real-time PCR分析。来自胚胎的RNAs使用Rneasy Micro Kit(Qiagen,Hilden,Germany)提取,并被转录成cDNA。在20μL的反转录体系(1μL random primers、1μL OligodT Primer、4μL Reverse Transcription buffer、1IU/mL PrimeScriptTEMRT Enzyme MixⅠ(TaKaRa,Dalian,China))中进行反转录。使用iQ5 Multicolor Real-time PCRDetection System(Bio-RAD)、利用SYBR Premix Ex Taq(Takara Dalian,China)通过定量实时PCR进行基因产物的定量分析,使用的特定引物见表1。Real-time PCR的反应系统包括Premix Ex TaqTMⅡ、forward/reverse primers、cDNA template。引物和cDNA的量先通过普通PCR优化,然后进行real-time PCR。PCR反应条件为:95℃预变性30s,95℃变性5s,60-62℃(根据所用的引物而定,见表1)退火20s,72℃延伸30s,循环40次。PCR的产物通过琼脂糖凝胶电泳确认。管家基因,GAPDH被用来作为实验的内参。使用2-△△Ct方法计算目的基因相对表达水平。
表1引物序列和退火温度
3.5结果
3.5.1NWSSJD对小鼠早期胚胎发育的影响
在HCG注射后42h、52h、70h和94h分别从小鼠输卵管和子宫中获取2-细胞胚胎、3-4细胞胚胎、8-16细胞胚胎和囊胚(图2),并统计了各期胚胎的发育率(表2)。在观察小鼠早期胚胎发育时,出现卵裂球碎裂、空泡化、发育延迟的胚胎被认为是退化的胚胎(图2)。与对照组比较,CPA显著降低了受孕小鼠的2-细胞胚胎、3-4细胞胚胎、8-16细胞胚胎和囊胚的获得数(P<0.05),提高了退化2-细胞胚胎、退化3-4细胞胚胎、退化8-16细胞胚胎和退化囊胚的获得数和退化率(P<0.05)。NWSSJD组各期正常胚胎的获得数与对照组比较无显著性差异,但显著高于CPA组各期正常胚胎的获得数,且NWSSJD组各期退化胚胎的获得数和胚胎的退化率与对照组比较无显著性差异,但显著低于CPA组各期退化胚胎的获得数和胚胎的退化率。NWSSJD有利于维持小鼠早期胚胎的正常发育。
表2 NWSSJD对早期胚胎发育的影响
3.5.2 NWSSJD对小鼠早期胚胎中H3K4me3表达的影响
对各个实验组收集的2-细胞胚胎、3-4细胞胚胎、8-16细胞胚胎和囊胚进行H3K4me3免疫荧光染色(图3A,图4A,图5A,图6A),并测定了胚胎中H3K4me3的平均荧光强度(图3B,图4B,图5B,图6B)。发现2-细胞胚胎、3-4细胞胚胎、8-细胞胚胎中H3K4me3的表达主要分布在核周,从16-细胞胚胎开始,H3K4me3从核周迁入细胞核内,到囊胚阶段核内H3K4me3的表达明显增强。与对照组比较,CPA显著降低了受孕小鼠的2-细胞胚胎、3-4细胞胚胎、8细胞胚胎和囊胚中H3K4me3的表达(P<0.05)。NWSSJD组各期胚胎中H3K4me3的表达与对照组比较无显著性差异,但显著高于CPA组各期胚胎中H3K4me3的表达(P<0.05)。NWSSJD维持着小鼠早期胚胎中H3K4me3的正常表达。
3.5.3NWSSJD对小鼠早期胚胎中甲基化酶SETD1B表达的影响
将各个实验组收集的2-细胞胚胎、8-细胞胚胎和囊胚进行甲基化酶SETD1B的western blotting分析(图7)。与对照组比较,CPA显著降低了受孕小鼠的2-细胞胚胎、8细胞胚胎和囊胚中SETD1B的表达(P<0.05)。NWSSJD组各期胚胎中SETD1B的表达与对照组比较无显著性差异,但显著高于CPA组各期胚胎中SETD1B的表达(P<0.05)。NWSSJD维持着小鼠早期胚胎中甲基化酶SETD1B的正常表达。
3.5.4 NWSSJD对小鼠囊胚中发育相关基因表达的影响
将各组收集的小鼠囊胚进行胚胎发育分化的相关基因(OCT-4、NANOG、CDX2)和凋亡相关基因(BCL-2、P53)的qRT-PCR分析(图8)。结果发现,与对照组相比,CPA显著降低了OCT-4、CDX2和BCL-2的表达,显著升高了P53的表达。与CPA组比较,NWSSJD显著提高了BCL-2的表达,显著降低了P53的表达,且NWSSJD组中BCL-2和P53的表达与对照组差异不显著;NWSSJD组中OCT-4和CDX2基因表达显著低于对照组,该2基因的表达高于CPA组中这2个基因的表达,但差异不显著。CPA和NWSSJD没有显著影响NANOG基因的表达。CPA影响了胚胎发育分化基因的表达,促进胚胎细胞凋亡,而NWSSJD则显著抑制了胚胎细胞凋亡。
上述结果显示,NWSSJD从抑制生精细胞和精子凋亡、促进精子成熟以及提高精液质量等方面,对睾丸功能的维持发挥多方面的有益影响,可被广泛用于治疗男性生精障碍。我们验证了NWSSJD的一个新的作用,NWSSJD可显著维持生精障碍小鼠精子中低的H3K4me3修饰水平,能维持精子中H3K4me3的低修饰水平,稳定胚胎中甲基化酶SETD1B的表达和H3K4me3的修饰水平,抑制胚胎细胞凋亡,促进早期胚胎发育。本研究对NWSSJD治疗男性生精障碍后对其后代发育的影响提供了一些参考依据。因此,我们推测H3K4me3修饰可能是NWSSJD的一个重要作用靶点。
需要说明的是,本发明中涉及数值范围时,应理解为每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用,由于采用的步骤方法与实施例相同,为了防止赘述,本发明描述了优选的实施例。尽管已描述了本发明的优选实施例,但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念,则可对这些实施例做出另外的变更和修改。所以,所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
显然,本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样,倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内,则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
序列表
<110> 吉林医药学院
<>
<120> 新温肾生精饮作为调节H3K4me3表达水平药物的应用
<>
<160> 12
<>
<170> PatentIn version 3.3
<>
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<>
<400> 1
agaggatcac cttggggtac a 21<>
<>
<>
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<>
<400> 2
cgaagcgaca gatggtggtc 20<>
<>
<>
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<>
<400> 3
tcttcctggt ccccacagtt t 21<>
<>
<>
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<>
<400> 4
gcaagaatag ttctcgggat gaa 23<>
<>
<>
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<>
<400> 5
caaggacgtg agcatgtatc c 21<>
<>
<>
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<>
<400> 6
gtaaccaccg tagtccgggt a 21<>
<>
<>
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<>
<400> 7
gagagcgtca acagggagat g 21<>
<>
<>
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<>
<400> 8
ccagcctccg ttatcctgga 20<>
<>
<>
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<>
<400> 9
atgcccatgc tacagaggag 20<>
<>
<>
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<>
<400> 10
agactggccc ttcttggtct 20<>
<>
<>
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<>
<400> 11
tgttaccaac tgggacgaca 20<>
<>
<>
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<>
<400> 12
ctgggtcatc ttttcacggt 20<>
<>
<>
<>
<>
Claims (10)
1.新温肾生精饮作为调节H3K4me3表达水平药物的应用。
2.根据权利要求1所述的新温肾生精饮作为降低精子中H3K4me3表达水平药物的应用,其特征在于,所述新温肾生精饮用于制备降低H3K4me3表达水平而提高精子质量、提高存活率的药物。
3.根据权利要求1所述的新温肾生精饮作为调节胚胎中H3K4me3表达水平药物的应用,其特征在于,所述新温肾生精饮用于制备调节胚胎中H3K4me3表达水平而促进早期胚胎发育的药物。
4.根据权利要求3所述的新温肾生精饮作为调节胚胎中H3K4me3表达水平药物的应用,其特征在于,所述早期胚胎为2-细胞胚胎、3-4细胞胚胎、8-16细胞胚胎和囊胚。
5.根据权利要求2或4所述的新温肾生精饮作为调节精子和胚胎中H3K4me3表达水平药物的应用,所述H3K4me3分别在所述2-细胞胚胎、3-4细胞胚胎、8-16细胞胚胎、囊胚和精子中表达。
6.根据权利要求4所述的新温肾生精饮作为调节胚胎中H3K4me3表达水平药物的应用,其特征在于,所述新温肾生精饮用于制备提高甲基化酶SETD1B表达水平的药物。
7.根据权利要求4所述的新温肾生精饮作为调节胚胎中H3K4me3表达水平药物的应用,其特征在于,所述新温肾生精饮用于制备提高BCL-2、OCT-4和CDX2表达水平的药物。
8.根据权利要求4所述的新温肾生精饮作为调节胚胎中H3K4me3表达水平药物的应用,其特征在于,所述新温肾生精饮用于制备降低P53表达水平的药物。
9.根据权利要求1-4以及6-8中任一项所述的新温肾生精饮作为调节精子和胚胎中H3K4me3表达水平药物的应用,其特征在于,所述新温肾生精饮包含以下重量份的物质:人参6-7份、锁阳9-10份、黄芪10-12份、淫羊藿4-6份、鹿茸1-3份、肉苁蓉9-10份、当归4-6份、沙苑子9-12份、山药13-15份、白术6-8份、川芎3-5份、白芍药4-6份、肉桂1-3份、木香1-3份和小茴香1-3份。
10.根据权利要求9所述的新温肾生精饮作为调节精子和胚胎中H3K4me3表达水平药物的应用,其特征在于,所述新温肾生精饮包含以下重量份的物质:人参6份、锁阳9份、黄芪12份、淫羊藿6份、鹿茸1份、肉苁蓉9份、当归6份、沙苑子9份、山药15份、白术6份、川芎3份、白芍药6份、肉桂1份、木香1.5份和小茴香3份。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202110574138.2A CN113209210A (zh) | 2021-05-25 | 2021-05-25 | 新温肾生精饮作为调节H3K4me3表达水平药物的应用 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202110574138.2A CN113209210A (zh) | 2021-05-25 | 2021-05-25 | 新温肾生精饮作为调节H3K4me3表达水平药物的应用 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN113209210A true CN113209210A (zh) | 2021-08-06 |
Family
ID=77098408
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202110574138.2A Pending CN113209210A (zh) | 2021-05-25 | 2021-05-25 | 新温肾生精饮作为调节H3K4me3表达水平药物的应用 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN113209210A (zh) |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN103110813A (zh) * | 2013-01-30 | 2013-05-22 | 贵州联盛药业有限公司 | 一种补肾生精的药物及其制备方法 |
CN105395771A (zh) * | 2015-11-08 | 2016-03-16 | 吉林医药学院 | 一种新温肾生精饮及其制备方法 |
CN108595911A (zh) * | 2018-05-03 | 2018-09-28 | 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 | 早期胚胎稳定H3K4me3区域的识别方法与应用 |
CN111789966A (zh) * | 2020-06-29 | 2020-10-20 | 华南农业大学 | 组蛋白甲基化H3K4me3在小鼠卵巢发育中的应用 |
-
2021
- 2021-05-25 CN CN202110574138.2A patent/CN113209210A/zh active Pending
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN103110813A (zh) * | 2013-01-30 | 2013-05-22 | 贵州联盛药业有限公司 | 一种补肾生精的药物及其制备方法 |
CN105395771A (zh) * | 2015-11-08 | 2016-03-16 | 吉林医药学院 | 一种新温肾生精饮及其制备方法 |
CN108595911A (zh) * | 2018-05-03 | 2018-09-28 | 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 | 早期胚胎稳定H3K4me3区域的识别方法与应用 |
CN111789966A (zh) * | 2020-06-29 | 2020-10-20 | 华南农业大学 | 组蛋白甲基化H3K4me3在小鼠卵巢发育中的应用 |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
王龙达等: "组蛋白H3甲基化修饰与精子发生的研究进展", 《中国医药指南》 * |
袁瑞等: "温肾生精饮治疗生精障碍的实验研究", 《四川中医》 * |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Kouwenhoven et al. | VGluT2 expression in dopamine neurons contributes to postlesional striatal reinnervation | |
CN109952379A (zh) | 将外源性线粒体递送到细胞中的方法 | |
Nomura et al. | Post-ovulatory oocyte aging induces spontaneous occurrence of polyploids and mosaics in artificial fertilization of Japanese eel, Anguilla japonica | |
US20240173265A1 (en) | Extracellular vesicles from microalgae, their preparation, and uses | |
CN104024404A (zh) | 单倍体细胞 | |
Kirkeby et al. | Preclinical quality, safety, and efficacy of a human embryonic stem cell-derived product for the treatment of Parkinson’s disease, STEM-PD | |
Lin et al. | Nrf2 inhibition affects cell cycle progression during early mouse embryo development | |
Rosner et al. | Divergent roles of the DEAD‐box protein BS‐PL10, the urochordate homologue of human DDX3 and DDX3Y proteins, in colony astogeny and ontogeny | |
Yao et al. | Laminarin enhances the quality of aged pig oocytes by reducing oxidative stress | |
CN113209210A (zh) | 新温肾生精饮作为调节H3K4me3表达水平药物的应用 | |
Fan et al. | Wdhd1 is essential for early mouse embryogenesis | |
Tang et al. | Temporal and spatial expression of caudal-type homeobox gene-2 during hindgut development in rat embryos with ethylenethiourea-induced anorectal malformations | |
Vladimirovna | Expression of FGF2 and nucleostemin in models of retinal regeneration in the newt under conditions of 3D organotypic culture in vitro | |
CN113288964A (zh) | 新温肾生精饮作为降低H3K27me3表达水平药物的应用 | |
CN112516318A (zh) | Cul4b在二型糖尿病治疗中的应用 | |
Kang et al. | Effectiveness of a medaka whole testis organ culture system using an agarose gel stand for germ cell proliferation and differentiation | |
Pocherniaieva et al. | The timing and characterization of maternal to zygote transition and mid-blastula transition in sterlet Acipenser ruthenus and A. ruthenus x Acipenser gueldenstaedtii Hybrid | |
JP7372713B2 (ja) | ヤツメウナギlipタンパク質の肥満治療及び耐寒性向上のための食品及び薬品の製造における使用 | |
EP4223308A1 (en) | Composition including plgf for prevention or treatment of neuropsychologic disease | |
CN113855698B (zh) | MT-siRNA在制备杀伤细菌和抑制细菌感染的药物中的应用 | |
CN113461776B (zh) | 一种具有预防及治疗肠炎功能的小肽及其应用 | |
Chen et al. | Astragalus polysaccharides combined with Codonopsis pilosula polysaccharides modulates the physiological characteristics of trophoblasts via miR-92a-1–5p/CCR7 axis | |
EP4223307A1 (en) | Composition for preventing or treating neuropsychologic disease, comprising manf | |
WO2016019366A1 (en) | Characterization and differentiation of human stem cell lines | |
Liu et al. | Excessive expression and activity of cathepsin B in sheep cumulus cells compromises oocyte developmental competence |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination |