CN112516318A - Cul4b在二型糖尿病治疗中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供CUL4B在二型糖尿病治疗中的应用。本发明研究发现CUL4B负调控脂肪分化，进一步研究证明，Cul4b敲除小鼠改善胰岛素抵抗和2型糖尿病症状。机制上，发现AKO小鼠中胰岛素信号通路更敏感，脂肪细胞更容易吸收葡萄糖。同时，AKO小鼠脂肪组织中巨噬细胞浸润明显减少。因此，CUL4B可以作为一个潜在药物靶点，抑制CUL4B的蛋白活性可以降低血糖，改善二型糖尿病症状，因此具有良好的实际应用之价值。

Description

CUL4B在二型糖尿病治疗中的应用
技术领域
本发明属于生物医药和分子生物学领域，具体涉及CUL4B在二型糖尿病治疗中的应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
随着经济的飞速发展和城市化进程的加快，人们的生活方式和饮食结构发生了巨大变化，超重及肥胖人口正逐年剧增。国内外的研究表明，肥胖是诱发高血压、心脑血管疾病、2型糖尿病、高血脂、脂肪肝等疾病的重要因素。其中体内脂肪沉积以心脏、腹部为中心而开始发展的一种肥胖类型称为向心性肥胖或中心型肥胖，它是一种比全身匀称性肥胖危害更大的肥胖类型。世界卫生组织已将肥胖列为一种严重危害人类健康的世界性疾病，这使得肥胖产生的机制及其干预研究成为世界医学研究的一个热点问题。
在过去的30年中，2型糖尿病患病率出现大幅增长。同时，糖尿病前期的患病率也显著增加。且糖尿病的流行呈现年轻化趋势。鉴于早期发病患者的远期并发症发生风险逐年增加，由此造成的经济和医疗负担令人十分担忧。
哺乳动物主要含有两种脂肪组织,即白色脂肪组织和棕色脂肪组织。前者的功能为将剩余的能量以甘油三酯的形式贮存在脂滴中,后者主要在寒冷和应激的情况下动员脂滴分解而进行适应性产热维持体温。棕色脂肪组织大量分布于新生婴儿的肾周、颈背、肩胛和腋窝等处,但随年龄增长而逐渐减少,至成年时其占机体脂肪组织的比重极少。相比之下,白色脂肪组织几乎遍布于整个机体,其中皮下脂肪和内脏脂肪为主要的贮存能量部位。目前,研究已证实白色脂肪组织的过度沉积与2型糖尿病、高血脂、心血管疾病等疾病的发生密切相关。传统的观点一般认为脂肪细胞的作用是储存能量，现在越来越多的研究认为，脂肪细胞能够分泌多种因子来调控各种激素、细胞因子和营养物质分泌、吸收和利用，在机体的代谢平衡中发挥非常重要的作用。肥胖的产生不仅是由于脂肪细胞体积增大，脂肪细胞数目增多在其中也发挥着非常重要的作用。在一些生理或病理因素的作用下，脂肪组织内干细胞会分化为脂肪细胞，甚至身体其它器官的干细胞也会募集到脂肪组织，分化为成熟的脂肪细胞，最终导致脂肪细胞数目的增加。脂肪细胞分化是一个从前脂肪细胞分化成成熟脂肪细胞的一个动态的、多分子参与的过程。研究脂肪细胞的分化，阐明脂肪细胞定向分化过程中的分子机制，将有利于更好地理解肥胖的发病机制，并可为2型糖尿病和心血管疾病的预防和治疗提供新的靶位点和策略。
Cullin-Ring泛素连接酶复合物(Cullin-ring ubiquitin ligases,CRLs)是哺乳动物中最大的一类E3泛素连接酶，CUL4B蛋白是这一复合物中的一员。遗传学研究发现人类CUL4B基因突变导致X连锁智力低下综合征，还表现为生长发育迟缓、向心性肥胖等多方面症状。然而，关于CUL4B基因突变引起肥胖等代谢性相关疾病的原因一直不清楚。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供CUL4B在二型糖尿病治疗中的应用。本发明研究发现CUL4B负调控脂肪分化，进一步研究证明，Cul4b敲除小鼠改善胰岛素抵抗和2型糖尿病症状。机制上，发现AKO小鼠中胰岛素信号通路更敏感，脂肪细胞更容易吸收葡萄糖。同时，AKO小鼠脂肪组织中巨噬细胞浸润明显减少。因此，CUL4B可以作为一个潜在药物靶点，抑制CUL4B的蛋白活性可以降低血糖，改善二型糖尿病症状，因此具有良好的实际应用之价值。
具体的，本发明涉及以下技术方案：
本发明的第一个方面，提供用于降低Cul4b基因和/或其表达产物表达水平的物质在制备产品中的应用。
所述产品的功能为如下任意一种或多种：
(a1)促进脂肪分化；
(a2)促进脂肪细胞增殖；
(a3)减少脂肪组织炎症；
(a4)降低血糖；
(a5)降低胰岛素水平；
(a6)降低游离脂肪酸；
(a7)提高脂联素；
(a8)治疗糖尿病，改善糖尿病症状。
本发明的第二个方面，提供用于提高Cul4b基因和/或其表达产物表达水平的物质在制备产品中的应用。
所述产品的功能为如下任意一种或多种：
(b1)抑制脂肪分化；
(b2)抑制脂肪细胞增殖；
(b3)增加脂肪组织炎症；
(b4)提高血糖；
(b5)提高胰岛素水平；
(b6)提高游离脂肪酸；
(b7)降低脂联素；
(b8)制备糖尿病动物模型。
本发明的第三个方面，提供一种产品，所述产品其活性成分包含用于降低Cul4b基因和/或其表达产物表达水平的物质。
所述产品的功能为如下任意一种或多种：
(a1)促进脂肪分化；
(a2)促进脂肪细胞增殖；
(a3)减少脂肪组织炎症；
(a4)降低血糖；
(a5)降低胰岛素水平；
(a6)降低游离脂肪酸；
(a7)提高脂联素；
(a8)治疗糖尿病，改善糖尿病症状。
本发明的第四个方面，提供一种产品，所述产品其活性成分包含用于提高Cul4b基因和/或其表达产物表达水平的物质。
所述产品的功能为如下任意一种或多种：
(b1)抑制脂肪分化；
(b2)抑制脂肪细胞增殖；
(b3)增加脂肪组织炎症；
(b4)提高血糖；
(b5)提高胰岛素水平；
(b6)提高游离脂肪酸；
(b7)降低脂联素；
(b8)制备糖尿病动物模型。
本发明的第五个方面，提供用于降低Cul4b基因和/或其表达产物表达水平的物质在如下任意一种或多种中的应用：
(a1)促进脂肪分化；
(a2)促进脂肪细胞增殖；
(a3)减少脂肪组织炎症；
(a4)降低血糖；
(a5)降低胰岛素水平；
(a6)降低游离脂肪酸；
(a7)提高脂联素；
(a8)治疗糖尿病，改善糖尿病症状。
本发明的第六个方面，提供用于提高Cul4b基因和/或其表达产物表达水平的物质在如下任意一种或多种中的应用：
(b1)抑制脂肪分化；
(b2)抑制脂肪细胞增殖；
(b3)增加脂肪组织炎症；
(b4)提高血糖；
(b5)提高胰岛素水平；
(b6)提高游离脂肪酸；
(b7)降低脂联素；
(b8)制备糖尿病动物模型。
以上一个或多个技术方案的有益技术效果：
上述技术方案报道了CUL4B在肥胖和肥胖相关的代谢性疾病的发生发展中的作用，经研究发现，CUL4B负调控脂肪分化，进一步研究证明，Cul4b敲除小鼠改善胰岛素抵抗和2型糖尿病症状。机制上，发现AKO小鼠中胰岛素信号通路更敏感，脂肪细胞更容易吸收葡萄糖。同时，AKO小鼠脂肪组织中巨噬细胞浸润明显减少。因此，CUL4B可以作为一个潜在药物靶点，抑制CUL4B的蛋白活性可以降低血糖，改善二型糖尿病症状，因此具有良好的实际应用之价值。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为本发明实施例在肥胖小鼠和诱导的脂肪细胞中，CUL4B蛋白水平下调。(A)8周龄雄性C57/B6小鼠，用高脂饮食喂养6周或12周后，取皮下脂肪并用所示抗体进行免疫印迹。(B)12周龄WT和db/db小鼠，取皮下脂肪并用所示抗体进行免疫印迹。(C)3T3-L1细胞经诱导培养液诱导分化后，细胞裂解液进行免疫印迹。
图2为本发明实施例高表达CUL4B抑制脂肪生成。用空载体或表达CUL4B的慢病毒感染3T3-L1细胞后，形成稳转细胞系，用诱导培养基处理细胞：(A)在处理后不同时间点取全细胞裂解物，用westernblot检测抗体。(B)诱导后第8天，油红O染色比较对照细胞和高表达CUL4B的细胞的脂滴大小。用定量PCR技术检测mRNA水平。(C、D)定量PCR检测mRNA水平。诱导期(天)。数据以平均值±标准差表示。t检验，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
图3为本发明实施例低表达CUL4B促进脂肪分化过程。其中，(A)使用慢病毒表达shRNA的对照序列(shControl)或小鼠Cul4b小干扰RNA序列(shCul4b)构建3T3-L1稳定细胞系。用诱导培养基处理细胞。在处理后不同时间点取全细胞裂解物，用westernblot检测抗体。(B)诱导分化后第8天，用油红O染色。(C和D)在处理后不同时间点提取总RNA样品，并进行成脂标志物的定量PCR分析。
图4为本发明实施例基础饲料喂养下AKO小鼠的表型。(A)左：WT和AKO小鼠不同组织中的蛋白质水平。右：WT和AKO小鼠腹腔巨噬细胞的蛋白质水平。(B)将8周龄雄性WT和AKO小鼠分组(每组n＝8)，并额外喂养基础饲料16周。体重、进食量和脂肪垫(附睾、腹股沟和蝙蝠)重量。
图5为本发明实施例脂肪细胞特异性Cul4b基因敲除小鼠易患肥胖症。(A)在基础饲料(NCD)或高脂饲料(HFD)喂养16周期间WT和AKO小鼠的体重(每组n＝7-8)。(B-D)8周龄雄性WT(n＝7)和AKO(n＝7)小鼠用高脂饮食喂养16周。比例尺，100μm。(B)小鼠的代表性照片。(C)在高脂饮食喂养的最后一周，每天的食物摄入量被监测。(D)脂肪垫(附睾、腹股沟和褐色脂肪)的代表性照片(上图)。脂肪垫重量(下图)。
图6为本发明实施例在AKO小鼠脂肪分化扩张中起主要作用。8周龄雄性WT(n＝7)和AKO(n＝7)小鼠用高脂饲料喂养16周。比例尺，100μm。(A)代表性的苏木精和伊红染色图像。(B)左，代表性的Caveolin蛋白染色图像。右，脂肪细胞直径的量化。每组共检测50个细胞/小鼠。数据以平均值±SEM表示。AKO组与WT组比较*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
图7为本发明实施例AKO小鼠的改善胰岛素敏感性。8周龄雄性WT和AKO小鼠分别饲喂6周(每组7只)。数据以平均值±SEM表示。(A)胰岛素耐受试验。曲线下面积(AUC)被量化。胰岛素注射后时间(min)。(B)葡萄糖耐量试验。定量测定GTT的AUC。葡萄糖注射后的时间(min)。(C)空腹血胰岛素浓度，(D)游离脂肪酸(FFA)浓度，(E)脂联素浓度。
图8为本发明实施例脂肪细胞中CUL4B的缺失可显著改善全身胰岛素敏感性。(A)胰岛素刺激脂肪、肝和肌肉中磷酸化Akt(Ser473)。小鼠腹腔注射胰岛素(1单位/kg)。注射10分钟后迅速解剖组织进行免疫印迹分析。计算pAkt/总Akt。(B)基础和胰岛素刺激初级脂肪细胞摄取3H-2-脱氧葡萄糖。胰岛素刺激±30min后5min内测定2-脱氧葡萄糖摄取量，数据均为三个独立实验的平均摄取量±SEM。*AKO与WT相比，p<0.05，**p<0.01。
图9为本发明实施例AKO小鼠脂肪组织炎症减少。8周龄雄性WT和AKO小鼠用高脂饮食喂养16周(每组n＝5)。(A)腹股沟脂肪部位F4/80和Caveolin免疫染色代表性图像。比例尺，100μm。(B和C)每克腹股沟脂肪或皮下脂肪的巨噬细胞数量。基质组分中F4/80+/CD11b+(B)和F4/80+/CD11b+CD11c+细胞(C)的流式细胞术分析。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。下列具体实施方式中如果未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域技术内的分子生物学的常规方法和条件，这种技术和条件在文献中有完整解释。参见例如Sambrook等人，《分子克隆：实验手册》中所述的技术和条件，或按照制造厂商所建议的条件。
结合具体实例对本发明作进一步的说明，以下实例仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。如果实施例中未注明的实验具体条件，通常按照常规条件，或按照销售公司所推荐的条件；实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可通过商业途径购买得到。
需要说明的是，Cul4b基因表达产物包括CUL4B蛋白。
技术人员应理解，术语“表达水平”是指在特定的时间点体内或样品中存在的基因产物的量。表达水平可以例如通过由基因表达的蛋白质或mRNA来测量/量化/检测。可以例如如下量化表达水平：用相同样品或参考样品(例如，在相同时间从同一个体得到的样品或相同样品的相同尺寸(重量、体积)的部分)中相同类型基因产物的总量(总蛋白质或mRNA)归一化样品中存在的目的基因产物的量，或者确定目的基因产物的量/限定的样品尺寸(重量、体积等)。可以通过本领域已知的任何方法来测量或检测表达水平，所述方法例如用于目的基因产物的直接检测和量化的方法(例如质谱)，或者通常通过目的基因产物与对目的基因产物具有特异性的一种或更多种不同分子或检测装置(例如，引物、探针、抗体、蛋白质支架)结合而工作的用于间接检测和测量目的基因产物的方法。技术人员还已知的是确定基因拷贝的水平，其还包括确定一个或更多个片段的不存在或存在(例如，通过核酸探针或引物，例如定量PCR、多重连接依赖性探针扩增(Multiplex ligation-dependent probeamplification，MLPA)。
本发明的一个典型具体实施方式中，提供用于降低Cul4b基因和/或其表达产物表达水平的物质在制备产品中的应用。
所述产品的功能为如下任意一种或多种：
(a1)促进脂肪分化；
(a2)促进脂肪细胞增殖；
(a3)减少脂肪组织炎症；
(a4)降低血糖；
(a5)降低胰岛素水平；
(a6)降低游离脂肪酸；
(a7)提高脂联素；
(a8)治疗糖尿病，改善糖尿病症状。
本发明的又一具体实施方式中，所述(a8)中，糖尿病为二型糖尿病。
本发明的又一具体实施方式中，降低Cul4b基因和/或其表达产物表达水平的物质可以是包括针对Cul4b的RNA干扰分子或反义寡核苷酸、小分子抑制剂、siRNA，实施慢病毒感染或基因敲除的物质，以及针对CUL4B蛋白特异的抗体。
本发明的又一具体实施方式中，所述产品可以为药物。
本发明的又一具体实施方式中，提供用于提高Cul4b基因和/或其表达产物表达水平的物质在制备产品中的应用。
所述产品的功能为如下任意一种或多种：
(b1)抑制脂肪分化；
(b2)抑制脂肪细胞增殖；
(b3)增加脂肪组织炎症；
(b4)提高血糖；
(b5)提高胰岛素水平；
(b6)提高游离脂肪酸；
(b7)降低脂联素；
(b8)制备糖尿病动物模型。
本发明的又一具体实施方式中，所述(b8)中，糖尿病为二型糖尿病。
本发明的又一具体实施方式中，提高Cul4b基因和/或其表达产物表达水平的物质包括采用基于基因特异性Mimics技术上调Cul4b表达和/或促进其活性的物质；如人工合成Cul4b的短发夹RNA(short hairpin RNA，shRNA)或上调LIGHT表达的启动子或者慢病毒；同时以及包括化合物类促进剂。
本发明的又一具体实施方式中，所述产品可以为药物或试剂。
本发明的又一具体实施方式中，提供一种产品，所述产品其活性成分包含用于降低Cul4b基因和/或其表达产物表达水平的物质。
所述产品的功能为如下任意一种或多种：
(a1)促进脂肪分化；
(a2)促进脂肪细胞增殖；
(a3)减少脂肪组织炎症；
(a4)降低血糖；
(a5)降低胰岛素水平；
(a6)降低游离脂肪酸；
(a7)提高脂联素；
(a8)治疗糖尿病，改善糖尿病症状。
本发明的又一具体实施方式中，所述(a8)中，糖尿病为二型糖尿病。
本发明的又一具体实施方式中，降低Cul4b基因和/或其表达产物表达水平的物质可以是包括针对Cul4b的RNA干扰分子或反义寡核苷酸、小分子抑制剂、siRNA，实施慢病毒感染或基因敲除的物质，以及针对CUL4B蛋白特异的抗体。
本发明的又一具体实施方式中，提供一种产品，所述产品其活性成分包含用于提高Cul4b基因和/或其表达产物表达水平的物质。
所述产品的功能为如下任意一种或多种：
(b1)抑制脂肪分化；
(b2)抑制脂肪细胞增殖；
(b3)增加脂肪组织炎症；
(b4)提高血糖；
(b5)提高胰岛素水平；
(b6)提高游离脂肪酸；
(b7)降低脂联素；
(b8)制备糖尿病动物模型。
本发明的又一具体实施方式中，所述(b8)中，糖尿病为二型糖尿病。
本发明的又一具体实施方式中，提高Cul4b基因和/或其表达产物表达水平的物质包括采用基于基因特异性Mimics技术上调Cul4b表达和/或促进其活性的物质；如人工合成Cul4b的短发夹RNA(short hairpin RNA，shRNA)或上调LIGHT表达的启动子或者慢病毒；同时以及包括化合物类促进剂。
所述产品可以为药物或试剂。
本发明的又一具体实施方式中，提供用于降低Cul4b基因和/或其表达产物表达水平的物质在如下任意一种或多种中的应用：
(a1)促进脂肪分化；
(a2)促进脂肪细胞增殖；
(a3)减少脂肪组织炎症；
(a4)降低血糖；
(a5)降低胰岛素水平；
(a6)降低游离脂肪酸；
(a7)提高脂联素；
(a8)治疗糖尿病，改善糖尿病症状。
本发明的又一具体实施方式中，所述(a8)中，糖尿病为二型糖尿病。
本发明的又一具体实施方式中，降低Cul4b基因和/或其表达产物表达水平的物质可以是包括针对Cul4b的RNA干扰分子或反义寡核苷酸、小分子抑制剂、siRNA，实施慢病毒感染或基因敲除的物质，以及针对CUL4B蛋白特异的抗体。
本发明的又一具体实施方式中，提供用于提高Cul4b基因和/或其表达产物表达水平的物质在如下任意一种或多种中的应用：
(b1)抑制脂肪分化；
(b2)抑制脂肪细胞增殖；
(b3)增加脂肪组织炎症；
(b4)提高血糖；
(b5)提高胰岛素水平；
(b6)提高游离脂肪酸；
(b7)降低脂联素；
(b8)制备糖尿病动物模型。
本发明的又一具体实施方式中，所述(b8)中，糖尿病为二型糖尿病。
本发明的又一具体实施方式中，提高Cul4b基因和/或其表达产物表达水平的物质包括采用基于基因特异性Mimics技术上调Cul4b表达和/或促进其活性的物质；如人工合成Cul4b的短发夹RNA(short hairpin RNA，shRNA)或上调LIGHT表达的启动子或者慢病毒；同时以及包括化合物类促进剂。
本发明的又一具体实施方式中，所述产品可以为药物或试剂。
根据本发明，“治疗”的概念表示任一适用于治疗代谢性疾病(如二型糖尿病)的措施，或者对于这种表现的疾病或所表现出来的症状进行预防性治疗，或者避免这种疾病的复发，例如在结束了治疗时间段之后的复发或对已经发作的疾病的症状进行治疗，或者预先介入性的防止或抑制或减少该类疾病或症状的发生。
根据本发明，上述药物还包括至少一种药物非活性成分。
所述药物非活性成分可以是药学上通常使用的载体、赋形剂及稀释剂等。而且，根据通常的方法，可以制作成粉剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、混悬剂、乳剂、糖浆剂、喷雾剂等的口服剂、外用剂、栓剂及无菌注射溶液形式的剂型使用。
所述可以包含的载体、赋形剂及稀释剂等非药物活性成分在领域内是熟知的，本领域普通技术人员能够确定其符合临床标准。
本发明的又一具体实施方式中，所述载体、赋形剂及稀释剂包括但不限于有乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯胶、藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石粉、硬脂酸镁和矿物油等。
本发明的又一具体实施方式中，本发明的药物可通过已知的方式施用至体内。例如通过静脉全身递送或者局部注射递送到感兴趣组织中。可选地经由静脉内、经皮、鼻内、粘膜或其他递送方法进行施用。这样的施用可以经由单剂量或多剂量来进行。本领域技术人员理解的是，本发明中有待施用的实际剂量可以在很大程度上取决于多种因素而变化，如靶细胞、生物类型或其组织、待治疗受试者的一般状况、给药途径、给药方式等等。
本发明的又一具体实施方式中，所述动物模型中的动物可以是非人哺乳动物，如小鼠、大鼠、豚鼠、兔、狗、猴、猩猩。
本发明的又一具体实施方式中，所述药物或物质施用对象可以是人和非人哺乳动物，如小鼠、大鼠、豚鼠、兔、狗、猴、猩猩等。
以下通过实施例对本发明做进一步解释说明，但不构成对本发明的限制。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例
材料和方法
1.动物饲养
实验小鼠饲养在无特定病原体(Specific pathogen Free，SPF)级别饲养室中，保持22℃恒温和各12小时昼夜交替。小鼠高脂饲料购自Research diet，D12492(60kcal％Fat)。Cul4bflox/flox来自本实验室构建，Fabp4-cre+/-小鼠购自南京大学模式动物研究所。本研究的所有小鼠实验均得到山东大学医学院动物伦理委员会的批准。
为得到脂肪组织特异性敲除的小鼠，将Cul4bflox/flox雌鼠与Fabp-cre+/-转基因小鼠交配，在该转基因小鼠中Cre酶在脂肪系统表达。交配后将得到以下2种雄性小鼠：野生型雄鼠(Cul4bflox/Y)和条件性敲除雄鼠(Cul4bflox/Y；Fabp-cre+/-)，比例是1:1。
2.小鼠基因型鉴定
2.1材料
1)蛋白酶K消化缓冲液：内含10mM Tris-HCl(pH8.3)、500mMKCl、1％(v/v)Tween-20，室温保存。
2)蛋白酶K(Sigma公司，Product Number:P2308)：以10mg/ml的浓度溶解于储存液中(50mM Tris-HCl，1mM CaCl2，pH8.0)，分装后放置在-20℃保存。
2.2基因型鉴定的引物
引物flox-F和flox-R用于检测Cul4b基因打靶片段，引物Cre-F和Cre-R用于检测Cre重组酶基因。
flox-F：5'-ACAGGTATTTGCCAGTGCTGTC-3'(SEQ ID NO.1)
flox-R：5'-TTCTGTTACCTTCCTACCGAGAG-3'(SEQ ID NO.2)
Cre-F：5'-ATCCATATTGGCAGAACGAAA-3'(SEQ ID NO.3)
Cre-R：5'-TGACCAGAGTCATCCTTAGCG-3'(SEQ ID NO.4)
2.3小鼠尾巴组织DNA的提取
1)在小鼠7-10天鼠龄时，剪取约0.5厘米长的尾巴标本。
2)将小鼠尾巴标本放入含有0.5ml蛋白酶K消化缓冲液的EP管中，在沸水浴中加热10分钟。
3)待缓冲液冷却至室温时，加入5μl蛋白酶K溶液，混匀后在55℃水浴中消化过夜。
4)旋涡振荡，使组织块松散。沸水浴中加热十分钟，灭活蛋白酶K。
5)12000rpm离心10分钟。
6)取上清用做PCR模板。
2.4基因型鉴定PCR
1)以从小鼠尾巴组织中提取的DNA为模板，按下表所示体积配制PCR反应体系，总体积为25μl。
Platinum Blue PCR SuperMix 19μl
上游引物(2pmol/μl) 2.5μl
下游引物(2pmol/μl) 2.5μl
DNA模板 1μl
2)按下表所示参数进行PCR反应。
Figure BDA0002860112560000131
3.分子生物学常规方法
聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)、琼脂糖凝胶电泳、限制性内切酶反应、割胶回收、连接反应、大肠杆菌质粒转染、质粒抽提、以及聚丙烯酰胺凝胶电泳等分子克隆常规操作参见《分子克隆》第二版(Molecular Cloning,A Laboratory Manual,2nd,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)，及《精编分子生物学实验指南》第三版(Short Protocols in Molecular Biology,3rd,John Wiley&Sons,Inc.,1995)。
4.真核表达质粒的转染
以转染HEK293细胞为例，使用FuGENE HD(Roche)转染试剂。
1)接种细胞，培养到60mm培养皿中，接种量为4×105/培养皿，培养24小时左右。
2)每个培养皿质粒DNA的转染量为2μg，当转染质粒的量不足2μg时，使用pcDNA3.0质粒补至总量为2μg。FuGENE HD体积(μl)与DNA质量(μg)比为3:1。
3)稀释FuGENE HD在不含抗生素的Opti-MEM培养基中(200μl/60mm培养皿)，混匀后室温静置5分钟。
4)转染体系中加入质粒DNA，混匀后室温静置15-20分钟后，把配好的转染混合物逐滴均匀加入到细胞培养皿中，轻轻混匀。
5)细胞培养6小时后，换成新鲜基础培养基，继续培养24-48hr。
5.全细胞裂解液的收集
1)收集细胞。将处理后的细胞于培养基中刮下，1,000g离心5分钟收集，PBS洗一遍后，弃去PBS。
2)裂解细胞。每一样品加入120μl RIPA缓冲液，经过7号针头剪切10次。4℃，13,200rpm离心10分钟。
3)转移92μl上清到新的1.5ml Eppendorf管中。
4)取2μl上清用于蛋白定量。
5)若需要检测多次跨膜蛋白：蛋白提取液中加入90μl的HMGCR Sol Buffer，60μl的4×Loading Buffer，37℃温育30分钟，混匀后于-20℃保存或直接用于Western Blot检测。
若不需要检测多次跨膜蛋白：剩余蛋白提取液中加入30μl的4×Loading Buffer。100℃空气浴温育10分钟，混匀后-20℃保存或用于Western Blot检测。
其中，RIPA缓冲液的成分为：终浓度50mM的Tris-HCl pH8.0，150mM NaCl，2mMMgCl2，0.1％SDS，1.5％Nonidet-P40，0.5％去氧胆酸钠。另含浓度为5μg/ml的PepstatinA，10μg/ml的Leupeptin，5μM的MG-132，1mM的PMSF，0.25mM的DTT。4×Loading Buffer的成分为：终浓度1％的SDS，6％的β-巯基乙醇，30％的甘油，以及适量的溴酚蓝。
6.Western blot分析蛋白表达
1)配制SDS-PAGE胶。根据《分子克隆实验指南》(科学出版社，第二版)第883页18.3制备所需浓度的分离胶，根据第883页表18.4制备浓度为4.5％的浓缩胶。
2)制备蛋白样品。根据实验要求按上述方法制备蛋白样品。
3)上样。样品混匀后上样于SDS-PAGE胶上样孔中，一般20μl/孔，要求每个孔总蛋白量一致，不足的体积以1×loading补平。
4)电泳。蛋白样品在浓缩胶中电压为80-100伏，在分离胶中电压为120-150伏。
5)转膜。待溴酚蓝或指示Marker跑到指定位置，将胶拆下来转膜，按顺序安装转膜装置：正极、滤纸、硝酸纤维素膜、凝胶、滤纸、负极。100伏恒压条件下通电90分钟。
6)封闭。转膜结束后取出硝酸纤维素膜，将膜浸泡在含5％的脱脂奶粉的TBST缓冲液中，室温下摇床振荡1小时。
7)一抗孵育。封闭结束后，弃去牛奶，换成按照一定比例稀释的一抗溶液(Primaryantibody+1％FBS+0.2％NaN3in 1×TBST)，室温下摇床振荡1小时或4℃过夜。
8)回收一抗，将硝酸纤维素膜用TBST缓冲液洗4次，每次5分钟。
9)二抗孵育。加入与一抗种属相配的二抗溶液(1：5000稀释于5％脱脂奶粉中)，室温下摇床振荡1小时。
10)弃去二抗，用TBST缓冲液洗硝酸纤维素膜4次，每次5分钟；
11)换成TBS缓冲液洗硝酸纤维素膜1次。
12)显色并成像。将ECL显色底物孵育于硝酸纤维素膜上，室温显色约10秒至2分钟不等，保鲜膜包好后，于暗室中直接扫描成像，或用X光片曝光、显影及定影。
7.慢病毒介导的基因沉默:
1)将合成的带有发卡结构的shRNA靶向片段的引物，退火后，连接入PLKO.1质粒中。
2)病毒扩增。接种3×106/培养皿HEK-293T细胞于100mm培养皿中。
3)48小时后，转染。配制转染混合物：3μg shRNA质粒，2.25μg psPAX2包装质粒，0.75μg pMD2.G蛋白衣壳质粒，18μl FuGENE HD，876μl Opti-MEM。混匀，15分钟后逐滴加入到细胞孔中。
4)48小时和72小时后分别收集上清，保存于-80℃，即病毒上清。
5)感染细胞。接种2×105/well 3T3-L1细胞于12孔板中。
6)24小时后，换液，每个孔中加入700μl病毒上清和300μl培养基。
7)48小时后，进行相关细胞处理，通过荧光定量PCR或Western Blot检测沉默效率。
8.RNA抽提与定量
1)将细胞弃去培养基，PBS洗一遍，弃去。
2)裂解细胞。每个60mm培养皿加入1ml TRIzol Reagent(GIBCO BRL)，室温处理10分钟。
3)将细胞裂解液转移到1.5ml Eppendorf管中。
4)每份样品中加入200μl的氯仿，Vortex低速混匀。
5)4℃，13,200rpm离心15分钟，转移500μl的上层水相至新Eppendorf管中。
6)每份样品加入500μl的异戊醇，Vortex低速混匀。
7)4℃，13,200rpm离心10分钟，弃去上清。
8)每份样品加入1000μl的70％乙醇，颠倒混匀。
9)4℃，13,200rpm离心5分钟，弃去上清。
10)室温晾干。
11)加入适量DEPC处理过的去离子水，充分溶解。
12)取适量RNA稀释。测定260nm的光吸收，并计算其浓度。
13)调整RNA浓度至1μg/μl。
14)进行逆转录反应生成cDNA或直接-80℃保存。
9.逆转录反应
cDNA的合成采用25μl体系，使用Promega公司的逆转录酶与缓冲液。每一体系含4μg RNA，0.5μg OligodT(T15V1)，终浓度0.4mM dNTP(each)。
1)每一体系中加入4μl RNA(1μg/μl)，0.5μl OlidgodT(1μg/μl)，10.5μl DEPCH2O，混匀。
2)70℃变性5分钟，冰上骤冷。
3)每一体系中加入3μl DEPC H2O，5μl 5×MLV Buffer，1μl dNTP(10mM each)，1μl M-MLV逆转录酶，混匀。
4)37℃反应1小时
5)70℃ 5分钟，灭活逆转录酶。
6)-20℃保存cDNA。
10.实时定量PCR Realtime-PCR采用20μl体系。使用Takara公司的HS Taq酶与缓冲液。每一体系含0.5U Hot-Start Taq DNA聚合酶，0.5×SYBR green，1.5mM MgCl2，62.5μM dNTP(each)，0.6μM引物，1.5μl cDNA模板(逆转录产物cDNA稀释4倍)。
1)将水、缓冲液、dNTP、镁离子、引物、模板与酶加入反应体系，混匀。
2)按以下的反应条件进行反应：
a.94℃预变性5分钟
b.94℃变性30秒
c.60℃退火30秒
d.72℃延伸30秒
e.b-d循环40次
3)根据荧光读数计算结果。
11.稳定表达细胞株的建立
1)以3T3-L1细胞为例，消化后接种到直径60mm培养皿中，接种量为4×105/培养皿；
2)24小时后，用FuGENE HD转染细胞，质粒的转染量为3μg/培养皿；
3)37℃培养48小时；
4)细胞传代，按照1:10的比例将细胞重新接种于100mm培养皿中，并更换培养基为含有700μg/ml G418的培养基；
5)37℃培养约10天，期间每2-3天更换一次培养基，维持700μg/mlG418浓度至大部分细胞死亡，具有抗性的细胞形成可见的克隆；
6)用枪头挑取单克隆，并分别接种于24孔板中，培养基维持200μg/mlG418浓度；
7)待24孔板长到80％密度后，分别消化并扩大培养，培养基继续维持200μg/mlG418浓度；
8)通过荧光观察，或用Western Blot检测外转基因的表达情况；
9)选择表达量合适的单克隆细胞株扩增备用。
12.石蜡切片
将取得的标本在4％PFA(Sigma P6148)溶液中4℃固定1-3天(依据取材时小鼠鼠龄和标本大小不同而异)。然后进行下面步骤：
1)取4％PFA固定的组织块，大小约0.5cm×0.5cm×0.2cm。
2)脱水。将组织块依次放入50％酒精60min—70％酒精60min—80％酒精60min—95％酒精45min—95％酒精45min—100％酒精40min—100％酒精40min。
3)透明。将组织块放入二甲苯中20min，待组织块透明。注意此操作于通风橱中进行，因二甲苯有毒，且有强烈的刺激性气味。
4)透蜡。将上述组织块依次放入已融化的液体纯蜡Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ中，各1个小时。注意要确保液体石蜡中没有渗入水，以免影响透蜡。
5)硬蜡包埋。先在铁模具中加入一些液态石蜡，稍微冷却，将组织块放入石蜡中，而后将塑料模具盒盖上，最后再加少许液态石蜡，进行冷冻，使石蜡变为固态，-20℃保存。
6)切片。将包埋好的组织从模具盒上取下来，并置于石蜡切片机上，调节切片的厚度为4-6μm，用毛笔将切割的切片向外拉，并用小镊子将包含完整组织的蜡片小心置于40℃温水中，使蜡片展开。
7)摊片。用载玻片小心将组织片捞出，每张载玻片上捞两份组织，用于做对照。将贴有组织的载玻片架子上，于40℃温箱中烘干水滴。
8)脱蜡。依次将载玻片放入二甲苯Ⅰ—二甲苯Ⅱ—100％酒精—100％酒精—95％酒精—90％酒精—80％酒精—70％酒精—50％酒精—25％酒精，在每个试剂中放置10分钟。
13.H&E染色
13.1试剂
1)Harris’s酸化的苏木素染液：
A液：10％的硫酸铝铵溶液(Sigma A2140)。
B液：内含8％的苏木素(Sigma H3136)和4％的氧化汞(Aldrich)。
工作液：250ml A液中加入15ml B液，煮沸2-3分钟后置于冰上，加入8ml冰乙酸，避光保存。
2)0.6％伊红溶液：内含0.6％伊红(Sigma E4382)的90％乙醇溶液，用冰乙酸调节pH值至4.6-5.0。
工作液：每238ml 0.6％伊红溶液中加入6ml 1％Phloxine B溶液(Sigma P4030)和6ml 2％Orange G溶液(Sigma 01625)。
13.2方法
1)石蜡切片的脱蜡和水化：二甲苯溶液2次，每次10分钟；无水乙醇溶液2次，每次5分钟；95％乙醇溶液5分钟；75％乙醇溶液5分钟；50％乙醇溶液5分钟；25％乙醇溶液5分钟；自来水洗涤3次。
2)Harris’s酸化的苏木素染液染色30秒。
3)自来水漂洗。
4)氨水溶液中浸泡10秒。
5)自来水漂洗3分钟。
6)伊红染液染色1分钟。
7)脱水和封片，显微镜下观察。
13.3结果分析
细胞核为深蓝色，细胞质为亮红色。
实验结果
1.CUL4B在肥胖小鼠中表达下调，在脂肪分化中也下调
为了研究CUL4B在动物肥胖过程中的作用，首先我们观察在食物诱导性肥胖过程中CUL4B蛋白水平的变化，我们发现随着给予高脂饮食时间的增加，小鼠的脂肪组织中CUL4B蛋白水平下降(图1A)。与这一结果对应的是，糖尿病模型小鼠(db/db小鼠)与野生型小鼠相比，CUL4B的蛋白水平也降低(图1B)。这些结果提示我们CUL4B蛋白可能在动物肥胖过程中发挥作用。
然后我们利用前脂肪细胞系3T3-L1来研究CUL4B在脂肪分化过程的作用，我们发现随着脂肪分化诱导时间的增加，CUL4B蛋白水平也降低，而CUL4B的同源蛋白CUL4A水平不变(图1C)，这些结果也提示我们CUL4B在脂肪分化过程起作用。
2.高表达CUL4B抑制3T3-L1细胞脂肪分化过程
前脂肪细胞3T3-L1是一种在体外脂肪分化中常用的模型，我们利用这一模型来研究CUL4B在脂肪分化中的作用。首先我们利用慢病毒表达系统获得了稳定表达CUL4B的3T3-L1细胞(图2A)。经脂向分化培养基诱导后，油红O染色比较对照细胞和高表达CUL4B的细胞的脂滴大小。可以看到，在高表达CUL4B后，3T3-L1细胞的脂滴数量明显减少(图2B)。定量PCR结果发现在高表达CUL4B后脂肪的标志基因Fabp4和Adipsin明显降低(图2C)，同时其它一些脂肪分化标志蛋白也有下降的趋势(图2D)。这表明CUL4B调控细胞的脂肪分化，高表达CUL4B减弱脂肪分化的能力。
3.低表达CUL4B促进脂肪分化过程
为了进一步研究CUL4B对前脂肪细胞3T3-L1分化的影响，我们利用慢病毒表达系统表达shRNA的方法获得了低表达CUL4B的3T3-L1细胞(图3A)。经脂向分化培养基诱导后，油红O染色发现，在低表达CUL4B后，3T3-L1细胞的脂滴数量明显增多(图3B)。可以看到，定量PCR结果发现在高表达CUL4B后脂肪的标志基因Fabp4和Adipsin明显升高(图3C)，同时其它一些脂肪分化标志蛋白也有上升的趋势(图3D)。结合上述图2的结果，说明CUL4B负调控细胞的脂肪分化。
4.获得Cul4b基因脂肪组织特异性敲除小鼠
为了研究CUL4B在脂肪分化中的作用，我们利用脂肪组织特异表达Cre重组酶的小鼠(FABP4-Cre+/-)，与Cul4bflox/flox小鼠杂交，获得了脂肪组织特异敲除的小鼠(Adipocyte-specific Cul4b knockout，AKO)。我们检测了该小鼠各个组织的蛋白表达情况，发现AKO小鼠中，附睾脂肪(Epi-WAT)，腹股沟脂肪(Ing-WAT)，肩胛褐色脂肪(BAT)的CUL4B都有效的敲除。而肝脏，脾脏，巨噬细胞中未检测到CUL4B蛋白水平的变化(图4A)。这说明我们成功获得了脂肪组织特异敲除的小鼠。
在基础饲料(normal chow diets,NCD)喂养8周后，野生型小鼠(wild type,WT)和AKO小鼠的体重和进食量没有差别(图4B)。处死小鼠后，我们分析小鼠各个部位的脂肪组织重量，也没有发现明显差别(图4B)。
5.Cul4b AKO小鼠在高脂饲料喂养下更肥胖
高脂饮食下，小鼠体重会快速增长，并且伴随脂肪组织增大，脂肪细胞体积变大，血液葡萄糖水平升高等类似于二型糖尿病的症状。接下来，我们来研究高脂饮食诱导下，AKO小鼠的表型特征。在连续给予小鼠16周的高脂饮食(60％fat diets)下，小鼠体重都快速增长，并且AKO小鼠比野生型小鼠体重增长更快(图5A)。在16周的时候，AKO小鼠的体重比野生型小鼠高10g左右(图5B)。饮食量上AKO小鼠也比野生型小鼠明显增多(图5C)。处死小鼠后，取小鼠各个位置的脂肪，称重发现AKO小鼠个各个位置脂肪重量都有增加，有意思的是，AKO小鼠的腹股沟脂肪(ingWAT)比野生型小鼠有更显著的增多(图5D)。腹股沟脂肪是一类皮下脂肪，现有的研究一般认为这是一类在代谢方面比内脏脂肪危害更小的脂肪，这提示我们AKO小鼠可能有改善的代谢表型。
6.Cul4b AKO小鼠脂肪分化增强
既然在AKO小鼠里腹股沟脂肪总量上升，那么这种增多是由于脂肪数目的增多还是由于体积的增大引起的呢？为回答这一问题，我们用苏木精&伊红染色(hematoxylin andeosin stain)的方法来观察脂肪的形态。我们发现，在AKO小鼠中，脂肪细胞都有不同程度的减小(图6A)。为了进一步确定这种体积的变化，我们用抗体来标记细胞膜表面的一种蛋白Caveolin，从而在荧光显微镜下更清楚的计算脂肪细胞的体积。通过计算我们发现，AKO小鼠的脂肪细胞直径明显减小(图6B)。这说明AKO小鼠脂肪体积变小，因此它的脂肪细胞增殖可能加快，这与图3的结果对应，即低表达CUL4B促进脂肪分化。
7.Cul4b AKO小鼠能够抵抗高脂饮食引起的胰岛素抵抗
小鼠的肥胖或代谢异常常伴随血糖水平的异常变化，而血糖的升高是2型糖尿病的主要症状。为了研究CUL4B对血糖的影响，我们利用AKO小鼠研究血糖水平。8周雄性WT小鼠和AKO小鼠，继续喂养高脂饲料16周后，胰岛素耐受实验(Insulin tolerance tests,ITT)和葡萄糖耐受实验(Glucose tolerance tests,GTT)发现，AKO小鼠比WT小鼠的血糖水平都降低(图7A，7B)。然后，禁食小鼠4小时后处死，取血后，检测胰岛素(insulin)，游离脂肪酸(free fatty acid，FFA)和脂联素(adiponectin)的水平。AKO小鼠血液中胰岛素和游离脂肪酸水平显著降低，脂联素水平升高(图7C，7D，7E)。这些实验结果都表明Cul4b脂肪敲除小鼠改善胰岛素抵抗和2型糖尿病症状。
8.Cul4b AKO小鼠胰岛素更敏感，脂肪细胞更易吸收血糖
上述结果显示AKO小鼠的血糖水平比WT小鼠降低，接下来我们检测缺失CUL4B是否对胰岛素信号产生影响。高脂饮食的小鼠在注射胰岛素后，取白色脂肪，肝脏，肌肉，检测Akt磷酸化(Ser473)水平。可以看到，AKO小鼠在胰岛素刺激后，pAkt水平比WT小鼠在各个组织中都升高(图8A)，这说明AKO小鼠中胰岛素信号通路更敏感。然后，分离原代脂肪细胞，观察3H-葡萄糖(3H-2-deoxyglucose)的吸收情况。可以看到，无论是在本底情况下，还是在加入胰岛素刺激情况下，来源于AKO小鼠的原代脂肪细胞都能吸收更多的葡萄糖(图8B)。综合这两个结果，说明AKO小鼠中胰岛素信号通路更敏感，脂肪细胞更容易吸收葡萄糖，这也就解释了上述在AKO小鼠中观察到的血糖水平降低的现象。
9.Cul4b AKO小鼠脂肪组织炎症降低
近些年大量的研究显示，肥胖往往伴随低度的炎症，炎症因子刺激胰岛素信号通路从而会导致胰岛素抵抗。脂肪组织里巨噬细胞侵袭的增加是一个常见的肥胖导致的炎症现象。因此我们比较WT小鼠和AKO小鼠在高脂饲料喂养后脂肪组织巨噬细胞浸润的差别。F4/80是巨噬细胞的标志蛋白之一，通过免疫荧光我们发现，在高脂饲料喂养的小鼠白色脂肪中，都有F4/80蛋白阳性的细胞即巨噬细胞存在，这些细胞在脂肪细胞的周围聚集。同时，AKO小鼠脂肪组织中巨噬细胞浸润明显减少(图9A)，这说明AKO小鼠的脂肪组织炎症减弱，与AKO小鼠的胰岛素敏感性增强是一致的。巨噬细胞分为两个亚群，其中M1型巨噬细胞具有更强的炎症性，它的标志蛋白是(F4/80+/CD11b+CD11c+)。流式细胞分析结果AKO小鼠脂肪组织中总的巨噬细胞(F4/80+/CD11b+)和M1型巨噬细胞都减少(图9B，9C)，这进一步说明AKO小鼠的脂肪组织炎症减弱，与上述结果中AKO小鼠的胰岛素敏感性增强是一致的。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 山东大学
<120> CUL4B在二型糖尿病治疗中的应用
<130>
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
acaggtattt gccagtgctg tc 22
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ttctgttacc ttcctaccga gag 23
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
atccatattg gcagaacgaa a 21
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
tgaccagagt catccttagc g 21

Claims (10)

1.用于降低Cul4b基因和/或其表达产物表达水平的物质在制备产品中的应用；
所述产品的功能为如下任意一种或多种：
(a1)促进脂肪分化；
(a2)促进脂肪细胞增殖；
(a3)减少脂肪组织炎症；
(a4)降低血糖；
(a5)降低胰岛素水平；
(a6)降低游离脂肪酸；
(a7)提高脂联素；
(a8)治疗糖尿病，改善糖尿病症状。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述(a8)中，糖尿病为二型糖尿病；
所述降低Cul4b基因和/或其表达产物表达水平的物质包括针对Cul4b的RNA干扰分子或反义寡核苷酸、小分子抑制剂、siRNA，实施慢病毒感染或基因敲除的物质，和针对CUL4B蛋白特异的抗体；
所述产品为药物。
3.用于提高Cul4b基因和/或其表达产物表达水平的物质在制备产品中的应用；
所述产品的功能为如下任意一种或多种：
(b1)抑制脂肪分化；
(b2)抑制脂肪细胞增殖；
(b3)增加脂肪组织炎症；
(b4)提高血糖；
(b5)提高胰岛素水平；
(b6)提高游离脂肪酸；
(b7)降低脂联素；
(b8)制备糖尿病动物模型。
4.如权利要求3所述应用，其特征在于，所述(b8)中，糖尿病为二型糖尿病；
提高Cul4b基因和/或其表达产物表达水平的物质包括采用基于基因特异性Mimics技术上调Cul4b表达和/或促进其活性的物质；如人工合成Cul4b的短发夹RNA或上调LIGHT表达的启动子或者慢病毒；以及包括化合物类促进剂；
所述产品可以为药物或试剂。
5.一种产品，所述产品其活性成分包含用于降低Cul4b基因和/或其表达产物表达水平的物质；
所述产品的功能为如下任意一种或多种：
(a1)促进脂肪分化；
(a2)促进脂肪细胞增殖；
(a3)减少脂肪组织炎症；
(a4)降低血糖；
(a5)降低胰岛素水平；
(a6)降低游离脂肪酸；
(a7)提高脂联素；
(a8)治疗糖尿病，改善糖尿病症状。
6.如权利要求5所述产品，其特征在于，所述(a8)中，糖尿病为二型糖尿病；
降低Cul4b基因和/或其表达产物表达水平的物质包括针对Cul4b的RNA干扰分子或反义寡核苷酸、小分子抑制剂、siRNA，实施慢病毒感染或基因敲除的物质，和针对CUL4B蛋白特异的抗体。
7.一种产品，所述产品其活性成分包含用于提高Cul4b基因和/或其表达产物表达水平的物质；
所述产品的功能为如下任意一种或多种：
(b1)抑制脂肪分化；
(b2)抑制脂肪细胞增殖；
(b3)增加脂肪组织炎症；
(b4)提高血糖；
(b5)提高胰岛素水平；
(b6)提高游离脂肪酸；
(b7)降低脂联素；
(b8)制备糖尿病动物模型。
8.如权利要求7所述产品，其特征在于，所述(b8)中，糖尿病为二型糖尿病；
提高Cul4b基因和/或其表达产物表达水平的物质包括采用基于基因特异性Mimics技术上调Cul4b表达和/或促进其活性的物质；如人工合成Cul4b的短发夹RNA或上调LIGHT表达的启动子或者慢病毒；同时包括化合物类促进剂；
所述产品为药物或试剂。
9.用于降低Cul4b基因和/或其表达产物表达水平的物质在如下任意一种或多种中的应用：
(a1)促进脂肪分化；
(a2)促进脂肪细胞增殖；
(a3)减少脂肪组织炎症；
(a4)降低血糖；
(a5)降低胰岛素水平；
(a6)降低游离脂肪酸；
(a7)提高脂联素；
(a8)治疗糖尿病，改善糖尿病症状。
10.用于提高Cul4b基因和/或其表达产物表达水平的物质在如下任意一种或多种中的应用：
(b1)抑制脂肪分化；
(b2)抑制脂肪细胞增殖；
(b3)增加脂肪组织炎症；
(b4)提高血糖；
(b5)提高胰岛素水平；
(b6)提高游离脂肪酸；
(b7)降低脂联素；
(b8)制备糖尿病动物模型。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN114404589A (zh) * 2021-12-24 2022-04-29 浙江大学 Rnase4作为治疗和/或预防糖尿病的药物靶点的应用

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
李培山等: "Lack of CUL4B in Adipocytes Promotes PPARγ-Mediated Adipose Tissue Expansion and Insulin Sensitivity", 《DIABETES》 *

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